Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Lähes 20% ihmisen syövissä maailmanlaajuisesti on infektioosia syytä kaikkein näkyvin esimerkkejä ovat hepatiitti B ja C-viruksen liittyvä maksasyövän ja ihmisen papilloomaviruksen liittyvä kohdunkaulan syöpä. On kiireesti löydettävä uusia lähestymistapoja hoitoon ja ehkäisyyn virusten liittyvien syöpien.

Menetelmät /Principal Havainnot

Viral antigeenejä ei ole aiemmin pidetty kohteina hoitoon tai ehkäisyyn virus -associated syöpiä. Oletimme, että oli mahdollista käsitellä kokeellisen HPV16-liittyvät kohdunkaulan syöpää (CC) ja hepatiitti B-liittyvä maksasolusyövän (HCC) kohdistamalla viruksen antigeenejä ilmentyy syöpäsoluissa radioaktiivisesti vasta-aineita viruksen antigeenejä. Hoito kokeellisen CC ja HCC kasvaimista

188Re-leimatun mAb: iden E6 ja HBx virusproteiineja, vastaavasti, aiheutti merkittäviä ja annoksesta riippuvaa viivästystä kasvaimen kasvua verrattuna käsittelemättömiin hiiriin tai käsitellyissä hiirissä leimaamattoman vasta-aineita.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä strategia on perustavalla tavalla erilainen kuin aiemmat käyttötarkoitukset radioimmunoterapiassa onkologian, joka oli suunnattu kasvaimeen liittyviä ihmisen antigeenejä ja lupauksia lisääntynyt spesifisyys ja vähäinen myrkyllisyys hoidon. Se herättää myös jännittävä mahdollisuus estää viruksen liittyviä syöpiä kroonisesti infektoituneilla potilailla poistamalla solut infektoitu onkogeenisella viruksia ennen kuin ne muuttuvat syöpää.

Citation: Wang XG, Revskaya E, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Hoitoon Cancer kuin Infectious Disease-virusantigeenit kuten Novel Tavoitteet hoito ja mahdolliset ehkäisy kasvaimet Viral etiologia. PLoS ONE 2 (10): E1114. doi: 10,1371 /journal.pone.0001114

Academic Editor: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 lokakuu 2007; Hyväksytty: 10 lokakuu 2007; Julkaistu: 31 lokakuu 2007

Copyright © 2007 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: E. Dadachova tukee NIH avustuksen AI60507; A. Casadevall – NIH avustukset AI33774, AI33142, AI52733, HL59842, ja U54 AI157158; R. D. Burk NIH avustuksen CA078527. Tätä työtä tukivat osittain Albert Einstein College of Medicine Kattava Cancer Center ja Center for AIDS Research at Albert Einstein College of Medicine ja Montefiore Medical Center rahoittaa National Institutes of Health (NIH AI-51519).

Kilpailevat edut: patenttihakemus tälle teknologialle on jätetty US PTO

Johdanto

on arvioitu, että lähes 20% ihmisen syövissä maailmanlaajuisesti on infektioosia syytä [1]. Useimmat näistä kasvaimista ovat virusperäinen, ja sisältävät vakiintunut yhdistysten hepatiitti B -viruksen (HBV) ja hepatiitti C -virus (HCV) kanssa maksasyövän; ja ihmisen papilloomaviruksen (HPV) -Kun syövät kohdunkaula, peräaukon, vulva, emättimen; sekä yhdistysten suunielun Epstein-Barrin virus (EBV) lymfoomaa ja nenänielun karsinooma; ihmisen T-lymfotrooppinen virus tyyppi 1 (HTLV-1) -Kun aikuisten T-solu- leukemia /lymfooma, ja ihmisen herpesvirus 8 (HHV-8) -Kun Kaposin sarkooma [2] – [7]. Yhdessä nämä virus liittyvä kasvaimet edustavat taakka noin 1,3 miljoonaa syöpätapausta vuosittain HBV /HCV-liittyvän maksasyövän osuus 523000 tapauksissa ja HPV: hen liittyvän kasvainten osuus 561000 tapauksissa [8]. Tarve löytää uusia lähestymistapoja hoitoon ja ehkäisyyn virusten liittyvän syöpien on ilmeinen ja kiireellinen.

