Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hitaasti vapauttava rikkivedyn (H

2S) luovuttaja, GYY4137 , aiheutti pitoisuudesta riippuvainen tappamista seitsemän eri ihmisen syövän solulinjoissa (HeLa, HCT-116, Hep G2, HL-60, MCF-7, MV4-11 ja U2OS), mutta ei vaikuttanut selviytymistä normaalin ihmisen keuhkojen fibroblasteista (IMR90, WI-38) määritettynä trypaanisiniekskluusiolla. Natriumvetysulfidia (NaHS) oli vähemmän voimakas eikä aktiivisia kaikissa solulinjoissa. Rakenteellinen analogi GYY4137 (ZYJ1122) puuttuu rikki ja sieltä ei voi vapauttaa H

2S oli aktiivinen. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttäen klonogeenisten määritystä. Inkubointi GYY4137 (400 uM) viljelyalustaan ​​johti sukupolven matalan ( 20 uM) pitoisuudet H

2S jatkuvia yli 7 päivää. Sen sijaan, inkubointi NaHS (400 uM) samalla tavalla johti paljon suurempi (jopa 400 uM) pitoisuuksilla H

2S, jotka kestivät vain 1 tunnin ajan. Mekanistinen tutkimukset paljastivat, että GYY4137 (400 uM) inkuboitiin 5 päivää MCF-7, mutta ei IMR90 solut aiheutti sukupolven pilkotun PARP ja pilkottiin kaspaasi 9, joka ilmaisee pro-apoptoottinen vaikutus. GYY4137 (mutta ei ZYJ1122) aiheutti myös osittainen G

2 /M pidätys näiden solujen. Hiiret ksenografti-tutkimukset käyttäen HL-60 ja MV4-11 solut osoittivat, että GYY4137 (100-300 mg /kg /päivä 14 päivää) vähensi merkittävästi kasvainten kasvua. Olemme päätellä, että GYY4137 osoittaa syövän vastaista aktiivisuutta vapauttamalla H

2S ajan päivän. Ehdotamme myös, että yhdistelmä apoptoosin ja solukierron pysähtymisen edistää tätä vaikutusta ja että H

2S luovuttajia olisi tutkittava edelleen mahdollisina syöpälääkkeet.

Citation: Lee ZW, Zhou J, Chen CS, Zhao Y, Tan CH, Li L, et al. (2011) Hidas vapauttava Rikkivety Luovuttaja, GYY4137, Näytteillä Novel Anti-Cancer Effects

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e21077. doi: 10,1371 /journal.pone.0021077

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 17 toukokuu 2011; Julkaistu: 20 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukee National University of Singapore tutkimuksen avustus PKM, LWD ja CHT (R-183-000-240-720, R183-000-240-101, R183-000-268-733). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rikkivety (H

2S) syntetisoidaan luonnostaan ​​kysteiini useiden entsyymien kuten cystathionine γ lyase (CSE), cystathionine β-syntetaasin (CBS) ja 3-mercaptosulfurtransferase (3-MST) on monenlaisia nisäkkäiden ja muiden kuin nisäkässoluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

. Viime vuosikymmenen aikana, lukuisia fysiologisia ja patofysiologisia roolit on ehdotettu tämän kaasun ohella lukuisia solu- ja molekyylitason tavoitteita sisältyy myös useita ionikanavia, entsyymejä ja transkriptiotekijät [1].

Sen lisäksi potentiaalia rooleja normaalissa fysiologia on myös kattava kuvaileva myrkyllisyydestä H

2S ja sen aseman ympäristön saastuttava [2]. Useat tutkimukset ovat tutkineet rooli H

2S puhkeamisessa solukuoleman ja todisteet on esitetty, että tämä kaasu voi käyttää sekä pro- ja anti-apoptoottisen aktiivisuuden viljellyissä soluissa [3], [4]. Kuitenkin tarkka mekanismi (t) mukana edelleen epäselviä.

