Krooninen sairaus

tiivistelmä

mikroympäristölle jäykistymistä on keskeinen rooli kasvainten synnyssä. Vaikka filopodia yleensä ajatellaan olevan yksi solu mechanosensors Probing ympäristön jäykkyyden vaikutukset ympäristöön jäykkyys filopodial toimintaa syöpäsolujen edelleen epäselviä. Tässä työssä olemme tutkineet filopodial toimintaa ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua CL1-5 viljelty substraateissa viritettävien jäykkyys käyttämällä uutta alustaa. Alusta koostuu optisesta nimeltään rakenteeltaan valaistus nano-profilometry, joka mahdollistaa ajan kulunut visualisointi filopodial toimintaansa ilman fluoresenssi merkintöjä. Viljelyn substraatit koostuvat polyvinyylikloridista sekoittaa ympäristöystävällinen pehmitettä, jolloin saadaan Youngin moduuli vaihtelevat 20-60 kPa. Solujen elinkelpoisuus tutkimukset osoittivat, että Solujen elinkelpoisuus viljellään alustoihin oli samanlainen kuin viljellään yleisesti käytettyihin elastomeerit, kuten polydimetyylisiloksaani. Time-rauennut elävien solujen kuvat hankittiin ja filopodial toimintaa vastauksena substraatit vaihtelevalla jäykkyys analysoitiin. Tilastolliset analyysit paljastivat, että keuhkosyövän soluja viljeltiin pehmeämpiä alustoille näytti olevan pitempi filopodia, korkeampi filopodial tiheydet suhteessa solun kehä, ja hitaammin filopodial sulkeutuminen hinnat. Kuitenkin ajallinen analysointi filopodial yhteydessä ilmeni, että onko filopodium päättää laajentaa ja vetäytymään on puhtaasti stokastinen prosessi ilman riippuvuutta muiden alustalle jäykkyyden. Ero on filopodial välistä toimintaa keuhkosyövän soluja viljeltiin substraateissa eriasteisia jäykkyys katosi, kun myosiinin II toimintaa inhiboi käsittelemällä soluja blebbistatin, mikä viittaa siihen, että filopodial on kiinteässä moduloidaan tartuntalujuus soluihin. Tuloksemme määrällisesti koskevat filopodial toimintaan keuhkosyöpään solujen ympäristön jäykkyys ja tulisi valottaa ymmärtäminen ja syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden.

Citation: Liou YR, Torng W, Kao YC, Sung KB, Lee CH Kuo PL (2014) Alustan Jäykkyys säätelee Filopodial Toiminta Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (2): e89767. doi: 10,1371 /journal.pone.0089767

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2013; Hyväksytty 26. tammikuuta 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Liou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisia rahoitustukea lupanumeroita NSC 100-2112-M-001-022-MY3 ja NSC101-2220-E-002-011, jonka National Science neuvoston Taiwan (https://web1.nsc.gov. tw /) ja myöntää numero 101-EY-17-A-19-S1-174 antamat talousministeriö Taiwan (https://www.moea.gov.tw/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mikroympäristölle jäykkyys on keskeinen rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä. Jäykistyminen soluväliaineen johtuva lisääntynyt kollageenin silloittumisen aikana tapahtuu tuumorigeneesin [1], [2]. Matriisi jäykistyminen vaikuttaa solun liikkuvuus, ohjaa siirtymistä syöpäsolujen ja voi lisäksi liittyä elinspesifiseen etäpesäke [3]. Jäykkä matriisi edistää vakautta solun fokaalisen adheesion, mikä parantaa solunsisäisen kasvutekijän signalointi ja vuorostaan ​​lisää kasvainsolun muutosta ja kasvu [2], [4]. Esimerkiksi on osoitettu, äskettäin, että useita keuhkosyövän solulinjat kasvoivat paremmin jäykempi alustoille [5], ja tämä vähennys matriisin stifferening estämällä lysyyli-oksidaasi-välitteisen kollageeniin ristisidoksia estyy kasvaimen etenemistä [6]. Ymmärtäminen syöpäsolujen tunnistaa ja reagoida ympäristön jäykkyyden pitäisi tarjota arvokasta tietoa koukeroita syövän etenemisen ja auttaa parantamaan hoidon strategioita.