radioimmunoterapiassa (RIT) käytetään antigeeni-vasta-aineen sitoutuminen toimittamaan sytotoksisia annoksia hiukkaspäästöjen säteilyn tuumorisoluihin [9], [10]. RIT Esimerkiksi on käytetty menestyksellisesti hoitaa tulenkestävä ja toistuvia lymfoomat, jossa kaksi radioleimattuja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) kohdistettu CD20 (Zevalin® ja Bexxar®) saaneet FDA tähän tarkoitukseen. On todennäköistä, itse asiassa, että RIT tulee ensisijaisena hoitona follikulaarinen lymfooma [11]. Tämä ”perinteinen” syöpä RIT tavoitteet ”itse” antigeenejä. Viime aikoina olemme osoittaneet, että RIT on myös laajoja potentiaalisia hoidettaessa sieni- ja bakteeri-infektioita, johon pyritään mikrobien antigeenejä radioaktiivisesti mAbien kokeellisissa malleissa sieni ja bakteeri-infektiot [12], [tarkistetaan 13]. Lisäksi olemme havainneet, että HIV-1-infektoituneissa soluissa voitaisiin poistaa in vitro ja in vivo kohdentamalla gp120 ja gp41 virusglykoproteiineja ilmentyy infektoituneiden solujen pinnalla radioaktiivisesti virusproteiini-spesifinen mAb: t [14].

Oletimme, että RIT kohdistettu viruksen antigeenejä voidaan käyttää hoidettaessa monenlaisia ​​virus tartuntatautien ja virus-liittyvä kasvaimia [15], [16]. Monet virus liittyvä syövät ilmentävät viruksen vasta joko sisäisesti tai niiden pinnoilla. On tärkeää huomata, että vaikka viruksen vasta ilmentää solunsisäisesti ovat potentiaalisia kohteita RIT, koska kasvain solujen liikevaihdon todennäköisesti johtaa vapauttaa näiden proteiinien osaksi välitilaan kasvain. Tämä lähestymistapa on täysin erilainen kuin edellä kuvattu käytöt RIT joiden kohteena kasvaimeen liittyviä antigeenejä, jotka ovat ”itse” (eli ihmisen) proteiineja. Kohdistamalla virus eikä ”itse” proteiinit, toivotaan, että radioleimattu mAb: t voivat olla tarkemmin keskittynyt kasvainkudoksen, mikä lisää tehokkuutta ja vähemmän toksisuutta. Tässä kuvaamme proof-of-periaatteen kokeiluja, jolla pyritään osoittamaan kyetään hoitamaan kokeellisen HPV16-liittyvä kohdunkaulan syövän (CC) ja hepatiitti B-liittyvä maksasolusyövän (HCC) kohdistamalla viruksen vasta ilmentyy syöpäsoluissa radioaktiivisesti vasta viruksen antigeenejä .

tulokset

valinta solulinjan-antigeenin yhdistelmä toimia kokeellisena kohdunkaulan syöpää (CC) malli

arvioimiseksi potentiaalin RIT kohdistaa viruksen vasta syövät viruksen etiologia, mitä tarvitaan tunnistamaan kasvaimen solulinjojen, jotka ekspressoivat kohdeantigeeniä, ja se voisi myös implantoitu nude-hiiriin. Valitsimme HPV16 ja HPV18 solulinjoissa, koska nämä kaksi HPV-tyypit muodostavat noin 70% kohdunkaulan syövistä ja merkittävä osa pään ja kaulan kasvaimet [17], [18]. E6- ja E7 onkoproteiineja katsottiin parhaiten mahdollisia antigeenisiä kohteita, koska nämä proteiinit ilmentyvät oleellisesti kaikissa kohdunkaulan syövän soluja, kun taas muiden virusten geenejä voidaan menettää. Mutaatioanalyysiin on osoittanut, että E6 ja E7 virusperäisen onkoproteiineja ovat välttämättömiä ja riittäviä kuolemattomaksi ihmisen solujen HPV. Siksi arvioimme Western blot ilmaus E6 ja E7 kolmessa ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa-HPV16-positiivisia CaSki- ja SiHa solulinjoissa ja HPV18-positiivisia HeLa S3 solulinjan. Vaikka CaSki- solut ilmensivät sekä E6- ja E7-antigeenejä (Fig. 1a, b), SiHa ja HeLa S3 solulinjoissa ollut mitattavissa olevaa ilmentymistä E6-antigeenin (tuloksia ei esitetä), mutta ei ilmaista E7-proteiinia (kuvio. 1 d, e); vaikkakin taso E7 ilmentyminen oli alhainen SiHa soluissa (Kuva. 1 d).

a) E6 alkaen teiiniuutteissa CaSki käsiteltyjen solujen MG132 3 tuntia; b) E7 teiiniuutteissa CaSki käsiteltyjen solujen MG132 3 tuntia; c) E6 alkaen teiiniuutteissa CaSki käsiteltyjen solujen MG132 6 tuntia; d) E7 teiiniuutteissa SiHa käsiteltyjen solujen MG132 3 tuntia; e) E7 teiiniuutteissa HeLa S3 käsiteltyjen solujen MG132 3 tuntia; f) HBX proteiinia uutteista Hep 3B2.1-7 käsiteltyjen solujen MG132: ssa 3 tuntia.

