Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer kantasolut (CSC) eristettiin kautta tarttumaton neuropallo määritys kolmesta glioomasolulinjoja : LI, U87, ja U373. Käyttämällä klonaalinen määritystä, kaksi kloonia (D2 ja F11) valittiin pallojen johdettu LI soluista ja karakterisoitiin varten: ilmaus kantasolujen merkkiaineita (CD133, nestiinifenotyypin, Musashi-1 ja Sox2); leviämisen; erotuskyvyn (määräytyy ilmaus GalC, βIII-Tubulin ja GFAP); Ca

2 + signalointi ja tuumorigeenisyystesti nude-hiirissä. Sekä D2 ja F11 kloonit ilmaistaan ​​korkeampi kantasolu merkkiaineiden suhteen emosolulinjassa. Kloonit kasvoivat hitaammin kuin LI solujen kaksinkertainen kasvu päällekkäisyyksiä ajan. Merkkiaineiden eriyttäminen (βIII-Tubulin ja GFAP) ilmaistiin korkeilla tasoilla sekä LI-soluissa ja neuropalloja. Ilmentyminen nestiinifenotyypin, Sox2, ja βIII-tubuliinia säädellä vähentävästi D2 ja F11, kun viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa, kun taas Musashi-1 lisättiin. Tässä tilassa päällekkäisyyttä aika D2 ja F11 lisääntynyt pääsemättä että LI soluja. D2, F11 ja vanhempien solut eivät ilmaisseet jännitteestä riippuva Ca

2 + -kanavien mutta ilmeni kohonneita solunsisäisiä Ca

2+ tasoa vastauksena ATP. Nämä Ca

2+ signaalit olivat suurempia LI-soluissa ja aloilla viljeltiin seerumia sisältävässä väliaineessa, kun he olivat pienempiä seerumia. ATP hoito ei vaikuttanut solujen lisääntymistä. Sekä D2 ja F11 indusoi kasvainten kun ortotopically injektoidaan kateenkorvattomiin nude-hiiriin tiheydellä 50 kertaa pienempi kuin LI-soluja. Kaikki nämä tiedot osoittavat, että sekä kloonien ominaisuudet CSC ja samaa stemness ominaisuudet. Havainnot koskevat ilmaus Differentiaatiomarkkerien ja Ca

2 + -kanavien osoittavat, että molemmat kloonit eivät pääse terminaaliin erilaistumista. Sekä D2 ja F11 voisi edustaa hyvä malli parantaa tietämystä CSC glioblastoma ja tunnistaa uusia hoitomenetelmiä.

Citation: Iacopino F, Angelucci C, Piacentini R, Biamonte F, Mangiola A, Maira G, et ai. (2014) eristäminen Cancer Kantasolut Three Human glioblastoomasolulinjoissa: karakterisointi Kaksi Valituissa klooneissa. PLoS ONE 9 (8): e105166. doi: 10,1371 /journal.pone.0105166

Editor: Giovanni Camussi, University of Torino, Italia

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2014; Julkaistu: 14 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Iacopino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on saanut Ranskan hallituksen tuki myönnetään CominLabs huippuosaamista laboratorio ja hallinnoi National Research Agency in ”Sijoittaminen tulevaisuuden” ohjelma viitteellä ANR-10-LABX-07-01. Se tuki myös Rennesin yliopistollisen sairaalan (COREC Project nimeltään Connexion, 2012-14). Kiitämme myös Euroopan tutkimusneuvoston ERC-2011-ADG – Avustussopimus nro 290901 – Lyhenne ”NEUCOD”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on yhä enemmän todisteita siitä, että kasvaimet hierarkkisesti järjestävät heterogeenisia sisältäen pienen osan syövän kantasoluja (CSC). CSC on monia yhtäläisyyksiä normaaleja kantasoluja, kuten itseuudistuvien kapasiteetin ja multilineage eriyttäminen ominaisuudet [1]. Lisäksi CSC ovat erittäin tuumorigeenisiä ja voi tuottaa phenocopies ensisijainen ihmisen maligniteetti immuunipuutteisilla hiirillä [1]. Eräästä kliinisestä näkökulmasta, CSC vastaavat kasvain huoltoa, sustentation, toistuminen ja kestävyys perinteisiin hoitoihin [2] – [4].