Filopodia, sormi ulkonemia solussa reunoilla, yleensä havaitaan erittäin metastaattinen syöpäsolut, kuten CL1-5, erittäin invasiivinen ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluissa [7], [8]. Ainutlaatuinen morfologia ja erittäin dynaaminen toiminta filopodia ne itsessään soveltuu organelles luotaa ympäristön jäykkyys. Filopodia tyypillisesti ojentaa ja vetää ajassa mittakaavassa kymmeniä sekunteja, kun taas niiden pitkä kesto ja suuri pinta-alan ja tilavuuden suhde mahdollistavat intiimi vuorovaikutus microenvironment. Filopodial sulkeutuminen liittyy taaksepäin virtausta F-aktiini johtuen ensisijaisesti myosiinin II supistuminen [9], kun taas myosiinin toiminta korreloivat positiivisesti alustan jäykkyys [4], [10]. Siten uskotaan, että filopodia voi toimia solujen mechanosensors tutkimalla ympäristön jäykkyys sulkeutuminen. Äskettäin alustan jäykkyyttä herkkä dynamiikkaa filopodia osoitettiin neuraalikasvun kartioita selittyy satunnaismalli perustuu ”moottori-kytkin” hypoteesi [11], [12]. Malli ennustaa, että myosiiniin ajettu taaksepäin virtausnopeus F-aktiini kasvaa ja filopodial vetovoima vähenee yhä alustan jäykkyyttä. Kokeelliset tulokset vahvistivat, että filopodia irrottaa substraatista useammin korkeamman alustan jäykkyyttä. Jos nämä ennusteet ja havainnot voidaan yleistää syöpäsoluja, voidaan odottaa, että yleinen filopodial toimintaa syöpäsolun kuten jakelun filopodial pituus ja tiheys myös säädellä alustan jäykkyyttä. Tämä on tärkeää, koska läsnäolo ja toiminta filopodia syöpäsoluissa arvellaan korreloida syöpäsolujen kykyä kotiin verisuonia ja tunkeutua kudokseen [7], [13] – [15].

Kuitenkin vaikutukset alustan jäykkyyttä on filopodial toimintaa syöpäsolujen edelleen epäselviä johtuu useista tekniikan rajoituksia. Halkaisijat filopodia tyypillisesti yksi-kolmesataa nanometriä, jotka ovat kate päätöslauselman raja tavanomaisen optinen mikroskopia. Niinpä useimmissa elävien solujen kuvien suhteen filopodial toiminta otettiin fluoresoiva proteiini-aktiini-transfektoitujen alkion neuronien, joissa on suuret filopodia klo kasvukartioilla. Kuitenkin parannettu ekspressio transfektoitujen fluoresoivan proteiinin-aktiini kompleksi voidaan muuttaa filopodial toimintaa, kun taas valotoksisuuden tuomat eksitaatiovalon voi vaikuttaa solujen toimintaan ja muuttaa dynamiikkaa filopodia [16], [17].

tässä työssä olemme tutkineet vaikutuksia alustan jäykkyyttä on filopodial toiminnasta keuhkosyöpäsoluissa CL1-5 käyttäen äskettäin kehitetty kuvantamisen tekniikkaa kutsutaan jäsennelty-valaistus nano-profilometry (SINAP), jossa käytetään topografinen herkkyyttä parantaa kuvan kontrastia filopodium tasaisella alustoille ja mahdollistaa etiketti vapaa, aika-rauennut visualisointi filopodial toimintaa kuvanopeus enintään 0,2 Hz [18], [19]. Parantaa kuvan kontrastia filopodia ja ympäröivän väliaineen, polyvinyylikloridi (PVC), joka materiaalien korkea taitekertoimet ja viritettävät jäykkyys oli mukautettu soluviljelmässä. Bioyhteensopivuutta PVC-substraatit arvioitiin käyttäen MTT-määritystä [20]. Kvantitoimme filopodial toimintaa yksittäisten solujen mittaamalla filopodial tiheys (eli lukumäärä filopodia pituusyksikköä kohti solun kehien), keskimääräinen filopodial, jonka pituus filopodial jatkeiden hinnat, ja laajennus /sulkeutuminen todennäköisyys yksilön filopodia , joka on määritelty osa aikaa, että filopodium käytetty laajennuksen /sulkeutuminen. Sen määrittämiseksi, onko vaikutus alustan jäykkyyttä on filopodial toiminta riippuu myosiinin II toimintaa, myös mitattuna muutos filopodial toimintaansa, kun soluja viljellään alustoille eriasteisia jäykkyys hoidettiin blebbistatin, myosiinin II estäjä.