proteasomin inhibiittoria MG132 vähentää hajoamista ubikitiinipromoottori-konjugoitujen proteiinien nisäkässoluissa vaikuttamatta ATPaasi tai isopeptidase toimintaa. MG132 on raportoitu johtavan kohonneeseen E6- ja E7-proteiinien kohdunkaulan syövän soluihin [19], [20]. Koska suurempia määriä kohdeantigeeneistä saattaa parantaa RIT tuloksia, tutkimme vaikutus esikäsittelyn CC solujen proteasomin estäjä MG132 tasoista E6 ja E7 ilme. Kuva. 1a ja b osoittaa, että CaSki- soluissa esikäsittely MG132 aiheutti ilmentymisen lisääntyminen sekä E6 ja E7, joilla on suurimmat ilmentymisen taso saavutetaan käyttämällä 2 ja 5 ug /ml MG132 joka laantui kun suurempia annoksia käytettiin. Jatkaminen itämisaika CaSki solujen MG132 ei aiheuttanut suurempia E6 ilme. Itse asiassa havaitsimme laski E6 ilmaisu pitkittyneen CaSki- solujen altistuminen MG132 (Fig. 1 c), mikä saattaa heijastaa kasvua proteiinien hajoamista jälkeen yli 3 h inkubaation. Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin E7-proteiinin SiHa- ja HeLa-S3-solulinjat (Fig. 1 d, e). SiHa solut eivät osoittaneet havaittavaa kasvua E7 tasojen (Fig. 2d); katsoo, E7 tasot kasvoivatkin hieman varten HeLa S3-solut käsiteltiin 1 ja 2 ug /ml MG132 (Fig. 1 e). Koska luotettavia ja korkea ekspressio E6 CaSki- soluissa sekä niiden kykyä tuottaa kasvaimia nude-hiirissä-valitsimme CaSki- soluissa ja proteiinin E6 edelleen in vitro ja in vivo kokeissa.

a, b) immunofluoresenssi kiinteä ja läpäiseviksi syöpäsoluja. Vasen paneeli näyttää valomikroskoopilla kuvia solujen. Raskaasti vahingoittuneet solut on merkitty nuolilla. Oikea paneelit esittävät immuunifluoresenssivasta kuvaa samasta liukuu käsiteltiin virusproteiini-spesifisten mAb: t ja sen jälkeen FTIC-konjugoitu polyklonaalinen vasta-aine hiiren IgG: t: a-CaSki-solujen ja E6-spesifinen C1P5 mAb, b-Hep 3B2.1-7 solujen ja HBx- erityiset 4H9 mAb; c) immunohistokemiaa CaSki kasvaimia. Vasen paneeli näyttää sitoutuminen E6-erityisiä mAb C1P5. Oikea paneeli näyttää Koska sitovaa valvonnan mAb 18B7; d) western blot Hep 3B2.1-7 kasvain HBx-spesifinen mAb 4H9.

Valinta cell line-antigeenin yhdistelmä, joka toimii kokeellinen hepatiitti B-liittyvä maksasolusyövän (HCC) malli

arvioitiin kaksi Hepatiitti B-liittyvä virusproteiineja mahdollisina kohteina RIT-HBx ja PreS2. HBx epäillään olevan rooli hepatokarsinogeneesin ja, toisin kuin muut potentiaaliset vaihtoehdot, HBx ei ole homologiaa isäntä proteiineja. Lisäksi geeni, joka koodaa HBx säilyy, vaikka HBV-genomin integroituu HCC, kun taas muut HBV geenit saattavat kadota [21], [22]. PreS2 epäillään myös olevan rooli hepatokarsinogeneesin (ts kautta transaktivaa- solujen geenien tärkeitä kasvun säätelyssä) [22]. HBx proteiini johdonmukaisesti havaittiin Western blot HCC-solulinja Hep 3B2.1-7 käyttäen 4H9 mAb, ja sen ilmentyminen oli riippumaton esikäsittely MG132 proteasomin inhibiittoria (Fig. 1 f), kun taas preS2 ei havaittu (tuloksia ei esitetä ). Siksi valitsimme Hep 3B2.1-7 solulinjassa ja HBx proteiinin yhdistelmä lisäkokeita varten.