CSC osa on eristetty monissa syövissä, kuten gliooma [2 ] – [5], käyttäen erilaisia ​​lähestymistapoja, [5] – [9]. Useimmat gliooma CSC on peräisin kliinisistä Tuumorinäytteet [7], [10], [17], kun vain muutama on saatu pysyviä solulinjoja: Rat C6-solut ja ihmisen pahanlaatuisen glioomasolulinjoja (U373, A172, U87 ja SU3 ) on käytetty [9], [17] – [23], [24]. Jotkut Tekijät eivät suosittele solulinjoissa lähteenä CSC, koska ne kasvavat seerumia sisältävässä väliaineessa, joka aiheuttaa soluja, jotka eroavat geneettisesti ja biologisesti kuin ensisijaisen kasvaimia, josta ne on johdettu [25]. Kuitenkin, syöpäsolulinjoissa on joitakin etuja suhteessa kasvainkudoksen. Itse asiassa ne eivät aiheuta kontaminoivat normaali kantasoluja, voidaan pitää homogeeninen näyte, ja se on helppo saada suuria määriä ne [21]. Siksi tunnistamiseen ja CSC vakiintuneista solulinjoista voidaan tarjota tärkeitä työkaluja tutkitaan biologiaa CSC [26]. Mikään yksittäinen markkeri on osoitettu olevan riittävä antamaan kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, mikä yhdistelmä erilaisia ​​markkereita käytetään tunnistamaan ja eristämään CSC gliooman, kuten nestiinifenotyypin, Sox2 (SRY liittyvät HMG-box geeni 2) ja Musashi -1 (Msi-1). Nämä molekyylit ilmentyvät korkeilla tasoilla hermo kantasoluja ja usein pidetään tuntomerkki erilaistumattoman valtion [27] – [30].

Kun altistuu sikiön seerumia, CSC erottaa alas sukujuuret vanhempien kasvain [6], [9], [12], [16] – [23]. Siksi CSC johdettu gliooma valikoivasti erilaistuvat astrosyytit, mutta multilineage eriyttäminen voidaan toisinaan havaittu hermosolujen suvusta, ja jotkut epänormaaleja soluja sekavin fenotyyppejä. On syytä huomata, että nämä suvusta on tunnusomaista perusteella molekyylimarkkereiden, kuten astrosyyttien markkerin GFAP, The oligodendrocytic markkeri GalC, ja hermosolujen markkeri (βIII-Tubulin) [7], [9], [16] – [ ,,,0],23], [25], eikä toiminnallisia parametreja. Esimerkiksi ratkaiseva testi tunnistaa hermosolun tulisi arvioida sen kyky tuottaa aktiopotentiaaleista [31], [32], mutta tämä testi ei yleensä tehdä. Lisäksi tärkeä rooli Ca

2+ signaalien kehittämiseen glioblastooma (GBM) on äskettäin arvioitu [33].

Mielenkiintoisia tuloksia on saatu käyttämällä CSC peräisin vakiintuneet solulinjat koskien invasiivisia ominaisuuksia, chemoresistance, huumeiden seulonta, apoptoosin, leviämisen, immuunivasteet, ja geenin ilmentyminen [34] – [39].

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että U87, U373 ja LI solulinjat sisältävät murto-osa soluja, jotka voivat muodostaa kasvaimen aloilla, kun viljeltiin seerumivapaassa hermo kantasolujen väliaineessa. Solut kasvain aloilla on kyky itseuudistumisen ja toissijainen aloilla muodostumista.

On tunnettua, että GBM on histologista vaihtelevuus ja heterogeenisuus [40], [41], joka johtaa eristäminen erillisten CSC alapopulaatioita joka ylläpitää primaarikasvaimen fenotyyppi ja genotyyppi, kuten äskettäin on kuvattu [19], [25]. Tuloksemme osoittavat selvästi, että kaikki ihmisen glioomasolulinjoja tutkimme sisältävät CSC. Lisäksi, kaksi kloonia, jotka on valittu LI-solulinjaa karakterisoitiin: ilmentymisen stemness markkereita, leviämisen, kyky erilaistua, läsnäolo jänniteherkkiin Ca

2+ kanavat ja ATP-riippuvainen Ca

2+ signaaleja, ja tuumorigeenisyystesti jälkeen potilaalle tehdä elinsiirron. Tietääksemme ei ole tietoa kirjallisuudessa noin läsnäolo CSC tässä LI solulinjassa. Nämä kaksi kloonia voivat edustaa malleja hyödyllisiä tulevien tutkimusten pahanlaatuisten gliooma, jonka tavoitteena on löytää uusia hoitomenetelmiä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Culture glioomasolulinjojen .