tulokset

karakterisointi PVC-substraatit

Viljelmä substraatit oli tehty seoksesta, PVC: n ja ympäristöystävällisesti, karboksylaatti tyyppi pehmitintä, di (isononyyli) sykloheksaani-1, 2-dicardoxylate (DINCH). Jäykkyys seosta viritetty säätämällä suhde PVC: n pehmittimenä, kun taas suuremmat suhdeluvut johti jäykempi komposiitit. Youngin moduli PVC komposiittien, mitattuna käyttämällä peräkkäisiä pakkausta irtotavaran, olivat 20,2 ± 2,5 kPa (

n

= 6), 35,7 ± 0 kPa (

n

= 1 ), ja 61,1 ± 12,9 kPa (

n

= 6) PVC 01:01, PVC 02:01, ja PVC 03:01 vastaavasti. Tässä PVC 01:01, 02:01 ja 03:01 katso PVC sommitelmia suhteilla PVC pehmitettä ollessa 01:01, 02:01, ja 03:01 vastaavasti. Nämä tiedot osoittavat, että jäykkyys PVC komposiittien on alueella useimpien kudosten pahanlaatuisia tiloja [21].

toimintaperiaate SINAP edellyttää, että viljelyalustasta on eri taitekerroin kuin solujen parantaa signaali-kohina-suhde kuvia. Taitekertoimet PVC komposiittien määritettiin käyttäen uusia digitaalisen holografinen mikrotomografialla kuten äskettäin on kuvattu [22]. Mitattu taitekertoimet PVC ja pehmittimen oli 1,53-1,57 ja 1,47, vastaavasti. Näin ollen tuloksena taitekertoimet PVC komposiitti vaihteli 1,47-1,53, joka on hyvin lähellä, että lasi (~1.5) ja suurempi kuin solujen (~1.36) [23].

Solujen elinkelpoisuus testi käytettiin määrittämään, onko biologinen yhteensopivuus PVC komposiittien on yhteensopiva muiden yhteensopivien substraattien käytetään yleisesti soluviljelmissä. Teimme MTT määrityksissä ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua CL1-5 viljelty lasia, PVC komposiitit, polyakryyliamidi (PA) geelit, ja poly (dimetyyli) (PDMS). Kuva 1 osoittaa tyypillisiä kuvia solujen viljelty eri alustoille. MTT-määritystä määrällisesti metabolisen aktiiviset solut optinen tiheys (OD) 570 nm: ssä. Kuten on esitetty kuviossa. 2, soluja kasvatettiin lasille ja PA geeli oli suurin kannattavuus verrattuna muihin elastomeeri- alustoille. Keskimääräinen elinkyvyt kasvatettujen solujen PVC komposiitit ja että PDMS substraattien olivat samanlaiset. Ei ollut mitään merkittävää eroa solujen elinkelpoisuuden välillä PVC 03:01, 02:01, ja 01:01. Tämä osoittaa, että biologinen yhteensopivuus PVC komposiittien on samanlainen kuin muiden yleisesti käytettyjen elastomeeristen substraatteja ja ei vaikuta muuttamalla suhdetta PVC: n pehmittimenä.

PVC 1:01, 2:01, ja 3 :1 viittaavat PVC sommitelmia suhteilla PVC pehmitettä ollessa 01:01, 02:01 ja 03:01 vastaavasti; PA ja PDMS lyhennetään varten polyakryyliamidin ja poly (dimetyyli) siloksaani vastaavasti. Asteikko bar = 100 pm.

Väriaine on violetti väri ja kvantifioitiin optinen absorbanssi 570 (

n

= 8, 5, 4, 4, 3, ja 3. lasin, PVC 03:01, PVC 02:01, PVC 01:01, PA geeli, ja PDMS alustan vastaavasti).

