Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cyclin G liittyvän kinaasin (GAK), keskeinen toimija clathrin välittämän kalvokuljetuksessa, on yli-ilmentynyt eri syöpäsoluissa. Täällä me raportoimme että GAK ilmentyminen korreloi positiivisesti Gleason pisteet kirurgisista näytteistä eturauhassyöpään potilaista. Alkion fibroblasteista hiirten ilmentävät kinaasia kuollut (KD) muodossa GAK osoitti konstitutiivisen hyper-fosforylaation kasvutekijän reseptorin (EGFR). Lisäksi tunnettujen EGFR: n estäjien gefitinibi ja erlotinibi, ravinnon flavonoidi luteolin oli voimakas estäjä Ser /Thr kinaasiaktiivisuutta GAK

in vitro

. Samanaikainen luteoliini- ja gefitinibin PC-3-solut oli suurempi vaikutus solujen elävyyden kuin anto joko pelkän yhdisteen; Tämä väheneminen elinkelpoisuutta liittyi rajuja alas-säätely GAK proteiinin ilmentymisen. Kattava microRNA erilaisia ​​analyysi paljasti, lisääntyneen ekspression miR-630 ja miR-5703 käsittelyn jälkeen PC-3-solujen luteoliinia ja /tai gefitinibin, ja eksogeeninen yliekspressio miR-630 aiheutti kasvun pysähtymisen näiden solujen. GAK näyttää olevan välttämätön solun kuolemaan, koska yhdessä gefitinibin ja luteoliini EGFR puutteesta U2OS luusarkoomasoluissa oli myös suurempi vaikutus solujen elävyyden kuin anto joko yhdistettä yksinään. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että GAK voi olla uusi terapeuttinen kohde eturauhassyövässä ja osteosarkooma.

Citation: Sakurai MA, Ozaki Y, Okuzaki D, Naito Y, Sasakura T, Okamoto A, et al. (2014) Gefitinibi ja Luteolin syy kasvu pidätys Human Eturauhassyöpä PC-3 solujen kautta esto sykliini G-Associated Kinase ja induktio miR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10,1371 /journal.pone.0100124

Editor: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 20 helmikuu 2014; Hyväksytty: 21 toukokuu 2014; Julkaistu: 27 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Sakurai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-Aid tieteellisen tutkimuksen S (nro 15101006), Scientific Research B (nro 20370081 ja 23370086), ja kartoittava tutkimus (nro 21651085) ja HN; ja tieteellisen tutkimuksen C (nro 22570185) ja NY alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi useimmin diagnosoitu syöpien ja on johtava syy miesten syöpäkuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Koska se ajetaan ensisijaisesti androgeenireseptorin (AR) signalointia, edenneen eturauhassyövän tyypillisesti hoidetaan androgeenien puute hoitoa, jossa kirurgisen tai kemiallinen kastraatio suoritetaan lohkoon aktiivinen AR signalointi joko poistamalla ligandin tai vaikuttavat reseptorin suoraan [2] . Vaikka tehokas, androgeeniablaatio ohjaa metastaattinen eturauhassyöpä vain muutaman vuoden ja melkein kaikilla potilailla kehittyy etenevä hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä (HRPC). Androgeenien puute hoito ei ole parantava näille potilaille vaikka pariksi tehokkaampia hoitoja, jotka kohdistuvat keskeinen testosteronin synteesiä, kuten CYP17A1 estäjä abirateronin ja AR-antagonisti MDV3100 [3], [4]. Tunnistaminen uusi kohde, joka ohjaa AR signalointi välillisesti, tai jopa tavoite, joka ei liity AR signalointi, voi olla hyödyllinen uusien hoitomenetelmiä HRPC.

läsnä kaikissa sykliini G liittyvän kinaasin (GAK) säätelee clathrin välittämää kalvokuljetuksessa toimimalla olennainen kofaktorina Hsc70 riippuvan kuoriutumista of clathrin päällystettyjä rakkuloiden sytoplasmassa [5], [6]. GAK myös tumassa [7], jossa se toimii transkription koaktivaattori ARS. Erityisesti GAK ​​ilmentyminen lisääntyy merkittävästi HRPC soluissa [8]. Lisäksi GAK ​​on merkitystä ylläpito oikea sentrosomimäärän kypsymisen ja mitoosi kromosomi congression, ja siRNA-välitteisen knockdovvn GAK aktivoi kara-kokoonpano tarkastuspiste, joka tunnistaa työntyi, väärin tai epänormaalin kondensoitu kromosomeja, mikä johtaa solusyklin pysähtymisen metafaasi [9]. GAK on välttämätön solujen kasvua, koska GAK Knockout (GAK

