Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on gynekologinen syöpä näytteille korkein sairastuvuus ja parantaminen hoitoja on edelleen tarpeen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että estrogeeni-reseptorin beeta (ER) laskivat yhdessä munasarjojen syövän synnyn. Tässä esitämme näyttöä siitä, että uudelleen ER in BG-1 epiteelin munasarjasyövän soluja, jotka ilmentävät ERa, johdot

in vitro

laskuun tyvi- ja estradioli-edistänyt solujen lisääntymistä. ER vähensivät solujen S-vaiheessa ja lisätä yksi solujen G2 /M-vaiheessa. Molekyylitasolla, huomasimme, että ER vaimentua yhteensä retinoblastooma (Rb), fosforyloitu Rb ja fosfo-AKT solun sisällön sekä sykliineiksi D1 ja A2. Lisäksi ER oli suora vaikutus ERa, voimakkaasti estämällä sen ilmaisun ja toimintaa, joka saattaa selittää osan antiproliferatiivinen toiminta ER. Kehittämällä uutta prekliininen malli munasarjasyövän perustuu luminoiva potilaalle tehdä ksenograftin kateenkorvattomissa Nude hiirillä, me kertoo vielä, että ER ilmentyminen vähentää kasvaimen kasvua ja läsnäolo kasvainsolujen sivustoja etäpesäkkeiden vuoksi ja siksi parempi eloonjäämisen hiirillä. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot paljastavat mahdollisen kasvaimen vaimennin roolia ER munasarjasyöpää Karsinogeneesin joka voi olla potentiaalista kliinistä merkitystä valinnassa sopivin hoitoa potilaille.

Citation: Bossard C, Busson M, Vindrieux D, Gaudin F, Machelon V, Brigitte M, et al. (2012) Potential Role of estrogeenireseptorin Beta tuumorisuppressorina munasarjan epiteelin syövän. PLoS ONE 7 (9): e44787. doi: 10,1371 /journal.pone.0044787

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 elokuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Bossard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia ARC (Association pour la Recherche contre le Cancer, Grant nro 3582) (https://www.arc-cancer.net), The Ligue Nationale contre le Cancer (http: //www.ligue-cancer .netto). Muriel Busson tukivat FRM (Fondation pour la Recherche médicale) (https://www.frm.org). DV oli vastaanottaja Ligue Nationale contre le Cancer. CB tukivat HFSP apurahan (https://www.hfsp.org/). KB Lab tukee Agence Nationale de la Recherche (ANR, myöntää numero 2010 JCJC 1104 01) (https://www.agence-nationale-recherche.fr/), Université Paris-Sud, Institut National de la Santé et de la Recherche médicale (INSERM) ja Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité Val d’Oise) ja kuuluu laboratorion Excellence LERMIT (Laboratory huippuyksikössä tutkimus Medication ja innovatiivisia Therapeutics) tukee avustus alkaen ANR (Investissements d’Avenir). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yhden epiteelisolukerroksen, joka ympäröi munasarjat on tällä hetkellä uskotaan olevan yksi syy on preneoplastiset leesiot johtavat johtaa munasarjan epiteelin kasvaimissa, jotka muodostavat suuren enemmistön munasarjojen syöpien [1]. Epiteelin munasarjasyöpä (EOC) on seitsemänneksi yleisin syöpä. On kuitenkin vielä neljäs tappavin, koska se on vaikea diagnosoida varhaisessa vaiheessa, ja näin ollen, hoitoon [2]. Joko luokiteltu morfologisiin luokat (eli vakavien, mucinous, endomet-, ja kirkas solut), joka perustuu histologiseen kriteerien ja muistuta epiteelin komponenttien normaali synnytyskanavassa, tai viime aikoina, on luokiteltu matala- tai korkea-asteen kasvaimissa [2], EOC on monimutkainen sairaus, jolle etiologia tunnetaan hyvin huonosti. Novel markkereita ja tavoitteet hoitoja siis kipeästi.

munasarja on tärkein elin tuotannon estrogeenien, jotka pääasiassa vaikuttavat kasvuun, erilaistumiseen ja toiminta lisääntymiskudosten [3]. Kautta mitogeenisiä toimintaa, estrogeenit rooleja munasarjojen syövän synnyn. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, lisääntynyt munasarjasyövän riski potilailla, jotka saavat pitkäaikaista estrogeenikorvaushoitoa [4], [5], [6], [7], kun taas potilailla, joita hoidettiin suun kautta otettavan yhdistyvät estrogeenit ja progestiinit osoitti pienempi riski kehittää munasarjasyöpä [8], [9]. Estrogeeni toiminta välittyy kahden reseptorin, ERa ja ER, kaksi transkriptiotekijät suuren perheen tumareseptorien [10], [11]. Noin 40 60% munasarjojen syöpiä ilmaista ERa [12], mutta se on kiehtovaa huomata, että vain pieni osa heistä hyötyy antiestrogeenihoidon [13]. Rooli ER että munasarjojen biologian edelleen huonosti ymmärretty, mutta se näyttää olevan erilainen kuin ERa [14].