Effects of alustan jäykkyyttä filopodial pituus ja tiheys

Sen määrittämiseksi, onko filopodial toiminta vaikuttaa substraatin jäykkyydestä, merkitsee CL1-5-solut ympättiin PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin. Substraatit päällystettiin fibronektiinillä ennen solun kylvö helpottamiseksi solujen kiinnittymistä. Immunovärjäys vastaan ​​päällystetyn fibronektiinin vahvisti, että imeytynyt fibronektiini ollut samanlaisia ​​pinta pitoisuudet poikki kolmenlaisia ​​alustoista; suhteet keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus värjättyä fibronektiinin alustaan ​​tausta olivat 1,64, 1,59 ja 1,41 ja PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti. Youngin moduli PVC komposiittien oli noin 60 kPa ja 20 kPa PVC 03:01 ja 01:01 vastaavasti, kun taas Youngin lasi on suuruusluokkaa GPa. Elävien solujen kuvat hankittu käyttäen SINAP järjestelmää. Tyypillisiä SINAP kuvia syöpäsoluja viljeltiin PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatti on esitetty kuviossa. 3, jossa filopodia luonnehditaan ohut, kirkas ulokkeita eripituisia solutasolla kehien.

Mittakaava = 5 mikrometriä.

Havaitsimme, että määrä filopodia solua kohti vaihteli 50 70. yksittäisten solujen tunnistimme kaikki näkyvät filopodia ja laskettu tiheys ja keskimääräinen kesto filopodia, kutsutaan

f

d ja

f

L vastaavasti. Filopodial tiheys määritettiin suhde filopodia numero kehä kennon. Kuvio 4A esittää vaihtelua

f

d näytteet soluja viljellään PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraattien, vastaavasti. Soluja viljellään PVC 01:01 oli suurin

f

d (keskiarvo = 0,55 um

-1, solujen määrä = 33), minkä jälkeen soluja viljeltiin PVC 3: 1 (keskiarvo = 0,31 um

-1, solujen määrä = 18), ja että viljellään lasille (keskiarvo = 0,31 um

-1, solujen määrä = 43). Tilastollinen analyysi osoitti, että on olemassa merkittävä ero tulosten PVC 01:01 ja 03:01 (

p

= 4,4 × 10

-9) ja PVC 01:01 ja lasi (

p

= 1,1 × 10

-9), kun ei ole merkittävää eroa tulosten PVC 03:01 ja lasi (

p

= 0,75). Tasaisen, kuten on esitetty kuviossa 4B,

f

L viljeltyjen solujen PVC 01:01 oli merkitsevästi pidempi kuin viljeltyjen solujen PVC 03:01 (

p

= 8,8 × 10

-4) ja lasin (

p

= 2,2 × 10

-4), kun ei ole merkittävää eroa, että PVC 03:01 ja lasi (

p

= 0,67). Keinot

f

L olivat 3,77, 3,08 ja 3,03 um PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasi vastaavasti. Nämä tiedot osoittavat, että kun syöpäsolujen viljellään elastomeerinen substraatteja, solut kasvavat pehmeämpi substraatilla on enemmän ja pidempään filopodia.

filopodial tiheys määritettiin määrä filopodia pituusyksikköä kohti solun kehä. Filopodial pituus on keskimäärin kaikkien näkyvissä filopodia solun. Palkit edustavat avulla muuttujien ja virheet merkitsevät keskihajonnat lasketaan 33, 18, ja 43 soluja PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti. Merkittäviä eroja ei havaittu tietojen PVC 01:01 ja 03:01, ja PVC 01:01 ja lasi että ** osoittaa

p

0,01.

Effects alustan jäykkyyttä dynamiikasta filopodial jatkeiden

Kysyimme jos filopodia on eri hinnat ja todennäköisyydet pidentää tai kutistu, kun syöpäsolut viljeltiin substraateissa eriasteinen jäykkyys. Tarkemmin, päättelimme, että filopodia syöpäsolujen viljellään jäykempi alustoille voi olla suurempi taipumus vetäytyy, mikä johtaa pienempään