vasta-aineiden sitoutuminen viruksen vasta elottomia soluja

Voit selvittää, onko vasta-aineita viruksen proteiineja, jotka tunnistettiin tavoitteet RIT pystyy sitoutumaan virusproteiineja ei-elinkelpoisia tuumorisoluja, teimme immunofluoresenssimenetelmällä kiinteiden ja läpäiseviksi CaSki ja Hep 3B2.1-7 soluja mAb C1P5 E6 ja 4H9 ja HBx proteiineja , vastaavasti, ja sen jälkeen FITC: hen konjugoidulla polyklonaalisella vasta-aineella hiiren IgG: tä. Vaikka sitoutuminen C1P5 mAb soluihin, jotka olivat lähes muuttumattomina oli heikko, raskaasti vaurioituneiden solujen kanssa läpäisevä kalvot osoittivat kirkkaan fluoresenssin osoittaen sitoutumiseen C1P5 E6 (Fig. 2a). Tallennuksesta ja läpäiseväksi myös mahdollista mAb 4H9 sitoutua HBx proteiiniin (Fig. 2b). O sitoutuminen ohjaus IgG1 mAb kiinteisiin ja läpäiseviksi CaSki- tai Hep 3B2. 1-7-soluja havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

ilmentäminen viruksen proteiinien kasvainten

Sen varmistamiseksi, että CaSki ja Hep 3B2.1-7 solut edelleen ilmaista E6 ja HBx virus- antigeenit, vastaavasti, kasvaimia indusoitiin karvattomilla hiirillä, suoritimme immunohistokemiaan ja immunoblot-E6 ja HBx, vastaavasti. Western blot valittiin Hep 3B2.1-7 aiheuttaman kasvaimia perustuu kirjallisuuteen raportointiin vaikeudet luotettavasti havaitsemaan HBx proteiini elimissä immunohistokemiallisesti [23]. Oli voimakas värjäytyminen E6 erityisiä mAb C1P5 in CaSki- kasvaimia (Fig. 2c, vasen paneeli) ilman värjäytymistä havaittavissa ohjaus IgG1 mAb (Fig. 2c, oikea paneeli). Western blot Hep 3B2.1-7-tuumoreita paljasti HBx proteiinin (Fig. 2d). Näin ollen, kun läsnä on kohde virusproteiineja CC ja HCC kokeellisiin kasvaimiin jos mahdollisuus suunnata näitä antigeenejä in vivo radioleimatun mAb: itä varten isotooppikuvantamiseen ja terapia.

bioleviäminen radioaktiivisesti mAb: iden viruksen proteiineja CaSki ja Hep 3B2.1-7-kasvain laakeri nude-hiiriin

suoritettu kuvantaminen ja biologinen jakautuminen kokeiluja

188Re-radioaktiivisella leimalla C1P5 ja 4H9 mAb CaSki- ja Hep 3B2.1-7-syöpäkasvaimia sisältävistä nude-hiirissä, vastaavasti, selvittää lokalisoinnin mAbien että kasvaimia. 24 tunnin kuluttua injektion CaSki kasvain oli näkyvissä skintigrafiset kuva hiiri injektoitiin

188Re-C1P5 mAb (Fig. 3a) eikä kuvaa hiiren injektoitu merkityksetön

188Re-18B7 mAb (Fig. 3b). Olemme myös laskettiin kasvaimen lihas suhde alkaen 48 tunnin biojakaantumi- tulosta, joka oli 10:01 varten

188Re-C1P5 vs. 03:01 varten

188Re-18B7. Yleinen otto

188Re-C1P5 mAb kasvaimissa 48 tuntia injektion jälkeen oli 2,0 (± 0,3)% injektoidusta annoksesta grammaa kasvain. Muut elimet, kuten maksassa, pernassa ja veressä osoittivat tasot oton ominaista IgG1 mAbien. Sillä Hep 3B2.1-7 käytimme toisen lähestymistavan todistaa erityisyyttä mAb sisäänottoa kasvain käyttäen mallia, kun hiiri kuljettaa kahta eri kasvaimia-yksi kasvain kiinnostava ja toinen-merkityksetön kontrolli kasvain. Karvattomia hiiriä suorittaa A2058 ihmisen metastaattinen melanooma kasvain oikeaan kylkeen ja Hep 3B2.1-7 vasemmalla (Fig. 3c). Hiiret injektoitiin

188Re-4H9 mAb ja kuvattiin scintigraphically 24 tuntia injektion jälkeen. Vasta-aine lokalisoitu Hep 3B2.1-7 kasvaimen toisin kuin merkityksetön kontrolli melanoomakasvaimen (Fig. 3d). Kyky radioleimattujen mAbien virusantigeeneille paikallistaa näitä kasvaimia hiirillä perusteltu arvio RIT näissä in vivo syöpää malleissa.