ihmisen solulinja U373 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA), astrosytooma aste III /glioblastooma, luovutti ystävällisesti professori Pierluigi Navarra, Institute of Pharmacology, katolinen yliopisto Sacred sydän, Rooma.

ihmisen solulinja U87 (ATCC, USA), astrosytooma aste III /glioblastooma, luovutti ystävällisesti Dr. Emilio Ciusani, National neurologiset Institute ”Carlo Besta”, Milano [42].

ihmisen LI solulinja, astrosytooma luokka IV, oli ystävällisesti lahjoitti professori Gabriella Zupi, Regina Elena instituutti, Rooma [43], [44].

kolme solulinjat (vanhempien solulinjat ) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa /Hamin F-12 (DMEM /F12) (Gibco, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Euroclone, Milano, Italia), antibiooteilla (penisilliini /streptomysiiniä 100 ky /ml /100 um /ml, Euroclone), 4-2-hydroksietyyli-1-piperatsinyyli-etaanisulfonihappo (10 mM, Euroclone), glutamiinia (2 mM, Euroclone) ja glukoosin (0,3% w /v, Sigma-Aldrich, St Louis , MO, USA), jäljempänä: vakio välineellä. Solut, jotka kasvavat yksikerroksisessa, jatkoviljeltiin yhtenäisiksi, ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä ilmassa: CO

2 (95%: 5%).

neuropallo (NS) kulttuuri

Kaikki yksikerroksista kasvava solulinjoissa, U373 (22-25

th passage), U87-MG (52-55

th passage) ja LI (93-95

th passage) ympättiin tiheydellä 100000 solua /ml, joka on määritelty seerumittomassa väliaineessa, DMEM /F12, jota on täydennetty antibiooteilla (penisilliini 100 IU /ml, streptomysiiniä 100 um /ml), HEPES (10 mM), glutamiinilla (2 mM), glukoosi (0,3% w /v), rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (rhEGF) (20 ng /ml, R anti-nestiinin (Chemicon, Tamecula, CA, USA); anti-Sox2 monoklonaalinen, (R anti-Musashi-1 (monoklonaalinen, R anti-galaktoserebrosidin (GalC, monoklonaalinen IgG3, Millipore Corp., Bedford, MA, USA); gliafilamenttiproteiinia Acid proteiini (GFAP, monoklonaalinen, IgG3, Millipore), anti-Hermosolujen Class IIIβ-Tubulin (monoklonaalinen IgG2a, TUJ1 Clone, Covance Research Group Inc.).

Virtaussytometria

arvioimiseksi CD133 ilmentymistä virtaussytometrialla, solut hajotettiin mekaanisesti, pestiin kahdesti liuoksessa, etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 2 mM fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisälsi 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA), ja inkuboitiin sitten anti- -CD133 /1 (AC133) -PE-vasta-aine (Miltenyi Biotec, Saksa) 01:20 30 min. 4 ° C: ssa pimeässä. Solut pestiin ja suspendoitiin PBS: ään analyysiä varten. Sitten ne analysoitiin virtaussytometrialla on PCA-96 System kone (Guava Technologies, Hayward, CA, USA).

Caco-2 cell line, jatkuva linja heterogeeninen ihmisen epiteelisolujen peräsuolen adenokarsinooma, oli käytettiin positiivisena kontrollina.

Immunosytokemia

Cryosectioning NS.

Koko NS kerättiin viljelypulloista, pestiin PBS: llä liika kasvatusliuosta, ja kiinteä 4%

paraformaldehydiä

(PFA) 10 minuuttia. huoneen lämpötilassa. NS asetettiin sitten PBS /20% sakkaroosia yön yli 4 ° C: ssa. Sitten ne on asennettu (MMA optinen leikkaus lämpötila) yhdistettä (Sakura, Tissue Tek, Torrance, CA), jota seurasi jäädytys -80 ° C: ssa. Viipaletta 10 um saatiin laitteella, säädetty ja asetettu dioja ( ”Super Frost Plus”, Menzel-Gläser, Braunschweig, Saksa).