f

D ja lyhyempi

f

L, kuten on esitetty kuviossa. 4. analysoimiseksi kokoonvedettävää ja laajentamalla dynamiikkaa yksittäisten filopodia, aika-vanhentuneen SINAP kuvia elävien solujen otettiin yhden ruudun 10 sekunnin välein viiden minuutin ajan. Vain filopodia kestänyt pidempään kuin yhden minuutin (ts näkymisen 6 peräkkäisen kehyksen) seurattiin ja hetkellinen filopodial pituudet mitattiin yksittäiset kehykset. Edustava pituus ajallinen profiilia seurattavan filopodium kuvataan kuviossa. 5. filopodium oli ensimmäinen pituus 0,92 um alussa seuranta jatkuvasti jatkettiin 100 sekuntia, ja vedetty 1,02 um lopussa kuvan hankinnan. Laskimme määrien pituuden muutos peräkkäisten kehysten ja viitataan positiivisia muutoksia kuin laajennus ja kielteinen takaisinveto hinnat. Tästä saatiin joukko laajennus /sulkeutuminen hinnat liittyy erilaisia ​​filopodial pituudet. Esimerkiksi laajennus hinnat filopodium kuviossa. 5 ovat 0,004, 0,04, ja 0,001 μm⋅s

-1 on filopodial pituus 0,92, 1,14, ja 1,79 um vastaavasti. Me seurataan 51, 59, ja 34 filopodia varten soluja viljellään PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasialustoista vastaavasti. Oletimme, että soluja viljelty samanlaista alustat samanlaisia ​​filopodial dynamiikka ja kokosivat nopeuden datan tyypin mukaan viljelyn alustoille. Vertailun helpottamiseksi korko dataa eri filopodial pituisia, me lajitelma data joukon pituusluokissa erottaa samalla kuilu. Ensin Valitsimme 2 um rako; nimittäin vaihtelevat 1 tarkoitetun filopodial pituus ≥0 ja 2 um, alue 2 viitataan filopodial pituus ≥2 um ja 4 um, ja niin edelleen. Kuvio 6 tiivistää vaihtelu nopeuden dataa määritetyn pituuden vaihteluväli soluja viljeltiin kolme erilaista substraatteja. Palkit edustavat korkokannan avulla datan lajitelma pituudessa alueella ja virheet merkitsevät keskihajonnat. Yleensä laajennuksen hinnat osoitti taipumus laskea, kun filopodial pituus kasvoi, kun taas sisäänveto hinnat näyttivät kasvavan pituuden lisääntynyt, joissa on paikallinen maksimi on pituus 11, 7, ja 7 um viljeltyjen solujen PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti. Havaitsimme samankaltaisia ​​suuntauksia kun lajittelu tietoja käyttämällä erilaisia ​​puutteita, kuten 1 tai 0,5 pm varten pituusluokissa. Huomaa, että kuvassa. 6 nopeuden dataa solujen pehmeämpiä alustoille virittämä suurempi pituusluokissa, joka on sopusoinnussa havaintojen kuvassa. 4B.

Kennon viljeltiin lasialustalle. Filopodial pituus oli 0,92 pm alkaessa kuva hankinta, jatkuvasti laajennetaan 1,81 um, ja vedettynä 1,02 um lopussa kuvan hankinnan. SINAP kuvat pituutta vastaavan datan merkitty piireissä näkyvät oikealla ja selityksin tallennusaikaan. Seurattu filopodium korostui nuolta 1

st kuvan.

(A), (B), ja (C) esittävät suhdetta laajennus hinnat ja filopodial pituudet soluja viljeltiin PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatti vastaavasti; (D), (E), ja (F) osoittavat vaihtelu sulkeutuminen hinnat suhteessa eri filopodial pituudet soluja viljellään PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatti vastaavasti. Palkit edustavat korkokannan avulla datan lajitelma pituudessa valikoimia ja virheet merkitsevät keskihajonnat. Aineisto lajitelma joukoksi pituusluokissa erotettu 2 um. Lukumäärät filopodia seuratut nopeuden mittaus ovat 51, 59, ja 34 PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasialustoista vastaavasti.

