Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli ymmärtää roolia myeloidisolun klusterien uninvolved imusolmukkeisiin alkuvaiheen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita.

Methods

sivullisten alueellisen imusolmuke osastoja 67 potilaalla vaiheen I-III resekoitu non -Pieni keuhkosyöpä immunovärjättiin havaitsemiseksi myelooisen klustereita, STST3 aktiivisuus ja okkultismin etäpesäke. Antra- intensiteetti, myeloidinen klusterin tunkeutuminen liittyy antra- ja pSTAT3 tasolla pisteytettiin ja korreloivat potilaan selviytymistä. Coxin monimuuttuja regressioanalyysi suoritettiin ennustetekijöiden muuttujia. Ihmisen makrofagien käytettiin

in vitro

nikotiinikorvaushoitoon.

Tulokset

CD68

+ myelooinen klustereiden liittyy antra- ja muun immunosuppressiivisen ja etäpesäkkeiden edistävää fenotyyppi ja kohonnut yleinen STAT3 aktiivisuutta havaittiin uninvolved imusolmukkeisiin. Potilailla, joilla on tupakoinnin historia, myeloidinen cluster pisteet korreloi merkitsevästi antra- intensiteetin ja pSTAT3 taso (P 0,01). Nikotiini aktivoitu STST3 makrofageissa in pitkäaikaiseen viljelyyn. CD68

+ myelooinen klustereita korreloi ja colocalized ja piileviä etäpesäkkeitä. Myeloidinen klusteri tilanne oli itsenäinen ennustetekijä (P = 0,049) ja liittyi eloonjäämisen Kaplan-Maier arvio potilailla, joilla on ollut tupakointi (P ​​= 0,055). Yhdistelmä myelooinen klusterin pisteet joko imusolmuke vaiheessa tai pSTAT3 taso määritellään kahden populaation, jolla on merkittävä ero eloonjäämisen (P = 0,024 ja P = 0,004, vastaavasti).

Johtopäätökset

Myelooisen klustereita helpottaa pro-metastaattinen mikroympäristön uninvolved paikallisiin imusolmukkeisiin ja liittävät okkulttisten etäpesäke alkuvaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Myeloidinen klusteri pisteet on itsenäinen ennustetekijä hengissä potilaalla on aiemmin tupakoinnin, ja voi esittää uutta menetelmää ilmoittamaan hoidon valintoja liitännäishoitona. Edelleen validointitutkimuksissa perusteltua.

Citation: Zhang W, Pal SK, Liu X, Yang C, Allahabadi S, Bhanji S, et al. (2013) Myelooisen klusterit ovat yhteydessä Pro-Metastaattinen ympäristö- ja huonon ennusteen tupakointiin liittyvät Early Stage ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (5): e65121. doi: 10,1371 /journal.pone.0065121

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 24, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus raportoitu tämän julkaisun tukivat National Cancer Institute of National Institutes of Health alle apurahan numero P30CA033572. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. [1] huolimatta alennettua tupakoinnin hinnat, tupakansavu on edelleen tärkein riskitekijä liittyy keuhkosyöpään. [2] tupakansavu sisältää tuhansia kemikaalien, noin 70, jotka ovat tunnettuja karsinogeenejä. [3] antra-, joka on laskeuman musta pöly asia, on todettu keuhkoissa ja imusolmukkeiden (LNS) niistä, joilla on ollut tupakoinnin. [4] Altistuminen tupakansavu aiheuttaa mutageneesi johtaa kuitenkin keuhkosyövän ja jatkoi tupakointi aiheuttaa lisääntynyt kuolleisuus ja uusiutumisen alkuvaiheessa tauti. [5] Vaikka hoidot ovat saatavilla hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), kehittyy useimmille potilaille toistumisen koska sen erittäin invasiivinen ja metastaattinen kapasiteetti. Uudet strategiat tarvitaan varhaiseen ennustamiseen mikrometastaattisessa taudin ja invasiivisia kapasiteetti NSCLC.