– /-) hiiret ovat alkion tappavia [10] ja hiiren alkion fibroblasti (MEF) johdettu GAK

– /- hiiret eivät jakaa ja lopulta tulla senescent [ ,,,0],11], koska häiriöt clathrin endosytoosin. Olemme kuitenkin aiemmin osoittaneet, että hiirten ilmentävät kinaasilla kuollut muoto GAK (GAK-kd) eivät alkion tappavia ja GAK-kd MEF kasvoivat normaalisti [12], mikä viittaa siihen, että menetys GAK kinaasiaktiivisuuden välttämättä ole tappava normaaleissa soluissa jotka ilmaisevat oikea määrä GAK. Lausunto ehdottaa, että estäjä GAK kinaasiaktiivisuuden voitaisiin kehittää uusi molekyyli-tavoite hoito, joka selektiivisesti estää niiden kasvun HRPC solujen parannettu GAK ilme kontrolloimalla AR signalointi välillisesti.

Gefitinibi [13], tyrosiinikinaasi-inhibiittori on selektiivinen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), on myös estää kinaasiaktiivisuutta GAK [14]. Vaikka EGFR [15] ja GAK [8] ilmentyvät korkeilla tasoilla eturauhassyövässä ja tehostetusta ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen [8], [15], gefitinibin yksin on tehoton [16] ja Samanaikainen gefitinibin ja sädehoitoa [17], tai doketakselin [18] on rajallinen terapeuttisia vaikutuksia. Luteoliini, yhteinen ravinnon flavonoidi löytyy monenlaisia ​​kasveja ja elintarvikkeisiin [19], on toinen antagonisti EGFR-liittyvä tyrosiini proteiinikinaaseja. Samanlaisia ​​gefitinibille, luteolin aiheuttaa kasvun pysähtymisen PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen kautta sääntely solusykliä säätelevien geenien [20]. Luteolin myös estää DNA topoisomeraaseista, kliininen tavoitteet syöpälääkkeiden [21]. Siksi luteolin voi olla käyttökelpoinen syöpälääke, vaikka sen

bona fide

kohde (t) ja molekyylitason mekanismeja estoon syöpäsolujen lisääntymistä jäävät hämäräksi, koska sen monenlaisia ​​farmakologisia ominaisuuksia.

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa uusi tekijä, joka ohjaa AR signalointi epäsuorasti HRPC potilailla, ja tutkimaan, GAK voitaisiin kohdentaa terapiaan paitsi HRPC vaan myös muihin syöpiin tiiviimpää GAK ilme. Todellakin, me täällä ilmoittaa, että kasvu ilmaus GAK vuonna HRPC potilailla positiivisesti korreloi Gleason pisteet, mitta taudin vakavuuteen. Sekä GAK ja AR lokalisoitu ytimiin syöpäsolujen GAK-positiivisten kirurgisista näytteistä.

in vitro

kinaasimääritys paljasti, että luteoliini ja gefitinibin estää kinaasiaktiivisuutta GAK yhtä voimakkaasti, mikä viittaa siihen, niiden käyttökelpoisuus estäjinä EAK: n kinaasiaktiivisuutta. Verrattuna vaikutuksia kummankaan lääkkeen yksin, samanaikainen antaminen luteoliini- ja gefitinibin PC-3-solut oli suurempi estävä vaikutus solujen elinkykyyn. Nämä yhdisteet oli myös kumulatiivinen estävä vaikutus GAK proteiinin ilmentymiseen, joka oli riippumaton proteasomeja välittämän hajoamisen. Yhdessä tässä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että GAK, jota yli-ilmennetään monissa syöpäsoluja, on uusi ehdokas lupaavia kohdennettuja kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja siRNA

Vasta-aineita seuraavia proteiineja käytettiin tässä tutkimuksessa: AR (Santa Cruz Biotechnology), aktiivinen kaspaasi 3 (Cell Signaling Technology), Ki67 (DakoCytomation), Lefty (Abcam), Lamin A /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( kani; Cell Signaling Technology), EGFR (hiiri, Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), Perk (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald), ja α-tubuliinin (Sigma-Aldrich). Anti-GAK monoklonaalisia vasta-aineita valmistettiin, kuten on raportoitu aikaisemmin [7]. Lefty1-erityinen siRNA: ita hankittiin Origene Technologies ja Gene suunnittelu.