RIT CaSki ja Hep 3B2.1-7-kasvain laakeri nude hiiret

arvioimiseksi terapeuttista vaikutusta

188Re-C1P5 mAb CaSki kasvaimen kantavien hiirten, eläimiin injektoitiin joko 350 uCi

188Re-C1P5 mAb, tai vastaavia määriä (30 ug per mouse) leimaamatonta ( ”kylmä”) C1P5 mAb tai ne jätetään hoitamatta. Kuva. 4a esittää muutosta kasvaimen tilavuuden käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. RIT 350 uCi

188Re-C1P5 mAb täysin pidätetty kasvaimen kasvua ja aiheutti sen tilavuuden pienentämiseksi (Fig. 4a ja b), kun taas käsittelemätön kasvaimet kasvoivat aggressiivisesti (Fig. 4a ja c) ja käsittelemätön kontrolli hiirillä oli uhrata päivä 20 jälkikäsittely (P 0,01). Mielenkiintoista on, että anto ”kylmä” C1P5 mAb johti myös merkittävästi hidastumisen kasvaimen kasvua, joka voi johtua induktion tulehduksen ja täydentää kaskadeja, jotka mAb.

a) muutokset kasvaimen tilavuuden; b) käsitellyn hiiren 350 uCi

188Re-C1P5 mAb; c) ohjaus hiiri (molemmat hiirillä näkyy Päivä 20 jälkikäsittely).

RIT Hep 3B2.1-7 paljaissa hiirissä me alunperin käytetyn samaa koe- kuin CaSki kasvaimia käyttämällä 350 uCi

188Re-4H9 mAb, ”kylmä” mAb-käsiteltyihin kontrolleihin ja käsittelemättömien ryhmiin. Anto 350 pCi

188Re-4H9 mAb aiheutti hitaampaa kasvaimen kasvua, mutta ei vangita sitä kuin tapauksessa CaSki kasvaimia. ”Kylmä” 4H9 mAb ei ollut vaikutusta tuumorin kasvuun. Löytää tehokkain annos radioaktiivisesti leimatun mAb hidastamiseksi kasvun erittäin aggressiivinen Hep 3B2.1-7 annoksena koe tehtiin. Terapeuttinen vaikutus

188Re-4H9 mAb alkoi ilmetä annoksella 280 pCi ja vaikutus nosti jokaisen tulevan annoksen nostaminen (Fig. 5a) (P 0,02). Vuoden loppuun kokeen kasvainten valvonnassa käsittelemättömien hiirien ja hiiret korkein 600 uCi ryhmä analysoitiin histologisesti. Ohjaus kasvain muodostui kohtalaisen eriytetty hepatoid solujen hajallaan pieniä pesäkkeitä kuolion, fibriinin veritulppa, ja verenvuoto. Neoplastiset solut ollut runsaasti eosinofiilinen hienoksi vakuoleja sytoplasmaan ja keskisuuret ytimet hyvin suuria ja anaplastinen ytimet, jotka sisältävät useita suuria eosinofiilinen nucleoli kanssa monitumaiset solut satunnaisesti ilmeinen. Mitoosi indeksi oli korkea ja siellä olivat hajallaan apoptoottisia soluja (kuvio. 5b). Sen sijaan RIT saaneista kasvaimia oli merkitsevästi enemmän kuolion ja verenvuoto kuin nähdään kontrolleissa. Morfologisia ulkonäkö kasvainsolujen oli usein enemmän vakuoleja solulimassa viittaa rappeuma (Kuva. 5c).

a) muutokset kasvaimen tilavuuden; b) ohjata käsittelemätöntä hiirtä; c) käsitellyn hiiren 600 uCi

188Re-4H9 mAb. Molemmat hiiret näkyy Päivä 18 jälkikäsittelyä. Vuonna b ja c alempi paneelit esittävät H kun taas muut virus- geenejä voidaan menettää aikana monivaiheinen prosessi kasvaimen. Samoin HCC, HBx ilmaus ajatellaan säilytettävä. On kuitenkin tärkeä huolenaihe kohdentamalla kolme proteiinia radioaktiivisesti mAb: t-niiden subsellulaarisista sijainti. Sekä E6- ja E7-sijaitsevat tumassa, ja HBx löytyy tumaan ja joskus sytoplasmassa. Tämän seurauksena, radioleimatun mAb: t näille proteiineille voivat sitoutua ainoastaan ​​niiden antigeenejä kun ne vapautetaan kuolleet solut tai kasvainsolut läpäiseviksi. Käymään näitä kokeita, päätimme CaSki solulinjaa kuin CC malli, koska löysimme sen ilmaisi E6 ja E7 korkealla tasolla in vitro ja kasvaimia kasvoi aggressiivisesti nude-hiirissä jälkeen piilevä aikana. Hep 3B2.1-7 solulinja valittiin HCC mallia, kun havaitsimme, että se ilmaisi HBx korkealla tasolla ja näytetään nopea kasvaimen kasvua hiirissä.

