Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Metyloidut DNA nesteet voivat olla sopiva biomarkkereiden syöpäpotilaille.

XAF1

on osoitettu olevan usein alassäädetty ihmisen mahasyövän (GC). Täällä tutkimme jos

XAF1

metylaation GC voisi olla hyödyllinen biomarkkereiden.

Methods

Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan

XAF1

mRNA ilmaisu; immunohistokemia ja western blot käytettiin tutkimaan XAF1 proteiinin ilmentymistä GC kudoksissa (n = 202) ja niiden vastaavat para-syöpä- histologinen normaalien kudosten (PCHNTs). Reaaliaikainen metylaatiospesifisen-PCR: ää käytettiin tutkimaan

XAF1

promoottori metylaation samassa paneelissa GC kudosten, niiden PCHNTs ja seerumit.

Tulokset

vahvistaneet usein

XAF1

alassäätöä sekä mRNA ja proteiini tasoilla GC kudoksissa verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja PCHNTs.

XAF1

hypermetylaation oli osoituksena 83,2% (168/202) GC kudosten ja 27,2% (55/202) ja PCHNTs, kun taas ei-metylaatio havaittiin 88 tavanomaista valvontaa. Metylointi taso GC kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin vuonna PCHNTs (

p

0,05). Hypermetylaatiota

XAF1

korreloi merkitsevästi down-regulation

XAF1

GC kudoksissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla (

p

0,001 jokainen). Lisäksi olemme havainneet suuri tiheys

XAF1

metylaatio (69,8%, 141 ulos 202) seerumeissa DNA: t samoista potilaista, kun taas seerumeista DNA: ita 88 ei-kasvain kontrollit olivat negatiivisia

XAF1

metylaatio.

XAF1

metylaation sekä GC kudoksissa ja seerumissa voisi olla hyvä biomarkkeri diagnosoimiseksi GC (AUC = 0,85 pehmo- ja AUC = 0,91 varten seerumit) ja korreloi merkitsevästi huonompi ennuste (

p

0,001). Lisäksi jälkeen leikkauksen negatiivinen positiiviseen siirtyminen

XAF1

metylaatio seerumista liittyy voimakkaasti kasvaimen uusiutumisen.

Johtopäätökset

1) toimintahäiriöstä

XAF1

on usein ja säädellään

XAF1

promoottori hypermetylaation; 2) havaitseminen verenkierrossa metyloitu

XAF1

DNA: t seerumissa voi olla hyödyllinen biomarkkereiden diagnoosissa, arvioitaessa potilaan tulos (ennustetta ja toistumisen) GC potilaille.

Citation: Ling ZQ, Lv P Lu XX, Yu JL, Han J, Ying LS, et ai. (2013) Circulating Metyloidut

XAF1

DNA Osoittaa huono ennuste mahasyövän. PLoS ONE 8 (6): e67195. doi: 10,1371 /journal.pone.0067195

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2013; Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Ling et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Science and Technology General Project Zhejiangin maakunnassa (no. 2009C33143), ja osittain avustusta selkäranka Talent Zhejiangin maakunnan lääketieteen ja hygienia Platform ohjelmat (no. 2011RCA009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä Kiinassa, joissa esiintyy ja kuolleisuus, noin osuus 10% kaikista pahanlaatuinen kasvain [1]. Mahalaukun tumorigeneesin on monimutkainen, usean vaiheessa, joihin muutoksia monien geenien [2]. Poikkeava promoottori metylaatio on yksi tärkeimmistä mekanismeista hiljentää joitakin kasvaimen synnyssä ja kasvaimen liittyvien geenien ja pelaa hyvin tärkeä rooli patogeneesissä ja etenemisessä ihmisen syövissä [3], [4] – [6], mukaan lukien mahasyöpä [7] , [8]. Samaan aikaan, varaamiseen tiedot erittäin suositeltavaa, että DNA: n metylaatio saattaa olla hyödyllinen ja tehokas biomarkkereiden syövän riskin arvioinnissa [5], [7], varhainen diagnoosi [7], ennustamisen potilaiden ennusteeseen [7], [8], ja arvioidaan herkkyys kemoterapeuttisten [9]. Viimeaikaiset tutkimus ja muut tutkimukset osoittivat, että havaitsemiseksi kiertävä metyloitua DNA veressä on voimakas ja käytännöllinen lähestymistapa syöpäpotilaille [7], [10], [11].