Kemikaalit ja ravintolisiä

Seuraavat kemikaalit ja ravintolisiä käytettiin tässä tutkimuksessa: gefitinibin (Tocris Bioscience), erlotinibi ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrition), Oryza luteolin (Oryza Oil Fat Chemical), luteolin (Sigma-Aldrich), resveratrolin (Sigma-Aldrich), ja DMSO (Sigma-Aldrich).

Soluviljely

PC-3-solut antamat japani Cancer Research Resources Bank. Kaikki muut ihmisen syöpäsoluja hankittiin American Type Culture Collection. Soluja pidettiin 5% CO

2 37 ° C: ssa Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone Laboratories), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. WT (EAK-kd

+ /+) ja EAK-kd

– /- MEF-soluihin pidettiin MEF väliaineessa (Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliini, streptomysiini, ja 50 mM 2-merkaptoetanoli) kuten aiemmin on kuvattu [22].

EGF stimulaation

kahden pesun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), MEF-solut viljeltiin matalan seerumin MEF väliaineessa (joka sisälsi 0,5% FBS) 12 h. Hiiren EGF: ää (Sigma) lisättiin elatusaineeseen lopullisessa pitoisuudessa 10 ng /ml (western blot-analyysi) tai 100 ng /ml (immunofluoresens-), ja soluja inkuboitiin sitten 5% CO

2 37 ° C: ssa osoitetut ajat.

FACS-analyysi

Solut värjättiin käyttäen Cycletest Plus DNA Reagent Kit (BD Bioscience), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Analyysi suoritettiin käyttäen FACS Calibur väline CellQuest ohjelmisto (BD Bioscience).

Growth käyräanalyysi

Noin 1,0 × 10

3 PC-3-solut ympättiin 3,5 cm Petri astia ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Gefitinibi, luteoliinia ja resveratrolin liuotettiin sitten DMSO: hon ja lisättiin viljelyalustaan ​​ajanhetkellä nolla.

Solujen elävyys mittauksesta miR-630

Expression of miR-630 päässä miRNASelect pEP- HSA-mir-630 ekspressiovektori suoritettiin valmistajan ohjeiden (Cell Biolabs). Määrittää elinkelpoisuuden, solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti, ja sitten trypsinoitiin osoitetuissa aikapisteissä. Numerot lisääntyvien solujen määritettiin käyttäen Countess Automated Cell Counter (Invitrogen).

Histologinen analyysi

Kirurginen yksilöitä potilailta, joille suoritetaan eturauhasen kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin, ja sitten leikataan 4 pm paksu sarja kohdat. Ensimmäinen leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja joita käytetään patologinen diagnoosi tulehtunut alue. Loput kolme osaa alistettiin immunohistokemiallisia analyysejä, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, parafiini poistettiin osat autoklavoitiin 0,1 M sitraattipuskurissa, estettiin naudan seerumin albumiinia, ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla PBS: ssä, joka sisälsi 2% naudan seerumin albumiinia. Toissijainen vasta-inkuboinnit ja signaalin laatua reaktiot suoritettiin käyttäen Histofine Simple Stain Kit (Nichirei) ja väri kehitettiin käyttämällä aminoethlcarbazole (Impact AEC; Vector Laboratories). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ydin- visualisointi ja sitten asennetaan käyttämällä Ultramount Aqueous Kiinnitysliiman Medium (Dako). Kuvat tallennettiin käyttäen mikroskooppia (BX51, Olympus), joka oli varustettu CCD-kamera (DP72; Olympus).

Western blot-analyysi

valmistamiseksi kokosolulysaateista, solut hajotettiin 4 ° C 30 minuutin ajan modifioidussa RIPA-puskurissa (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM ditiotreitolia, 0,1% SDS ja 0,1% deoksikolaatti) täydennettynä 1% proteaasinestäjä cocktail (Sigma-Aldrich), 1 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, ja 10 mM β-glyserofosfaatti. Sentrifugoinnin jälkeen tyhjennetään lysaatit altistettiin SDS-PAGE: lla. Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille, jotka oli suljettu, ja sitten immunoblotattu mainituilla vasta-aineilla in Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja Tween 20: tä, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa. Immunoreaktiivisen proteiinin vyöhykkeet visualisoitiin käyttäen Western Salama Plus ECL-reagensseilla (PerkinElmer).

puhdistus rekombinanttiproteiinien

puhdistus GST-merkittyjen proteiinien osalta kinaasimääritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti,