ER

knock-out eläimiä (βERKO) ovat subfertile, tuottavat vähemmän pentueet ja pennut päälle ylistimulaatiohoitoa induktion [15], [16]. Munasarjojen βERKO eläinten sisältävät vähemmän suuria antral munarakkuloita ja keltarauhasen verrattuna villin tyypin littermates, joka on samanaikainen alemmilla tuottaman estradiolin [17] ja alennettu ilmentyminen keskeisten geenien munasarja toiminto kuten aromataasin (

Cyp19a1

), LH-reseptorin (

Lhcgr

), ja prostaglandiini nopaliinisyntaasin 2 (

Ptgs2

) [18].

Useat tutkimukset ovat unraveled mahdollinen rooli ER in EOC. Erityisesti ER tasot olivat alhaisempia munasarjakasvaimia verrattuna normaaleihin kudoksiin [19], [20], [21], [22]. Lisäksi menetys ER ilmaisun voisi korreloida lyhyemmän eloonjäämisaste munasarjasyöpä potilaiden [23]. ER tasot liittyy myös metastaattinen imusolmuke asema [24]. Polymorfismi (rs127572) on

ER

geeni on myös tunnistettu äskettäin ja osoitettu liittyvän lisääntynyt riski saada munasarjasyöpä [25]. On kuitenkin vielä tiedetä, onko tämä polymorfismi vaikuttaa ilmentymistä ER. Solunsisäisen sijainnin ER kasvainsoluissa näyttää olevan tärkeä. Itse asiassa hiljattain tehty tutkimus on osoittanut, että ER paikallistettiin sytoplasmassa kasvainsolujen, kun se oli pääasiassa ydinvoiman normaaleissa epiteelisoluissa [26]. Lisäksi sytoplasmista ilmentyminen ER oli korreloi huonon lopputuloksen potilaille, joilla on edennyt vakavien munasarjasyöpä [14]. Nämä havainnot yhdessä edellä mainitun kliinisen korrelaatioita ER ja potilaan selviytymistä, johtavat meidät oletuksen, että ER on kriittinen tekijä munasarjakasvain etenemiseen ja rajaamiseksi tarkka osuus tämän reseptorin molekyyli polkuja taustalla EOC syövän syntymistä.

tätä tarkoitusta varten käytimme BG-1-soluissa, kuten solu malli ja käytti ortotrooppinen ksenografti hiirimallissa olemme kehittäneet. BG-1-solulinja on ihmisen EOC solulinja, joka on peräisin kiinteän primaarikasvaimen kudosta potilaasta, joilla on vaiheen III, huonosti eriytetty munasarjan adenokarsinooma [27]. Nämä solut ilmentävät ERa ja ovat herkkiä estrogeenit leviämisen kannalta [21], [28]. Kokeellisissa malleissa munasarjojen syövän synnyn ovat välttämättömiä ymmärtää molekyylitason mekanismeja kehittämiseen taudin, mutta myös tehon arvioimiseksi uusien terapeuttisten lääkeaineiden [29]. Useita malleja on kehitetty, mukaan lukien erilaiset ksenografti- ja siirtogeenisiä malleja, yksikään ole täysin tyydyttävää. Ksenograftimalleja että tällä hetkellä käytetään joko vatsaonteloon, ihon alle tai ortotooppisesti intrabursal munasarjoissa. Vain harvat raportit kuvaavat potilaalle tehdä ksenograftin. Kuitenkin potilaalle tehdä soluistutusryhmä voidaan pitää useamman fysiologisen, kuten syöpäsolut suoraan istutettiin munasarjojen ympäristössä ja voi johtaa etäpesäkkeitä. Siksi tutkia roolia ER vuonna EOC Karsinogeneesin päätimme hyödyntää ortotrooppinen ksenografti hiirimallissa perustuu käyttöön lusiferaasin (Luc) ilmentävä ihmisen epiteelin munasarjasyöpä BG-1-soluissa.

osoittavat tässä, että uudelleen ER in BG-1-soluissa käyttäen adenoviruksen johdot

in vitro

inhiboitumiseen sekä perus- ja estradiolin indusoimaa soluproliferaatiota. ER kykenee sen antiproliferatiivista toimintaa vähentämällä taajuuden solujen S-vaiheessa, kasvua solut G2 vaiheessa, sekä muuttunut ilmaus solusyklin sääntelyviranomaisten. Molekyylitasolla, ER pystyi tukahduttaa ilmaisun, aktiivisuus ja signalointi ERa, ja siten estää sen proliferatiivisen toimintaa. Lisäksi ER pystyi voimakkaasti vähentämään kehittämiseen ortotooppisten munasarjojen ksenografti sekä tuumorisolujen läsnäolo sivustoja etäpesäkkeiden, mikä johtaa lisääntyneeseen eloonjäämiseen hiirillä. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot tukevat rooli ER kasvaimen vaimentimen EOC karsinogeneesissä.