immunofluoresenssimenetelmällä ssa syöpäsoluista ja immunohistokemia ja Länsi blot kasvainten paljasti runsasta E6 ja HBx antigeeninen tavoitteet CasKi- ja Hep 3B2.1-7 aiheuttama kasvaimia, vastaavasti (kuvio. 2). Läsnä saatavilla antigeenin radioleimattu mAb: iden on todennäköisesti seurausta proteiinin vapautumisen kasvainsoluista nopeiden vaihtuvuus. Tästä seuraa, että radioaktiivisesti vasta kertynyt kasvainkudoksessa siten, että niitä voidaan kuvata scintigraphically (Fig. 3). Yksi eduista kohdistaminen viruksen vasta kasvaimia, että ne ovat vain löytyy pahanlaatuisia soluja. Sen sijaan, Chen ja työtovereiden havaittu mitään eroja kasvaimeen sekä erityisiä ja ei-spesifistä radioleimattua vasta-aineita niiden biologisen jakautumisen kokeita, kun ne suunnattu intranukleaarinen histonien [24].

kyky radioaktiivisesti mAbs virusproteiinit toimittaa sytotoksiset radionuklidi 188-Renium kasvainsoluihin helpotti onnistunut tuloksista RIT näitä mAb on kasvain. Anto 350 pCi annoksen E6-sitovien

188Re-C1P5 mAb CaSki- kasvainta kantavien hiirten täysin pysähtynyt kasvaimen kasvua ja jopa johti sen regressio (Fig. 4). On myös todennäköistä, että siellä oli joitakin terapeuttista hyötyä vasta itse tunnisteettomina vasta-aineet voivat välittää tulehdusreaktioita ja aktivoi kohteliaisuus. Tulevaisuudessa se kannattaa tutkia lisääntynyt solun tasolla E6: n ja E7 onkoproteiineja voitaisiin saada esikäsittely käyttämällä MG132 in vivo, ja onko tämä johtaa terapeuttiseen hyötyyn. Annosvaste kokeita hiirillä Hep 3B2.1-7 HCC-kasvaimia selvästi osoittanut annos riippuvuuden terapeuttisen vaikutuksen (Fig. 5). Se, että suuremmat annokset radioleimattujen mAb tarvittiin tuottamaan terapeuttinen vaikutus HCC kuin kohdunkaulan kasvain saattaa heijastaa aggressiivisuus Hep 3B2.1-7 ja tunnetun radioresistance maksakasvaimien verrattuna suhteellisen säteilylle kohdunkaulan karsinoomien [25] . On myös huomionarvoista, että terapeuttinen voittoja sekä kokeellisia kasvaimia saavutettiin annoksilla radioaktiivisuuden jotka ovat selvästi alle suurin siedetty annos oli noin 800 pCi varten

188Re-leimatun IgG1s hiirillä [26], ja sellaisenaan annokset käytettiin ei odoteta aiheuttavan lyhyt- tai pitkäaikaisia ​​toksisuuksien.

on tärkeää korostaa, että käsiteltäessä viruksen liittyviä syöpiä kohdistamalla virusantigeenin ei jokainen solu kasvain on ilmaista viruksen antigeenejä terapeuttisen vaikutuksen . Pitkän kantaman emitterit kuten

188Re (päästöt alue kudokseen 10 mm) säteilevät on 360 ° pallo ja näin ollen voi tappaa soluja läheisyydessä antigeenin sijainti. Lisäksi korkea pitoisuus kohdennettuja viruksen antigeeni ei todennäköisesti tarvita terapeuttisen annoksen kasvain, mukaan meidän viime mallia RIT melanooman (kohdistettu melaniinia, joka on myös solunsisäinen antigeeni). Tämä malli osoitti, että potilaan saama säteilyannos kasvaimeen on pitkälti riippumaton melaniinin (antigeenin) pitoisuus [27].

Tämä lähestymistapa pätee myös lupauksen estää viruksen liittyviä syöpiä kroonisesti infektoituneissa yksilöissä-esimerkiksi, pysyvyys HPV-infektio HIV-tartunnan saaneista ihmisistä heikentää niiden merkittävä riski HPV: hen liittyvän syöpien. Vaikka on immunoterapiaa HBV ja HCV, monet potilaat eivät saavuta viruspuhdistuma ja hoito liittyy huomattavia sairastuvuuteen. Ei ole myöskään rokote HCV, ja monet miljoonat ihmiset ympäri maailmaa ovat sairastuneet HBV huolimatta olemassa tehokas rokote. Solut jatkuvasti tartunnan HPV, HBV, HCV tai muut virukset voidaan mahdollisesti eliminoida RIT suunnattu viruksen vasta ennen he muuttuvat pahanlaatuinen fenotyyppi.

