Krooninen sairaus

tiivistelmä

MAb 4C5 on solu läpäisemätön, anti-HSP90 hiiren monoklonaalinen vasta-aine, alun perin tuotettu käyttäen hybridoomateknologiaa. Olemme aiemmin osoittaneet, että mAb 4C5 spesifisesti tunnistaa sekä α- ja vähemmässä määrin β-isoformi HSP90. Lisäksi

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset paljastivat, että selektiivisesti toimintaa solun pinnan HSP90, mAb 4C5 merkittävästi heikentää syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Tässä kuvaamme käyttökuntoon mAb 4C5 osaksi hiiri-ihminen-kimeeran. Vielä tärkeämpää me raportoimme että mAb 4C5 ja näin ollen sen kimeeriset vastine ovat täysin vailla raskaan ketjun ja koostuvat ainoastaan ​​toiminnallinen kappa kevytketjudimeerisen. Kimeerinen vasta-aine on osoitettu säilyttää alkuperäisen vasta-aineen spesifisyyden ja toiminnallisia ominaisuuksia. Näin ollen se pystyy estämään toiminnan pinnan HSP90, mikä vähentää syöpäsolujen invaasiota

in vitro

. Lopuksi esitämme

in vivo

todisteita, jotka osoittavat, että kimeerinen 4C5 merkittävästi estyy metastaattisen karstanmuodostus MDA-MB-453-solujen keuhkoihin SCID hiirillä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kimeerinen kevyen kappa-ketjun vasta-ainetta voitaisiin mahdollisesti käyttää syövän vastaisen aineen, jolloin käyttöön uudentyyppinen vasta-ainefragmentin, joilla on alentunut mahdolliset haitalliset immunogeenisiä vaikutuksia, osaksi syöpähoitojen.

Citation: Sidera K, El Hamidieh A, Mamalaki A Patsavoudi E (2011) 4C5 Cell läpäisemätön Anti-HSP90-vasta-aineen kanssa syövän vastainen vaikutus, koostuu Yhden kevytketjudimeerisen. PLoS ONE 6 (9): e23906. doi: 10,1371 /journal.pone.0023906

Editor: Paul C. Driscoll, MRC National Institute for Medical Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: toukokuu 11, 2011; Hyväksytty: 28 heinäkuu 2011; Julkaistu: 1. syyskuuta 2011

Copyright: © 2011 Sidera et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lämpöshokkiproteiini 90 (HSP90) pidetään erittäin houkutteleva huumeiden tavoite syöpäterapialle, koska suurin osa sen asiakas proteiinien avainrooleja hankinnan ja /tai ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin [1] – [4]. Viime aikoina olemme ja muut ovat todenneet, että allas HSP90 solun pinnalla [5] – [8], jossa se on esitetty osallistua syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [9] – [11]. Lisääntyvä todistusaineisto vahvistaa edelleen käsitettä laaja-alainen ilmiö solunulkoisen HSP90 chaperoning, sekaantunut syövän etenemiseen ja metastaattinen leviäminen [12] – [16] siten tukemalla estäjiä, jotka kohdistuvat erityisesti solun pinnan HSP90. MAb 4C5 on solu läpäisemätön hiiren monoklonaalinen vasta-aine on tuotettu käyttäen hybridoomateknologiaa [17], joka tunnistaa spesifisesti sekä α ja vähemmässä määrin β isoformin HSP90 [8]. MAb 4C5 alun perin osoitettu estävän solujen vaeltamiseen prosessit

in vitro

kehityksen aikana hermoston [18], [19] vaikuttamalla aktiinisytoskeletonver- uudelleen järjestely ja muodostumista liikkuvia rakenteita kuten lamellipodioihin [8], [20]. Myöhemmin esitetty todisteita, jotka osoittavat sitoutumalla selektiivisesti pintaan altaan HSP90, mAb 4C5 vähentää merkittävästi melanooman solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [11]. Lisäksi mAb 4C5: n osoitettiin estävän solunulkoiseen vuorovaikutusta HSP90 ja kasvutekijän reseptorin ErbB-2: MDA-MB-453-rintasyöpäsolujen, mikä heikentää alavirran signalointia ja vähentää syöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota [21]. Lopuksi mAb 4C5 on osoitettu estävän toimiva vuorovaikutus erittyy HSP90 ja aktiivinen muotoja metalloproteinaasien 2 ja 9, on tarpeen, että entsyymien aktivointi, joka on välttämätön syöpäsoluinvaasiota ja ekstravasaation [14]. Nämä yhdistetyt tiedot osoittivat, että ainutlaatuinen kapasiteetti mAb 4C5 estämään spesifisesti solunulkoiseen altaan HSP90 vaikuttamatta monenlaisia ​​tärkeitä solunsisäisiä rooleja tämän kaperoni- voi olla kliinistä hyötyä hoidettaessa ihmisen syöpäsairauksia. Kuitenkin hiiren mAb: t eivät ole ihanteellisia terapeuttisia aineita, koska niiden potentiaali immunogeenisuuden edustaa rajoitus niiden kliinistä käyttöä. Soveltaminen hiiren mAb: iden ihmisten hoidossa on tullut toteutettavissa kynnyksellä yhdistelmä-DNA-tekniikoita, jotka on johtanut kehitystä kimeerisiä ja humanisoituja vasta-aineita, joilla on vähentynyt immunogeenisyys [22] ilman merkittävää häviötä affiniteetti, erityisesti kun kyseessä on kimeerisen vasta-aineet [23], [24].