X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin (

XIAP

) -associated tekijä 1 (

XAF1

) on uusi negatiivinen säätelijä

XIAP

, joka kääntää XIAP suoja rooli kasvainsoluihin [12] – [14]. Menetys

XAF1

lauseke tehdä kasvainsolujen resistenssi apoptoosia ja edistävät kasvainsolun eloonjäämistä, [14] – [17]. Toimintahäiriö

XAF1

on raportoitu useissa ihmisen syövissä todennäköisesti läpi promoottori metylaatio [15] – [19], mikä viittaa sen merkitystä kasvainten synnyssä. Ihmisen mahalaukun syövän,

XAF1

on raporttien mukaan toistuvasti ja merkittävästi alassäädetty ja tämä alas-säätely

XAF1

luultavasti kautta DNA hypermetylaatiota erityisiä CpG sivustoja [15], [16 ], [18]. Ei kuitenkaan raportti on saatavilla noin

XAF1

metylaatio veressä ja sen potentiaali biomarkkerina. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme

XAF1

promoottorin metylaation pariksi kudos- ja seeruminäytteistä suuri paneeli potilaita, joilla on mahalaukun syöpä, ja arvioitiin verenkierrossa metyloitu

XAF1

mahdollisena biomarkkeri mahasyövän .

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

De-tunnistettu ihmisen kudosnäytteitä ja seerumit saatiin Zhejiang Human Tissue Specimen Bank. Käyttö yksilöiden hyväksyi Institutional Review Board Zhejiangin maakunnassa Cancer Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan mukaisesti vaatimusten meidän laitoksen hallituksen etiikasta. 88 ei-syöpä vapaaehtoiset kunhan kirjallinen lupa. Osa näytteistä oli peräisin Zhejiang Kansan sairaalassa ja First Kansan sairaalan Chunan County. Institutionaalinen Review Board Medical Ethics Zhejiangin maakunnassa Kansan sairaalassa ja First Kansan sairaalan Chunan County hyväksyttyjen menetelmän näytteenotosta sekä kirjallinen suostumus kaikilta potilaista.

kudosnäyte

pariksi kasvain ja para-syöpä- histologinen normaalien kudosten (PCHNT) näytteet kerättiin leikkauksen aikana 202 primaarisessa mahalaukun adenokarsinooman Zhejiangin maakunnassa Cancer Hospital, Zhejiang kansan sairaalassa ja First kansan sairaalan Chunan County tammikuusta 2008 joulukuuhun 2009. PCHNT arvioitiin mikroskooppisesti normaalien solujen ja ilman dysplastic soluja. Yksikään näistä tapauksista oli tehty muuta lääketieteellistä hoitoa ennen leikkausta. Demografiset, kliinisten ja histopatologisten parametrien näistä tapauksista on esitetty taulukossa 1. kasvun malli kasvainsolujen määritettiin Ming luokittelun [20]. Kaikki otettiin potilaita oli seurattu jaksoittain kunnes eräpäivänä. Antral limakalvon biopsia näytteet 88 syöpäsolujen vapaaehtoiset gastroskopialla arvottiin kerättiin verrokkeina saman ajan kuluessa, mukaan lukien 54 miestä ja 34 naista, joiden keski-ikä 52,9 vuotta vanha. Näistä vapaaehtoiset, 48 potilasta diagnosoitu krooninen ei-atrofinen gastriitti. Samaan aikaan pariksi seeruminäytteet kerättiin ennen leikkausta tai endoskopia.

Analyysi Helicobacter pylori (

H. Pylori

) Infection

Koepaloista saatu kaikista potilaista, jotka oli tähystystutki-.

H

.

pylori

tila määritettiin nopealla ureaasi testi ja Giemsa-värjäys menetelmiä [21], [22]. Sitä pidettiin

H

.

pylori

infektio, kun molemmat testit olivat positiivisia, ja näytteet, joiden yksi positiivinen suljettiin tilastollista analyysia [22].