On ehkä yllättävää, on ollut vähän tutkimuksia vaikutuksesta H

2S syöpäsoluihin

in vitro

ja ole raportteja sen vaikutus taudin etenemiseen

in vivo

. Useita vuosia sitten kerroimme, että H

2S suojattu paksusuolen syöpäsoluissa (HCT-116) peräisin apoptoosin vuoksi p-fenyylietyyli-isotiosyanaattia [5]. Muut ovat sittemmin todettu, että H

2S kasvattaa ihmisen paksusuolen syövän solujen lisääntymisen ja vähentää apoptoosia useissa solulinjoissa (esim HCT-116, [6]) ja vähentävät samalla selviytymisen muissa ihmisen paksusuolen solulinjoja (esim WiDr-, [7]) . Näiden eri havainnot ovat vaikea sovittaa yhteen. Kuitenkin yksi selitys saattaa piillä valinnassa H

2S luovuttaja. Rikkivetyä suolat, kuten natriumvetysulfidia (NaHS) ja natriumsulfidin (Na

2S) on käytetty laajalti tutkia biologisia vaikutuksia tämän kaasun monissa soluissa, kudoksissa ja eläimissä. Lisättäessä vettä, nämä suolat tuottavat suuren määrän H

2S lyhyen ajan kuluessa. Koska soluviljelmissä tapahtuu aikana tunteja tai päiviä, on todennäköistä, että vähän, jos ollenkaan, H

2S on läsnä väliaineessa lyhyen aikaa lisäämällä joko NaHS tai Na

2S. Vaikka siis ole suoraa mittauksia on tehty tähän asti, vaikuttaa todennäköiseltä, että pitoisuus H

2S että syöpä (tai jopa muita) kuin syöpäsoluja altistetaan aikana kulttuurin NaHS on korkea alussa eikä kokeen ajan. Näin ollen voi olla vaikeaa tehdä lopullisia johtopäätöksiä siitä, pystyykö H

2S vaikuttaa syöpäsolun säilymiseen käyttäen rikkivetyä suoloja luovuttajan aineina.

Tätä ajatellen olemme aiemmin raportoitu, että GYY4137 vapauttaa H

2S hitaasti sekä vesipitoiset väliaineet ja, kun niitä annetaan ehjä eläimille ajan tuntien tai päivien [8], [9]. Olemme nyt verrata vaikutusta GYY4137 ja NaHS eloonjäämiseen eri syövän ja muiden kuin syöpäsolujen kulttuurissa ja korreloi niiden vaikutus konsentraation muutoksia H

2S keskipitkällä. Lisäksi olemme tutkineet vaikutusta GYY4137 kasvaimen kasvuun käyttämällä ksenograftimallia immuunipuutteisilla hiirillä.

Materiaalit ja menetelmät

pöytäkirjat tehtiin suostumuksella National University of Singapore (NUS) Institutional Review Board (IRB, viitekoodi: 09-120E) ja NUS Institutional Animal Care ja Käytä lausunnon (IACUC, protokolla numero: 804/05).

kemiallinen synteesi GYY4137 ja ZYJ1122

GYY4137 syntetisoitiin kemiallisesti talon kuten aiemmin on kuvattu [8]. ZYJ1122 (morfolin-4-ium diphenylphosphinate) syntetisoitiin seuraavasti. Liuokseen, jossa oli difenyylifosfiinihappoa (1,0 mmol, 1,0 ekviv.) Dikloorimetaanissa (DCM; 2 ml) huoneenlämpötilassa, morfoliinia (2,0 mmol, 2,0 ekv.) Lisättiin tipoittain. Reaktiota sekoitettiin samassa lämpötilassa 1 tunti ja tuote myöhemmin kerättiin imusuodatuksella. Puhdas tuote saatiin sen jälkeen, kun oli pesty kylmällä DCM: llä. Valkoinen kiinteä aine saatiin 56%: n saanto.

1H-NMR (500 MHz, CDCI

3, ppm): δ = 7,77-7,74 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 6H), 3,77-3,75 (m, 4H), 2,95-2,93 (m, 4H); LRMS (ESI) m /z 217,2 (M

-). Puhtaus ja yhdisteiden rakenteet varmennettiin käyttäen Proton ydinmagneettiresonanssispektrometrialla (

1H NMR) ja massaspektrometria (kuviot S1, S2, S3, S4).

mittaus H

2S

sukupolvi H

2S joko NaHS (Sigma), GYY4137 tai ZYJ1122 (kaikki 400 uM) määritettiin erissä (100 ui) poistettiin ajoitettu välein (korkeintaan 7 vuorokautta) viljellyistä MCF- 7-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Sigma), kuten alla on kuvattu. Pitoisuus H

2S (määritetty yhdistelmä vapaan H

2S, HS

– ja S

2) mitattiin spektrofotometrisesti edellä kuvatulla [10]. Lyhyesti, väliaine (100 ui) sekoitettiin 0,85% w /v sinkkiasetaattia /3% NaOH-seosta (1: 1-suhteessa, 100 ui). Metyleenisininen muodostettiin sitten lisäämällä N, N-dimetyyli-p-fenyleenidiamiini-dihydrokloridia väriainetta ja FeCI

3 (loppukonsentraatiot, 2,5 mM ja 3,3 mM vastaavasti), ja absorbanssi sen jälkeen seurattiin 670 nm: ssä. Pitoisuus H

2S (määritelty edellä) määritettiin käyttämällä standardikäyrää NaHS (0-400 uM; R

2 = 0,9987).