nykyisen työn kuvaamme kloonaus ja sekvensointi mAb 4C5 geenit peräisin hybridoomasolulinjasta ja onnistunut rakentaminen toimiva hiiri-ihminen-kimeeran, joka on esitetty säilyttää ominaisuudet vanhempien vasta-aineen. Vielä tärkeämpää me raportoimme, että mAb 4C5 on täysin vailla raskas (H) ketju, ja se koostuu vain toiminnallisen immunoglobuliinin kevyen kappa-ketjun dimeerin ja sen ominaisuuksia voidaan toisteta sisältävän rekombinanttiproteiinin vain tämä valo (L) ketju polypeptidiä. Lopuksi osoittavat mahdollista terapeuttista tehoa tämän uuden tyyppisen vasta-aineen fragmentti.

Tulokset

MAb 4C5 on vasta-ainefragmentti täysin vailla raskaan ketjun

elektroforeettinen liikkuvuus mAb 4C5 tutkittu pelkistävissä ja ei-pelkistävä SDS-PAGE osoitti, että se ei ole tavanomaista IgG-molekyylin. Tarkemmin sanoen, kun puhdistettu mAb 4C5 suoritettiin pelkistävä SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus, jossa on anti-Fab, emme tarkkailla tyypillinen 25 kDa: n ja 50 kDa: n vyöhykettä, jotka vastasivat L- ja H-ketjun, vastaavasti tavanomaista IgG-vasta-ainetta, vaan yksi ainoa vyöhyke noin 25 kDa: n (Fig. 1A). Mielenkiintoista identtinen 25 kDa: n vyöhykkeen jälkeen saatiin immunoblottauksella anti-kappa L-ketjun vasta-aineella (Fig. 1A). Näin ollen, sen jälkeen kun ei-pelkistävät elektroforeesi immunoblottauksella näitä molempia vakio-vasta-aineita, osoittaa mAb 4C5 olla huomattavasti pienempi kuin perinteinen IgG1-molekyylin, koska se liikkui noin 50 kDa. (Fig. 1A). Lopuksi, ei immunoreaktiivisuus havaittiin elektroforeesin jälkeen mAb 4C5 sekä pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa, mitä seurasi immunoblottaus käyttämällä anti-Fcy (Fig. 1A). Nämä yhdistetyt tiedot osoittivat, että mAb 4C5 voi joko puuttuu osa sen H-ketjun, tai että se on täysin vailla H-ketjun. Jotta edelleen tutkia näitä mahdollisuuksia seuraavan kerran suoritetaan Northern blot-analyysi käyttäen IgG1 H-ketjun anturi. RNA on peräisin hybridoomasoluista, jotka tuottavat ehjän IgG1-immunoglobuliinin nimetty 2D10 toimi positiivisena kontrollina. Toisin kuin positiivinen kontrolli, ei lainkaan radioaktiivisuutta havaittiin hybridisaation jälkeen RNA: iden, jotka ovat peräisin mAb 4C5 hybridooma- ja NSO-myeloomasolut (negatiivinen kontrolli) (Fig. 1 B), mikä osoittaa, että mAb 4C5 voi kokonaan puuttuu H-ketjun geenin. Tämä vahvistettiin H-ketjun PCR-monistuksen kokeiluja. Monistamiseksi H-ketjun cDNA: n mAb 4C5, paneeli kahdeksan hiiren yleisen alukkeita ja polyA + pohjamaali vastaavasti kohdistuu 5′- 3 ’päät mRNA, testattiin useita erillisiä PCR-reaktioissa. Kaikissa testatuissa olosuhteissa mitään monistusta tietyn H-ketjun tuote havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä yhdistetyt tiedot osoittivat, että mAb 4C5 puuttuu H-ketjun ja siksi eteni rekombinanttiekspressiovektoriin vasta-aineen L-ketjun yksin voidakseen tutkia sen ominaisuuksia.