Reaaliaikainen RT-PCR

mRNA ilmaisun on

XAF1

analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR [23]. Yhteensä RNA: t eristettiin käyttäen Trizol (Gibco). Yhteensä 3 ug kokonais-RNA: t saatettiin käänteistranskriptio käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega). Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

) valittiin sisäisenä vertailuna. Sekvenssit

XAF1

alukkeet olivat seuraavat: (F) 5′-TGGGTGTAGGATTCTCCAGG-3 ’, (R) 5′- GGTTTGCCCAAG GACTACAA-3’.

GAPDH

alukesekvenssit olivat seuraavat: (F) 5′-CATGA GAAGTATGACAACAGCCT-3 ’, (R) 5′-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT- 3’. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin laskettaessa suhteellisia muutoksia geenien ilmentyminen.

immunohistokemiallinen värjäys

ilmentyminen XAF1 proteiinin määritettiin immunohistokemiallisella analyysillä XAF1 monoklonaalisella vasta-aineella (Santa Cruz Biotechnology ). Immunohistokemiallinen värjäys XAF1 suoritettiin käyttäen edustavaa parafinoidut yksilöitä 202 GC potilailla. Jälkeen deparaffinization, antigeenin haku 0,01 M sitraattipuskurissa, ja inaktivointi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden 3% H

2O

2 /metanoli, inkuboimme diat kanssa vasta-aineen XAF1 4 ° C: ssa yön yli, ja immunohistokemiallisella värjäyksellä, seuraavat standardi avidinbiotin-peroksidaasi-kompleksi tekniikkaa, suoritettiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB) kromogeenina. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Immuunihistokemialliset värjäys pisteet (ISS) määritetään kolmen riippumattoman patologia Yhdistämällä värjäytymisen esiintymistiheys ja voimakkuus seuraavasti [24], [25]: ei värjäytymistä pisteytetään 0, 1~10% värjättyjen solujen pisteytetään 1, 11~50% kuten 2, 51~80% kuten 3, ja 81~100% kuten 4. värjäys voimakkuus on luokiteltu asteikolla 0-3, jossa 0, negatiivinen; 1, heikko; 2, kohtalainen; ja 3, vahva. Kun on multifokaalinen immunoreaktiivisuus ja on merkittäviä eroja värjäytymisvoimakkuuksia välillä pesäkkeitä, keskiarvo vähiten intensiivistä ja voimakkain värjäytyminen kirjattiin. Raakadata muunnettiin ISS kertomalla taajuus pisteet ja värjäyksen voimakkuuden pisteet. Teoriassa ISS voi vaihdella välillä 0 12. ISS on 9~12 pidettiin vahva immunoreaktiivisuus, 5~8 pidettiin kohtalainen, 1~4 pidettiin heikkona, ja 0 pisteytettiin negatiivisiksi. Osiot jossa värjäystä ei voitu hyvin ominaista katsottiin epäselvä.

Western Blot analyysi

Pariksi kasvain ja PCHNT yksilöitä 20 tapausta valittiin satunnaisesti 202 mahalaukun syöpäpotilaiden western blot analyysiä. Yhteensä proteiini uutettiin ja kvantitoitiin sitten käyttäen Lowryn menetelmällä [26]. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen anti-XAF1 monoklonaalisia vasta-aineita (Santa Cruz, CA) mukaan edellisen raportin [6]. β-tubuliinia toimi sisäisenä kontrollina.

DNA Extraction, bisulfiittimodifikaatio ja Reaaliaikainen metylaatiospesifisen-PCR (MSP) B

Serial 5 mm osissa, joka sisälsi syöpä ja ei-neoplastisia kudokset asennettu ei-päällystetyn objektilaseille ja kuivattiin 37 ° C: ssa yön yli. Jälkeen deparaffinization ja värjäys hematoksyliinillä ja eosiinilla (H

XAF1

(UF) 5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3 ’, (UR) 5′-CTCCTACCCTTAAAACC CACAAT-3’ [23]. Ihmisen genomista DNA: ta (NEB) käsiteltiin SSSI metyylitransferaasin in vitro käytettiin positiivisena kontrollina. Perifeerinen veri DNA terveelle kohteelle käytettiin negatiivisena kontrollina. Prosenttiosuus metyloitua DNA: iden näytteissä laskettiin viitteet sellaisina kun edellinen on kuvattu [27], [28]. Metyloitua DNA: t indeksi pisteytettiin mukaan prosenttiosuus DNA: n metylaatio; 0, 20%; 1, 20% -40%; 2, 40% -60%; 3, 60% -80%; ja 4, 80%. Indeksi pisteet 0 pidetään DNA unmethylation ja tulokset 1-4 katsottiin hypermetyloitunut vastaavasti [7], [27]. 20% katkaisi kynnystä DNA hypermetylaation perustui valvonnasta normaalin näytteistä ja sisäisen laadunvalvonnan saatu reaaliajassa MSP-analyysi.