E. coli

BL21 soluja transformoitiin pGEX plasmidi inkuboitiin Luria-Bertani-liemi 37 ° C: ssa, kunnes ne saavuttivat absorbanssin 0,4-0,8 600 nm: ssä. Expression kunkin rekombinanttiproteiinin indusoitiin yön yli altistuminen solut 0,5 mM IPTG: tä 20 ° C: ssa. Sitten solut kerättiin ja lyysattiin sonikoimalla PBS: ssä, joka sisälsi 1% Triton X-100, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 1 mM bentsamidiinia, 100 ug /ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mM NaF ja 1 mM Na

3Vo

4. Sentrifugoinnin jälkeen tyhjennetään lysaattia adsorboitiin glutationi Sepharose 4B: hen (Amersham Pharmacia Biotech), huuhdeltiin PBS: lla, ja eluoitiin sitten puskurilla, joka sisältää 10 mM pelkistettyä glutationia (Nacalai Tesque).

In vitro

kinaasianalyysiä of GAK

In vitro

kinaasimääritykset suoritettiin käyttäen GST-merkitty ihmisen AR (~150 ug /ml) kuin testinäyte ja puhdistettua GST-merkittyjä ihmisen GAK (~ 100 ug /ml) kuin testikinaasia. Puhdistettu fragmentti B’γ3 alatyypin hiiren PP2A (B’γ; ~ 10 ug /ml) käytettiin positiivisena kontrollina GAK substraattia, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Aurora kinaasin (~ 50 ug /ml) ja Lats1 /2 kinaasin (-25 ug /ml; n läsnä ollessa tai poissa ollessa Mob1A (~ 50 ug /ml), kun sen aktivaattori) käytettiin positiivisena kontrollina entsyymejä, ja kinaasin -dead (KD) muodossa Aurora kinaasin (~ 50 ug /ml) käytettiin negatiivisena kontrollina fosforylaatiota AR. Kinaasien ja alustan proteiineja inkuboitiin 30 min 30 ° C: ssa 10 ul: ssa reaktiopuskuria (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 5 mM MnCI

2, 1 mM DTT: tä, 5 mM NaF, 50 mM β-glyserofosfaatti), joka sisälsi 5 uM ATP: tä ja 10 uCi [γ-

32P] ATP: tä (PerkinElmer). Tarvittaessa gefitinibi, erlotinibi, SB203580, resveratroli, ja luteolin sisällytettiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4 x Laemmli-puskuria (0,4 M Tris-Cl, pH 6,8, 8% SDS, 20% glyserolia, 10% 2-merkaptoetanolia ja 0,2% bromifenolisinistä). Näytteet erotettiin gradientti SDS-PAGE käyttäen Multigel II Mini laite (Daiichi Pure Chemicals) ja havaittiin autoradiografialla. Proteiinien määriä ladattiin geeliin seurattiin värjäämällä Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) tai SimplyBlue ™ SafeStain (Life Technologies).

Ihmisen genomin mikrosiruanalyysi

Microarray analyysit suoritettiin kuten yksivärisiä hybridisointeja käyttäen Agilent kaikkiaan Human Genome oligonukleotidigeenisirumenetelmää (4 x 44K, Tuotekoodi: 4112F). Kokonais-RNA uutettiin PC-3-soluja 24 h hoidon jälkeen DMSO, 60 uM luteoliini, 60 uM gefitinibi, tai 60 uM luteolin plus 60 uM gefitinibin käyttäen miRNeasy Mini Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen). Laatu RNA määritettiin käyttäen RNA 6000 Nano LabChip Kit Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA käänteistranskriboitiin käyttäen AffinityScript käänteistranskriptaasia (Agilent Technologies) ja oligo-dT-aluketta, jotka sisältävät T7 RNA-polymeraasin promoottorin sekvenssiä.

In vitro

transkriptio suoritettiin sitten käyttäen T7 RNA-polymeraasia ja Matala signaali Quick-Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) merkitä cRNA: t, jossa Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Puhdistettu Cy3-leimattua cRNA: t (1650 ng) hybridisoitiin mikrosiruja. Pesu, skannaus, ja geeni analyysejä suoritettiin valmistajan protokollan (Agilent Technologies). Agilent Feature Extraction ohjelmisto (v. 10.5.1) käytettiin arvioimaan paikalla laatua ja purkaa ominaisuus intensiteetti tilastoja. Subio Platform ja Subio Basic Plug-in (v1.15; Subio Inc.) käytettiin sitten laskemaan välillä näytteen taitettava muutoksia, jotka analysoitiin yhden otoksen Opiskelijan

t

-testaukset. Microarray data on talletettu Gene Expression Omnibus-tietokanta (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) hakunumerolla GSE53180.