. Elektroforeettinen analyysi mAb 4C5, jonka jälkeen immunoblottauksella anti-hiiri-kappa-ketju, anti-hiiri-Fab ja anti-Fcy-vasta-ainetta. Ehjä IgG1 immunoglobuliini tuottaman 2D10 hybridoomasolut toimii positiivisena kontrollina. Pelkistävissä elektroforeesilla, jota seuraa Western blot anti-Fab-vasta-aine, yhdessä 25 kDa: n-immunoreaktiivinen kaistan havaitaan, sen sijaan, että 25- ja 50-kDa: n vyöhykettä, jotka vastasivat L- ja H-ketjun, vastaavasti, ehjän IgG1 . Tämä 25 kDa: n vyöhyke on identtinen vastaava vyöhyke kappa L-ketjun, kuten on esitetty Western blot anti-hiiri-kappa-ketju-vasta-ainetta. Under-ei-pelkistävissä elektroforeesilla, jota seuraa Western blot sekä anti-kappa ja anti-Fab-vasta-aineita, mAb 4C5 on esitetty siirtää noin 50 kDa, eikä 150 kDa odotettavissa ehjä IgG1-molekyylin. Ei mAb 4C5 immunoreaktiivisuus havaitaan elektroforeesin jälkeen sekä pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa, jota seuraa Western blot anti-Fcy-vasta-ainetta. Kun kyseessä on IgG1 immunoglobuliini samoissa olosuhteissa 50 kDa ja 150 kDa havaitaan, vastaavasti. B. Ei radioaktiivisuus havaitaan sen jälkeen Northern blot-analyysi 4C5 hybridoomasta johdetun RNA: n H-ketjun radioaktiivisesti koetin. RNA johdettu IgG1 tuottavien 2D10 hybridoomasolut ja NSO myeloomasolujen toimi positiivinen ja negatiivinen kontrolli, vastaavasti.

rakentaminen kimeerisen L-ketjun vasta-

Ensimmäinen vahvistus mAb 4C5 kappaketjun geenin ensimmäisen juosteen cDNA-templaattia suoritettiin käyttäen yleistä hiiren L-ketjun alukkeita mukainen Barbas [25]. PCR-tuote, joka vastaa täyspitkää mab 4C5 L-ketjun, sitten subkloonattiin pComb3H vektoriin. Sekvenssianalyysi rekombinantti L-ketjun (rec-4C5) paljasti, että se kuuluu kappaketjun alaryhmän I [26] (Fig. 2).

nukleotidi- ja aminohapposekvenssit L-ketjun variaabelin alueen mAb 4C5.

Kimeerinen L-ketju-vasta-aine (ch-4C5) rakennettiin korvaamalla hiiren LCκ koodaavan alueen kanssa, joka vastaa ihmisen LCκ insertti. Sekvenssin analyysi useiden yhdistelmä-DNA-klooneja vahvistettiin onnistunut kimeerisen hiiri-ihminen-vasta-aine.

Sekä rec-4C5 ja ch-4C5 ilmennettiin bakteerien periplasmiseen tilaan ja puhdistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Elektroforeettisen motilities puhdistetun vasta-aineet testattiin pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa ja havaittiin olevan samanlainen kuin vastaava motiliteettia alkuperäisen mAb 4C5-vasta-aine (Fig. 3A).

.

Vasen paneeli:

SDS-PAGE puhdistetun vasta-pelkistävissä olosuhteissa, jota seuraa Coomassie Brilliant Blue-R-värjäys paljasti kaikissa tapauksissa noin 25 kDa: n vyöhyke, joka vastaa L-ketjun.

Oikea paneeli:

Ei-pelkistävissä olosuhteissa vasta-aineita on esitetty siirtyä kuin L-ketjun dimeerin. B. Western blot MDA-MB-453-solulysaateista käyttäen mAb 4C5, rec-4C5, ch-4C5 ja kaupallisen anti-HSP90α vasta-aine, joka toimii positiivisena kontrollina. Kaikissa tapauksissa yksittäinen 90 kDa immunoreaktiivisia vastaava vyöhyke HSP90 havaitaan. C. Immunosaostus MDA-MB-453-solulysaateista anti-HSP90α, jota seuraa immunoblottaus joko hiiren tai yhdistelmä-DNA-vasta-aineita. Kaikissa tapauksissa yksittäinen immunoreaktiivisia kaistan havaitaan. D. Käänteinen immunosaostuskokeissa MDA-MB-453-solulysaateista käyttäen mAb 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5, jonka jälkeen Western blot anti-HSP90α. Kaikissa tapauksissa yksittäinen immunoreaktiivisia kaistan havaitaan mikä osoittaa, että molemmat yhdistelmä-vasta-aineet tunnistavat HSP90.