Soluviljely ja huumeet Hoito

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AGS ja KATO III) viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, vastaavasti. Viljellyt solut käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus on 1,0 umol /l. Trikostatiini A (TSA) (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus on 20 ng /ml ylläpitäjä seuraavat 5-atsa hoitoon tai yksin 24 tuntia. Solut kerättiin ja alistettiin DNA, RNA ja proteiinien puhdistuksessa ja myöhemmät analyysit.

Tilastollinen analyysi

SPSS 17.0 tilasto-ohjelmalla annettiin tietojen analysointia. Counting vertailutuloksia ryhmien välillä saatettiin

χ

2 testiä ja Fisherin testiä. Survival analyysi computered avulla Kaplan-Meier menetelmä ja merkittävää arvioitiin avulla log-rank-testi. Univariate analyysi Coxin regressiomallin käytettiin määrittämään yksilöityjen ennustetekijät, ja monimuuttuja analyysi Coxin regressiomallin käytettiin tutkimaan yhteisvaikutuksia. Kaikkien tilastolliset analyysit,

p

arvojen 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Down-regulation

XAF1

Alkeisyhdistyksessä Mahalaukun kasvaimet

tutkimiseksi

XAF1

geeniekspressioprofiili, tutkimme mRNA ilmaus

XAF1

in 88 ei-syöpä vapaaehtoisia, ja 202 ensisijainen mahasyövän kudosten ja niitä vastaavat PCHNTs. Kuten kuviossa 1A,

XAF1

ilmentyminen väheni merkittävästi mahasyövän näytteissä verrattuna normaalissa valvonta ja PCHNTs (

p

0,001). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa

XAF1

ilmaisun PCHNTs verrattuna ei-syöpä valvontaa.

,

XAF1

mRNA ekspressiotaso GC kudoksissa, PCHNTs ( para-syöpä- histologiset normaalia kudosta) ja ei-syöpä valvonta määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR ja normalisoitiin

GAPDH

. B-F, XAF1 -proteiiniekspressio alassäädetty mahasyövän kudoksissa. B, edustava positiivinen, korkea ilmentyminen XAF1 proteiinin PCHNT kudoksissa; C, poissa XAF1 ilmaisun huonosti eriytetty GC; alkuperäinen suurennos x 200. D, yhteenveto XAF1 immunohistokemiallisella värjäyksellä tuloksia 202 syöpien. E, tyypillisen western blot-analyysi XAF1 ilmaisun mahasyövän ja vastaavat PCHNT näytteet eri

XAF1

metylaatiotasoilla. PCHNT kudokset asiassa 59 (XAF1 metylaatio pisteet: 0); GC kudokset asiassa 59 (metyloitu

XAF1

pisteet: 4); PCHNT kudokset asiassa 20 (metyloitu pisteet: 0); GC kudokset asiassa 20 (metyloitu

XAF1

pisteet: 1). Beeta-tubuliinia on käytetty sisäisenä kontrollina. F, yhteenveto western blotting tulokset 20 GC ja vastaavat PCHNTs esitetty suhteellinen bändejä tiheys normalisoitu beeta-tubuliinin samoista näytteistä.