Soluviljely ja solujen elinkelpoisuuden

Kaikki solulinjat, paitsi HCT-116 saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Ihmisen kohdunkaulansyövän (HeLa), kolorektaalisyövän (HCT-116), maksasyövän (Hep G2), osteosarkooma (U2OS), rinta adenokarsinooma (MCF-7) ja ihmisen diploidi keuhkojen fibroblasteja (IMR90 ja WI-38) viljeltiin DMEM täydennetty 10% v /v naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone), penisilliiniä /streptomysiiniä (100 U /ml; Sigma) ja L-glutamiinia (2 mM; Caisson) 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Ihmisen akuutti promyelosyyttinen leukemia-solut (HL-60) viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 20% v /v FBS, kun taas ihmisen myelomonosyyttileukemia (MV4-11) soluja viljeltiin RPMI: ssä, jossa on 10% v /v FBS samoissa inkubaatio-olosuhteissa. Elävien solujen populaatiot inkuboitiin NaHS, GYY4137 tai ZYJ1122 (400 tai 800 uM) kerättiin 5 päivän jälkeen ja laskettiin kolmena kappaleena värjäyksen jälkeen trypaanisinisellä käyttäen hemosytometriä. Pitoisuus vaste GYY4137 (100-1000 uM) syntyi MCF-7, HL-60 ja MV4-11 altistetaan lääkkeitä 5 päivää, ja kyky vähentää eloonjäämisen arvioitu IC

50-arvot. Pesäkkeenmuodostus käyttäen MCF-7-soluissa arvioitiin myös klonogeenisten eloonjäämisen määritys, kuten on kuvattu muualla [11]. Lyhyesti, MCF-7-soluja (10000) ympättiin kolmena rinnakkaisena 6-kuoppaisilla levyillä, kun läsnä on GYY4137, NaHS tai ZYJ1122 (200-600 uM) ja 10 päivää, kunnes pesäkkeet olivat helposti havaittavissa. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla (5% w /v), ja edustava kuvat siepattiin käyttäen ChemiGenius 2 Bio Imaging System (SynGene Ltd).

In vivo

tehoa GYY4137

eläin Koejärjestely on kuvattu aiemmin [12]. Lyhyesti, naispuolinen, sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä (17-20 g, 4-6 viikon ikäisiä) oli kasvatettu talossa ja ylläpitää koko erityisissä taudinaiheuttajista vapaat (SPF) isolaattorit. Eksponentiaalisesti kasvavat HL-60 ja MV4-11 soluja (1 x 10

7) ( 95% elinkelpoisuus) pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja ihon alle ruiskutetaan löysää ihoa lapaluiden väliin ja vasen etujalka vastaanottajan hiirillä. Eläimet käsiteltiin joko GYY4137 (100, 200 ja 300 mg /kg /vrk, ip) tai suolaliuoksella (1 ml /kg /vrk, ip) ja 14 päivää alkaa 14 päivää injektion jälkeen solujen jolloin hiirillä oli palpoitavissa kasvaimet 100 mm

3 keskikoko Kaikkia eläimiä seurataan tarkasti. Paino ja kasvaimen koko mitattiin vuorokauden välein. Kasvaimen koko mittauksen, pituus (L) ja leveys (W) kasvaimen mitattiin paksuus, ja kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin TV = (L x W

2) /2.