Tulokset

Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että ER on heikosti ilmaistu EOC kudoksissa ja solulinjoissa verrattuna normaaliin kudokseen [11]. Otimme hyväkseen ihmisen EOC solulinjaa BG-1, joka ilmaisee endogeenisten tasojen ERa ja on herkkä estrogeenit [27]. Täällä ensimmäinen vahvistaa, että BG-1-soluissa näyttää matalan vakaan tilan tasoja ER tuotteiden, eli mRNA ja proteiineja (Fig. 1A, B). Seuraava askel kohti arvioidaan roolia ER munasarjojen syövän synnyn oli palauttaa ilmaisunsa munasarjasyöpäsoluja. Näin ollen, BG-1-soluja infektoitiin selkäranka (Ad5) tai ihmisen

ER

(Adβ), joka koodaa adenoviruksen [30], [31].

ER

yliekspressio todellakin saatu Adβ-tartunnan soluja validoitu reaaliaikaisella PCR ja Western blot analyysit (Fig. 1A, B). Mielenkiintoista, ER tasot olivat voimakkaasti alas-säädellä estradioli (E2) sekä RNA ja proteiini tasoilla. Lisäksi ilman ER, ERa tasot olivat myös alas-säädellä E2, joskin vähemmässä määrin. Kun ER otettiin käyttöön soluissa, pohjapinta ekspressiotaso ERa puuttuessa E2 vähennettiin ja puoleen. Läsnäolo ER voimakkaasti vähentynyt ERa tasot E2: n läsnäollessa (yli 15-kertainen pieneneminen 3 h), mikä viittaa siihen, että ER parantaa hajoamista ERa: n. Tämä johtuu todennäköisesti proteasomin riippuvan hajoamisen ERa ja ER proteiinit [32]. Vaikutukset ER ilmentymisen vaikutus estrogeeni reagointikykyä Sitten tutkittiin. Analysoimme kyky ER transaktivoimaan synteettinen lusiferaasireport- herkkä estrogeenien BG-1-soluissa. Endogeeninen ERa pystyi aktivoimaan reportteri läsnäollessa E2 (Fig. 1 C). ER voimakkaasti tukahdutettu aktiivisuutta ERa vasteena E2, mikä viittaa siihen, että läsnä ERa, ER käyttäytyy pikemminkin repressorina kuin aktivaattorin estrogeenin signalointia. Varmistaakseen toimivuuden reseptorin tuotettujen, myös tarkastetaan toimintaa ER vuonna EOC solulinjassa PEO14 [33], joka raportoidaan ilmaista alhainen ERa (Fig. 1 E) ja siten ei vastaa estrogeenit [34] . Sekä ERa ja ER kykenivät stimuloimaan estrogeeniherkkä toimittaja upon E2 altistumista, vaikka ER oli hieman vähemmän aktiivisia kuin ERa (Fig. 1 D). Siksi puuttuessa ERa, ER säilyy kyky transaktivoida estrogeenin signalointireittejä. Kun ERa ja ER yhdessä ilmenivät PEO-14-solujen, aktiivisuutta reportteri E2: n läsnäollessa oli samanlainen kuin yhden ERa: n yksinään. Tämä viittaa siihen, että ER-negatiivisen PEO-14-solulinja, ER voi vaikuttaa ERa toimintaa. Western blot kokeissa PEO-14-solut osoittavat, että kun ERa ja ER ilmennettiin erikseen, niiden tasot olivat voimakkaasti vähentynyt E2: n läsnäollessa (Fig. 1 E). Kun ERa ja ER yhdessä ilmenivät, hajoamista ERa läsnäollessa E2 hieman lisääntynyt, mutta ei osuutta nähdään BG-1-soluissa. Sillä ER, -parin ERa parannettu hieman hajoamista ER. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että ERa tasoja ei säädellä samalla tavalla BG-1 ja PEO-14 soluja, mikä selittäisi ERa aktiivisuus ei vähennetä läsnäolo ER PEO-14 verrattuna BG-1 soluja.