ch-4C5 tunnistaa erityisesti HSP90

Jotta tutkia vasta-aineiden spesifisyys, western blot analyysi suoritettiin MDA-MB-453 rintasyövän solulysaateista käyttäen kaupallista polyklonaalista anti-HSP90α vasta-aineella (Chemicon International, USA), mAb 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5. Kaikissa tapauksissa on yhtä ja samaa immunoreaktiivisia bändi havaittiin (Fig. 3B), vahvistetaan, että molemmat rec-4C5 ja ch-4C5 säilyttävät spesifisyyden isän mAb 4C5. Tämä tulos varmistettiin edelleen immunosaostuksella suoritetuissa kokeissa esipuhdistettiin MDA-MB-453-solulysaateista anti-HSP90α, jota seurasi immunoblottaus mAb 4C5, rec-4C5 tai ch-4C5. Kaikissa tapauksissa yksittäinen immunoreaktiivisia bändi havaittiin, mikä osoittaa, että kimeerisen L-ketjun tunnistavat tiettyjä HSP90 (Fig. 3C). Sama tulos saatiin, kun immunosaostus suoritettiin käyttäen mAb 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5 ja sen jälkeen Western blot anti-HSP90α vasta-aineella (Fig. 3d). Kaikissa kokeissa merkityksetön IgG käytettiin negatiivisena kontrollina.

ch-4C5 on solu läpäisemätön ja ei vaikuta toimintaan solunsisäisen HSP90

Jotta tutkia ch-4C5 sitoutuu pintaan HSP90, tallentamattomiin MDA-MB-453-soluja inkuboitiin joko rec-4C5 tai ch-4C5 kun kulttuuriin. Näin ollen, vasta-aineet oli pääsy vain ulkopinnalle soluja. Inkubaation jälkeen solut käsiteltiin epäsuoran immunof- käyttäen fluoresoivasti leimattua sekundääristä vasta-ainetta. Havaitut Tyypillinen pistemäinen immuunivärjäystä vahvisti solun pinnan merkintöjä (Fig. 4A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun anti-HSP90α ja mAb 4C5 (Fig. 4A). On huomionarvoista, että samalla tavoin kuin mAb 4C5, ch-4C5 sekä rec-4C5 tunnistavat myös solunsisäisen altaan HSP90 osoittaa immunof- kiinnittämisen ja permeabilisaation jäl- MDA-MB-453-soluja (Fig. 4B). Lopuksi, vasta-aineiden sitoutuvan elää MDA-MB-453-soluja tarkkailtiin eri aikavälein. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, samoin kuin mAb 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5 ei sisäistetty ja pysyi sitoutuneen solun pinnalla jopa 24 tuntia kulttuuriin.

. Immunof- merkintöjä MDA-MB-453-solujen avulla sekä rec-4C5 ja ch-4C5. Pistemäinen immunoleimaus se tarkoittaa pintaa altaan HSP90. Negatiiviset kontrollit tehtiin käyttämällä vasta-ainetta, oli solunsisäinen β tubuliinia (data ei näytetty). Mitta-asteikko: 20 um B. immunof- havaitseminen solunsisäisten HSP90 kiinteissä MDA-MB-453-solujen, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100. Samoin kuin hiiren vasta-, rec-4C5 ja ch-4C5 tunnistavat solunsisäiseen altaan HSP90. Mitta-asteikko: 20 um C. vasta-aineen toteamiseksi sisäistämisen, elävät solut inkuboitiin vasta-aineiden eri aikavälein, kiinnitettiin sitten, permeabilisoitiin ja fluoresoivasti leimattua. Ei sisäistämisen mAb4C5, rec-4C5 ja ch-4C5 on havaittu edes 24 tunnin inkubaation jälkeen. Sitä vastoin anti-HSP90α vasta-ainetta voitu havaita solunsisäisesti sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. Mitta-asteikko: 20 um D. MDA-MB-453-solulysaateista, käsiteltiin mAb 4C5, rec-4C5, ch-4C5 ja anti-HSP90α analysoitiin western blot käyttämällä vasta-aineita ErbB2: ta vastaan, Akt, CRAF ja HSP90α. Aktiini toimi latauskontrollina. MAbin läsnä 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5 ei vaikuttanut tasot kinaasien verrattuna kontrolleihin. Sitä vastoin solun läpäisevä anti-HSP90α-vasta-aine vähensi merkittävästi tasoilla ErbB2, Akt ja CRAF.

merkitys ch-4C5 solun läpäisevyyttä tutkittiin seuraamalla tasoa osajoukon solunsisäisen HSP90 asiakkaan proteiineja. Tähän mennessä yli 100 solunsisäisiä HSP90 asiakas proteiineja on tunnistettu. Cell läpäisevä HSP90-inhibiittorit indusoivat hajoaminen näiden proteiinien koska niiden stabiilius riippuu solunsisäinen HSP90-toiminto [3]. Koska meidän tiedot osoittivat, että mAb 4C5 ja myöhemmin rec-4C5 ja ch-4C5 ovat solun läpäisemätöntä, tutkimme niiden kykyä vaikuttaa vakautta kolme hyvin tunnettu HSP90 client proteiineja, Akt, CRAF ja erbB-2. Inkuboinnin jälkeen MDA-MB-453-solujen kanssa eri pitoisuuksilla mAb 4C5, rec-4C5 ja ch-4C5, tasot Akt, kä ja ErbB2 seurattiin western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa 4D näillä vasta-aineilla ei ollut vaikutusta steady-state tason tahansa kinaasien tutkittu. Sitä vastoin, kun soluja inkuboitiin solua läpäisevän anti-HSP90α, ekspressiotasot näiden kinaasien vähenivät merkittävästi (Fig. 4D).