Cell Cycle Analysis ja Western-blottaus

MCF-7-soluja (40000) inkuboitiin 6-kuoppaisilla levyillä, kun läsnä tai poissa GYY4137 (400 uM) ja joko 5 tai 8 päivää. Solut, jotka käsitelty ZYJ1122 käytettiin kontrollina. Analysoida solusyklin profiilin, solut kiinnitettiin 70% v /v etanolia jäissä ainakin 2 tuntia ja sitten värjättiin propidiumjodidilla (20 ug /ml propidiumjodidia, 100 ug /ml RNaasi A: ta ja 0,1% v /v Triton X-100) 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Stained soluja asetettaisiin tämän jälkeen DNA sisällön analyysi virtaussytometrialla (Dako CYAN ADP) ja saadut tiedot käsiteltiin käyttämällä Summit ohjelmistoa (Beckman Coulter). Solulysaateista MCF-7 alistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF). Membraanit blokattiin Tris puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi rasvatonta maitojauhetta (5% w /v) ja sen jälkeen inkuboitiin asiaa primaarisen vasta-aineen (1 ug /ml) 4 ° C: ssa yön yli. Käytetyt vasta-aineet olivat α-PARP, α-pilkotaan-PARP, α-pilkottiin kaspaasi 9 (Cell Signaling Ltd.) ja α-tubuliinin (Sigma).

Tilastollinen analyysi

Solujen eloonjääminen, IC

50 ja kasvainten tilavuudet ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe (SEM). Sillä

in vitro

tutkimuksissa solujen selviytymistä sekä ei-hoito (NT) ja hoitoryhmien analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA seurasi post-hoc t-testillä. Sillä

in vivo

tutkimuksissa väliset vertailut hikkelikontrolliryhmään ja eri annos hoitoja analysoitiin käyttäen lineaarista yhdistettyä mallia pituus- tietojen analysointi SPSS-ohjelmistolla (IBM).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

vapautuminen H

2S päässä NaHS ja GYY4137 viljelyalustassa

inkubointi joko NaHS tai GYY4137 viljelyalustaan ​​johti vapauttaa havaittavia määriä H

2S mitä heijastaa lisääntynyt keskittyminen H

2S (uM) poistamisen jälkeen erissä ja määrityksen metyleenisinistä muodostumista. Vapauttaminen H

2S alkaen NaHS oli nopeaa – huipussaan tai ennen 20 min ja hidastui havaittavissa tasolle 90 min. Täydellisenä vastakohtana H

2S vapautuminen GYY4137 oli paljon pienempi ( 10% siitä havaittu NaHS), mutta säilyi, jäljellä korkeampi kuin lähtötilanteessa jopa 7 päivää. Tapahdu H

2S ilmeni ZYJ1122, kontrollina GYY4137 puuttuu rikin ja siten kykene muodostamaan H

2S, samoissa koeolosuhteissa jopa 7 päivää (kuvio 1A). Kemiallisia rakenteita GYY4137 ja ZYJ1122 on esitetty osakuva kuvion 1A.

(A) H

2S vapauttava profiili NaHS, GYY4137 ja ZYJ1122. H

2S vapautuu NaHS, ja GYY4137 (400 uM) määritettiin erissä (100 ui) väliaineen peruutettu ajoitettu välein (korkeintaan 7 vuorokautta) viljellyistä MCF-7-soluissa. Pitoisuus H

2S määriä arvioitiin spektrofotometrisesti käyttäen N, N-dimetyyli-p-fenyleenidiamiini-dihydrokloridia ja tulokset osoittivat H

2S pitoisuus (uM). H

2S vapautuminen GYY4137 oli merkitsevästi erilainen (

P

0,05) T = 0 kaikkina ajankohtina 0,3 tunnista 7 päivää. H

2S vapautuminen NaHS oli merkitsevästi erilainen (

P

0,05) T = 0 kaikkina ajankohtina jopa 1,5 tuntia. Ei havaittavaa H

2S vapautettiin ZYJ1122 (400 uM) samanlaisissa kokeellinen conditons. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± keskivirhe tarkoittaa, n = 3. kemialliset rakenteet GYY4137 ja ZYJ1122 on esitetty upotettu. (B): n kasvu- käyrä analyysit MCF-7, HL-60 ja MV4-11 soluja käsiteltiin NaHS, GYY4137 ja ZYJ1122 (400 uM) yli 5 päivää. Solujen eloonjääminen määritettiin trypaanisinisellä värjäystä. Tulokset osoittavat solujen kasvua prosentteina suhteessa NT solujen määrä 5. päivänä ja ovat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvo, n = 3.

