Krooninen sairaus

tiivistelmä

FET solulinja, joka on johdettu varhaisessa vaiheessa paksusuolen syöpä, on ei-tuumorigeenisiä kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Suunniteltu FET solut, jotka ilmentävät TGF-α (FETα) näyttö konstitutiivisesti aktiivinen EGFR /ErbB signalointi. Nämä solut muodostaa helposti ksenograftikasvaimissa kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Tärkeää on, FETα solut säilyttivät vaste TGF-beeta-välitteistä kasvun estäminen, ja, kuten vanhempien FET solujen ilmaus hallitseva negatiivinen TGF-beeta tyypin II reseptori (DNRII) in FETα soluissa (FETα /DNRII) kumotaan reagointikykyä TGF -beeta aiheuttama kasvun esto ja apoptoosin stressiolosuhteissa

in vitro

ja lisääntynyt metastaattinen liittyvää potentiaalia potilaalle tehdä malli

in vivo

, mikä osoittaa etäpesäkkeitä suppressoriaktiivisuutta TGF-beeta signalointi tässä mallissa. Syöpä angiogeneesi pidetään laajalti keskeisenä määrite kasvainten muodostumista ja etenemistä. Tässä osoitamme, että TGF-beeta-signalointia estää ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijä A: n (VEGFA), ja että menetys autokriinisiä TGF-beetan FETα /DNRII solujen lisännyt ilmentymisen VEGFA. Sääntely VEGFA ilmentymisen TGF-beeta ei transkriptiotasolla mutta transkription jälkeisellä tasolla. Tuloksemme osoittavat, että TGF-beeta pienenee VEGFA proteiinin vakautta ubikinaation ja hajoaminen on PKA- ja Smad3 riippuvia ja Smad2 riippumaton polku. Immunohistokemiallista (IHC) analysoi ortotooppisten kasvainten osoittivat merkittävästi vähentää TGF-beeta-signalointia, lisääntynyt CD31 ja VEGFA värjäytymistä kasvainten FETα /DNRII soluissa verrattuna vektorin kontrollisoluja. Nämä tulokset osoittavat, että inhibitio TGF-beeta-signaloinnin lisää VEGFA ilmaisun ja angiogeneesin, jotka saattavat parantaa osaltaan etäpesäkkeiden näiden solujen

in vivo

. IHC tutkimukset suoritettiin ihmisen paksusuolen adenokarsinooma näytteet osoittivat, että TGF-beeta-signalointia korreloi käänteisesti VEGFA ilmaisu, joka osoittaa, että TGF-beeta-välitteisen suppression VEGFA ilmentymisen olemassa paksusuolen syövän potilaille.

Citation: Geng L, Chaudhuri A, Talmon G, Wisecarver JL, Wang J (2013) TGF-beeta vaimentaa VEGFA välittämää Angiogeneesi Colon Cancer Metastasis. PLoS ONE 8 (3): e59918. doi: 10,1371 /journal.pone.0059918

Editor: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty: 20 helmikuu 2013; Julkaistu 25 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Geng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää P20RR018759 ja R01CA140988-01 (https://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8215881 icde=14708223 ddparam= ddvalue= ddsub= cr=1 csb=default cs=ASC) JW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Transforming kasvutekijä beeta (TGF-beeta) koostuu ryhmästä monitoiminen polypeptidejä, jotka säätelevät eri solun prosesseja, myös solujen jakautumista, apoptoosia, erilaistuminen, muuttoliike, tumorigenecity ja etäpesäkkeitä, sitoutumalla TGF-beeta-reseptoreihin. Useat tutkimukset osoittavat, että TGF-beeta signalointi toimii joko kasvain promoottori tai tuumorisuppressorina. Kasvaimen promoottori toiminto TGF-beetaa on yhdistetty sen kykyyn indusoida epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), joka antaa resistenssin apoptoottisen vaikutusten TGF-beeta-[1] – [3]. Kuitenkin me ja muut ovat osoittaneet kokeellisesti, että TGF-beeta välittää tuumorisuppressorigeenin aktiivisuus erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien paksusuolen syöpä, ja että menetys TGF-beeta-signaloinnin johtaa hankinnan ja etenemistä pahanlaatuisuuteen [4] – [11]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että TGF-beeta signalointi estää etäpesäkkeiden alaryhmässä koolonkarsinoomasoluissa käytettäessä potilaalle tehdä malli

in vivo

[12]. Siksi tunnistaminen mekanismi (t), johon TGF- beeta nostattaa sen etäpesäkkeiden vaimentimella toiminta on ratkaiseva ymmärrystämme syövän etenemisen ja kehittää tehokkaita terapeuttisia strategioita.