kuluessa kasvaimen mikroympäristössä, immuunijärjestelmän solut tuottavat immunosuppressiivisia tekijöitä, kuten interleukiini (IL) -6, IL-10, transformoiva kasvutekijä -β ja endoteelikasvutekijä (VEGF), jolloin tehoton anti-kasvain immuunivasteen ja edistäminen kasvaimen kasvua, angiogeneesiä ja invaasio. [6], [7], [8], [9], [10] microenvironment maligniteetteja mukaan lukien NSCLC muuntaa myelooinen soluja, jotka ovat välttämättömiä sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin, osaksi immunosuppressiivisia soluihin, jotka helpottavat immuunijärjestelmän kiertäminen. [6], [11], [12], [13] konstitutiivisen aktivaation signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 3 (STST3) ydinsoluissa on ratkaisevan tärkeää kehityksen immunosuppression primaarikasvainten ja niiden mikroympäristön. [7], [9], [14]

merkitys myeloidisolujen on kuvattu ilmastointi pre- metastaattinen kudosta tulevaisuuden kylvö metastaattisen syöpäsoluja. [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] joissakin kasvainmuodoista sisääntunkeutuva ydinsoluissa valmiiksi metastasoitunut kudoksen muodossa klustereita, jotka ovat niin sanottuja ”pre-metastaattinen markkinaraon.” [16], [19], [20] tuoreessa raportissa, sfingosiinin-1-fosfaatti-reseptori 1 (S1PR1 ) -STAT3 signalointi akselin ydinsoluissa osoitettiin olevan kriittinen myeloidisolun kolonisaation ennalta metastaasien, edistää etäpesäke. [24] korrelaatio soluttautuminen myeloidisolun klustereita ennalta metastaasien ja potilaan ennustetta ei ole aikaisemmin kuvattu . Oletimme, että soluttautuminen myeloidisoluissa ja kohonnut STAT3 toimintaa ennalta metastasoitunut kudosta NSCLC potilaat voivat ennustaa hoitotuloksia seuraavien poistettu kirurgisella. Alueelliset LNS yleisesti miehitti NSCLC-solujen prosessissa etäpesäke. Tutkimme uninvolved alueellisen LNS potilaista, joilla kokoisen NSCLC määrittää yhdistyksen välillä myeloidisolun klustereiden aktivointi STAT3 ja potilaan ennustetta.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

potilas näytteet kerättiin mukaisesti City of Hope Institutional Review board (IRB # 10062) ja potilaan kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin. Sivullisten imusolmukekudoksesta kerättiin 67 potilaalla patologisesti varmistettu diagnoosi NSCLC, joille tehtiin joko välikarsinan imusolmuke näytteenotto- tai täydellinen imusolmukkeiden poiston ja todettiin patologisesti määrätietoisesti N0 sairaus, tai N1-N3 tauti. Potilailla oli vähintään 1 imusolmuke luonnehdittu välinpitämättömästi kasvain, jossa saatavilla parafinoidut kudosta. Yksi uninvolved imusolmukekudoksesta korttelin päässä kustakin pätevä potilaan saatiin ja neljän um: n leikkeitä valmistettiin myöhempää analyysejä. Staging määritettiin American sekakomitean Cancer suuntaviivojen 7

painos. [25] Potilaiden demografiset ja kliiniset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Normaali LN kohdat 4 yksilöille syövän ostettiin Abcam, IMGENEX ja GeneTex, ja kaikki olivat eettisesti saatiin ja tutkittiin ja diagnosoida lisensoitu patologia.

immunohistokemia (IHC) B

Leikkeitä inkuboitiin vasta-aineilla CD68 (ABD Serotec, klooni 514H12, 01:50) , pY705-STAT3 (Cell Signaling, klooni D3A7, 1:50), CD33 (Leica, klooni PWS44, 1:200), CD163 (ABD Serotec, klooni EDHu-1, 1:200), IL-6 (Abcam, 1 :400), IL-10 (ABD Serotec, klooni JES3-12G8, 1:100), VEGF-A (Abcam, klooni VG-1, 1:200), matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9, Cell Signaling, 1: 100), stroomasolulinja eristetyn hyytymistekijä 1 /kemokiinin (CXC-motiivin) ligandin 12 (SDF-1 /CXCL12, R 2, Hiilipigmentti ilmestynyt kiinteä mutta hajallaan (ei klusteroitu); 3, klustereita enemmän kuin noin 50-solujen kanssa, kiinteän hiilen pigmenttiä ei havaittu. Kuvat ovat on esitetty kuvassa. 1. myelooisesta klusterin tunkeutumisen arviointi, IHC diat värjättiin CD68 tutkittiin 40x suurennus koko osiot ja pisteytettiin kokonaisluku asteikolla 1-3 seuraavasti: 1, myeloidinen klusterin alue oli pienempi kuin 5% koko kudoksen alueelle ; 2, myeloidinen cluster alue oli välillä 5% ja 50% koko LN kudoksen alueella; 3, myeloidinen cluster-ala oli suurempi kuin 50% koko LN kudoksen pinta-ala (Fig. 1). Kaiken pSTAT3 taso pisteytettiin prosenttiosuutena pSTAT3