ch-4C5 estää syöpäsolujen invaasiota

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mAb 4C5 inhiboi MDA-MB-453 rintasyöpä ja B16-F10-melanooma soluinvaasiota on haavan paranemista määritys [11], [21]. Sen varmistamiseksi, että ch-4C5 esiintyy sama funktionaalinen ominaisuus, suoritimme

in vitro

haavojen määrityksiä käyttäen MDA-MB-453 ja B16 F10 syöpäsoluja. Ohjaus kasvatettiin joko pelkästään viljelyalustassa, tai elatusaineessa, joka sisälsi 200 ug /ml merkitystä BM88-vasta-aine. Tilastollisesti merkittävää eroa ei havaittu kahden tyyppisiä tarkastuksia käytetty. Keskiarvo kahden kontrolli pidettiin 100% ja haavan. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, B läsnäolo ch-4C5 elatusaineessa vähensi merkittävästi laajentaa ja MDA-MB-453 syöpäsoluinvaasiota sisällä siirtymistä raon jälkeen 24 h, verrattuna kontrolliviljelmiin. Tarkemmin sanottuna, kun läsnä on ch-4C5 johti 46%: n inhibitio haavan sulkeminen, joka oli samanlainen kuin se, joka saavutetaan anti-HSP90α, sekä mAb 4C5 ja rec-4C5 sisällytettiin kasvualustaan ​​(Fig. 5A , B). Palkit kuvassa. 5B edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SEM. Sisällä yksi kokeilu, kukin ehto testattiin kolmena kappaleena. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä B16 F10-melanoomasoluja ja kasvavia pitoisuuksia ch-4C5, joka tuotti annoksesta riippuvaisen inhibition soluinvaasion (Fig. 5C, D). On tärkeää huomata, että haavan paranemista määrityksen vaikutus ch-4C5 on suunnattu soluinvaasion eikä solun proliferaatiota arvioi riippumaton MTT-määrityksellä (tuloksia ei ole esitetty). Tämä on sopusoinnussa aiemmin julkaistu tietoja, jotka osoittavat läsnäolo mAb 4C5 kasvualustaan ​​B16 F10 [11] ja MDA-MB-453 [21], ei vaikuta solujen lisääntymistä, koska alhainen BrdU havaittiin ilman näkyvää erot puuttuessa tai läsnä ollessa vasta-aineen.

. Haavojen parantumisen määritys. Valokuvia edustavat vaihe-kontrastin kuvia saatu nolla kertaa (vasen paneeli) ja 24 tunnin (oikea paneeli) jälkeen tyhjästä muodostumisen, joka osoittaa MDA-MB-453 solumigraatio joko kontrolliviljelmien tai viljelmät mukaan lukien anti-HSP90α, mAb 4C5, suosi- 4C5 tai ch-4C5. Mitta-asteikko: 200 um. B. kvantitatiivinen vaikutus vasta sulkemisesta haavan. Lisäämällä 200 ug /ml anti-HSP90α ja mAb 4C5 viljelyalustassa johti 48% ja 55%: n vähennys haavan, vastaavasti verrattuna valvoa viljelmiä, joita pidetään johti 100%: een haavan sulkemiseen. Lisäämällä 200 ug /ml rec-4C5 ja ch-4C5 elatusaineessa johti 46% ja 46% inhibitio haavan, vastaavasti. Erojen tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Studentin t-testiä. Läsnäolo anti-HSP90α, mAb 4C5, rec-4C5 tai ch-4C5 oli tilastollisesti merkitsevä vaikutus haavansulkemiseen (p 0,01 kussakin tapauksessa). C. Phase-kontrastin kuvia saatu nolla kertaa (vasen paneeli) ja 24 tunnin kuluttua alusta muodostumisen (oikea paneeli), joka osoittaa B16 F10 melanooma soluinvaasiota on haavan paranemista määritys läsnäollessa 200 ug /ml ch-4C5. Mitta-asteikko: 200 um. D. kvantitatiivinen vaikutus kasvavien pitoisuuksien ch-4C5 on hyökkäys tasosta B16 F10-melanoomasoluja. Läsnä oli 50 ug /ml ch-4C5 johti 15%: n inhibitio hyökkäystä, kun on lisätty 100 ug /ml ja 200 ug /ml ch 4C5 johti 21% ja 43% inhibitio muutto, vastaavasti verrattuna kontrolliviljelmiin, jotka olivat katsoa aiheutuvan 100% haavan sulkemiseen. E. visualisointi kuolleita soluja käyttäen trypaanisinivärin. In ch-4C5 käsitellyissä viljelmissä, solun kuoleman esiintyvyys on samanlainen kuin havaittiin kontrolliviljelmissä. Sen sijaan, että käsitellyissä viljelmissä anti-HSP90α-vasta-aine, joka on paljon suurempi määrä soluja värjätään trypaanisini, mikä osoittaa lisääntyneen solukuoleman Scale bar, 30 um. F. Ohjaus ja ch-4C5 käsitellyt solut fiksoitiin läpäiseviksi ja värjättiin fluoresoivasti leimattua phalloidin. Mittakaava 40 pm G. Korkeampi suurennos osoittaa phalloidin värjäytymistä (F-aktiini). Ch-4C5 estää tehokkaasti leviämisen lamellipodioihin. Mitta-asteikko: 16 um.