Human miRNA mikrosiruanalyysi

miRNA mikrosiruanalyysillä suoritettiin käyttäen Agilent SurePrint Human v18.0 miRNA taulukot, jotka sisältävät 20-40 varustelu kohdistaminen 1919 ihmisen miRNA luetteloitu versiossa 8.0 ja Sanger-tietokannan (design ID 025416). Alikvootit kokonais-RNA (100 ng) käytettiin valmistamaan miRNA koettimet, mukaan Agilent-protokollan (v. 2.4). Lyhyesti, kokonais-RNA defosforyloitiin vasikan suolen alkalisella fosfataasilla, denaturoitu DMSO, ja sitten leimattiin syaniini 3-pCp käyttäen T4-RNA-ligaasia ja miRNA Labeling Kit. Koettimet hybridisoidaan paneelit 20 tuntia 55 ° C: ssa samalla pyörittäen käyttämällä Agilent miRNA Hybridisaatio Kit. Monista mikrosirut tehtiin PC-3-solut käsiteltiin DMSO, luteolin, gefitinibi tai luteolin ja gefitinibi. Objektilasit pestiin Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent) huoneenlämpötilassa 5 min ja sitten Gene Expression Wash Buffer 2 (Agilent) 37 ° C: ssa vielä 5 minuuttia. Hybridisaation jälkeen ja pesun jälkeen levyt skannattiin käyttäen Agilent skanneri (G2505C). Kuvat uutettiin käyttäen Agilent Feature Extraction ohjelmisto (v. 10.7.3) ja Agilent GeneSpring GX -ohjelma (v. 12,6). Yhteenlaskettu geeni signaali GeneView tiedostoja (uutetaan oletusasetukset Agilent Feature Extraction ohjelmisto) käytettiin. Erot miRNA ekspressiotasoja normalisoitiin käyttämällä PC-3 käsitellään DMSO näytteen kontrollina. aFold-muutokset yli 2,0 ja

P

-arvot alle 0,05 (Opiskelijan

t

-testi) katsottiin lisäanalyysiä. Mirna microarray data on talletettu Gene Expression Omnibus tietokannasta hakunumerolla GSE53178.

Quantitative real-time PCR

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7900 väline (PE Applied Biosystems) ja määritys-on-Demand TaqMan koettimien Lefty1 (Hs00764128_s1), miR-630 (HSA-mir-630), ja miR-5703 (HSA-mir-5703), mukaan valmistajan protokollia (Agilent Technologies).

tilastollinen

Error baareja jokaiseen data edustaa SDS keskiarvosta.

P

-arvot laskettiin Studentin

t

-testaukset, ellei toisin mainita.

Ethics

Ihmisen näytteet kerättiin koepalan päässä prostates of syöpäpotilaat kliiniset tiedot poikkeavat Kinki yliopistollisessa sairaalassa. Kaikki kokeet, joissa käytetään ihmisen näytteet hyväksynyt eettinen komitea Osaka University (hyväksyntä # 326) ja Kinki University (hyväksyntä # 23-088); meidän eettinen komitea luopua tarvetta suostumusta. Kirurgisista näytteistä potilailta, joille suoritetaan eturauhasen at Kinki yliopistollisen sairaalan (Osaka, Japani) kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin ja leikataan 4 pm paksu leikesarjojen.