Angiogeneesi on tärkeä tekijä syövän etenemisen. Kiinteitä kasvaimia, eivät voi kasvaa tiettyä kokoa ilman riittävää verisuonten syöttö riittävästi happea ja ravinteita. VEGF /VEGFR-reitti on tärkeä välittäjä angiogeneesin [13] ja VEGFA toimii voimakas kasvaimen angiogeeninen tekijä [14]. VEGFA stimuloi uusien verisuonten, jotka tarjoavat kasvaimissa, joissa tarvitaan happea ja ravinteita [14], [15]. Expression of VEGFA on osoitettu säänneltävä transkriptiota ja translaatiota tasolla [16] – [19]. Sääntely VEGFA ilmentymisen TGF-beeta signalointi ei ole kovin hyvin tutkittu. On raportoitu, että TGF-beeta indusoi VEGF eritystä ihmisen sytotrofoblastisoluissa [20]. Päinvastoin, toinen ryhmä osoitti, että TGF-beeta-antisense-oligonukleotideja lisää VEGFA ilmentymistä ihmisen keratinosyyteissä ja ihon fibroblastien

in vitro

[21]. Näin ollen, TGF-beeta voi differentiaalisesti säädellä VEGFA ilmaisu riippuu solun yhteydessä.

FET koolonkarsinoomasolulinja, joka eristettiin ja eriytetty varhaisessa vaiheessa syöpä, säilyttää autocrine TGF-beeta-aktiivisuutta. Nämä solut muodostavat pienen kasvain kyhmy on inokulaatiopaikalla kateenkorvattomissa nude-hiirissä, joka ei vähitellen kasvaa ja sitten taantuu yli 3-5 viikkoa [5], [22]. Kyvyttömyys Näiden paksusuolisyöpä peräisin olevat solut tuottamaan progressiivisen kasvaimen kasvua

in vivo

viittaa siihen, että, suhteessa enemmän edenneen mallin solulinjat, FET-solut säilyttävät monia normaalin kasvun ehkäiseminen, mukaan lukien inhibitorinen vaste TGF-beeta. Näin ollen FET-solut muokattu ilmentämään TGF-α (FETα), joka konstitutiivisesti aktivoi EGFR /ErbB signalointia. Nämä solut (FETα) muodostaa helposti ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä [22]. Kuitenkin FETα solut säilyttivät vaste TGF-beeta-välitteistä kasvun hidastumisen ja harvoin metastasized

in vivo

. Expression of vallitsevan negatiivisen TGF-beeta tyypin II reseptori (DNRII) in FETα soluissa, nimetty FETα /DNRII, kumotaan vastata TGF-beeta aiheuttama kasvun esto ja apoptoosin stressiolosuhteissa

in vitro

ja merkittävästi lisääntynyt metastaattinen liittyvää potentiaalia potilaalle tehdä malli

in vivo

[12]. Siten näyttää siltä, ​​että menetys TGF-beeta-tuumorisuppressorigeenin vastaus on salliva etäpesäkkeiden kehittymisessä, jonka FETα soluja, jotka osoittavat tukevat etäpesäkkeiden vaimentimen toimintaa TGF-beeta-signalointia tässä solussa mallissa. Nykyinen tutkimus hyödyntää FETα /vektorin ja FETα /DNRII solumallin järjestelmä testata hypoteesia, että TGF-beeta signalointi välittää angiogeneesin kautta säätelevät VEGFA ilmaisua, joka voisi edistää etäpesäkkeiden vaimentimen toiminta TGF-beeta. Tässä tutkimuksessa me raportoimme, että koolonkarsinoomasoluissa, TGF-beeta estää VEGFA ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla, luultavasti vähentämällä VEGFA proteiini vakautta ubikinaation ja hajoamista. Tämä asetus on Smad3 riippuva ja Smad2 riippumaton. Tuloksemme osoittavat myös, että TGF-beeta-välitteisten alas-säätely VEGFA ilmaisu on kautta PKA-välitteisen reitin. Lisäksi osoitamme, että menetys autokriininen TGF-beetan FETα /DNRII soluissa johtaa lisääntyneen ilmentymisen VEGFA verrattuna kontrollisolujen sekä

in vitro

ja

in viv

o, mikä viittaa siihen, että yksi osa autokriinisiä TGF-beeta-aktiivisuutta sen etäpesäkkeiden vaimennin yhteydessä tukahduttaa angiogeneesiä. Lopuksi, IHC tutkimukset osien ihmisen paksusuolen adenokarsinoomien osoittavat, että TGF-beeta-signalointia korreloi käänteisesti VEGFA ilmaisu, joka ilmaisee, että yhteys menetys TGF-beeta-aktiivisuutta ja lisääntynyt VEGFA ilmentymistä esiintyy myös paksusuolen syöpää potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä oli hyväksynyt University of Nebraska Medical Center Institutional Animal care ja Käytä komitea (IACUC #: 07-043-08-FC).