Materiaalin jäykkyys vaikutti merkittävästi takaisinveto hinnat kun filopodial pituus ylittänyt tietyn mittakaavassa. Huomasimme, että merkitys esiin, kun asteikko oli asetettu 4 pm, mikä on noin keino

f

L kuvassa. 4B. Jokaista seurataan filopodium, me kerääntyvät nopeustiedoista mitataan filopodial pituus ≥4 um ja laskea keinot. Me viittasi avulla jatkeiden niinkin

V

E ja

V

R vastaavasti. Olemme kokosi

V

E ja

V

R laskettu soluista viljeltiin samanlaista alustan ja valikoituja data joukoksi osuudet vaihtelevat jotka olivat yhtä erotettu 0,02 μm⋅s

-1. Esiintyvä todennäköisyys tietyllä nopeudella alue oli siis arvioidaan laskemalla osa tietojen valikoituja osaksi kiinnostunut alue. Kuvio 7 havainnollistaa todennäköisyysjakauman laajennuksen ja takaisinveto hinnat arvioitu soluja viljeltiin on kolmenlaisia ​​alustoille. Kiinteä, katko- ja katkoviivat esittävät normaalijakauman sopii tietoihin lasin, PVC 03:01, ja PVC 01:01 vastaavasti. Tilastollinen analyysi paljasti, että ei ollut merkittävää eroa

V

E soluja viljellään kolmesta alustoille (

p

= 0,17). Keinot

V

E olivat 0,052, 0,064 ja 0,054 μm⋅s

-1 soluille viljellyt PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti . Kuitenkin

V

R soluja viljellään PVC 01:01 oli huomattavasti hitaampaa kuin lasi (

p

= 0,02), kun taas eroja

V

R solujen välissä viljelty PVC 01:01 ja PVC 03:01 (

p

= 0,31) ja että PVC 03:01 ja lasi (

p

= 0,05) eivät olleet merkittäviä. Keinot

V

R olivat 0,059, 0,063 ja 0,069 μm⋅s

-1 soluille viljellyt PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti . Nämä tulokset viittaavat siihen, että filopodia solujen viljellään pehmeämpää alustoille näyttävät vetäytyy hitaammin kun filopodial pituus ylittää keskimääräisen pituuden.

Aineisto lajitelma sarjaksi osuudet vaihtelevat jotka yhtä erotettiin 0,02 μm⋅s

-1. Kiinteä, katko- ja katkoviivat esittävät normaalijakauman sopii tietoihin lasin, PVC 03:01, ja PVC 01:01 vastaavasti. Kertoimien määritys (eli

R-

neliö) kolmen varusteet ovat 0,9.

määrällisesti taipumus filopodial kutistumista, kun soluja viljeltiin substraateissa erityisen jäykkyys, määrittelimme todennäköisyys, että filopodium haluaa perua kuin (1), jossa

t

E ja

t

R Merkitään jakeet aikaa että filopodium kuluvaa jatkeiden vastaavasti. Koska olimme lähinnä kiinnostuneita filopodial dynamiikka vaikuttavat keinot

f

L, vain ajallinen data jälkeen filopodial pituus on yli 4 um tutkittiin ja ajanjaksot että filopodial pituus pysyi paikallaan jätettiin . Huomaa, että ulos vetämisen ja sisään todennäköisyyttä filopodium ovat samat, jos

P

R on yhtä suuri kuin 0,5. Kuvio 8 esittää todennäköisyysjakauman

P

R lasketaan soluja viljeltiin kolme alustoilla. Jälleen kiinteä, romuttuneet, ja katkoviivat esittävät normaalijakauman sopii tietoihin lasin, PVC 03:01, ja PVC 01:01 vastaavasti. Tilastollinen analyysi paljasti, että ei ollut merkittävää eroa

P

R solujen viljelty kolmenlaisia ​​alustan (

p

= 0,54). Keinot

P

R olivat 0,48, 0,48 ja 0,47 PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasi vastaavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, että onko filopodium päättää laajentaa ja vetäytymään on puhtaasti stokastinen prosessi ilman riippuvuutta muiden alustalle jäykkyyden. Niinpä vaihtelu

f

L välillä substraatteja eriasteisia jäykkyys johtui pääasiallisesti vaihteli hinnat filopodial takaisinveto, joka johtui pääasiassa myosin II supistuminen ja riippuvat alustan jäykkyyttä.

Sisäänvetoarvoa suuntaus määriteltiin osa ajasta että filopodium käytetty peruutuksessa. Kiinteä, katko- ja katkoviivat esittävät normaalijakauman sopii tietoihin lasin, PVC 03:01, ja PVC 01:01 vastaavasti. Kertoimien määritys (eli

R-

neliö) kolmen varusteet ovat 0,9.