Tässä vaiheessa on huomattava, että estävää vaikutusta anti-HSP90α vasta-aineen MDA-MB-453 hyökkäys oli suurelta osin lisääntyneen solukuoleman arvioituna trypaanisinisellä värjäystä, joka valikoivasti värit kuolleita soluja (Kuva. 5E). Sen sijaan, kun viljelmiä käsiteltiin mAb 4C5 ja ch-4C5, ilmaantuvuus solukuolema oli samanlainen kuin havaittiin kontrolliviljelmissä (Fig. 5E). Tämä tulos tukee edelleen, että ch-4C5, toisin kuin solun läpäisevä anti-HSP90α-vasta-aine, on solu läpäisemätön ja ei vaikuta solunsisäistä allas HSP90, joka on tärkeä solujen eloonjäämistä.

Lopuksi nämä viljelmät tutkittiin suhteessa aktiini uudelleen järjestely dynamiikka käyttäen fluoresoivasti leimattua phalloidin. MDA-MB-453-solut altistettiin ch-4C5 olivat vähemmän leviämistä verrattuna soluihin kontrolliviljelmissä, ja niiden morfologia oli osoitus liikkumaton soluissa. Lisäksi kun visualisoidaan suuremmalla suurennuksella lamellipodioihin käsitellyissä viljelmissä oli vähemmän kehittyneitä ja vähemmän levittää verrattuna lamellipodioihin vertailuviljelmissä (Fig. 5 F, G). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa aiemmin julkaistujen tietojen suhteen vaikutuksesta mAb 4C5 on aktiini uudelleen järjestely ja lamellipodioihin kehitystä [21].

ch-4C5 vähentää MDA-MB-453 metastasoitunut laskeuma keuhkoihin SCID hiiret

vieressä pyrki tutkimaan

in vivo

vaikutus ch-4C5 on metastasoitunut käyttäytymiseen MDA-MB-453 syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten, MDA-MB-453-soluja esi-käsitellyn tai 200 ug /ml ch-4C5 ja sitten leimattiin fluoresoivalla väriaineella DiO ja ruiskutettiin suonensisäisesti SCID-hiiriin häntälaskimon kautta. Kaksitoista tuntia injektion jälkeen, hiiret lopetettiin ja metastaattisen talletukset MDA-MB-453-soluja jäljitettiin ja arvioitiin keuhkoissa sekä valvonnan ja ch-4C5-käsiteltyjen ryhmien. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, merkittävä lasku laskeuman MDA-MB-453-solujen havaittiin ch-4C5 käsitellyissä hiirissä verrattuna kontrollieläimiin. Tarkemmin, kvantifiointi metastaattisen karstanmuodostus osoitti 38%: n inhibition ch-4C5 käsitellyillä hiirillä verrattuna kontrollihiiriin (Fig. 6B).