+ solujen 10 satunnaisessa kentiltä 100x suurennus (Fig. 1). STAT3 aktiivisuutta valkosoluissa liittyy antra- pisteytettiin kokonaisluku asteikolla 1 3 10 satunnaisessa kentiltä 200x suurennus: 1, alle 5% anthracotic solut olivat pSTAT3

+; 2, 5% -50% oli pSTAT3

+; 3, yli 50% oli pSTAT3

+ (Fig. 1). Mikäli erimielisyyttä antra- intensiteetti, myelooinen klusteri soluttautuminen ja myeloidisolun pSTAT3 tasolla, leikkeet uudelleen arvioinut kaksi tarkkailijaa yhteen ja lopullinen päätös tehtiin. Jos asiasta ei päästä yleiseen pSTAT3 tasolla, keskiarvo laskettiin lopputulos.

HE värjäystä ja IHC värjäyksen CD68 tai pSTAT3 osoittavat edustaja kuvia pisteytystä antra- intensiteetti, anthracotic myeloidinen cluster tunkeutuminen, yleinen STAT3 aktiivisuus ja anthracotic myeloidisolun STST3 aktiivisuutta. Numero on vasemmassa yläkulmassa jokaisen kuvassa pisteet. (Scale bar, 200 nm)

ennustetekijöiden arviointi, potilasta kaksijakoinen matalan ja korkean ryhmät kullekin merkki: antra- intensiteetti: 1 tai 2 = pieni, 3 = korkea; myeloidinen klusterin tunkeutuminen liittyy antra-: 1 tai 2 = pieni; 3 = korkea; Kaiken STAT3 aktiivisuus: pienempi tai yhtä suuri kuin 50% = heikko, yli 50% = korkea; STAT3 aktiivisuutta valkosoluissa liittyvät antra-: 1 = heikko, 2 tai 3 = korkea.

diat värjätty yleiseurooppalaisen CK käyttäen IHC arvioitiin piilevän etäpesäkkeiden alle 100 x ja 200 x suurennus. Occult metastasoitunut NSCLC-solut ovat suhteellisen suuria kooltaan, korkea ydin–sytoplasman suhde, ja näyttää selkeä ja intensiivinen rengasmainen sytoplasmista tummanruskea 3,3′-Diaminobenzidine-värjäystä. [28]

Soluviljely

THP-1 saatiin American Type Culture Collection ja erilaistuneet makrofagien forboli 12-myristaatti 13-asetaattia stimulaatiota. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja terveistä luovuttajista eristettiin Histopaque 1077 (Sigma). Monosyyttejä rikastettu EsaySep CD14

+ valinta kit (StemCell Technologies) ja eriytetty makrofageihin viljelemällä klo 10 ng /ml granulosyytti-makrofagi pesäkkeitä stimuloiva tekijä (PeproTech) 6 päivää ja lepo 1 päivä. Makrofagit hoidettiin nikotiinia (Sigma-Aldrich) kanssa tai ilman 1 uM AZD1480 (tarjoamia AstraZeneca), että ilmoitettuina ajankohtina.

Western blotting

Samanlaiset määrät solu- lysaatin proteiineja valmistettu RIPA puskuri tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja immunoblotattu vasta pY705-STAT3 (Cell Signaling), yhteensä STAT3 (Santa Cruz) ja β-aktiini (GE healthcare).

tilastollinen analyysi

määrälliset positiivista värjäytymistä alueilla IHC analysoitiin Studentin

t

-testi. Pairwise korrelaatiot joukossa laboratorio biomarkkereiden mittaus oli arvioinut spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin. Kaplan-Meier dikäyrät arvioimaan eroja eloonjäämiskäyrien ja P-arvot perustuvat log-rank-testi esitettiin. Mittaukset Kunkin biomarkkereiden sovitettiin kanssa univariate Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin. Tutkia lisää ennustuksen teho ylittää kliinisten muuttujien Coxin monimuuttuja regressioanalyysi suoritettiin myös mallin valintaan keskuudessa vaiheessa solmukohtien vaiheessa antra- intensiteetti, myelooinen klustereiden liittyy antra-, yleinen pSTAT3 tasolla myelooinen klusteri pSTAT3 tasolla ja okkultismin etäpesäke. Vaikutus pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun vastaava P-arvo 0,05 (*, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen R ohjelmistoa.