Lisäksi

XAF1

ekspressio oli huomattavasti alhaisempi kehittynyt kasvaimia (vaihe III /IV) kuin alkuvaiheen kasvaimissa (vaihe I /II) (

p

0,0001, kuvio S1A), ja oli huomattavasti alhaisempi huonosti eriytetty kasvaimia kuin hyvin /kohtuullisesti erilaistunut kasvaimet (

p

0,0001, kuva S1B).

tarkista XAF1 proteiinin taso mahasyövässä kudoksissa, suoritimme immunohistokemiallinen analyysi 202 mahasyövän kudosten ja niitä vastaavat PCHNTs. Nuclear XAF1 ilmentyminen oli johdonmukaisesti läsnä normaalissa mahalaukun epiteelin osoittaa korkea immunoreaktiivisia tulokset. XAF1 proteiinin ilmentyminen havaittiin korkealla tasolla 97,5% (197/202) ja PCHNTs (kuvio 1 B). Kuitenkin, korkean ilmentymisen XAF1 proteiinia havaittiin vain 16,8% (34/202) mahalaukun syövän kudosten; Suurin osa mahasyöpä kudosten olivat poissa tai alhainen XAF1-proteiinin (kuvio 1C). Immuunihistokemialliset havainnot on koottu taulukkoon 1. immunohistokemiallinen värjäytyminen pisteet mahasyövän kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin vuonna PCHNTs tai terveillä (

p

0,0001, kuvio 1 D). Menetys XAF1 proteiinin korreloi merkitsevästi

H. pylori

infektio, kasvaimen koon, histologiset erilaistuminen, imusuonten invaasio, laskimoiden invaasio, invasiivisia syvyys, imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke ja kliinisessä vaiheessa (taulukko 1) (kaikki

p

0,05).

Immuunihistokemialliset tulokset 20 mahasyövän kudokset varmistettiin vielä avulla western blot -analyysin. Edustaja western blotting tuloksia kaksi tapausta kuvassa 1E. Suhteellinen määrä XAF1 proteiinin ilmentymistä normalisoida β-tubuliinin samoista näytteistä. Keskimääräinen XAF1 proteiini tasolla 20 mahasyövässä kudoksiin oli merkittävästi pienempi kuin vuonna PCHNTs (

p

0,05) (kuvio 1 F).

Promoottori hypermetylaatiota

XAF1

Alkeisyhdistyksessä mahalaukun kasvaimet

Tutkiakseen molekyylitason mekanismit

XAF1

hiljaisuus syöpien, haimme reaaliaikaisen MSP tekniikka tutkia DNA metylaatiostatuksen

XAF1

promoottori. Taajuus

XAF1

hypermetylaation mahasyövän kudoksissa, jotka vastaavat PCHNTs ja ei-syöpä kontrollit olivat 83,2% (168/202), 24,8% (50/202) ja 5,7% (5/88), tässä järjestyksessä. Hypermetylaation taajuus

XAF1

syövissä on huomattavasti korkeampi kuin PCHNTs ja ei-syöpä hallintalaitteet (kaikki

p

0,0001, kuva 2).

Data osoittaa taajuus

XAF1

hypermetylaation (DNA: n metylaatio taso ≥20%) kussakin ryhmässä.

on huomioitava, että metyloitu tila

XAF1

korreloi merkitsevästi joitakin kliinis-patologinen parametrit mahasyövän, kuten imusolmuke etäpesäke, T-vaihe,

H

.

pylori

infektio, jne (kaikki

p

0,05, taulukko 2). Mitään merkittävää korrelaatiota hypermetylaatiota

XAF1

ja sukupuoli, ikä diagnoosin, kasvaimen kohdalle ja etäpesäkkeiden todistettiin (kaikki

p

0,05) (taulukko 2).

XAF1

Promoottori hypermetylaation liittyy sen transkription hiljentäminen mahasyövän Cells

tarkastella välisten suhteiden

XAF1

metylaatio ja

XAF1

ilme, vertasimme

XAF1

metylaatio tasolla

XAF1

mRNA-tasolla ja proteiinin tasot määritetään joko immunohistokemiallinen analyysi (kuvio 3A) tai western-blottauksella (kuvio 3B) Spearman korrelaatioanalyysiin. Kuten on esitetty kuviossa 3A, XAF1 proteiinin ekspressio (määritettynä immunohistokemiallista analyysiä) 202 GC kudoksissa korreloi läheisesti

XAF1

mRNA-tasolla [lg (T /N)] (määritetty RT-PCR) (

γ

= 0,841,

p

0,0001). Tärkeämpää,

XAF1

metylaatio taso oli merkitsevästi yhteydessä

XAF1

mRNA tasolla (

γ

= – 0,846,

p

0,0001) ja XAF1 proteiini tasolla (

γ

= -0,969,

p

0,0001). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun analysoidaan korrelaatio

XAF1

promoottorin metylaation ja XAF1 proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot -analyysillä (kuvio 3B). Nämä tulokset vahvasti syytteeseen että

XAF1

ilmentymistä säätelee

XAF1

promoottori metylaatio.