Yhteenvetona, me suorittaa in vitro ja in vivo kokeissa arvioida uutta strategia hoitoon virukseen liittyvää kasvainten käyttämällä radioleimattua mAbien kohdistettu virusproteiineja. Tämä strategia on täysin erilainen kuin aiemmat käyttötarkoitukset RIT onkologiaan, jotka on kohdistettu kasvaimeen liittyvät ihmisen antigeenejä mikä johtaa merkittävää ottoa radioaktiivinen vasta normaaleissa kudoksissa, mikä myrkyllisyys. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että kohdentamalla sijaan virus eikä itse proteiineja saattaa olla mahdollista, että radioleimatun mAbien keskittyä tarkemmin sisällä kasvainkudoksen, mikä lisää tehokkuutta ja vähemmän toksisuutta. Tämä strategia nostaa esiin myös jännittävä lisämahdollisuus estää viruksen liittyviä syöpiä kroonisesti infektoituneilla potilailla poistamalla solut infektoitu onkogeenisella viruksia ennen kuin ne muuttuvat syöpää.

Methods

Vasta

hiiri mAb: t välillä Abcam C1P5 HPV16 E6 + HPV18 E6 ja TVG 701Y HPV16 E7 käytettiin CC kokeissa. Hiiren mAb 4H9 HBV HBx (Aviva, Cat # AVAMM2005) ja hiiren mAb S26 HBV-proteiinin Hbs (Gene Tex Inc. Cat # GTX18797), joka reagoi ristiin HBsAg preS2 antigeenin käytettiin HCC kokeissa. Hiiren 18B7 mAb (lgG1) ja

C. neoformans

[28] käytettiin merkityksetön kontrolli kaikkien spesifisten vasta-aineiden. Kanin polyklonaalinen vasta-aine, joka oli konjugoitu alkaliseen fosfataasiin hiiren IgG H L hankittiin Abcam ja käyttää sekundaarisen vasta-aineen Western blot.

Solulinjat ja solujen viljelyn

kolme ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjat: Hela S3, SiHa ja CaSki ostettiin ATCC (Manassas, VA). Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti DMEM /HAM F-12K (Sigma, 1:01), joka sisälsi 10% FBS: ää (Sigma) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä liuosta (Sigma, penisilliini 10000 U ja streptomysiiniä 10 mg /ml) 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. Solulinjaa Hep 3B2.1-7 (

Homo sapiens

hepatatocellular karsinooma) hankittiin ATCC. Se sisältää integroidun hepatiitti B -viruksen genomin ja johdettiin maksasyövän kudosten 8-vuotiaan musta poika. Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC), joka sisälsi 10% FBS: ää (Sigma) 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Cell kerrokset 75 ml: n pullossa dispergoitiin lisäämällä 2 ml 1 x trypsiini-EDTA-liuosta (Sigma, 0,25% (w /v) trypsiinillä-0,53 mM EDTA), huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. A2058-solulinja, joka on johdettu imusolmuke etäpesäke potilaasta, joilla on pahanlaatuinen melanooma saatiin ATCC: ltä. Soluja pidettiin yksikerrosviljelminä Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, jossa 4 mM L-glutamiini, 4,5 g /l glukoosia, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 5% penisilliini-streptomysiiniä liuokseen 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, ja kerättiin käyttämällä 0,25% (w /v) Trypsiini-EDTA-liuosta. Rutiini ylläpito solulinjojen suoritettiin ATCC protokollia.

Western blotit

Solupelletit suspendoitiin hajotuspuskuriin (4% SDS, 20% glyseroli, 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,002% bromifenolisinistä ja 10% β-merkaptoetanolia). Proteiini näytteitä keitetään vedessä 15 minuuttia ennen käynnissä SDS-PAGE. Kaksikymmentä puoli kuusi ui proteiini liuos laitettiin kuhunkin kuoppaan 12% betonielementtien SDS-PAGE-geelissä (Bio-Rad). SDS-PAGE tarkkailuun käytettiin suhteellisen proteiinin määriä näytteitä. Kaksitoista prosenttia SDS-PAGE-geeli on käytetty proteiinien erottamiseksi, ja elektroforeesi suoritettiin käyttäen Mini-Protean® 3 Cell-järjestelmä (Bio-Rad). Elektroforeesin jälkeen geeli siirrettiin PVDF-siirtopuskurissa (25 mM Tris, 190 mM glysiini ja 2,5% (v /v) metanoli) 5 min. Sitten proteiinit siirrettiin geeliä Immun-blot ™ PVDF-kalvolle (Bio-Rad) on Puolikuivat elektroforeettinen siirto Cell (Bio-Rad) 15 V: ssa 17 minuutin ajan. Kalvo liotettiin salpauspuskurilla (25 mM Tris-HCI (pH 7,6), 1 mM EDTA ja 150 mM NaCl) 5 minuutin ajan, ja sitten siirretään blokkausliuosta (5% rasvatonta kuivamaitoa eston puskuri) varovasti ravistaen tunnin ajan. Kalvo inkuboitiin TBST-liuosta (0,1% Tween-20, 25 mM Tris-HCI (pH 7,6) ja 500 mM NaCl), joka sisälsi 1:3000 laimennettiin primaarisen vasta-aineen huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan sekoittaen varovasti. Sitten membraani pestiin TBST: llä kolme kertaa (10 min pesua kohti). Kalvo hybridisoitiin että sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu alkaliseen fosfataasiin (Kanin polyklonaalista hiiren IgG H L (alkalinen fosfataasi)) TBST: ssä, jossa on 1:100,000 laimennus. Kolmen pesun jälkeen TBST: llä, membraani inkuboitiin CDP-Star ™ kemiluminesenssi substraattiliuosta (Sigma) 5 min ajan, ja sitten altistettiin CL-LTISTUKSEN ™ kalvon (Pierce). Filmi kehitettiin valmistajan ohjeiden.