Blebbistatin hoito muuttaa filopodial toimintaa

Koska alustan jäykkyyttä säätelee vahvuus soluadheesion ja myosiinin II toiminta [10], mietimme onko havaittu poikkeama filopodial pituus ja tiheys välillä soluja kasvatettiin alustoille eriasteisen jäykkyys katoaa, jos myosiinin toiminta oli estetty. Ensin tarkasteltiin elinkykyisyyksiä ja filopodial toimintaa syöpäsolujen käsitelty blebbistatin eri pitoisuuksina. CL1-5 soluja viljeltiin lasi substraattien 24 tunnin ajan ja altistettiin liuoksia, jotka sisältävät 10-30 uM blebbistatin 1 tunti estämään myosiinin toimintaa, viittaa äskettäin kirjallisuudessa [24]. Solujen elävyys tutkimukset käyttäen MTT-määritystä osoitti, että hoito 10-30 uM blebbistatin ei tuonut CL1-5 solut merkittäviä haittavaikutuksia (Kuva. 9), kun taas filopodial tiheys ja keskimääräinen kesto kasvoivat, blebbistatin pitoisuuksilla (Kuva. 10) . Tilastollinen analyysi osoitti, että filopodial tiheys syöpäsolujen käsiteltiin 30 uM blebbistatin oli merkittävästi suurempi kuin käsiteltiin 0 (

p

= 0,006) ja 10 uM blebbistatin (

p

= 0,03), mutta ei ollut merkittävää eroa, joka hoidettiin 0 ja 10 uM (

p

= 0,1). Samoin filopodial pituus syöpäsolujen käsitelty 30pM blebbistatin oli merkitsevästi pidempi kuin käsitelty 0 (

p

= 3,2 × 10

-5) ja 10pM blebbistatin (

p

= 0,02), ja oli merkittävä ero, joka käsiteltiin 0 ja 10 uM (

p

= 0,01).

soluja viljeltiin lasisubstraatit 24μM DMSO: ta tai blebbistatin varten 1 tunti (

n

= 5 kutakin pitoisuutta). Optinen tiheys solujen soveltamatta reagenssien kutsuttiin ohjaus (

n

= 8). Palkit edustavat keinot muuttujien ja virheet merkitsevät keskihajonnat.

Palkit edustavat keinot muuttujien ja virheet merkitsevät keskihajonnat lasketaan 43, 24 ja 31 solut käsiteltiin 0, 10, ja 30 uM blebbistatin vastaavasti. Merkin * tarkoittaa

p

0,05.

saavuttamiseksi merkittävä estyminen myosiinin toimintaa, me viljellä CL1-5 soluja PVC 01:01, PVC 03:01 ja lasisubstraatin ja käsiteltiin soluja liuoksella, jossa oli 30 uM blebbistatin 1 tunti. Kuva 11 osoittaa edustaja Kirkas ja immunostain kuvia soluja, joita oli käsitelty eikä käsitelty blebbistatin. Laskimme määrä värjättyä vinkuliini kohti solua. Vaikuttaa siltä, ​​että blebbistatin hoito lisäsi solujen pyöristäminen kaikista kolmenlaisia ​​alustoissa ja tehostetun filopodial venymään ja haarautuvia, mutta vähensi paikallisessa tarttumisessa varten soluja viljellään jäykempi alustoille. Keskimääräinen ja keskihajonta vinkuliini lukumäärä solua kohti oli 53,2 ± 28,3, 93,6 ± 30,3, ja 155,8 ± 35,5 soluille viljellyt PVC 01:01 (

n

= 5), PVC 03:01 (

n

= 5), ja lasisubstraatin (

n

= 8) ilman bleddistain hoitoa. Sen jälkeen bleddistain altistuminen, numerot muuttui 40,5 ± 13,6, 51,7 ± 19,5, ja 101,6 ± 22,3 soluille viljellyt PVC 01:01 (

n

= 3), PVC 03:01 (

n

= 4), ja lasisubstraatti (

n

= 9).