, korrelaatio

XAF1

metylaatio

XAF1

mRNA taso määritetään RT-PCR-analyysi ja XAF1 proteiinin ilmentyminen määritettiin immunohistokemiallisella analyysi 202 mahasyövän kudoksiin. B, korrelaatio

XAF1

metylaatio

XAF1

mRNA taso määritetään RT-PCR-analyysi ja XAF1 proteiinin ilmentyminen määritettiin western blotting-analyysi 20 jäädytetyt mahasyövässä kudoksiin. Sekä A ja B,

XAF1

metylaatio tulokset korreloi käänteisesti

XAF1

geeni-ilmentymisen sekä mRNA: n ja proteiinin tasot.

5-atsa-CdR Administration palautus Expression of

XAF1

edelleen varmistamiseksi epigeneettiset sääntelyn

XAF1

ilmaisun, AGS ja KATO III soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR ja /tai TSA .

XAF1

-mRNA uudelleen sekä mahalaukun syövän solulinjat, mukana demetylaation

XAF1

promoottorin (kuvio 4), mikä osoittaa, että

XAF1

transkriptionaalisesti vaiennetaan näissä soluissa DNA hypermetylaation. Mielenkiintoista, TSA hoito yksinään oli tehokas palauttamisessa

XAF1

ilmaisun AGS ja KATO-III ilman merkittävää muutosta

XAF1

metylaatio tasolla, mikä viittaa siihen, että histonimodifikaation voi myös olla mukana säätelyssä

XAF1

ilme. Kuitenkin anto TSA seuraavista 5-atsa-CdR oli additiivinen vaikutus palauttamaan geeniekspression vähenemisen entisestään Metylointilaitteistoon tason

XAF1

. Nämä tulokset ovat yhtä mieltä viimeaikaiset tutkimukset, jotka ehdotti, että TSA voi olla demetylaation vaikutus geeni-spesifisellä tavalla [5]. Western blot-analyysi käyttämällä AGS soluja, mallina, vahvistettiin säätely ylöspäin XAF1 proteiinien jälkeen 5-atsa-CdR ja 5-atsa-CdR /TSA hoidot (kuva 4).

Kaksi mahasyövän solulinjoja (AGS ja KATO III) käsiteltiin 1,0 umol /l 5-atsa-CdR 72 tunnin ajan ja /tai 100 nM TSA: ssa 24 tuntia. Metylaatiotasot määritettiin reaaliaikaista MSP. Suoritimme reaaliaikainen RT-PCR-analyysi kolminkertaisesti kullekin cDNA näytteestä ja käyttää mediaaniarvoja kolmessa kokeessa. Suhteellinen

XAF1

-mRNA normolized että

GAPDH

saman näytteen kaavalla 2

-ΔΔCT. Tulokset kerrottuna 100 parempaa visualisointia. Prosenttiosuus

XAF1

DNA: n metylaatio näkyy vasemmalla puolella; kun taas suhteellinen mRNA ilmaus

XAF1

näkyy oikealla puolella. B: n ilmentyminen XAF1 proteiinitasolla seuraavat 5-atsa-CdR ja TSA hoitoja. Western blot-analyysi AGS solujen käsittelyn jälkeen DMSO (kontrolli), 5-atsa-CDR tai 5-atsa-CdR /TSA: ssa 72 tuntia osoittaa ajan sääntely XAF1 proteiinien käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliin (DMSO). Beta-tubuliinia näkyy latauskontrollina.

Detection of Kiertävä

XAF1

Metylointi

Olemme havainneet tiheä

XAF1

metylaatio perusasteen mahasyövän (83,2%), mikä viittaa siihen, että se voi olla hyvä biomarkkereiden jos

XAF1

metylaatio saattaa olla havaittavissa seerumissa. Siksi tutkimme

XAF1

metylaation sovitetussa seerumin DNA: t alkaen 202 GC potilaille.