Ohjaus tai ch-4C5 käsitellyn MDA-MB-453-soluja leimattiin fluoresoivalla värillä DiO ja injektoitiin SCID-hiiriin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Arviointi metastaattisen talletusten suoritettiin useita tunteja myöhemmin. A. Edustavia kryoleikkeet keuhkojen valvontaa ja ch-4C5 käsitellyissä hiirissä. Nuolet osoittavat MDA-MB-453-solujen värjätään DiO läsnä keuhkokudoksessa. Merkittävä väheneminen laskeuman syöpäsolujen havaittiin keuhkoissa ch-4C5 käsitellyissä hiirissä. Mitta-asteikko: 100 um B. Kvantitatiiviset vaikutukset ch-4C5 on metastaattinen laskeuman MDA-MB-453-solujen keuhkoihin, osoitti 38%: n inhibitio verrattuna kontrollieläimiin. Palkit edustavat keskiarvoa kahdesta itsenäisen kokeen ± SEM. Tilastollinen merkitys erot testattiin Studentin t-testiä (p 0,01).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kuvaamme kloonaus ja sekvensointi anti-HSP90 hiiren monoklonaalinen vasta-aine , nimeltään mAb 4C5. Vielä tärkeämpää on, me osoitamme, että mAb 4C5 ei ole tavanomainen IgG-molekyylin, mutta sen sijaan se on täysin vailla H-ketjun ja koostuu ainoastaan ​​kappa-kevytketjun dimeerin. Tämä havainto oli aluksi tuetaan SDS-PAGE-elektroforeesilla denaturoivissa ja ei-denaturoivissa olosuhteissa, mikä osoittaa, että mAb 4C5 kulkeutuu unconventionally noin 26- ja 50-kDa, vastaavasti. Lisäksi, kun kokonais-RNA eristettiin mAb 4C5 tuottava hybridoomasolulinja tehtiin Northern blot -hybridisaatiolla käyttäen IgG1 H-ketjun cDNA: n radio-leimattu koetin, radio aktiivisuutta ei havaita. Kanssa edellä olevista tuloksista, kun yritimme täydentää H-ketjun cDNA yleispalvelua käyttävät hiiren H-ketjun alukkeiden emme voi eristää H-ketjun tuote kaikissa testatuissa olosuhteissa. Lopuksi epätavallinen mAb 4C5 vahvistettiin epäilyksettä, koska yhdistelmä-kappa L-ketjun ilmaistu bakteereissa osoitettiin säilyttää kaikki ominaisuudet isän vasta-, mukaan lukien antigeeniä sitovat ja

in vitro

eston syöpäsoluinvaasiota.

Tämä monoklonaalinen vasta-aine on alun perin tuotettu immunisoimalla hiiriä aivoperäinen kalvon osa 15 päivää vanha rotan alkioiden [17], ja sen osoitettiin spesifisesti tunnistaa ja estää toiminnan pinta HSP90 aikana solujen migraatioprosesseille [8]. Lisäksi mAb 4C5 osoitettiin merkittävästi hidastaa ja metastaasit syöpäsoluja. Tarkemmin sanottuna, on osoitettu, että tämän vasta-aineen estää melanoomasolujen invaasion ja metastaasin [11] sekä vuorovaikutus pinnan HSP90 solunulkoisen domeenin ErbB-2, joka johtaa heikentynyt alavirran signalointia ja sen jälkeen alennettua

in vitro

rintasyövän soluinvaasiota [21]. Aivan äskettäin Stellas et ai. [14] edellyttäen

in vitro

ja

in vivo

todisteita, jotka osoittavat, että mAb 4C5 epäsuorasti estää aktivoinnin pro-Gelatinaasien MMP-2 ja MMP-9, tarpeen syöpäsoluinvaasiota, ekstravasaatio ja etäpesäke. Nämä yhdistetyt tiedot edelleen tukevat ajatusta, että mAb 4C5 voisi olla käyttökelpoinen syövän terapeuttista ja suunnattu tutkimuksemme kohti määrittäminen aminohapporyhmittymä ja rekombinanttista ekspressiota tämän vasta-aineen.

On hyvin tunnettua, että hiiren vasta-aineiden on rajoitettu käyttää

in vivo

ihmisten hoidossa, koska niiden immunogeenisyys. Useamman tapauksissa tämä ongelma on voitettu käyttäen geeniteknologian lähestymistapoja kimeeristen hiiri-ihminen ja täysin humanisoidut vasta-aineet. Ottaen huomioon epäsovinnainen luonne mAb 4C5 yhdistettynä siihen, että aikana inhimillistämisen prosessin vasta affiniteetti usein alennetaan, me seuraavaksi käyttövalmiiksi hiiren mAb 4C5 toimivaksi hiiri-ihminen kimeeristä versiota, että samoin kuin isän vasta-sitoutuu pinta HSP90, on solu läpäisemätön ja estää syöpäsolujen invaasiota. Kimeerisen vasta-aineen, joka on suunniteltu korvaamalla Cκ- alueen isän hiiren vasta-aineen vastaava ihmisen CK-alue oli osoitettu säilyttää spesifisyys ja affiniteetti isän hiiren vasta-aineen.