Solut kasvavat yksikerroksisessa ympättiin ”Super Frost Plus” dioja ja kello erilainen kulttuuri ajat, ne fiksattiin 4% PFA: ssa 10 minuutin ajan. Pesun jälkeen PBS: llä, levyt pidettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käsiteltiin.

immunosytokemiallisessa analyysin jälkeen nesteytys PBS: llä, samaa menettelyä seurattiin kryoleikkeet ja peitinlasit. Osiot peitettiin blokkausliuoksella (Super Block, UCS Diagnostics, Roma, Italia) 8 min. tai 0,3% (v /v) Triton X-100, 1% (w /v) BSA: ta ja 10% (v /v) ”normaali aasi seerumin” in PBS: ssä 1 tunnin ajan. Sen jälkeen ne inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavat ensisijaiset vasta-aineita (laimennettuna estoliuoksessa): anti-nestiinin (1:200); anti-Sox2 (01:50); anti-msi-1 (1:200); anti-GalC (1:100); anti-GFAP (1:500); anti-βIII-Tubulin (1:200). Huuhtelun jälkeen suolaliuoksella puskurilla, viipaleita inkuboitiin HRP polymeerin konjugaattia (SuperPicture Polymer Detection Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA), ja pesuvaiheen jälkeen, 3,3′-diaminobentsidiiniä (Vector, Burlingame, CA, USA ) käytettiin kromogeenina. Tumat vastavärjättiin Harri hematoksyliinia. Negatiiviset kontrollit tehtiin jättämällä ensisijainen vasta-aine.

Western-blot-analyysi

Solut sekä yksikerrosviljelyissä ja NS jälkeen 0-45 päivää kulttuurin, kerättiin hajotuspuskuria (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% Triton X-100, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCI, pH 7,6), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma-Aldrich), ja 17,4 ug /ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (Sigma-Aldrich). Proteiini uutteet kvantifioitiin Bradfordin Protein Assay. Western-blot-analyysi, 50 ug kokonais-proteiinit eroteltiin denaturoivalla polyakryyliamidigeeleillä (SDS-PAGE): 10% (MSI-1, βIII-Tubulin) ja 8% (nestiinin) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF; Immobilon P , Millipore, USA) kalvo elektroblot. Membraanit blokattiin PBS-T: n (PBS-puskurilla suolaliuokseen, jossa oli 0,1% Tween-20), joka sisälsi 5% BSA: ta ja inkuboitiin sitten yön yli primaarisilla vasta-aineilla. Pesun jälkeen 3 x 5 min., Kalvoja testattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa sekundaarisen vasta-aineen (anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaattia, Sigma, 1:10,000). Ilmestys suoritettiin kemiluminesenssin.

Signaalit kvantitoitiin densitometrisellä skannaus (ChemiDoc dokumentaatiojärjestelmän /QuantityOne kvantitoimiseksi ohjelmistot; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

konfokaali Ca

2+ kuvantamisen

konfokaali Ca

2+ kuvantaminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Lyhyesti, solut maljattiin lasipeitinlevyille inkuboitiin 30 min. 37 ° C: Ca

2 + -sensitive fluoresoivaa väriainetta Fluo-4 AM: n (2,5 uM, Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) Tyroden liuokseen, joka sisälsi: 150 mM NaCl, 4 mM KCI, 2 mM MgCI

2, 10 mM glukoosi, 10 mM HEPES, ja 2 mM CaCl

2. PH säädettiin arvoon 7,4 NaOH: lla. Väriaine ladattu solut pestiin ja pidettiin peitinlaseilla 30 min. huoneenlämmössä (23-25 ​​° C) tuoreen Tyroden ratkaisu mahdollistaa täydellisen väriaine de esteröimällä. Peitinlasit siirrettiin sitten perfuusiobioreaktorissa kammioon saatetaan vaiheesta käännettyä mikroskooppia (DM IRE2, Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) kiinnitetty konfokaali laserskannaus (ASR-SP2, Leica). Fluo-4-ladattu solut olivat innoissaan kanssa 488-nm linjaa Ar /ArKr laser, ja päästöjen signaali kerättiin valomonis- sisällä ikkuna vaihtelee 500-535 nm. Solunsisäiset Ca

2+ transientit stimuloitiin joko solu altistuminen ATP (50 uM) tai kalvo Depolarisaatio (saatu altistamalla solut modifioitua Tyroden liuosta, joka sisälsi 100 mM KCI). Solunsisäiset Ca