(A), (B), ja (C) ovat kirkas kuvia käsiteltyjen solujen säännöllisesti viljelyalusta kontrollina; (D), (E), ja (F) ovat niitä vastaavien immunofluoresenssimenetelmällä mielikuvia nucleus (sininen) ja vinkuliini (vihreä); (G) – (L) esittävät Kirkas ja vastaavat immunofluroresence kuvia solujen käsiteltiin 30 uM blebbistatin yhden tunnin inhiboida myosiinin II toimintaa. Asteikko bar = 10 um.

Tilastollinen analyysi osoitti, että sen jälkeen, kun altistettiin 30 uM blebbistatin yhden tunnin ajan, ero

f

D välillä viljeltyjen solujen PVC 01:01 ja PVC 03:01 tuli merkityksetön (

p

= 0,11), ja

p

arvon merkityksen

f

D erosta PVC 01:01 ja lasin laski (

p

= 0,0069) verrattuna ilman blebbistatin hoitoa (

p

= 1,1 × 10

-9). Lisäksi blebbistatin hoito lisäsi merkittävästi

f

D, jossa on enemmän merkittävä kasvu soluissa viljelty PVC 03:01 (

p

= 0,046 varten PVC 01:01,

p

= 2,1 × 10

-6 varten PVC3:1, ja

p

= 0,006 lasin). Lukumäärät otokseen solut olivat 10, 13, ja 31 PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasi vastaavasti. Kuvio 12A on koottu muutos

f

D soluja altistetaan blebbistatin yhden tunnin ajan. Huomaa, että tulokset on esitetty kuviossa. 4A piirrettiin vieressä nämä palkit vertailua.

valkoiset pylväät edustavat välineet tietojen mitattuna soluja ilman blebbistatin hoitoa (eli data kuviossa. 4); harmaa palkit ilmaisevat välineet tietojen mitattuna solujen blebbistatin hoitoon; ja virheet määritä keskihajonnat tietojen. Numerot käsiteltyjen solujen blebbistatin ovat 10, 13, ja 31 PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasisubstraatin vastaavasti. # Ja ## merkitsevät

p

0,05 ja

p

0,01 vastaavasti erotuksen kautta saatuja tietoja samanlaista substraattien kanssa ja ilman blebbistatin hoitoa; * Ja ** ovat selityksin varten

p

0,05 ja

p

0,01 vastaavasti erotuksen kautta saatuja tietoja erilaisia ​​substraatteja ja ilman blebbistatin hoitoa. Huomaa, että solut ilman blebbistatin hoitoa, merkittäviä eroja ei havaittu tietojen PVC 01:01 ja PVC 03:01, ja välillä, että PVC: 01:01 ja lasi; että käsiteltyjen solujen blebbistatin, merkitsevä ero havaittiin vain tietojen välillä PVC 01:01 ja lasi.

f

L, viljeltyjen solujen substraatilla eriasteisia jäykkyys esillä samanlaisen muutoksen käsittelyn jälkeen 30 uM blebbistatin (Fig. 12B). Jälleen tulokset on esitetty kuviossa. 4B piirrettiin vierestä jälkeen blebbistatin hoidon vertailuun. Tilastollinen analyysi paljasti, että blebbistatin hoito lisäsi merkittävästi

f

L soluja PVC 03:01 (

p

= 0,005) ja lasin (

p

= 3,2 x 10

-5); vaikka muutos

f

L ei ollut merkittävää soluja PVC 01:01 (

p

= 0,48). Keskiarvot

f

L oli 4,32 um, 3,95 um, ja 4,98 um PVC 01:01, PVC 03:01, ja lasi vastaavasti. Ero on

f

L solujen välillä viljellyt substraateissa eriasteisen jäykkyys tuli merkityksetön jälkeen blebbistatin hoidon (

p

= 0,12). Nämä tulokset viittaavat siihen, että havaitut alustan jäykkyyttä herkkää toimintaa filopodia olivat ainakin osittain moduloidaan myosiinin II aktiivisuutta.

Keskustelu

Tässä työssä me määrällisesti suhde filopodial toimintaa keuhkosyövän soluja ja alustan jäykkyyttä käyttäen tarra-vapaa kuvantamismenetelmä. Huomasimme, että alustan jäykkyyttä säännellyt filopodial pituus ja tiheys syöpäsoluissa luultavasti kautta vaikuttavien filopodial takaisinveto korko, joka oli ensisijaisesti moduloitu monipuolinen myosiinin toimintaa.