BG-1-solut infektoitiin Ad5: llä tai Adβ adenovirukset ja käsiteltiin 24 tuntia kontrollivehikkelillä etanolilla (Control) tai E2-10

-8M (E2). Ilmentyminen ER ja RS9 viite geeni mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD ER ilmentymisen normalisoidaan RS9 3 riippumattoman kokeen. Mittaukset Adβ ja Adβ + E2 ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. ** P 0,001. B. Proteiinit erotetaan soluista tartunnan samoissa olosuhteissa kuin A ja käsiteltiin 0, 3, 6 tai 24 E2 10

-8M (E2). Tasot ERa ja ER analysoitiin western blot. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Ylempi bändi ER blot merkitty tähdellä vastaa epäspesifinen värjäystä. C. transkriptionaalinen aktiivisuus ER. BG-1-solut infektoitiin Ad5: llä tai Adβ adenovirukset ja transfektoitiin ERE2-TK-Luc toimittaja sekä β-galaktosidaasi toimittaja. Solut käsiteltiin etanoli ajoneuvon (Control) tai E2 (10-8 M) 24 tuntia. Tulokset osoittavat suhteelliset Luc toiminta (% arvoista Ad5-tartunnan soluja ilman E2) ± SD jälkeen normalisoinnin β-gal aktiivisuus (3 itsenäistä koetta). Mittaukset Ad5 + E2 ja Adβ + E2 ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. * P 0,05. D. PEO14 solut infektoitiin Ad5, Adα, Adβ tai yhdistelmä Adα ja Adβ adenoviruksen ja transfektoitiin ERE2-TK-LUC-reportterin kanssa β-galaktosidaasi toimittaja. Soluja käsiteltiin ohjattu ajoneuvo (Control) tai E2 (10-8 M) 24 tuntia. Tulokset osoittavat suhteelliset lusiferaasiaktiivisuudet (% arvoista Ad5 tartunnan soluja ilman E2) ± SD jälkeen normalisoinnin β-gal aktiivisuus (3 itsenäistä koetta). Mittaukset Adα, Adβ ja Adα + β ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. *** P 0,001. NS: merkityksetön. E. Proteiinit PEO14 infektoiduista soluista samoissa olosuhteissa kuin D ja vehikkeliä etanolilla (Control) tai E2 10

-8M (E2) 3, 6 tai 24 h analysoitiin western blot, jossa vastaan ​​ERa ja ER . Aktiini käytettiin latauskontrollina. Ylemmän kaistaleen merkitty tähdellä oikeassa paneelissa vastaa epäspesifinen värjäystä.

vieressä tutkittu vaikutuksia on

ER

ilme syöpäsolujen leviämistä. BG-1-soluissa tartunnan Ad5 tai Adβ adenovirukset kasvatettiin

in vitro

puuttuessa tai E2: n läsnäollessa. Kuten odotettua, E2 stimuloi leviämisen ohjaus BG-1-soluissa (kuvio. 2A). Mielenkiintoista, ER tukahdutettu 50% sekä perus- että E2-riippuvaista lisääntymistä BG-1-soluissa. Havaitsimme myös antiproliferatiivista vaikutusta ER vuonna ERα- ja ER-negatiivinen PEO14 soluissa. Kuitenkin, tämä inhibitio ei vaikuttanut E2 (kuvio S2). Vaikka

in vitro

vaikutuksia ER on havaittu tähän mennessä hyvin vähän tiedetään sen

in vivo

toimia munasarjasyövän malleissa. Ensimmäisenä lähestymistapa arvioida tässä vaiheessa, käytimme malli ihonalaisen injektion. Jotta herkkä, dynaaminen ja varhaisen seurannan kasvaimen kasvua, meillä on stabiilisti transfektoitu BG-1 solut konstitutiivinen Luc toimittaja. Joilta munasarjat kateenkorvattomia Nude istutettiin pelletti kolesteroli- tai E2 ja ruiskutetaan BG-1-soluissa tartunnan Ad5 tai Adβ adenovirukset. BG-1-soluissa muodostaa kasvaimia vain E2: n läsnäollessa (Fig. 2B).