XAF1

metylaatio havaittiin 141 (69,8%), seerumin DNA: t 202 mahasyöpäpotilaista (kuvio 5). Sen sijaan,

XAF1

metylaatio ei havaittu seerumin DNA: ita 88 ei-syöpä valvontaa.

Seuraavaksi vahvisti johdonmukaisuuden

XAF1

metylaatio välillä kasvain kudosten ja vastaavien seerumissa. Vuonna 168 tapauksissa, jotka osoittivat

XAF1

metylaatio kasvainkudoksissa, 141 näytetään

XAF1

metylaatio niiden pariseeruminäytteitä, jolloin yhdenmukaisuus 83,9% välillä. Ja 34 mahasyöpäpotilaista ilman

XAF1

metylaatio niiden mahasyövässä kudoksiin, ei metylaatio havaittiin kaikissa seerumin DNA: t (kuva S2).

XAF1

Metylointi biomarkkerina diagnostiikassa mahasyövän

arvioimiseksi arvoa

XAF1

Metylointia biomerkkiaine diagnosoinnissa GC, me piirretään vastaanotin toimii (ROC) käyriä ja laskettu AUC (AUC) arvoja DNA: n metylaatio tietoja molemmista GC kudokset ja seerumit. Sekä ROC analyysit

XAF1

metylaatio kudoksissa ja seerumit esiin huomattavia erotteleva kapasiteetti (kuva 6); AUC-arvo kudosten

XAF1

metylaatio oli 0,849 (95% luottamusväli, ,806-+0,892;

p

0,0001), AUC-arvo seerumin

AXF1

metylaatio oli 0,909 (95% luottamusväli, +0,875-,942;

p

0,0001).

Receiver operating (ROC) käyrä analyysiä käytettiin arvioimaan mahdollisuutta

XAF1

metylaatio mahasyövän kudoksissa tai seerumissa biomarkkerina diagnosoida syöpään. Sillä

XAF1

metylaatio mahasyövän kudoksissa, alue ROC-käyrän alla (AUC) on 0,849 (95% luottamusväli, ,806-+0,892;

P

0,0001). Sillä

XAF1

metylaatio seerumissa, AUC on 0,909 (95% luottamusväli, ,875-+0,942;

P

0,0001).

Lisäksi, kuten

XAF1

metylaatiostatuksen mahasyövän kudoksissa ja seerumit korreloi merkitsevästi imusolmuke etäpesäke, T-vaihe, kliinisessä vaiheessa, ja muut kliinis-patologinen parametrit (kaikki

p

0,05, taulukko 2 ).

XAF1

metylointi korreloi prognoosi mahasyöpäpotilaista

merkittävä korrelaatio

XAF1

metylaatio monia kliinis-patologinen parametrit (taulukko 2 ) ehdotti, että se voi liittyä ennustetta mahalaukun syöpäpotilailla. Kunnes eräpäivä Follow-up, 113: lla 168

XAF1

hypermetylaation mahasyövän kudoksissa meni nopeasti taudin etenemistä tai kuolivat. Median taudista vapaa eloonjääminen (DFS) oli vain 23,4 kuukautta. Sen sijaan, että 34 potilasta ilman

XAF1

hypermetylaation niiden mahasyövässä kudoksiin, vain 5 potilasta huononi, ja mediaani DFS oli 39,6 kuukautta. Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on

XAF1

hypermetylaation niiden mahasyövässä kudoksiin näytteillä ilmeinen elinajan kuin että ilman

XAF1

hypermetylaation (

p

0,0001) (Kuva 7A). Samoin Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on positiivinen seerumi

XAF1

metylaatio oli huomattavasti pienempi DFS kuin potilailla ilman seerumia

XAF1

metylaatio (

p

0,0001 ) (kuvio 7B), mikä osoittaa, että

XAF1

promoottori metylaatio seerumin oli epäsuotuisa ennustaja varten mahasyöpäpotilaista.

kumulatiivinen tautivapaan elinajan (cum DFS) käyrät on piirretty agains

t XAF1

DNA: n metylaation tasolla mahasyövässä kudoksissa (A) ja sera (B). Sekä A ja B, Kaplan-Meier-analyysi käytettiin ja

P

0,0001, vastaavasti.