Tulokset

Myelooisen klusterit ovat näkyvä ja yleinen STAT3 toimintaa dramaattisesti koholla uninvolved NSCLC imusolmukkeisiin

Verrattuna normaaliin LNS yksilöiden ilman syövän, näkyvä hiili pigmenttikertymää eli antra-, havaittiin uninvolved LNS peräisin NSCLC potilaiden kuten kuvassa. 2A. Immunofluoresenssivärjäyksellä osoitti anthracotic solut olivat CD68

+ myeloidisoluissa (Fig. 2A). Verrattuna sivullisten alueellisen LNS eturauhassyöpään, melanooma tai rintasyöpä potilailla (dataa ei esitetty), kun läsnä on myeloidisolujen liittyy antra- oli ainutlaatuinen sivullisten NSCLC alueellisen LNS. IHC värjäys, huomasimme, että ydinsoluissa liittyy antra- yleensä muodostuu klustereita, jota ei havaittu normaalissa LNS (Fig. 2B). Kohonnut yleinen STST3 aktiivisuus uninvolved LNS peräisin NSCLC potilaiden havaittiin myös IHC värjäystä pY705-STAT3 (Fig. 2B).

(A) HE värjäys normaalien LNS yksilöistä ilman syöpä (n = 4; vasen kaksi paneelia) ja mitäänsanomattoman alueelliset LNS peräisin NSCLC potilaiden (keskellä kaksi paneelit) esittäen anthracotic Hiilipigmentti (nuolilla; Mittakaava, 20 pm) potilaan LNS. Immunofluoresenssivärjäyksellä for CD68 (oikea paneeli) osoittaa, anthracotic pigmentti kuuluu CD68

+ soluja (Huomaa mustat pisteet merkitty pienillä nuolilla CD68

+ solujen Mittakaava, 20 pm). (B) IHC värjäys osoittaa näkyvästi CD68

+ myelooinen klustereiden liittyy antra- ja erittäin aktivoitu STST3 in uninvolved NSCLC alueellisiin LNS (oikea paneeli) verrattuna normaaliin LNS (n = 4; vasen paneelit) (Mittakaava, 200 nm).

Positiiviset korrelaatiot antra- intensiteetti, myelooinen klusteri soluttautuminen ja pSTAT3 tasolla NSCLC potilaalla on aiemmin tupakoinnin

potilailla, joilla on ollut tupakointi, antra- intensiteetti, myelooinen klustereiden liittyvä antra-, yleinen STAT3 aktiivisuus ja anthracotic myeloidisolun STAT3 aktiivisuutta ei liity taudin etenemiseen (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin CD68

+ myelooinen klusterin tunkeutuminen korreloi positiivisesti antra- intensiteetti ja yleisen pSTAT3 aktiivisuutta (Fig. 3A). STAT3 aktivaatio anthracotic myelooisen klustereiden liittyy myös antra- intensiteetti (Fig. 3A). Sitä vastoin potilailla, joilla ei ollut tupakointi, antra- havaittiin mutta korrelaatioita STST3 ja antra- tai luuytimen klustereiden liittyy antra- ei löydetty (Fig. 3A). Näin fokusoimme tutkimuksen roolista myelooisen klustereiden ja STAT3 potilailla, joilla on tupakoinnin historiaa.

(A) Potilaille, joilla on tupakoinnin historia, mutta ei niille, joilla ei ollut tupakoinnin, myelooisen klusteri tunkeutuminen liittyy antra- korreloi antra- intensiteetti ja yleisen STAT3 toimintaa; antra- korreloi STST3 aktiivisuus myelooinen klustereiden liittyy antra-. Korrelaatio määritettiin nonparametric Spearmanin rank korrelaatio testi. Näkyy ovat keskiarvoja ± SEM, ** P 0,01, *** P 0,001. (B) Nikotiini aktivoi STST3 ihmisen makrofageissa. Western blotting osoittaa pSTAT3 ja yhteensä STST3 ilmentymistä ihmisen THP-1-johdettujen makrofagien ja ihmisen ensisijainen monosyyteistä peräisin makrofagien jälkeen nikotiinikorvaushoitoon tai ilman AZD1480.