ER

ilmaisun merkittävästi vähentynyt 70% E2-vauhditti BG-1-soluissa, mikä tukee mahdollisen antiproliferatiivinen rooli ER vuonna EOC.

kasvu BG-1-soluissa , jotka ilmentävät tai ER, seurattiin

in vitro

käyttäen solu laskuri. BG-1-soluja maljattiin 24-kuoppalevyille ja viljeltiin, kun läsnä on ajoneuvon tai E2 (10

-8M). Leviämisen ilmaistaan% valvonnan kasvatettujen solujen päivänä 0. Tiedot ovat keskiarvo ± keskihajonta kolmen rinnakkaisen. Mittaukset Ad5 + E2 ja Adβ + E2 ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. ** P 0,001. B. ER estää kasvaimen kasvua Bioluminoivan ihonalaisen hiirimallissa. BG-1-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti Luc ja tartunnan Ad5 tai Adβ adenovirukset injektoitiin ihon alle ovariektomisoiduissa naisten Nude hiirillä. Lusiferaasin aktiivisuutta seurattiin 25 päivää. Tulokset ilmaistaan ​​fotoneja /s (Ph /s) ja edustavat keskiarvoa ± SD 8 eläimistä. Mittaukset Ad5 + E2 ja Adβ + E2 ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. * P 0,05.

Sitten tutkitaan mekanismeja vastuussa kasvaimia torjuvaa vaikutusta ER. Solusyklin jakautuminen vertailtiin virtaussytometrialla valvonta- ja ER-ilmentävät BG-1-soluissa (kuvio. 3A). Emme havainneet mitään SubG0 huippu, mikä viittaa siihen, että ei apoptoosia tapahtunut.

ER

ilmaisua ei muuttanut osuus BG-1 soluja G0-G1 vaiheessa, mutta se vähenee voimakkaasti, että solujen S-vaiheessa. Huomasimme myös, että

ER

β ilmaisua laukaisi lisääntynyt solujen määrä G2-M-vaiheessa solusyklin. Ilmaisu solusykliaktiivisuuden merkkiaineiden oli seuraava seurattiin Western blot analyysit (Fig. 3B). Useat solun lukiertosäätelijöistä kuten Sykliinit A ja D1, AKT ja Rb raportoidaan säädellä estrogeenien [35]. Havaitsimme, että fosforylaatio AKT nostettiin heti E2 hoidon Ad5-tartunnan BG-1-soluissa (kuvio. 3B).

ER

ilmaus alensi fosfo-AKT sisältöä sekä ajoneuvo- ja E2-teated solut ja tämä tapahtui 3, 6 ja 24. ER aiheutti samanlaisia ​​muutoksia sykliini D1 yhteensä Rb ja fosforyloitu Rb ilme. Todellakin, tasot sykliini D1 yhteensä Rb ja fosforyloituu Rb olivat ajan säädellään E2 hoitoa Ad5 infektoiduissa soluissa ja tämä induktio väheni ER. Sykliini A2 näytetään myöhään induktio 24 jälkeen E2 hoidon ja tämä väheni läsnäolo ER.

BG-1-soluja kerättiin 24 infektion jälkeen Ad5 tai Adβ adenovirukset ja analysoitiin solusyklin jakeluun. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM 3 kokeen. Ad5 ja Adβ ryhmiä verrattiin parittomalla Studentin

t

testiä. ** P 0,001. B. BG-1-solut infektoitiin Ad5 tai Adβ viruksia. Infektion jälkeen soluja käsiteltiin 3, 6 tai 24 kanssa ajoneuvon (etanoli, C) tai 10

-8M E2. 30 ug proteiinia uutteet käytettiin Western blot. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Ellei suhde kohde-proteiinien yli β-aktiini on esitetty alla geelit. Edustajalle 2 kokeita.

Tutkimaan edelleen

in vivo

rooli ER munasarjasyöpää Karsinogeneesin voimme perustaa enemmän fysiologinen malli potilaalle tehdä istutuksen kasvainsolujen munasarjoissa. Ad5- tai Adβ-tartunnan BG-1-Luc solua injektoitiin vasemman munasarja ja kasvaimen kasvua seurattiin bioluminesenssi. Kuten on esitetty kuviossa. 4A,

ER

ilmaisu merkittävästi esti kasvaimen kasvua. Kun eutanasia päivänä 28 injektion jälkeen ohjaus hiirillä näkyy selvä lisäys vatsakalvon määrän ja kasvaimen tilavuuden vasemmassa munasarja (Fig. 4B). Jyrkästi, volyymi sekä vatsakalvon ja munasarja näytti paljon pienempi hiirillä ruiskutetaan ER-ilmentävien BG-1-soluissa. Me seuraavaksi selvitettävä, metastaattinen prosessi vaikutti

ER

ilme. Jotta tähän päästäisiin, keuhko-, maksa- ja puolella oikeaa munasarja kerättiin. Laajuus kasvainsolujen läsnä näissä elimissä arvioitiin mittaamalla Luc aktiivisuus meidän potilaalle tehdä mallissa. Lusiferaasiaktiivisuus havaittiin keuhkoissa, maksassa ja vastapuolinen munasarja injektoitujen hiirien Ad5-tartunnan BG-1-soluissa, (Fig. 5A). Mielenkiintoista on, että