MG132 hoitoon solujen

MG132 (Z-LLL-CHO, MW = 457,6) hankittiin Calbiochem on voimakas, palautuva ja solun läpäisevä proteasomin inhibiittori (Ki = 4 nM). MG132 liuotettiin ensin tippa 100% etanolia, minkä jälkeen DMEM /HAM F-12K väliaineessa ei ole lisätty FBS, ja kantaliuos säilytettiin 4 ° C: ssa. Soluviljelmä kerättiin ja siirrettiin 6 steriiliin koeputkeen. Jokainen putki sisälsi 0,5-1 ml soluviljelmää (solujen konsentraatio oli -10

6 solua /ml), ja solujen annettiin kasvaa 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa yön yli. Sitten, MG132 lisättiin putkiin, että lopulliset pitoisuudet 0, 1, 2, 5, 10 tai 25 ug /ml (0, 2,1, 4,2, 10,5, 21 ja 52 uM, tässä järjestyksessä). Soluja inkuboitiin samoissa olosuhteissa vielä 3 tai 6 tuntia. Lopuksi solut kerättiin sentrifugoimalla ja selkeytetty pesemällä PBS: llä.

Radioisotooppinen ja radioleimaamiseksi vasta-aineiden

beeta-emitteri

188Re, joiden puoliintumisaika on 16,9 tuntia eluoitiin muodossa natrium perrenaatin Na

188ReO

4 peräisin

188W /

188Re generaattori (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN). Vasta-aineet leimattiin

188Re suoraan sitoutumisen alennetaan

188Re kehitettyyn-SH-ryhmä on vasta aikaisemmin kuvatulla [11].

Immunofluoresoivat havaitseminen viruksen vasta kasvainsoluissa

kasvainsolut kasvatettiin dia kammioissa 37 ° C: ssa 12 tunnin ajan. Väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä kolme kertaa. Koko menettelyn, solut pestiin 3 kertaa PBS: llä jokaisen käsittelyn jälkeen. Ne kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä huoneenlämpötilassa 20 min, minkä jälkeen läpäiseväksi 0,3% Triton-X100 PBS: ssä huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. Kiinteät ja läpäiseviksi soluja blokattiin 5% BSA plus 0,1% Triton X-100 PBS: ssa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Virusantigeenit-spesifinen mAb: t laimennettiin 1:200 edellä BSA: ta ja Triton X-100-liuosta ja inkuboitiin solujen kanssa huoneen lämpötilassa 60 min. FTIC-konjugoitu kanin polyklonaalinen vasta-aine hiiren IgG: 1:300 laimennusta lisättiin soluihin 60 min inkuboinnin huoneen lämpötilassa pimeässä. Objektilasit katsella Olympus AX70 mikroskooppi (Melville, NY) varustettu FITC suodatin.

kasvainmuodoista

Kaikki eläinkokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti instituutin Animal Studies Albert Einstein College of Medicine. Ihmisen kohdunkaulansyövän CaSki- ja ihmisen maksasyövän Hep 3B2.1-7 solulinjat valittiin kasvainmuodoista perustuu sen ilmentymä E6 ja HBx, vastaavasti, ja niiden tumorigenecity nude-hiirissä. Kuuden viikon ikäiset naaras Nu /Nu CD1 nude-hiirissä ostettiin Charles River injektoitiin oikeaan kylkeen 10

7 CaSki tai Hep 3B2.1-7 solua 0,1 ml: ssa DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. CaSki- kasvaimet alkoi ilmestyä noin 60 päivää injektion jälkeen, Hep 3B2.1-7 kasvaimet-10 vuorokautta solujen injektion. Sillä biologista jakaantumista of HBx-erityisiä mAb, nude-hiiriin inokuloitiin 10

7 A2058 ihmisen metastaattisen melanooman solujen ja 10

7 Hep 3B2.1-7 solujen oikean ja vasemman sivun vastaavasti. Biologista jakaantumista ja hoito Kokeet aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat 0,3-0,7 cm halkaisijaltaan.

immunohistokemiallinen havaitseminen HPV E6 proteiinin CaSki- kasvaimissa

Kasvaimet otettu CaSki- tuumoreita kantavaa hiirtä kiinnitettiin