Tulokset

GAK on paikallistettu pääasiallisesti tumaan syöpäsolujen

Vaikka GAK paikantuu pääasiassa solulimassa normaaleissa soluissa, kuten TIG-1, äskettäin raportoitu, että osa proteiinin löytyy myös tumaan [7 ]. Erityisesti aikaisemmassa tutkimuksessa käyttäen neo-adjuvantti hormonihoito kudos microarray osoittaneet GAK ilmentyminen lisää merkittävästi etenemisen aikana eturauhasen syövän androgeeniriippumattomuuteen [8]. Sen määrittämiseksi, mikäli EAK ilmentyminen on täydennetty ytimet syöpäsolujen, immunoblot käytettiin mittaamaan EAK-proteiinin tasot sytoplasman ja ydinvoiman jakeet eri syöpäsolulinjoissa. Hormonin erottelua ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (PC-3), GAK ilmennettiin korkeammalla tasolla tumassa kuin sytoplasmassa; tämä tulos vahvistettiin käyttäen kahta erilaista monoklonaalista vasta-ainetta (kaistat 3 ja 4 on esitetty. 1). Vaikka määrä GAK oli alhainen, ytimet hormoniherkän ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP) ilmaisi myös GAK (kaista 6 kuvassa. 1). Lisäksi ydinvoiman GAK bändi liikkui nopeammin kuin sytoplasmisen GAK bändi, mikä viittaa erillisten muutoksia proteiinin näissä soluosastoihin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös MDA-MB231 ja MCF-7-rintasyöpäsolut, sekä HeLaS3 kohdunkaulan syövän soluja (Fig. 1). Sitä vastoin, GAK oli läsnä korkeammalla tasolla solulimafraktio kuin ydin- osa TIG-1 normaalien fibroblastien (Fig. 1). Varsinkin hormoni-herkkä syöpäsolujen (PC-3 ja MDA-MB231) ilmaisi GAK ​​korkeammiksi kuin hormoni-herkkien syöpäsolujen (LNCaP ja MCF-7). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GAK on muutettu, ja yli-ilmennetään syöpäsolujen, erityisesti metastaattisen soluja.

Western blot-analyysi GAK, lamiini A /C, ja α-tubuliinin (kontrolli) sytoplasman (Cyt), ja ydinaseiden (Nuc) otetut eturauhassyöpää (PC-3 ja LNCaP), rintasyöpä (MDA-MB231 ja MCF-7) ja kohdunkaulan syöpä (HeLaS3) solulinjat. Lamin A /C käytettiin ydin- merkki. Kaksi eri anti-EAK-vasta-aineita käytettiin. Nuolet ja nuolenpäät osoittavat GAK määrittelemillä taajuusalueilla lähinnä ydin- ja sytoplasman jakeet, vastaavasti.

Nuclear GAK ilmentyy korkeilla tasoilla kirurgisista näytteistä eturauhassyöpään potilaista

Määritä jos ydin- yliekspressio GAK tapahtuu

in vivo

immunohistokemiallinen analyysit normaalin ja syöpä- kirurgisista näytteistä 42 eturauhassyöpäpotilaille tehtiin. Vaikka GAK vasta ilmennettiin heikosti normaaleissa kudoksissa, proteiini ekspressoituu korkeina tasoina ytimet syöpäsolujen (Fig. 2A-E). Chi-squared testi paljasti tilastollisesti merkitsevä positiivinen korrelaatio GAK immunovärjäyksen ja Gleason (taulukko 1 ja taulukko S1).

A-D, hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys (A, B) ja anti -GAK immunovärjäystä (C, D) edustavien eturauhasen osien syöpä (A, C) ja normaalin (B, D) kudosten eturauhassyövän potilailla (n = 42). Mittakaava = 50 pm. E, korkeampi voima suurennus kehystetty alue näkyy C. Mittakaava = 50 pm.

Yli-aktivaatio AR signalointi liittyy etenemiseen androgeeniriippuvaisen eturauhasen-syöpiä. Koska GAK vuorovaikutuksessa AR

in vitro

[8], immunovärjäyksellä käytettiin määrittämään jos GAK myös colocalizes AR

in vivo

. Nuclear lokalisointi EAK ja AR havaittiin ytimet syöpäsolujen kaikki EAK-positiiviset kirurgisista näytteistä (n = 4 potilailla, joilla on Gleason pisteet ≤7 ja n = 5 potilailla, joilla on Gleason ≥8) (Fig. S1) . Kuitenkin, huolimatta niiden tumalokalisaatio, suoraan fosforylaatiota AR, jonka GAK ei havaitun

in vitro

kinaasimääritys (Fig. S1E). Lisäksi kolme riippumatonta potilaan näytettä, GAK ja AR ei colocalize kanssa Ki-67, syövän antigeeni, joka löytyy pääasiassa solujen kasvuun ja on poissa leposoluissa (Fig. S2). Tämä havainto viittaa siihen, että rinnakkais- ja GAK ja AR ei välttämättä korreloi syöpäsolujen kasvun.