ER

ilmaisu vähensi voimakkaasti tuumorisolujen läsnäolo, ja mahdollisesti metastaasit kaikki nämä elimet, mikä viittaa siihen, että ER kykenee kaksoisrooli tuumorin kasvua ja levittämistä. Tämä vahvistettiin

in vitro

haavojen kokeissa osoittaa, että

ER

ilmaisu vähentää motiliteettia BG-1-soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Koska ER vaikutti sekä kasvaimen kasvua ja solujen levittämistä, mietimme onko tämä voisi mahdollistaa parantaa hiirten eloonjäämistä. Hiiriä seurattiin 80 päivän ajan ja päivittäin tarkastettava merkkejä sairastuvuuteen.

ER

ilmentymisen merkittävästi viivästynyt kuolema kahden kuukauden kuluttua injektion Adβ-tartunnan BG-1-soluissa, 50% hiiristä edelleen säilynyt (kuvio. 5B). Tämä on voimakas kontrasti kanssa 100% kuolemaan vertailuhiiriin jota esiintyy alle kaksi kuukautta.

BG-1-Luc soluissa tartunnan Ad5 tai Adβ adenovirusten injektoitiin vasemmassa munasarjassa Nude hiirillä. Luc aktiivisuutta seurattiin 35 päivän kuvattu kuvassa. 1C. Tulokset ilmaistaan ​​fotoneja /s (Ph /s) ja ne edustavat yhdessä edustavassa kokeessa, joka vastaa keskimääräistä ± SD vähintään 5 eläintä ryhmää kohti. Mann-Whitney-testiä käytettiin vertailussa. * P 0,05 ** p 0,01. Edustava kuva päivä 35 näkyy. B. Edustavia kuvia kokonaisista eläimistä ja sukuelinten eläinten uhrattiin päivänä 35 näytetään.

Nude hiiriin ruiskutettiin BG-1-Luc solujen samoissa olosuhteissa kuin kuviossa. 4. lopetettiin 28 päivää injektion jälkeen. Keuhkot, maksa ja oikea kontralateraalista munasarja otettiin ja Luc aktiivisuus määritettiin kuten edellä mainittiin. Tulokset ilmaistaan ​​fotonit /s /mg proteiineja ja edustavat keskiarvoa 5 eläintä ± SEM. Mann-Whitney-testiä käytettiin vertailussa. * P 0,05 ** p 0,01. B. Kaplan-Meierin selviytymisen käyrä. 10 hiiret olivat ortotooppisesti ksenosiirrettyjä BG-1-soluissa, jotka ilmentävät stabiilisti Luc, tartunnan Ad5 tai Adβ adenovirukset, seurattiin päivittäin kehittämiseen hengitysvaikeudet, halvaus ja laihtuminen, ja lopetettiin heti, jos huomattava. P-arvo on yksi saatu log-rank testejä.

Keskustelu

Me raportoimme tässä, että käyttöönotto ER vuonna munasarjasyöpäsoluja näyttämällä endogeenisten tasojen ERa johtaa voimakkaaseen esto on

in vivo

kasvun ja solujen levittämistä, välittyvät valvonta ERa: n ilmentymisen ja signalointi.

in vitro

leviämisen kokeet osoittavat selvästi esto E2-riippuvaista proliferaatiota jonka ER että ERa-positiivisten munasarjasyövän solulinja BG-1. Tämä on ensimmäinen osoitus antiproliferatiivista vaikutusta ER käytettäessä ERa-positiivisten munasarjasyövän solulinja. Lisäksi ER voisi myös estää kasvua ERa-negatiivinen munasarjasyövän solulinja PEO-14. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aikaisempien havaintojemme saatu ERa-negatiivisia solulinjoja rintojen [31] ja eturauhasen [30] syöpäsolujen ja toinen tutkimus suoritettiin ERa-negatiivisten SKOV3 EOC-solulinjaa [36]. Soluissa, joilta puuttuu estrogeenin reseptoreihin, on todennäköistä, että palauttaminen ERa voi mahdollistaa proliferaation, kun E2 hoitoon, koska se laukaisee eri ohjelma transkription säätelyyn, verrattuna soluihin, jotka ilmentävät luonnollisesti ERa, kuten aiemmin osoitti rintasyöpäsoluissa [37 ]. Todellakin, havaitsimme, että endogeeniset ERa tasot BG-1-soluja voimakkaasti vähennetty läsnäolo ER, kun taas ER vaikutti vähemmän ERa tasoilla PEO-14 soluihin. Lisäksi ER voi estää täysin ERa aktiivisuutta BG-1-soluissa, mutta ei PEO-14-soluissa. Tämä voi johtua siitä, että BG-1-soluissa, endogeeninen ERa on valvonnassa sen oma promoottori, kun taas PEO-14-solut, eksogeeninen ERa ohjaa viruksen promoottori. Lisäksi voidaan sulkea pois, että kofaktoreita tarvittava ERa ja ER aktiivisuus kahdessa solutyypissä ovat erilaisia, mikä selittää niiden ero aktiivisuus BG-1 ja PEO-14-soluissa.