Nikotiini aktivoi STST3 ihmisen makrofageissa

tupakoinnin on yksi tärkeimmistä syistä antra- sisällä keuhkokudoksessa. [4], [29] Koska korrelaatio antra- intensiteetti ja STAT3 aktiivisuutta havaittiin ainoastaan ​​NSCLC potilaalla on aiemmin tupakoinnin, arvioimme, onko riippuvuutta komponentti tupakansavu, nikotiini, aktivoi STST3 ihmisen makrofageissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, STAT3 aktiivisuus koholla molemmissa monosyyttisolulinjassa THP-1-johdettu makrofagien ja ensisijainen monosyyteistä peräisin makrofagien jälkeen nikotiinin hoidon 2 päivää, ja aktivointi kumosi kokonaan jonka Janus-kinaasi (JAK) estäjä, AZD1480, joka esittää aktivointi on kautta JAK-STAT3 reitin.

Pro-syövän ja pro-metastasoitunut fenotyyppi myelooisen klustereiden

tunnusomaista fenotyyppi CD68

+ myelooinen klustereiden liittyy antra- in uninvolved alueellisen LNS alkaen pienisoluista keuhkosyöpää tupakoinnin historiaa IHC (Fig. 4). Koska anthracotic pigmentti pysyy kudosta Immunovärjäyksen, se toimii soluliman merkkiaineena ydinsoluissa liittyy antra-. Ilmentymistä CD33 vahvisti nämä solut olivat myeloidisista linage (tuloksia ei ole esitetty). Tutkia, onko myelooista klustereita oli M2-polarisoitu, suoritimme CD163 värjäystä ja klusterien osoitti vahvaa värjäytymistä. Tutkimus myelooisen klusterin fenotyypin osoittivat IL-6 ja IL-10, jotka molemmat ovat immunosuppressiivisia tekijöitä. VEGF: n ilmentymistä-A: n ja MMP-9 osoitti rooli angiogeneesissä ja kudoksen remodeling. VEGF-A tunnetaan myös estävän dendriittisolujen kypsymistä. [30] aktivointi STAT3 up-regulation Bcl-xL: n ilmentyminen myeloidisoluissa, [24] ja myelooinen klustereita osoittivat positiivista värjäytymistä varten Bcl-xL. SDF-1 /CXCL12 on rooli rekrytoinnissa NSCLC kautta SDF-1 /CXCL12-CXC kemokiinireseptorin tyyppi 4 akselilla, [31], [32] ja IHC värjäys osoitti, että SDF-1 erittäin ilmaisseet myelooisesta klustereita. Kaikki nämä molekyylit ovat STAT3 alavirtaan säädeltyjen geenien. [7] Lisäksi, IL-6, IL-10: n ja VEGF-A on STAT3 aktivaattoreita. [7] Tilastollinen analyysi osoitti merkittävää eroa näiden molekyylien ilmentyminen välillä myelooinen klustereiden liittyy antra- ja muilla osa-alueilla LN.

IHC värjäys osoittaa ekspressiota CD163, IL-6, IL-10, VEGF-A: n, MMP-9, SDF-1: n ja Bcl-xL, että myeloidisoluissa liittyvän kanssa antra-. Kutakin proteiinia, edustavat kuvat osoittavat positiivisia ja negatiivisia värjäytyminen alueet valittiin samasta dia. Kvantifiointia suoritettiin analysoimalla satunnaisesti kuvia myelooisen klusterin liittyvillä alueilla antra- ja muilla alueilla (10 kuvaa kustakin ryhmästä) 10 potilaalla. Kaksisuuntainen Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastolliseen analyysiin. Näkyy ovat keskiarvoja ± SEM, *** P 0,001. (Scale bar, 200 um 100 x ja 400 x; 25 pm 1600 ×)