2+ transienttien aiheuttama näiden ärsykkeiden hankittiin 0,5 Hz ja amplitudi mitattiin suhteessa AF /F-suhde, eli missä F

max edustaa fluoresenssi kirjattiin huipussaan Ca

2+ transientit laskettuna kaikista tallennetut toimenpide (kesto 60 t) kiinnostuksen kohteena olevan alueen jäljittää ympärille jokaisen solun elin; F

pre on keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti mitattiin edeltävässä ärsyke aikana (20 s); ja F

bgnd on taustafluoresenssi mitataan alueen alalla puuttuu väriaine-täynnä rakenteita. Alaryhmässä kokeita, joiden tarkoituksena on arvioida panosta extra-vs. solunsisäisessä Ca

2+ mitattuun solunsisäistä Ca

2+ transientit, kahden peräkkäisen ATP ärsykkeet suoritettiin solujen erilaistumiseen päivä 5. Ensimmäinen soveltaminen ATP suoritettiin normaalissa Tyroden ratkaisu. Kun 5-min. ATP hakemus toistettiin muokatussa Tyroden ratkaisu, jossa Ca

2+ poistettiin (so lähes Ca

2 + vapaata ratkaisu). Ennen testiä vaikutukset Ca

2+ poisto ATP aiheuttama Ca

2+ transientteja, vakautta Ca

2+ vastausten kahden peräkkäisen ATP ärsykkeet toistuu 5-min. väli arvioitiin: erot pienempiä kuin 5% ei löytynyt.

Proliferaatiomääritys

LI-solut ympättiin monikuoppalevyihin vakio keskipitkällä kun NS klooneja siirrostettiin NSCM (25000 solua kuoppaa kohti). Solujen määrä määritettiin päivinä 2, 4, 6, 8 ja 10 ymppäyksen jälkeen käyttäen automaattista solulaskijalla (NucleoCounter, ChemoMetec A /S, Allerød, Tanska). Elatusaine vaihdettiin joka 2. päivä.

kasvukäyrä kertyi jotta vaakakoordinaatti datum määritellään päivää ja pystysuuntainen ordinaatta nollapisteen määritellyn solutiheyksillä. Solun kaksinkertaistaa aikoina logaritminen kasvu laskettiin Hayflick kaavaa: (T = väestö kahdentumisaikoina; t = aikaansa jälkeen alakulttuuri, N

t = solujen määrä sovittuun aikaan; N

0 = solujen määrä alussa alakulttuurin).

joukko solujen kasvua kokeita tehtiin testata vaikutusta ATP soluproliferaatioon. Solut (LI, D2, F11, ja D2 ja F11 kerättiin sen jälkeen kun 1-päivän ja 5-vuorokautta erilaistumisen medium) ympättiin tiheydellä 50000 solua /kuoppa 1 ml: ssa viljelyalustaa 24-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin ATP pitoisuudet 0-100 ug /ml on 0, 1, 2, 3, 4, 5 ja 7 päivää. Solulaskennat suoritettiin sytometria. Kokeet suoritettiin kolminkertaisina.

In vivo

analyysi kasvaimien

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä.

Kaikki käytetyt eläimet kokeiltiin tiukasti mukaisesti Institutional Animal Care ja käyttö komitean ohjeiden voimassa katolisessa yliopistossa pyhän sydämen ja joka pyrittiin minimoimaan kärsimystä. Työ tehtiin alaisuudessa Animal eettinen komitea, ”A. Gemelli ”, School of Medicine, katolinen yliopisto Sacred Heart, Rooma, Italia (hyväksytyn hankkeen lupa: prot.pdc.CESA /A /42/2011).

Kateenkorvattomia karvattomia hiiriä (nu /nu; 6 -8viikko vanha; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) nukutettiin ip ketamiini ja ksylatsiinin ja stereotakti- istutettu joko erotettu D2, F11 soluja (10000 tai 1000 per hiiri) tai LI soluja (500000 tai 10000 per hiiri) 3 ui PBS oikeaan striatumissa. Kontrolliryhmä sai pelkkää vehikkeliä (PBS). Istutetuista hiiristä, 4 eläintä ryhmää kohti, punnittiin kerran viikossa, seurataan kahdesti viikossa ja tapettiin, kun he kehittivät neurologiset oireet (ataksia /inkoordinaatiota /huikea /epäsymmetrinen). Hiiret tapettiin murtamalla niska alle syvän anestesian. Aivoleikkeet tutkittiin tuumorien läsnäolon, kuten alla on kuvattu.