uutuus Tutkimuksemme on pitänyt ulottaa nämä tiedot kahteen

in vivo

malleissa. Jos kliininen todisteita perustuu ER tasoilla normaalissa kudoksessa ja syöpä mukaan tämä reseptori voisi toimia mahdollisena tuumorisuppressori toistaiseksi Prekliinistä todisteita on saatettu vahvistaa tämän hypoteesin. Ensin käytetään klassista ihonalaisen malli, vastaamaan tähän kysymykseen tarkemmin selvittää, onko estrogeeni vaadittaisiin vai ei. BG-1

in vivo

kasvu oli selvästi riippuvainen läsnäolosta estradiolin ja ER voisi toimia kasvaimen kasvua. Käytimme myös potilaalle tehdä istutuksen bioluminesoivista solujen munasarjoissa. Suostumuksella

in vitro

kokeissa havaitsimme vahvaa hidastanut kasvaimen kasvua, kun BG-1-solut ilmentävät ER.

Solusyklianalyysiä osoitti, että ER inhiboi solujen lisääntymistä, vähentämällä osuutta soluja S-vaiheessa, ja osuuden lisäämistä solut G2-M-vaiheessa. Tämä tilanne on samankaltainen kuin rintasyöpäsoluissa [38]. Molekyylitasolla, ER voisi vähentää fosforylaation Akt ja Rb. Lisäksi ER vähensi myös ilmaus sykliini D1 ja sykliini A. sykliini D1 vuorovaikutuksessa Sykliinistä riippuvaisen kinaasin-4 ja -6, mikä johtaa fosforylaatioon Rb ja dissosiaatio Rb /E2F monimutkainen, mikä aiheuttaa etenemisen kautta G1 [35]. Sykliini vuorovaikutuksessa sykliiniriippuvaisiin Kinase-2 edistää siirtymistä S G2 vaiheeseen [39]. Lisäksi, fosforylaatio AKT suosii G1 /S siirtymisen estämällä transkriptionaalista aktiivisuutta Foxo tekijöitä, jotka säätelevät sykliini D1 ja p21 ilmentymistä [40]. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että ER johtaa vähenemiseen AKT fosforylaatio, mikä puolestaan ​​johtaa vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 ja fosforylaatiota Rb.

miten ER voi vaikuttaa solujen lisääntymistä, olemme siitä, oliko se voisi suoraan muuttaa ERa ilmaisun ja signalointia BG-1-soluissa. Onkin mielenkiintoista huomata, että ER on myös syvällisiä vaikutuksia ERa tasoilla kuin se pieneni noin 15-kertaisesti ERa ilmaisun 3h. Vaikka tarkkaa molekyylitason mekanismeja osuus negatiivisen vaikutuksen ER on ERa in BG-1 soluja on vielä selvittämättä, laajuutta ja hajoaminen ERa on varmasti kriittinen sen aktiivisuus ja nämä parametrit muuttuvat ER läsnä vai ei. Itse asiassa vanhempien BG-1-soluissa, jotka ekspressoivat vain ERa, reseptorin kohdistuu myös E2-riippuvainen hajoamista. Tämä johtuu todennäköisesti proteasomaalisten hajoaminen reseptorin, kuten on esitetty useissa solutyypeissä aikaisemmissa tutkimuksissa [41], [42]. Paradoksaalisesti E2-riippuvaista proteasomaalisten hajoamista ERa vaaditaan myös täyden aktiivisuuden kautta sääntelyn vuorovaikutusta reseptorien kanssa sen koaktivaattoreiden [42] ja kierto ERa promoottorista sen kohdegeenien [43]. Tilanne näyttää erilaiselta, kun ER on ekspressoidaan kanssa ERa in BG-1-soluissa. Itse asiassa me raportoimme, että ER voitaisiin vähentää nopeammin ja voimakkaammin ilmentymistä ERa BG-1-soluissa, kun läsnä on E2, verrattuna soluihin, joissa vain ERa on läsnä. Tämä on yhtäpitävä sen kanssa, mitä havaitaan ERa-positiivisen rintasyövän solulinjan T47-D transfektoitu ER [44]. Tämä viittaa siihen, että ER voisi laukaista nopeasti proteasomaalisten hajoaminen ERa: n läsnä ollessa E2. Jos oletamme, että ERa ja ER muodossa heterodimeerejä kuten aikaisemmin on kuvattu [45], [46], ER saattaa lisätä hajoaminen ERa läsnä kompleksissa, muuttamalla sen rakenteen ja estää sitä toimimasta. Niinpä ERa olisi tehottomampia aktivoida sen kohdegeenien eikä voinut pelata sen proliferatiivisen rooli.