Myelooisen klustereita korreloivat ja colocalize kanssa LN okkulttisten etäpesäkkeitä

piilevän LN etäpesäke on yhdistetty huonon ennusteen suuren kohortin potilaista, joilla kokoisen NSCLC. [28] arvioimalla pan-CK, havaitsimme okkultismin etäpesäkekasvainten solujen LNS 8 potilasta 49 potilaan, joilla on tupakoinnin historia (Kuva. 5A) . Kiinnostavaa kyllä, suurin osa potilaista positiivisia piilevän LN etäpesäkkeiden (7 ulos 8) osoittivat lisääntynyttä myelooinen klustereiden liittyy antra- että sivullisten LNS (Kuva. 5A). Piilevän LN etäpesäkkeiden korreloi positiivisesti Myelooisessa klustereiden liittyy antra- (P = 0,012, r = 0,350) ja antra- intensiteetti (P ​​= 0,032, r = 0,310). Lisäksi okkultismin etäpesäkekasvainten soluja yleensä havaitaan tai hyvin lähellä klustereita myeloidisolujen liittyy antra- (6 out of 8, Fig. 5A (a-b)). Kaksoisvärjäys yleiseurooppalaiseen CK ja CD68 vahvisti rinnakkaispaikantumisen (Fig. 5B).

(A) IHC värjäys osoittaa okkulttisen etäpesäke ”sivullisten” LNS (kaksi parasta paneelit) ja etäpesäkekasvainten soluista mukana LN kuin positiivisen kontrollin (alempi vasen paneeli) (Mittakaava, 50 pm). Pylväsdiagrammi osoittaa korrelaatio myeloidinen klusterin tunkeutuminen liittyy antra- ja piilevän etäpesäkkeiden (OM). P-arvo määritettiin nonparametric Spearmanin rank korrelaatio testi. (B) konfokaali esittävät kuvat rinnakkaispaikantumisen yleiseurooppalaisen CK

+ NSCLC-solut (nuolet) ja CD68

+ myelooinen klustereiden liittyy antra-. (Scale bar, 50 pm) (C) konfokaali esittävät kuvat rinnakkaispaikantumisen myeloidien klustereiden liittyy antra- (nuolet) ja cFn. (Scale bar, 50 pm)

On osoitettu, että cFn ilmentymistä ennen metastaattisen kudos on koholla ja sillä on tärkeä rooli muodostumista ennalta metastaattisen myelooinen klustereita. [16] lisäksi STAT3 säätelee ilmentymistä cFn pre-metastaattinen myeloidisoluissa. [24] LN leikkeet oli värjätty cFn ja CD68 osoitti, että cFn on colocalized pieniä klustereita myeloidisolujen liittyy antra- (Fig. 5c), joka osoittaa mahdollista osuutta cFn rekrytoinnissa myeloidisoluissa ja klusterin muodostumista NSCLC alueellisiin uninvolved LNS.

myelooisen klustereita ja yleistä pSTAT3 taso ennustaa ennuste NSCLC potilaalla on aiemmin tupakoinnin

arvioinut ennusteen arvioinnissa of antra- intensiteetti, CD68

+ myelooinen klusterin tunkeutuminen liittyy antra- ja pSTAT3 tasolla. Vuonna univariate analyysissä anthracotic myelooinen klusteri pisteet osoittivat suuntaus kohti merkitys ennustaminen kokonaiselinaika (P = 0,061, Riskisuhde (HR) = 2,22, 95% CI [0.96, 5.13]). Kaplan-Meier selviytymisen arvio Log-rank testi osoitti myös lähes merkitsevä ero myelooinen klusterin liittyy antra- korkea ja -matala ryhmässä (P = 0,055; Kuva. 6A). Sekä mediaanielinajassa ja 5 vuoden pysyvyys on parantunut matalan myelooisen klusterin ryhmä (mediaanielinajassa: 116,1 kuukautta, 95% CI [86,0, NA] vs. 56,1 kuukautta, 95% CI [35,1 – NA]; 5 vuoden pysyvyys: 78,5%, 95% CI [63,3%, 97,3%] vs. 38,0%, 95% CI [20,8%, 69,3%]). Lisäksi yleinen pSTAT3 osoitti suuntaus kohti merkitys ennustaminen kokonaiselinaika (P = 0,093; Kuva. 6B).