hematoksyliini-eosiinilla ja immunohistokemia värjäys aivojen osien

kasvain-solu-istutetaan hiirillä aivot kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja leikata mikrotomin osaksi koralli osiin. Hematoksyliini- eosiini-värjäys, aivojen leikkeet kiinnitettiin objektilaseille värjättiin Harri hematoksyliinillä 2 min. ensin, ja sitten vastavärjättiin alkoholi- eosiinilla. Luonnehtia aivokudoksen immunohistokemiallisesti, leikkeet värjättiin primaarisilla vasta-aineilla ihmisen-specific anti-nestiinin (1:200), anti-βIII-Tubulin (1:200), ja anti-GFAP (1:500), sen jälkeen, kun samaa menettelyä on kuvattu edellä.

tilastollinen analyysi

Kaikki arvot kuvioissa ja tekstin esitetty keskiarvoja ± SD. Kaikki merkittävät erot keskiarvot arvioitiin Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA. Kaksipuolinen p 0,05 hyväksyttiin merkittävä.

Tulokset

eristäminen CSC mukaan neuropallo (NS) muodostuminen määrityksessä

Tarkat viljelyolosuhteet NSCM, pallojen muistuttava tyypillinen NS muodostuu nopeasti päälle yksikerroksiset kaikissa solulinjoissa (kuvio 1A). Noin 3 päivää myöhemmin, U87 ja LI solulinjat kasvoivat täysin pallomaiseksi (10-20 solua) ilman kiinnittyneitä soluja (ensisijainen NS), kun taas jotkut tarttuneet solut jatkoivat tällä U87 solulinjassa. 1-2 viikon viljelyn, muodostumista kasvaimen aloilla havaittiin ja valokuvattiin käännettyä mikroskooppia. Pallot voidaan lisätä ja jatkuvasti viljeltiin vapaasti kelluva muodossa (kuvio 1A). Siksi kaikki solulinjat muodostettiin itsestään uusiutuvien aloilla kulttuuriin.

(A): Top, vanhempien solulinjat (LI, U87 ja U373-solut) viljellään niiden taso väliaineessa lisätään 10% seerumia. Middle, muodostuminen neuropallojen päälle yksikerroksiset U373 solulinjan. Kuvat otettiin sen jälkeen 1, 2 ja 3 päivää neuropallo väliaineessa. Pohja, kuvia ensisijainen NS syntyy LI, U87 ja U373-solut päivällä 8. (B) peräisin olevat kloonit LI (D2 ja F11) ja U87 (C7 ja E8) ensisijainen NS. Alkuperäinen suurennus 200 × 400 ×. Asteikko bar = 100 pm.

rajoittavan laimennuksen /Kuulat Kasvaimen aloittaminen (TS-CI) analyysi

määrittämiseksi kykyä kolme solulinjojen muodostamiseksi NS, TS-CI analyysi. Taajuus TS-IC oli 1,56%, että U373-solujen (1 solu jokaista 64 osoitti kykyä muodostaa ensisijaisen NS), 1,45%, sillä U87-MG-soluja (1 solu jokaista 69 osoitti kykyä muodostaa ensisijaisen NS), ja 2,74% LI-solut (1 solu joka 36. osoittivat kyky muodostaa ensisijainen NS).

Yhden pesäkkeen muodostumisen analyysi

arvioidaan kyky uusiutua ensisijaisen NS, joka on klonogeeniset määritys esitettiin. Tehokkuus pesäkkeiden muodostuminen oli 9,5%, 10,5% ja 33,3% NS peräisin U373, U87 ja LI, vastaavasti.

Kasvavat kloonit valittiin, eriteltyjä, joka säilyy monia alakulttuurit. Kaksi kloonia (D2 ja F11) saatiin ensisijainen NS johdettu LI ja kaksi (C7 ja E8) alkaen U87 joka muodosti itsestään uusiutuvien aloilla viljelmässä (kuvio 1 B). Yksikään klooneista peräisin U373 pystyi sinnikkäästi kulttuuriin, vaikka toinen väliaine johdosta. Morfologia kloonien oli vaihteleva. F11, C7 ja E8 kasvoi täysin pallomaisesti, kun taas D2 taipumus muodostaa sekä pallomaisia ​​tai pitkänomainen aggregaatteja (kuvio 1 B).