Itse lisäksi sen vaikutukset ERa ilme, emme voi sulkea pois, että ER vähentää myös ERa aktiivisuutta, kuten on esitetty transfektointi estrogeenia reagoiva toimittaja BG-1-soluissa. Tämä on sopimukseen aiemman tutkimuksen suoritetaan sopivasti ERa-positiivisen rintasyövän solulinjoissa, joissa ER transfektoitiin, mikä viittaa siihen, että ERa ja ER on erilliset tehtävät [47]. Tämä puolestaan ​​saattaa vaikuttaa E2-riippuvainen signalointi ERa, jota ei säädellä tasoa aktiivisuuden keskeinen tavoite liittyvien geenien leviämisen, kuten AKT, Rb, sykliini D1 tai sykliini A2. Lisäksi muut tutkimukset ovat negatiivinen toiminnan ER on ERa signalointi [44], [48]. Erityisesti ER on osoitettu muuttavan rekrytointi AP-1 komplekseja ERa kohdegeenien [44], jonka tiedetään toimivan synergiassa ERa. Kun heterodimerisoitu kanssa ERa, ER voi myös muuttaa kykyä ERa vuorovaikutuksessa koaktivaattoreiden. Aikaisempi tutkimus on myös ehdottanut Ying Yang toiminnan ER

in vivo

, joka on repressori ERa signaloinnin läsnäollessa ERa, mutta voi myös korvata ERa puuttuessa ERa [48]. Alas-säätely ERa ilmentymisen ER voi olla ainoa mekanismi kasvun inhibition ER, koska ER voi myös vähentää solujen kasvua ERa-negatiivisten PEO-14 soluihin. On mahdollista, että ER vaikuttavat suoraan tekijöitä soluproliferaatioon, kuten transkription jaksoihin, solu- lukiertosäätelijöistä vaan myös kasvutekijöitä.

ilmoittaa, että ER voi vain vähentää kasvua primaarikasvaimen, mutta voisi myös vähentää laajuus etäpesäke, tai ainakin läsnä tuumorisolujen eri elimissä. Olemme aiemmin osoittaneet, että ER voi estää

in vitro

syöpäsoluinvaasiota [31], mikä varmasti selittää laski levittämiseen havaittu. Emme kuitenkaan voi täysin sulkea pois sitä mahdollisuutta, että kasvun hidastumista primaarikasvaimen johtaa myös vähentynyt etäpesäke. Riippumatta vaikutus kohdistaman ER, tämä vähentäminen etäpesäke varmasti selittää elonjäämisetua hiirten istutettiin ER soluihin.

Yhteenvetona meidän havainnot tarjoavat todisteita skenaario, jossa ER toimii mahdollisena kasvaimeen vaimennin ja on potentiaalinen kohde tuleville hoidoille EOC. Tietääksemme tämä on ensimmäinen

in vivo

osoitus antiproliferatiivisia ja -metastatic toimia ER on prekliinisissä potilaalle tehdä mallin munasarjojen syövän synnyn. Tuloksemme yhdistää ER ja mestastasis prosessissa ovat täysin samaa mieltä kliiniset tutkimukset paljastavat, että ER ei ilmenny metastaattisessa muodoissa munasarjojen syöpien [20] ja menetys sen ilmaisun korreloi lyhyemmällä eloonjäämiseen [23]. Täällä lisäksi selvittää, että ER vaikuttaa suoraan ERa ilmaisun, solusyklin ja invasiivisia ominaisuuksia syöpäsoluja. Syyt osuus heikon ilmentymisen ER munasarjasyövän jäävät hämäräksi. Viimeaikaiset raportit ehdottaa mahdollisia epigeneettisellä muutoksia, jotka johtavat

ER

vaiennettu, kuten munasarjojen syöpäsolujen DNA metyylitransferaasi tai histonideasetylaasi estäjät voivat palauttaa sen ilme [49], [50], [51]. Toinen hypoteesi olisi etuoikeutettu hajoamista ER-proteiinin että proteasomin, jolloin alhainen tämän reseptorin syöpäsoluissa [32]. Nämä voivat olla raidat tutkia tulevaisuudessa ohjaukseen ER ilmaisun ja kehittää uusia hoitomuotoja munasarjasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

tuumorisolulinja

Ihmisen munasarjan solu