Kaplan-Meier käyrät osoittavat potilaiden selviytymiseen ryhmitelty: (A) myelooinen klusteri tunkeutuminen liittyy kanssa antra-, (B) yleisen pSTAT3 tasolla (C) yhdistelmä solmukohtien vaiheessa ja myelooinen klustereiden liittyvät antra-, (D) yhdistelmä myelooisen klustereiden liittyy antra- ja yleisen pSTAT3 tasolla (n = 49).

monimuuttuja Coxin regressioanalyysi mallin valintaan ,, solmukohtien vaiheessa ja anthracotic myelooinen klusterin pisteet jäivät lopulliseen malliin (solmukohtien vaihe: P = 0,033, HR = 1,75, 95% CI [1.05, 2.94]; anthracotic myelooisesta klusterin pisteet: P = 0,049, HR = 2,34, 95% CI [1,00, 5,43]), joka osoittaa, että myelooinen klustereiden liittyvät antra- alueellisissa uninvolved LNS tarjota lisää ennustuksen virtaa potilaaseen kokonaiselossaoloaikaa saavuttaa tavanomaista kliinis muuttujia. Siksi yhdistimme solmukohtien vaiheessa ja myelooinen klustereiden liittyvät antra- parantaa yleistä selviytymistä ennusteen. Huolimatta rajallinen otoskoko, potilailla, joilla on negatiivinen LNS ja alhainen myelooinen klustereita oli merkittävästi parantunut eloonjääminen verrattuna niihin, joilla positiivinen LNS ja korkea myelooinen klustereita (P = 0,024; mediaanielinajassa: 113,0 kuukautta vs. 44,0 kuukautta; 5 vuoden pysyvyys: 83,1% vs. 15,0%; Fig. 6C). Yhdistelmä anthracotic myelooinen klusterin pisteet ja yleistä pSTAT3 tasolla myös määritelty kaksi populaatioissa potilaalla on merkittävästi erilainen prognoosi (P = 0,0041, Fig. 6D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että myelooinen klustereiden liittyvät antra- in uninvolved LNS ovat riippumattomia ennustajia huonon ennusteen tupakointi pienisoluista keuhkosyöpää.

Keskustelu

kehittäminen etäpesäkkeitä kirurgisen resektion NSCLC edellyttää monitahoisia vuorovaikutuksia helpotettu kasvain ja strooman solujen microenvironment on metastaattinen sivustolla, mukaan lukien immuunisolujen. Soluttautuminen CD68

+ myeloidisolun klustereiden liittyy antra- oli näkyvästi hyvänlaatuista LN peräisin NSCLC potilaiden ja aktivointi STAT3 nostettiin, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien useita syöpäsairauksia. [14], [24] Pre-metastasoitunut kapealla muodostuminen on ollut johtuvan erilaisia ​​välittäjäaineita, mukaan lukien VEGF, MMP-9, STAT3 ja SDF-1 /CXCL12. [16], [20], [21], [24] fenotyyppinen rajaaminen myelooisen klustereiden nähdään sivullisten LN osoittivat IL -6, IL-10: n ja VEGF-A: n estäjät tuumorin vastaisen immuniteetin, VEGF-A: n ja MMP-9, kuten pro-angiogeenisten tekijöiden ja SDF-1: n kemoattraktantti verenkierrossa NSCLC-soluja. Runsas myelooinen klustereiden liittyy antra- in uninvolved LNS voi edistää immunosuppressiiviseen ympäristöön ja pelata pro-syövän ja pro-metastasoitunut rooli. Expression Antiapoptoottisten geeni Bcl-x L on sopusoinnussa myös aiemman raportin ennalta metastaattinen myelooisesta klustereita. [24]

kasvain microenvironment, STST3 sovittelee monisuuntainen ylikuulumisen välillä kasvaimeen liittyviä myeloidisoluissa ja muut strooman solut, mukaan lukien endoteelisolut. [10] Siten, sen lisäksi, että vaikutusta kasvaimeen eritetyn tekijät ja tupakointi, korkeus STAT3 aktiivisuutta pre-metastasoitunut LNS voi myös edistää kasvaimen etäpesäke ja etenemisen läpi tunkeutumisen myeloidisolujen. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että esto STAT3, joka on konstitutiivisesti aktivoitu valmiiksi metastasoitunut lokeroita, voi vähentää myeloidisolun tunkeutuminen tulevaisuudessa metastaasien. [24], [33] STST3 heikentää myös kasvaimenvastaista immuniteetti helpottaa karsinogeeni aiheuttaman keuhkotulehduksen kasvaimen muodostumisen. [ ,,,0],34] Tuloksemme osoittavat, että nikotiini kykeni aktivoimaan STST3 ihmisen makrofageissa myöhempien kumottua JAK /STAT esto, mikä viittaa siihen, että muodostuminen ennalta metastaasien ja etäpesäkkeitä potilailla, joilla tupakointiin liittyvät NSCLC voivat olla herkkiä STST3 saarto.