Coxin regressioanalyysiä paljasti, että

XAF1

metylaatio seerumeissa on itsenäistä vaikutusta potilaiden eloonjäämiseen: potilaalla on

XAF1

metylaatio oli huonompi ennuste (

p

0,0001, riskisuhde 5,710; 95% CI, 3.474~9.383). Lisäksi TNM vaiheet ja ikä diagnoosin voitaisiin harkita, koska vaikuttava tekijä ennusteen mahasyövän, vasta kun vaikutus

XAF1

metylaatio oli eliminoitu. Lisäksi verenkierrossa metyloiduksi

XAF1

veressä oli suurempi vaikutus ennusteeseen kuin TNM vaiheissa (taulukko S1).

Positiivinen Transition kiertävän

XAF1

Metylointi ennustaa Kasvain toistuminen ja huono ennuste

Niistä 202 potilaasta, jotka tutkittiin ennen leikkausta verenkierrossa

XAF1

metylaatio, 72 potilasta sai seurantaa tutkimukset kiertävän

XAF1

metylaatio 2~5 kertaa välein 1~6 kuukautta leikkauksen jälkeen. Niistä 12 toistuva potilaista, 10 potilaalla näkyy negatiivinen positiiviseen siirtymisen

XAF1

metylaatiostatuksen niiden seerumit, kaksi muuta osoitti aina positiivinen

XAF1

metylaatio, mikä viittaa siihen, että seuranta

XAF1

metylaatio seerumin voi olla hyvä merkki ennustamiseen kasvaimen uusiutumisen (taulukko 3).

keskustelu

XAF1

(

XIAP

-associated kerroin 1) on uusi

XIAP

sitoutuva proteiini, joka voisi häiritä yhdistäminen

XIAP

kanssa caspases, poistetaan sen suoja kasvainsoluihin ja johtaa tuumorisolujen apoptoosin [12 ] – [14]. Anti-apoptoosin funktio

XIAP

määritetään suhde ekspressiotasot

XIAP

vastaan ​​

XAF1

[15]. Vähentynyt ilmentyminen tai hiljaisuus on

XAF1

on yleinen tapahtuma ihmisen kasvaimissa [16] – [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäinen vahvisti, että

XAF1

geenien ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty sekä mRNA-tasolla ja proteiinin taso suuressa paneelissa ensisijainen mahasyövän kudoksiin, ja alas-säätely

XAF1

ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä kasvaimen vaiheisiin, etäpesäke ja niin edelleen, syytetään menetys

XAF1

toimintoa syövän etenemiseen. Tämä on sopusoinnussa muiden tutkimusraportteja [17] – [19]. Tutkia molekyylimekanismeja vastuussa

XAF1

hiljaisuus, tutkimme

XAF1

promoottori metylaatio suuressa paneelissa mahasyövän kudoksiin (

n

= 202) ja normaalit kontrollit (

n

= 88) käyttäen reaaliaikaista MSP tekniikkaa. Olemme havainneet korkean taajuuden (83,2%) DNA hypermetylaatiota

XAF1

mahasyövän kudoksissa. DNA hypermetylaatiota

XAF1

merkittävästi korreloi down-regulation

XAF1

sekä mRNA ja proteiini tasoilla mahasyövän kudoksissa (kuva 3). Lisäksi, 5-atsa-CdR hoitoon merkittävästi palautettu

XAF1

ilmaisun

XAF1

vaiennetaan mahasyövän solulinjoissa (kuvio 4). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että usein alas-säätely

XAF1

mahasyövän soluissa säätelee sen promoottori hypermetylaation. Mielenkiintoista on, että hoito mahasyövän solujen TSA, histonideasetylaasi- inhibiittori palautti myös

XAF1

ilmaisua, joko yksin tai yhdessä 5-atsa-CdR hoidon, mikä osoittaa, että histonimodifikaation voi myös olla mukana

XAF1

sääntelyä.

DNA: n metylaatio voidaan käyttää mahdollisena kasvain biomarkkereiden erilaisissa ihmisen syövissä [3] – [11], [23]. Läsnäolo soluttoman DNA kiertävän ääreisverenkierrossa on kuvattu potilailla, joilla on pahanlaatuinen prosesseja, ja aktiivinen vapautuminen kasvaimen DNA verenkiertoon on raportoitu [29] – [31].