Sytoplasmiset GAK säätelee EGFR-välitteisten signalointireittien

Down-regulation of GAK vähentää tyrosiinikinaasin aktiivisuus EGFR ja muuttaa sen alavirran signalointireitteihin [5]. Voit selvittää tämän asetuksen välittyy Ser /Thr kinaasiaktiivisuutta GAK, tutkimme käyttäytymistä EGFR GAK-kd MEF [12]. Immunoblot-analyysi villityypin (WT) ja EAK-kd MEF-paljasti, että läsnä on kaksi EGFR proteiinien molemmista näytteistä, joista suurempi on hallitseva EAK-kd MEF (Fig. 3A). Suurempi band katosi sen jälkeen kun soluja λ-fosfataasin (Fig. 3B, kaista 2), mikä viittaa siihen, että se edustaa fosforyloitua muotoa EGFR. Tyr-fosfataasin estäjä Na

3Vo

4, mutta ei Ser /Thr-fosfataasi-inhibiittorit NaF, β-glyserofosfaatti, ja okadahapon, poistetaan tämä vaikutus λ-fosfataasin, viittaa siihen, että Tyr tähteet EGFR ovat konstitutiivisesti fosforyloituu GAK-kd MEF puuttuessa EGR ärsyke (Fig. 3B). Vastaavasti kun MEF olivat seerumin puutteessa 11 tunnin ajan, käsitellään sykloheksimi- 1 h estävän uuden proteiinin synteesiä, ja sitten stimuloidaan lisäämällä EGF, fosforylaatio EGFR oli huomattavampi GAK-kd MEF kuin WT MEF (kuvio . 3C ja 3D). Erityisesti vielä suurempi EGFR-proteiini havaittiin sekä WT ja GAK-kd MEF 10 min kuluttua EGF stimulaation (Fig. 3C ja 3D), mikä viittaa siihen, että EGF lisäsi fosforyloidun Tyr jäämien EGFR. Tämä-hyperfosforylaatiota kiihtyi defosforyloitumista fosforyloidun ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasien 1/2 (pERK1 /2) (Fig. 3C), jotka ovat alavirtaan efektoreja EGFR, mikä viittaa siihen, ennenaikainen väheneminen EGFR-signalointia.

, western blot-analyysi EGFR WT (GAK-kd

+ /+) ja mutantti (GAK-kd

– /-) MEF. B, vaikutusten Tyr-fosfataasin estäjä (50 mM Na-

3Vo

4) ja Ser /Thr-fosfataasi-inhibiittorit (50 mM NaF ja 50 mM β-glyserofosfaatti, tai 2,5 uM okadahappoa) inhibitioon EGFR fosforylaatiota λ-fosfataasin (λPPase; 200 U). A, B, nuolet osoittavat fosforyloidun EGFR-proteiinin. Alfa-tubuliinin (α-kylpyamme) käytettiin latauskontrollina. (C, D) Western blot analyysi ekspressiotasoja EGFR ja ERK1 /2 WT (+ /+) ja EAK-kd (- /-) MEF seuraavat EGF stimulaatio osoitetut ajat. Sykloheksimidi (50 ug /ml) lisättiin elatusaineeseen 1 h ennen EGF: n (10 ug /ml) estää uuden proteiinin synteesiä. Kallellaan ja vaaka nuolet osoittavat fosforyloidun ja hyper-fosforyloitiin EGFR bändejä, tässä järjestyksessä. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. C nuolenpää osoittaa ero ilmaus fosforyloidun ERK1 /2 WT ja GAK-kd MEF. D, NT, ei-käsitelty. E, immunovärjäys EGFR-proteiinin WT (+ /+) ja mutantti (- /-), MEF-käsitelty tai ilman proteasomin inhibiittoria MG132 (50 ug /ml). Merkittäviä paneelit ympäröivät turkoosi ja vihreä linjat. F, numerot EGFR-positiivisten solujen WT ja EAK-kd (Homo-solujen) läsnä ollessa tai ilman MG132. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM n = 3 itsenäistä koetta kullakin ajanhetkellä.

immunovärjäys osoitti, että tasot EGFR sytoplasmassa EAK-kd MEF olivat pienempiä kuin ne, jotka ovat solulima WT MEF, mikä viittaa epänormaali sisäistäminen EGFR tyrmäys soluissa (sarake 2 paneelit kuvion. 3E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun koe toistettiin läsnä ollessa proteasomin inhibiittoria MG132, mikä viittaa siihen, että poikkeavuus ei johtunut hajoamista EGFR proteiinien (sarake 4 paneelit kuvion. 3E). Lisäksi määrä EGFR-positiivisten solujen oli pienempi EAK-kd MEF kuin WT MEF, ja tämä fenotyyppi oli myös riippumaton proteasomin esto (Fig. 3F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että konstitutiivinen-hyperfosforylaatiota EGFR aiheuttama puute GAK aktiivisuus haittaa asianmukaisen reseptorin paikallistaminen, mikä vähentää aktivointi EGFR-välitteisen kasvun signalointiin. Edellä kuvatut tulokset ovat yhdenmukaisia ​​hiljattain raportin, joka MEF peräisin GAK ehdollisesta hiirten ja GAK pudotus solut valmistettiin käyttäen pientä hiusneula-RNA: t näyttää muuttuneen solunsisäisen EGFR kaupan, niiden kasvu pysähtyy, ja ovat vähentäneet pERK1 /2 signalointi [11]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että puute GAK aktiivisuuden häiritsee aktivointiin EGFR-välitteisen signalointireitteihin.