Detection piilevän etäpesäkkeitä potilailla, joilla resektoidun NSCLC tarjoaa lisää ennustetekijöiden kriteerit, joita voidaan käyttää määritettäessä adjuvanttihoito. [28] Kun arvioimme okkultismin etäpesäke hyvänlaatuinen LNS, useimmat havaittiin niillä, joilla korkea myelooisen klustereiden liittyvä antra- ja okkultismin etäpesäkekasvainten solujen colocalized näissä klustereissa. Rekrytointi näistä myelooinen klustereiden ja myöhemmät okkultismin etäpesäke voi johtua cFn, joka oli läsnä myös sivullisten LN paikalla klusterien.

Koska myeloidisolun STST3 toiminta ei vaikuta ainoastaan ​​immuuni asetus yhteydessä kasvain [14], mutta on myös tärkeä rooli ennen metastaattisen kudosta, [24] muodostumista myelooisen klustereiden ja aktivointi STAT3 voi vaikuttaa potilaan ennustetta. Potilailla, joilla ei imusolmuke osallistumista, joilla on alhainen myelooinen klustereiden liittyy antra- osoitti parantunut selviytymistä. Yhdistelmä Antrasiitti myelooinen klusterin pisteet ja pSTAT3 tasolla määriteltävä tarkemmin ennusteen jälkeen kasvain ja LN vaihe potilailla, joilla kokoisen NSCLC.

Vaikka tulokset ovat lupaavia, nykyinen tutkimus on useita rajoituksia. Ensinnäkin päätelmät rajoittavat potilaiden lukumäärä on pieni, jotka muodostavat meidän kohortin. Jatkotutkimuksissa suurempia potilasmääristä tehdään vahvistaa päätelmiä. Toiseksi, meidän edellinen julkaisu osoitti STST3 aktivaatio myelooisissa klustereita on ratkaisevaa niiden kolonisaatio ennalta metastaasien helpottamiseksi etäpesäkkeiden hiirimalleissa. [24] Samoin nykyinen tutkimus osoittaa, että myelooinen klusteri tunkeutuminen uninvolved LNS NSCLC potilaiden korreloi okkultismin etäpesäke ja ennustetta. On kuitenkin tärkeää huomata, että korrelaatio ei ole sama kuin syy. Myelooisesta klusteri kerääntyminen NSCLC ennalta metastasoitunut LNS voi ilmetä sekundaarisena tapahtuman aikana metastasointiin. Siten suoria todisteita olisi tarpeen osoittaa, että CD68

+ myelooinen klusterit ovat vastuussa pohjustusta NSCLC solmukohtien etäpesäkkeitä.

Edellä mainituista rajoituksista huolimatta meidän tutkimus antaa näyttöä siitä, että STST3 ja myelooinen tunkeutuminen liittävät varhain etäpesäkkeitä ja voi olla tärkeä tupakoinnin aiheuttamien keuhkosyövässä. Korrelaatio myeloidia klustereiden liittyy antra- ja pSTAT3 potilaan selviytymisen tarjoaa lisätietoja harkittaessa tulevia hoito. Esto polkuja, jotka stimuloivat ennalta metastasoitunut kapealla muodostuminen voi osoittautua tehokkaammaksi kuin tavanomaisen kemoterapian. Investigation suuremmissa kohortteja validointiin ja mahdollisille kokeet määritellään tarkemmin roolia myelooisen klustereiden ja STST3 alkuvaiheen NSCLC. Lisäksi tarkastelu tuoreesta kudoksesta ja eristäminen elinkelpoisten myelooisen klustereiden antaa oivalluksia solun mekanismeista.

Kiitokset

Haluamme kiittää Brian Armstrong, Ph.D. Valon Microscopy Imaging Core, Rebecca Nelson, Ph.D. Department of Information Sciences ja henkilökunnan jäsentä patologian Core City of Hope Kattava Cancer Center, heidän avustaan ​​tutkimuksessa.