Se on ollut yleisesti hyväksyttyä käsite, että vasta-molekyyli vaatii sekä H- ja L-ketjut täyden toiminnan [27]. Lisäksi, H-ketjun uskotaan olevan vallitseva tekijä vapaan energian antigeeniä sitovien, kun taas osuus L-ketju on tarkoitus rajoittaa [28], [29]. Jälkimmäinen ajatusta tukee lisäksi se seikka, että cameloids hallussaan luokan täysin toimivia vasta-aineita puuttui kokonaan L-ketjujen ja joka koostuu H-ketjun dimeerejä [30], [31]. In yhteydessä näihin havaintoihin, H-ketjut yksin osoitettiin vuorovaikutuksessa erilaisia ​​antigeenejä tietyllä tavalla (vaikkakin alemmalla affiniteetilla kuin kokonaisia ​​vasta-aineita), joka on johtanut soveltamista yhden verkkotunnuksen johdettujen vasta-aineiden H-ketjun [32] tutkimuksessa, bioteknologian sekä ihmisen terapeuttisina. Aikaisemmin on ollut satunnaista raportteja antigeenin sitoutumisen L-ketjuja. Ensimmäinen esimerkkejä vapaan inmmunoglobulin kevyiden ketjujen kyseessä ns Bence-Jones proteiineja. Nämä raportoitu L-ketjun dimeerejä ilmaistaan ​​useita myeloomasolut, kerätty virtsa ihmispotilaiden [33]. Lisäksi suuria määriä L-ketjujen havaittiin kerääntyä ekstrasellulaarisissa nesteissä ja kudoksissa potilailla, joilla on L-ketjun erittävät kasvaimet [34]. Kappa-kevytketjun-dimeeriä, jossa CD4-antigeenin spesifisyys on peräisin hybridoomasolulinjasta kuvattiin vuonna 1987 Ledbetter et ai. [35] ja 1994 Mei Sun et al [36] on raportoitu, että puhdistettu L-ketjun monoklonaalinen vasta-aine vasoaktiivinen intestinaalinen polypeptidi (VIP), joka näkyy sekvenssi-spesifisiä ja korkean affiniteetin sitoutuminen VIP. Näin ollen, Nishimura et ai. [37] raportoivat sellaisen rekombinanttisen λ kevyen ketjun, joilla on huomattavasti korkeampi aktiivisuus sitoutumaan antigeeniin verrattuna koskematon vasta-aine. Lisäksi nämä tutkijat esittelevät todisteita siitä, että tämä yhdistelmä-kevyt ketju voisi toimia potentiaalisesti käyttökelpoinen väline kliiniseen käyttöön, kuten radio-immuunikuvannus- ja radio-immunoterapia keuhkosyöpien. On myös raportoitu, että vasta-aineen L-ketjun dimeerejä tuotettu hiiren hybridooma reagoivat ihmisen melanooma kudosten [38]. Vuonna 1998 Pereira et al. [39] osoittivat, että yksi L-ketjun variaabelin sekvenssi sisältää kaikki tekijöihin tarvittavat kardiolipiini sitovia, affiniteetilla samanlainen kuin koskematon vasta-aine. Viime aikoina, Dubnovitsky et ai. [40] ilmoitetaan, että yhdistelmä-V

L-domeenin monoklonaalinen vasta-aine vastaan ​​ferritiini säilyttänyt antigeeniä sitova toiminto affiniteetilla verrattavissa täyspitkän vanhempien vasta-aine.

Tässä työssä me ovat osoittaneet, että ch-4C5 on täysin vailla raskaan ketjun ja se koostuu L-ketjun dimeerin. ch-4C5 on suuri spesifinen aktiivisuus, kuten osoittaa immunoblottauksella ja immunof- kokeet, joissa käytetään rintasyövän soluja. Lisäksi ja samalla isän vasta-ch-4C5 näyttelyitä toiminto salpaavia ominaisuuksia arvioituna

in vitro

haavoja määrityksessä. Lopuksi, käyttäen

in vivo

määrityksessä olemme osoittaneet, että ch-4C5 vähentää metastaattisen laskeuman MDA-MB-453-rintasyöpäsolujen keuhkoihin SCID-hiirten.

Nämä tulokset antavat uuden näkökulman kliiniseen soveltamiseen L-ketjun vasta-aineita syöpähoitojen. Rekombinantti L-ketjun vasta-aineilla on useita etuja kokonaisten vasta-aineiden ja V

H vasta kun ne on tarkoitettu ihmisen terapeuttisten, eli suhteellisen helppo ja toistettavissa tuotanto, laadunvalvonta, ja nopeampi puhdistuma verenkierrosta. Lopuksi kliinisestä näkökulmasta, pinta HSP90 tarjoaa uuden ja erittäin lupaava ekstrasellulaarinen lääke tavoite tehokkaan metastasoituneen syövän. Tässä yhteydessä kyky ch-4C5 selektiivisesti inhiboivat pinnan altaan HSP90, kuten on esitetty

in vitro

ja

in vivo

esitetyt tulokset nykyisessä työssä, puuttumatta HSP90 solunsisäisen toiminto, tekee tämä ainefragmentti potentiaalinen syövän terapeuttista.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet tehtiin mukaan kansallisten ja kansainvälisten suuntaviivat ja oli nimenomaisesti hyväksynyt eettinen komitea Helleenien Pasteur-instituutin (lupa nro: K /533, Veterinary Directorate District of Attiki). SCID-hiiriä perin ostettiin Jackson Laboratory, kasvatettu ja ylläpidetty erityisten taudinaiheuttajista vapaa olosuhteita Experimental Animal yksikkö Helleenien Pasteur-instituutti.