vaikutus NaHS ja GYY4137 solujen kasvuun ja kannattavuuden

Vaikutus NaHS, GYY4137 ja ZYJ1122 kasvuun kolmen syöpäsolun riviä eli MCF-7 (rinta-adenokarsinooma), MV4-11 (akuutti promyelosyyttinen leukemia) ja HL-60 (myelomonosyyttileukemia), seurattiin 5 päivää. Kussakin ilmoitettu aikaväli, useita elävien solujen kummassakin hoitoryhmässä kirjattiin kolmena kappaleena. GYY4137 (400 uM) vähensi solujen lisääntymisen kaikkien kolmen syövän riviä, kun taas sekä NaHS ja ZYJ1122 olivat inaktiivisia (kuvio 1 B).

vaikutuksen määrittämiseksi kahta eri pitoisuuksina (400 uM ja 800 uM) GYY4137, NaHS ja ZYJ1122 laajempaan paneelin ihmisen syöpäsolulinjoja, solujen selviytymisen vielä neljä syöpäsolulinjoja eri alkuperää eli kohdunkaulan karsinooman (HeLa), kolorektaalisyövän (HCT-116), hepatosellulaarinen karsinooma (Hep G2) ja osteosarkooma (U2OS ) solut määritettiin verrattuna kaksi normaalia ihmisen diploidi fibroblasteissa (WI-38 ja IMR90) (kuvio 2A). Yli 5 päivän viljelemisen jakson NaHS (400 uM) ei vaikuta selviytymisen tahansa seitsemästä syövän linjat testataan. Sen sijaan vaikutus GYY4137 solun eloonjääminen oli paljon jyrkempää kanssa 30-70% (

P

0,01) kuolema kaikissa syöpäsolulinjoissa samana pitoisuutena. Korkeampi pitoisuus NaHS (800 uM) johti edelleen, vaikkakin pieni, väheneminen HCT-116, Hep G2 ja MCF-7 solujen eloonjäämistä (15-30%), vaikka jälleen mitään merkittävää eroa solujen eloonjääminen oli ilmeinen HeLa , HL-60, U2OS ja MV4-11 soluja. Sen sijaan, GYY4137 samana pitoisuutena, merkittävästi vähentää eloonjäämistä noin 75-95% kaikissa syöpäsolulinjoissa. Absoluuttinen taso solukuoleman aiheuttama GYY4137 vaihteli syöpäsolulinjoissa, joilla on eniten vaikutusta HepG2, HL-60, MV4-11, MCF-7 ja U2OS solujen ja vähiten vaikutusta HCT-116 ja HeLa-soluissa. Tästä syystä myöhemmin kokeita käyttämällä yhtä tai useampaa HL-60, MCF-7 ja MV4-11 syöpäsoluja. Tärkeää on, ei NaHS eikä GYY4137 muuttanut merkittävästi selviytymisen ihmisen syöpäsolujen WI-38 ja IMR90 fibroblasteissa. Rikkiä puuttuu ohjaus yhdiste, ZYJ1122, eteen merkittävää vaikutusta eloonjäämiseen tahansa solulinjan, mikä viittaa siihen, että havaitut vaikutukset GYY4137 syöpäsoluihin johtuvat todennäköisesti H

2S vapautuminen. Pitoisuus vastesuhde GYY4137 (100-1000 uM) vähentää solujen eloonjäämistä tutkittiin myös MCF-7, HL-60 ja MV4-11 soluja. IC

50-arvot Tämän yhdisteen 337,1 ± 15,4, 389,3 ± 16,8 ja 341,8 ± 21,2 gM (kaikki n = 3) (kuvio 2B).

(A) Hoidon vaikutus (5 päivää) eri syövän ja ei-syöpäsolujen kanssa NaHS, GYY4137 ja ZYJ1122 (400 uM tai 800 uM) määritettynä trypan blue -värjäyksellä. Tulokset osoittavat prosenttiosuuden solujen elinkelpoisuuden ei-hoitoon (NT) inkuboinnin jälkeen ilman lääkehoitoa ja ovat keskiarvo ± S.E. keskiarvo, n = 3, (

#

P

0,05; *

P

0,01). (B) pitoisuus-vaste-käyrät, joka osoittaa GYY4137 hoito 5 päivää eloonjäämiseen MCF-7, HL-60 ja MV4-11 soluja. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± keskivirhe keskiarvo, n = 3 (C) edustaja valokuvat, jotka esittävät klonogeeniset selviytymisen määritykset MCF-7-solujen altistuksen jälkeen (5 päivää, 200-600 uM) joko NaHS (ylärivi), GYY4137 (keskimmäinen rivi) ja ZYJ1122 (alin rivi) . NT = ei hoitoa.