Expression kantasolujen merkkiaineiden ja sukua-spesifisten

CD133, nestiinifenotyypin, Sox2 ja Msi-1 arvioitiin arvioida staminal luonnetta valikoitujen kloonien. Käyttämällä immunosolukemiallinen, 50% LI soluista ja 100% U87 oli nestiinifenotyypin-positiivisia ja värjäytyminen oli sijoitettu sytoplasmisen tasolla. Sekä D2 ja F11 kloonit johdetut NS LI-solujen, kasvua kantasolujen markkeri havaittiin ekspression. Yli 80% soluista sekä klooneista oli positiivisia nestiinin. Kasvua ei nestiinivärjäys havaittiin molemmissa peräisin olevat kloonit U87 soluista suhteessa emosolulinjassa (kuva 2).

insertit viittaavat negatiivisiin kontrolleihin. Alkuperäinen suurennus 400 ×. Asteikko bar = 100 pm.

Sen Tämän näytön perusteella ja morfologiset näkökohta, myöhemmät kokeet on suoritettu vain klooneja D2 ja F11 kanssa sen selvittämiseksi, jos havaitut erot voivat vastata eroja käyttäytymistä.

analysoiminen CD133 ilmentymistä virtaussytometrialla, havaitsimme 0,04, 0,13, ja 1,44% CD133-positiivisten solujen LI, D2, ja F11-solut, vastaavasti (kuvio 3A). Nämä arvot säilyivät jälkeen eri sykliä kylmäsäilytys. Käyttämällä immunosolukemiallinen, huomasimme, että 30% LI-soluissa läsnä pienissä ryhmissä yksikerrosviljelmässä olivat positiivisia Sox-2, joka tyypillisesti lokalisoitu tumissa; Lopuksi 100% LI-soluissa osoitti heikkoa MSI-1 sytoplasmisen värjäytymistä (kuvio 3B). Sekä D2 ja F11 klooneja, kasvua kantasolujen markkeri ilmentymistä havaittiin. Kahdeksankymmentä prosenttia solut molemmista klooneista oli positiivisia nestiinin ja 100%: Sox-2. Voimakkaampi ilmentymisen MSI-1 havaittiin 100% soluista (kuvio 3B). Nestiinin ilmentyminen sekä klooneja vahvistettiin Western blot -analyysillä. Kuva 4C viittaa saadut tiedot F11 klooni.

V: Virtaussytometrianalyysi mitata CD133 ilmentyminen peräisin olevien solujen LI yksikerrosviljelyissä ja D2 ja F11 klooneja. CaCo

2-solut ovat positiivisia kontrolli. CD133 ilmentyminen arvioitiin molemmissa klooneja 5

nnen kanavan (5

THP) ja 16

nnen kanavan (16

THP). B: Tietojen edustavasta kokeesta on immunosytokemiallisessa värjäyksen Msi-1 ja Sox2 ilmaisun LI, D2 ja F11 soluja. Istukkaat viittaavat negatiivisiin kontrolleihin. Alkuperäinen suurennus 400 ×. Asteikko bar = 100 pm.

V: immunosytokemi- värjäys nestiinin, MSI-1, Sox2 ja βIII-Tubulin ilmentymistä D2 ja F11 soluja viljeltiin neuropallo väliaineessa (ilman seerumia) tai erilaistumiseen väliaineessa ( seerumin läsnä ollessa) 5-45 päivää. Alkuperäinen suurennus 400 ×. Asteikko bar = 100 pm. B: Jotkut βIII-Tubulin positiivisia soluja, joilla on tyypillinen hermosolujen kaltainen morfologia. Alkuperäinen suurennus 630 ×. Mittakaava = 50 pm. C: Western blot-analyysi nestiinifenotyypin, MSI-1 ja βIII-Tubulin ilmentyminen F11 soluissa viljellään eri aikoina erilaistumista väliaineessa. Proteiinit tasot analysoitiin immunoblot-analyysillä ja kvantitoitiin densitometrialla ja standardoitu tasot β-aktiini latauskontrollina. Arvot ovat keskiarvoja ± SD puun riippumattomassa kokeessa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin D2-soluja. Immunoblottings edustavien kokeiden esitetään. * P 0,05 Opiskelijan

t

-testi vs. vanhempien solulinjoissa, * p 0,01 vs. F11 soluja.