Luteolin ja gefitinibin estävät kinaasiaktiivisuuden GAK

Gefitinibi estää GAK, EGFR, ja reseptori-vuorovaikutuksessa seriini /treoniini-kinaasi

in vitro

[14]. Sen määrittämiseksi, onko gefitinibi estää GAK aktiivisuutta suoraan, joka on

in vitro

kinaasimääritys suoritettiin käyttäen PP2A B’γ, tunnettu tavoite GAK, substraattina [22]. Gefitinibin esti GAK ​​autofosforylaation ja EAK-välitteisen fosforylaation PP2A B’γ annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että gefitinibi estää GAK kinaasiaktiivisuutta suoraan (Fig. 4A). Vaikutukset muiden estäjät, kuten tunnettu EGFR estäjä erlotinibi [24] ja p38a ja GAK estäjä SB203580 [25], on GAK aktiivisuus tutkittiin. Molemmat yhdisteet estivät GAK aktiivisuutta samalla tavalla, vaikka ne olivat hieman vähemmän voimakas kuin gefitinibin (Fig. 4A).

In vitro

kinaasimääritykset määritellään myös vaikutusten luteolin (flavonoidi) ja resveratrolin (a polyfenolien) on GAK toimintaa; nämä yhdisteet inhiboivat eturauhassyövän solulinjoissa [20], [26]. Erityisesti 10gM luteolin esti GAK ​​toimintaa rajusti, kun taas sama pitoisuus resveratrol oli vain estää heikosti (Fig. 4B). Lisäksi analyysi osoitti, että 2 JlM luteolin vaadittiin estämään GAK aktiivisuutta (Fig. 4C). Nämä tulokset osoittavat, että lisäksi gefitinibin, luteolin ja erlotinibi ovat uusia estäjiä GAK.

A-C, edustava SDS-proteiinien altistetaan

in vitro

kinaasimäärityk- käyttäen

32P-γATP, GAK (-100 ug /ml), kuten entsyymin, PP2A B’γ (~ 10 ug /ml) substraattina, ja osoitetut pitoisuudet gefitinibi, erlotinibi ja SB203580 inhibiittoreina. Signaalit sisällytetty havaittiin autoradiografialla ja proteiinien määriä ladattu arvioitiin Coomassie Brilliant Blue (CBB) värjäys. Kaaviot esittävät intensiteetti suhde fosforyloitu PP2A B’γ ja GAK suhteessa, että ei-käsiteltyjen näytteiden. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM n = 3 itsenäistä koetta kussakin pitoisuudessa.

Co-gefitinibin ja luteoliini aiheuttaa kuoleman PC-3-solujen

Seuraavaksi tutkimme vaikutus yhdessä gefitinibin ja luteoliini kasvuun PC-3 syöpäsolujen. Ensin käytetään genomisen DNA: n sekvensointi tutkia läsnäolon mutaatioita EGFR-geenin PC-3-soluja, jotka on raportoitu aikaisemmin olevan tunsivat usein keuhkosyöpä soluihin [27]. Kuten on esitetty kuviossa. S3, löysimme ei mutaatioita tällaisissa kohdissa genomissa PC-3, joka viittaa siihen, että vähäisiä määriä gefitinibin (~ 1 uM) ei voi olla tehokas PC-3-solut. Itse asiassa suurempaa gefitinibin (60 uM) vaadittiin pysäyttää kasvun PC-3-solut. Mielenkiintoista on, että kun määrä lisääntyvät solut laskettiin sen jälkeen, kun solut on altistettu 60 uM luteoliini, 60 uM gefitinibi, tai yhdistelmä näistä lääkkeistä 24, 48 tai 72 h, löysimme kumulatiivinen estävä vaikutus gefitinibin ja luteoliini on solujen kasvua (Fig. 5A). Kontrollisoluja käsiteltiin dimetyylisulfoksidin (DMSO) yksinään.