Vaikutus NaHS, GYY4137 ja ZYJ1122 (200-600 uM) eloonjäämiseen MCF-7-solut arvioitiin myös

in vitro

käyttäen klonogeeniset määritys. Edustavia valokuvia on esitetty kuvassa 2C. Näitä kokeita varten, MCF-7-solut maljattiin läsnä ollessa tai ilman lääkkeitä ja niitä viljeltiin yli 10 vuorokauden jakson aikana. GYY4137 aiheutti pitoisuudesta riippuvaista menetystä solujen pesäkkeiden muodostumista, joka oli lähellä maksimikonsentraatioilla pitoisuutena 600 uM. Solujen menetys ei ollut ilmeinen molemmissa NaHS ja ZYJ1122 käsiteltyjen näytteiden.

Vaikutus GYY4137 (400 uM, 5 tai 8 päivää) MCF-7-solut tutkittiin myös käyttämällä solusyklin analyysi. Sub-G1 väestön MCF-7-solut altistettiin GYY4137 oli merkittävästi suurempi (

P

0,05) verrattuna joko ei-käsitellyt solut tai solut altistetaan saman pitoisuuden ZYJ1122 päivänä 5 (kuvio 3A ). Täten osa-G1 solupopulaatio käsiteltiin GYY4137 edusti 7,5% koko solupopulaation päivänä 5 ja 14,8% päivänä 8 hoidon verrattuna noin 1% soluja, jotka joko eivät saaneet hoitoa tai altistettiin ZYJ1122 ( Kuva 3A). Lisäksi oli merkittävä kertymistä 4N-DNA solupopulaation käsitellyissä soluissa GYY4137 (18,6% ja 26,6% sen jälkeen, kun 5 ja 8 päivää inkuboinnin vastaavasti) verrattuna joko käsittelemättä (14,8%) tai ZYJ1122-käsitelty (14 %) soluja (kuvio 3A). Lisäkokeissa, sitä mahdollisuutta, että GYY4127 laukaisee syöpäsolun kuoleman edistämällä apoptoosia tutkittiin myös. Vahva signaali pilkotaan-PARP ja aktivoitu kaspaasi 9 havaittiin MCF-7 näytettä käsiteltiin GYY4137 (400 uM, 5 päivää), jossa on suuresti vähentynyt signaalin käsitellyissä soluissa ZYJ1122 (kuvio 3B). Mielenkiintoista on, että ei ole lohkaisu PARP eikä kaspaasi 9 havaittiin IMR90-soluja inkuboitiin joko GYY4137 tai ZYJ1122.

(A) Solusyklianalyysiä MCF-7-soluissa, sen jälkeen 5 päivää (NT ja ZYJ1122) ja 5 ja 8 päivää (GYY4137) lääkehoitoa. Sisäkkeet näyttää prosentuaalinen solujen jakauma kussakin solusyklin vaiheessa. Esitetyt tulokset ovat osoitus 3 yksittäisten kokeiden. NT: ei-hoito. (B) Western blot analyysi apoptoosin markkereita (α-katkaistuun-PARP, α-pilkottiin kaspaasi 9) MCF-7 ja IMR90 käsiteltiin (5 päivää), jossa GYY4137 tai ZYJ1122 (molemmat 400 pM). Anti-katkaistuun kaspaasi-9-vasta-ainetta käytetään havaitsee suureen fragmenttiin, kaspaasi-9 katkaisun jälkeen, mutta ei tunnista lohkaisemattoman prokaspaasi-9. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Esitetyt tulokset ovat osoitus 3 erillisiä kokeita.

vaikutus GYY4137 kasvaimen kasvuun

in vivo

ihonalainen elinsiirrot joko HL-60- tai MV4-11 soluja johti ajasta riippuva kasvaimen kasvua SCID hiiri (kuvio 4A, B). Kasvaimen tilavuus lopussa kokeilu oli 3024 ± 220 mm

3 ja 1166 ± 199 mm

3 (n = 4-6) eläimillä, jotka saivat päivittäin ajoneuvon injektio ja annettiin HL-60 ja MV4-11 soluissa . Administration of GYY4137 päivittäin johti merkittävään (