Kuulat viljeltiin alle erilaistumista olosuhteet eri aikoina ja analysoitiin ilmentämiseen kantasolujen merkkiaineita ja sukua-markkereita. Yön yli inkuboinnin erilaistumiseen väliaineessa, neuropallon solut olivat kiinnittyneet viljelylevyssä ja kasvoi yksikerroksisessa. Ilmaisu hermo-specific βIII-Tubulin, GFAP, ja GalC arvioitiin immunosolukemiallinen. Sekä βIII-Tubulin ja GFAP olivat erittäin ilmaistaan ​​emosolulinjassa ja molemmat kloonit, kun GalC ei ilmaista (tuloksia ei ole esitetty). Kun erilaistumista olosuhteissa ilmentymisen hermo-specific βIII-Tubulin vähentynyt (kuvio 4A), kun taas GFAP ei muuttunut merkittävästi (tuloksia ei ole esitetty). Erityisesti, jotkut βIII-Tubulin ilmentäviä soluja oli neuroni kaltainen morfologia (kuvio 4B), kun taas toiset olivat monitumaisia ​​soluja.

pieneneminen βIII-Tubulin ekspressio arvioitiin myös Western blot -analyysillä sekä D2 ( tuloksia ei ole esitetty) ja F11 (kuvio 4C) klooneja.

D2 ja F11 klooneja lasku sekä nestiinifenotyypin ja Sox-2 immunopositivity, kunnes ei-havaittavat määrät havaittiin sen jälkeen, kun pitkäkestoisempi NS soluviljelmässä erilaistumisen elatusaineessa (kuva 4A ). Silmiinpistävä väheneminen nestiinifenotyypin tasojen varmistettiin lisäksi Western blot-analyysi (kuvio 4C tarkoitetaan saatuja tietoja F11 klooni). Ei ilmeisesti vaihtelu Msi-1 ilmentymisen, analysoi immunosolukemiallisella, havaittiin, mutta sen sijainti muuttaa välillä tuman ja sytoplasman ajasta riippuen pysyvyyden seerumissa sisältävässä väliaineessa (kuvio 4A). Western blot-analyysi osoitti, että LI-soluissa, ja molemmat kloonit ilmensivät samanlaisia ​​ilmentyminen MSI-1, kun taas solut, sekä klooneista alle erilaistumista osoitti korkeamman proteiinin. Kuvio 4 esittää saadut tiedot F11 klooni.

konfokaali Ca

2+ kuvantamisen

eriytymättömiä soluissa (viitataan ajan pisteen päivä-0), KCI stimulointi tuotti Ca

2+ transientit alle 10% kaikista soluista (

n

= 9 ulos 127), ja keskimääräinen amplitudi näiden häiriöiden oli 0,36 ± 0,02. Alhainen reagointikykyä depolarisoivan ärsykkeisiin havaittiin myös erottamaan soluissa. Itse asiassa solujen prosenttiosuus vastaa KCI stimulaation Ca

2+ häiriö- oli pienempi kuin 10% päivänä-5, päivä-15 ja päivä-30 myös, keskimääräinen amplitudi 0,75 ± 0,25 [

n

= 7 ulos 287], 0,42 ± 0,07 [

n

= 10 pois 418] ja 0,34 ± 0,02 [

n

= 7 ulos 418], tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittavat, että LI johdettu ihmisen kantasoluja, joko eriytymättömiä tai eri vaiheissa eriyttäminen eivät ilmaise toiminnallinen jänniteherkkiin Ca

2 + kanavia. Kuitenkin, kun nämä solujen valmisteet altistettiin 50 uM ATP: tä, selkeästi havaittavissa solunsisäistä Ca:

2+ häiriöiden havaittiin. Eriytymättömissä soluissa (päivä 0), ATP tuotettu Ca

2 + signaalit 16,1 ± 9,8% kaikista soluista (39 out of 127), joiden keskimääräinen amplitudi 0,79 ± 0,10. 1 päivän kuluttua kulttuurin erilaistumista liuoksesta ja reagoivien solujen prosenttiosuus kasvoi 89,2 ± 7,2% (

n

= 115 ulos 132) ja keskimääräinen amplitudi häiriöiden lisääntyi samoin (1,49 ± 1,13). Päivänä-5, enää kasvaa reagoivien solujen prosenttiosuus havaittiin (86,3 ± 3,5%;

n

= 430 ulos 492), mutta ohimenevää amplitudi saavutti maksimiarvon 2,69 ± 0,07. Ei merkittäviä muutoksia Ca

2 + signaaliamplitudit havaittiin seuraavina päivinä erilaistumisen enintään 30 päivältä: AF /F-arvot ovat 2,48 ± 0,07 vuorokautena-15 (77,8 ± 7,1% vasteen tuottavien solujen;

n

= 334) ja 2,55 ± 0,11 päivänä-30 (80,5 ± 5,1% vasteen tuottavien solujen;

n

= 306).