P

0,05) annokseen tuumorin kasvun eston kummassakin eläimiä. GYY4137 (suurimmalla annoksella käytetty eli 300 mg /kg) annettiin päivittäin 14 päivän ajan vähensi kasvainten tilavuuden mukaan 52,5 ± 9,2% (n = 6) ja 55,3 ± 5,7% (n = 4) HL-60 ja MV4-11 ruiskutetaan eläimet. Vaikka ei mitata objektiivisesti näissä kokeissa, GYY4137 hoito ei vaikuttanut eläinten paino tai törkeästä käyttäytymisestä.

on kokonaisuudessaan vakiintuneiden kasvaimia, (A) HL-60 ksenograftin hiiret (B) MV4-11 -ksenografti hiiret, joita käsiteltiin päivittäin joko GYY4137 (100, 200 ja 300 mg /kg, ip) tai ajoneuvon hallinnan. Hoito GYY4137 vähensi kasvaimen tilavuutta sekä eläinmalleissa, annoksesta riippuvalla tavalla. Tulokset osoittavat muutoksia kasvaimen tilavuuden keskiarvo ± keskivirhe keskiarvo (n = 4-6, #

P

0,05; *

P

0,01).

Keskustelu

raportti täällä, että (i) GYY4137 (mutta ei NaHS) aiheuttaa pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä syöpäsolun eloonjäämisen, (ii) ei GYY4137 eikä NaHS ja samoilla pitoisuuksia ja koeolosuhteissa vaikuttaa selviytyminen normaali eli ei-syöpäsoluja, (iii) GYY4137 edistänyt syöpäsolun (MCF-7), mutta ei normaalien solujen (IMR90) apoptoosin kuten mittaamalla sub-G1 väestö ja havainnoimalla pilkotun PARP ja halkaistut kaspaasi 9 ja laukaisi solukierron pysähtymisen MCF-7-solujen G

2 /M vaiheessa (iv) H

2S konsentraatio väliaineessa, joka sisältää MCF-7-solut ylitetty ’perustason’ tasoa jopa 7 päivän kuluttua altistumisesta GYY4137 mutta alle 2 tunnin kuluttua altistuksesta ja NaHS, (v) ZYJ1122, kontrollina GYY4137 ole rikkiä ja näin ollen kykene muodostamaan H

2S, on aktiivinen kaikissa tapauksissa, ja (vi) GYY4137 annettiin päivittäin immuunivajaisiin hiiriä 14 päivää aiheutti annoksesta riippuvainen väheneminen kasvaimen kasvun aikaansaama aikaisemman injektion, yksi kahdesta ihmisen leukemian solulinjoja.

Näin ollen esillä oleva data osoittaa, että ensimmäistä kertaa, syövän vaikutus hitaasti vapauttavan H

2S luovuttajan , GYY4137. Kaikki syöpäsolut testattu olivat herkkiä tämän yhdisteen tosin eri tavoin. Se on vakiinnuttanut että NaHS vapauttaa suuria määriä H

2S lyhyen ajan kuluessa. Esillä olevassa kokeiden, osoitamme, että GYY4137, kuten NaHS, myös vapauttaa H

2S inkuboinnin jälkeen elatusaineessa, joka sisälsi MCF-7-soluissa mikä vahvistaa niiden aiempien havaintojen spontaanin H

2S sukupolven vesiväliaineessa [8]. Koska ZYJ1122 ei osoittanut syövän vastaista aktiivisuutta jossakin

in vitro

malleissa voimme päätellä, että syövän vastaista aktiivisuutta sekä GYY4137 ja NaHS (suurina pitoisuuksina) on erittäin todennäköisesti H

2S- riippuvainen. Ehkä yllättäen, GYY4137 osoitti suurempaa syövän soluntappamisaktiivisuutta kuin teki NaHS

in vitro

vaikka se johtaa selvästi pienempiä pitoisuuksia H

2S solussa väliaineessa. Siten optimaalinen tappaminen syöpäsolujen H

2S näissä koeolosuhteissa näyttäisi esiintyä pienillä pitoisuuksilla kaasun leviämisen aikana useita päiviä verrattuna paljon korkeampi pitoisuus saavutetaan lyhyemmässä ajassa altistuksen jälkeen solujen NaHS. On huomattava, että vaikka suhteellisen suuria pitoisuuksia GYY4137 (eli 400-800 uM) tarvitaan tätä vaikutusta, tehokas konsentraatio H

2S syntyy paljon vähemmän eli 20 uM, joka perustuu mittauksiin viljelyalustassa. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että GYY4137 voi kertyä syöpäsoluja ja siten vapauttaa suurempia määriä H

2S solunsisäisesti. Tämän ehdolla mielessä esillä data viittaa siihen, että nopeus, jolla solut altistuvat H

2S sekä pitoisuus H

2S kohtasi on kriittinen määritettäessä kyky tämän kaasun edistää solujen tappaminen.

Mielenkiintoista, ei GYY4137 eikä NaHS aiheutti merkittävää tappamista normaali eli ei-syöpäsoluja viittaa siihen, että vaikutus molempien H

2S luovuttajien on spesifinen syöpäsoluja. Vaikutusmekanismi syöpäsolun tappaminen vaikutus GYY4137 on myös tutkittu. Hoito MCF-7-solujen GYY4137 johti solukierron pysähtymisen G

2 /M vaiheessa ja edistäminen apoptoosin todisteena lisääntynyt Saharan G1 väestö sekä läsnäolo sekä pilkkoa PARP ja halkaistut kaspaasi 9. Ei merkittävää vaikutusta joko solusyklin tai apoptoosin näkyi ZYJ1122 käsiteltyjä soluja jälleen viittaa siihen, että nämä molemmat vaikutukset olivat toissijaisia ​​jatkuva altistuminen solujen alhainen H

2S. Kyky H

2S aiheuttaa syöpäsolujen tappaminen tällä tavalla ei ole aikaisemmin raportoitu. Kuitenkin, H

2S on aiemmin osoitettu vaikuttavan sekä solukierron ja apoptoosin. Esimerkiksi H

2S edistää solusyklin alkamista ja lisääntymistä suolen IEC-18 cell

in vitro

aktivoimalla MAPK [13]. H

2S voi myös esiintyä sekä pro- (esim. [14]) ja anti- (esim. [15]) apoptoottinen aktiivisuus riippuen solutyypistä tutkittu ja koeolosuhteita, erityisesti pitoisuus H

2S käytetty. Useita mahdollisia molekyylikohteista ovat sekaantuneet vaikutus H

2S apoptoosiin lukien p38 ja kaspaasi-3 [15], [16], muut MAPK kuten MEK ja JNK [17] sekä laajennettu tuotanto lämpöshokkiproteiini (HSP-90) [18]. Vaikka tarkkaa solujen vaikutusmekanismia GYY4137 jää epäselväksi, se ei tunnu kohtuutonta, että H

2S, vapautuu hitaasti usean päivän, voi vaikuttaa redox mekanismeja solussa saada aikaan syövän vaikutusta. Tässä valossa, se voi olla kiinnostavaa vaikutuksen arvioimiseksi GYY4137 on reaktiivisten happiradikaalien tuotannon ja antioksidantti-entsyymin tasot syöpäsoluissa.

Yhteenvetona GYY4137 on anti-syöpäsolujen toimintaa niin

in vitro

ja

in vitro

. Ehdotamme, että GYY4137 hajoaa hitaasti, jolloin saatiin H

2S joka yhdistelmällä solukierron pysähtymisen ja apoptoosin edistämiseksi, kasvaimen kasvu estyy. Ei solukuolema näkyi kuin syöpäsoluja. Onko tällainen solut yksinkertaisesti hajoavat H

2S nopeammin vai onko syöpäsolut ovat ainutlaatuisen herkkiä tappava vaikutus tämän kaasun vaatii lisätutkimuksia. Havainto, että syöpäsolut voidaan tappaa selektiivisesti altistuessaan suhteellisen pieniä määriä H

2S suhteellisen pitkän ajan kuluessa on avain. Tämä havainto on pidettävä mielessä tulevissa työtä tutkimalla roolia H

2S syöpäsolun selviytymisen ja myös kehittää uusia H

2S-pohjainen syöpälääkkeitä.

tukeminen Information

Kuva S1.

1H-NMR-spektri GYY 4137.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s001

(TIF) B Kuva S2.

Massaspektrometria kirjo GYY 4137.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s002

(TIF) B Kuva S3.

1H NMR-spektri ZYJ1122.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s003

(TIF) B Kuva S4.

Massaspektrometria kirjo ZYJ1122.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021077.s004

(TIF) B

Kiitokset

Olemme erittäin kiitollisia Dr. Thilo Hagen hänen arvokkaasta ehdotuksia kokeellisia malleja, ja Dr. Zhao Yudong hänen neuvoja

in vivo

data-analyysi. Kiitämme tohtori Bert Vogelstein tarjota HCT-116-solulinja.