Cell Lines ja reagenssit

FETα /DNRII solut saatiin transfektoimalla vallitsevan negatiivisen TGF-beeta tyypin II reseptoria FETα soluja, kun taas FETα /vektorisäädön soluja transfektoimalla muodostettiin ohjaus plasmidin. FETα /vektori, FETα /DNRII, HCT116, RKO, C, CBS, GEO ja vanhempien FET koolonkarsinoomasoluille [9] viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 McCoyn 5A seerumittomassa väliaine (Sigma), jota oli täydennetty 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää, 20 ug /ml insuliinia, ja 4 ug /ml transferriiniä, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Rekombinantti ihmisen TGF-beeta-1 hankittiin R pSmad3; Fig. 1 D, vasen paneeli). Näin ollen, VEGFA ekspressio lisääntyi merkittävästi DNRII soluissa verrattuna vektorisäätö solut (Fig. 1 D, vasen paneeli). Immunofluoresenssi VEGFA vahvisti higer ilmentymisen VEGFA in FETα /DNRII soluissa kuin FETα /vektori-solut (Fig. 1 D, oikea paneeli).

(A) Western blot -analyysi VEGFA ilmentymisen eri koolonsyöpäsolulinjoissa ja HCT116-solut uudelleen ilmentävät TGF-beeta-RII. (B ja C) FET-soluja kasvatettiin 50% konfluentteja ja käsiteltiin 4 ng /ml TGF-beeta1 varten osoitetun ajanjaksoja (B) tai 4 ng /ml TGF-beeta-1: n läsnä tai poissa ollessa 200 nM SB525334 varten 48 h (C). Western blot-analyysit suoritettiin anti-VEGFA-vasta-aineen havaitsemiseksi VEGFA ilmentymisen. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (D) Western blot (vasen paneeli) ja immunovärjäys (oikea paneeli) analyysit VEGFA ilmaisun FETα /vektori ja FETα /DNRII soluja. Fosforylaatiota Smad2 ja Smad3 (pSmad2 pSmad3) osoitettiin osoittamaan Smad aktivointi (vasen paneeli).

TGF-beeta estää VEGFA ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla

määrittää, kuinka TGF-beeta estää VEGFA ilmaisu, mRNA: n ilmentyminen VEGFA määritettiin FET soluissa, joita käsiteltiin TGF-beeta eri aikoja. RT-PCR tulokset osoittivat, että VEGFA mRNA-tasot pysyivät muuttumattomina jälkeen TGF-beeta hoitoa jopa 48 tuntia (Fig. 2A, ylempi paneeli). Kvantifiointi kokeiden toisto vahvisti havainnon (Fig. 2A, alempi paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että TGF-beeta säätelee VEGFA ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla. Yksi mahdollisista mekanismeista posttranskriptionaalisella sääntely on, että proteiinin vakautta. Sen määrittämiseksi, onko TGF-beeta-signalointia säätelee proteiinin stabiilisuutta VEGFA, sykloheksimidin (CHX) lisättiin FET soluihin inhiboimaan proteiinisynteesiä, kun niitä käsiteltiin TGF-beeta. Näissä olosuhteissa, tasot VEGFA väheni nopeammin TGF-beeta-käsiteltyjen näytteiden kuin kontrollinäytteiden (Fig. 2B, ylempi paneeli). Kvantifiointi ja normalisoituminen intensiteetti VEGFA bändejä kanssa vastaavan aktiini bändejä osoitti selvästi, että TGF-beeta-hoito vähensi puoliintumisaika VEGFA proteiinin (Fig. 2B, alempi paneeli), mikä osoittaa, että TGF-beeta säätelee VEGFA proteiinin stabiiliuden . Edelleen leikellä oleva mekanismi, proteasomin estäjä, MG132 tai ubikitiini E1 estäjä, PYR41, käytettiin hoitoon FET soluihin yhdessä TGF-beeta. Kuten kuviossa 2C on esitetty, joko MG132 tai PYR41 estää TGF-beeta-välitteisen suppression VEGFA ilmaisun. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-beeta-signaloinnin pienenee VEGFA proteiinin vakautta ubikinaation ja hajoaminen.

(A) FET-soluja kasvatettiin 50% konfluentteja ja käsiteltiin 4 ng /ml TGF-beeta1 varten osoitetun ajanjaksoja. RT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu

Materiaalit ja menetelmät

(ylempi paneeli). Voimakkuus kunkin VEGFA mRNA bändi määrällisesti ja normalisoitu kanssa vastaavan aktiinivyöhykkeen. Arvot ovat keskiarvoja ± S. E. kolminkertaisista kokeista (alempi kuva). (B) Western blot-analyysi VEGFA ekspressio suoritettiin osoitettuina ajankohtina FET soluissa, joita käsiteltiin 100 ug /ml sykloheksimidiä (CHX) yksinään tai CHX ja TGF-beeta yhdessä (ylempi paneeli). Voimakkuus kunkin VEGFA kaistan kvantifioitiin ja normalisoitu kanssa vastaavan aktiinivyöhykkeen (alempi kuva). (C) Western blot-analyysi VEGFA ilmentymisen FET soluissa käsitelty TGF-beeta yksin, TGF-beeta MG132 (10 uM) tai TGF-beeta PYR41 (15 uM). (D) Expression of Smad2 ja Smad3 FET solujen tyhjä vektorisäätö (Ctr), Smad2 shRNA (Sh-S2) tai Smad3 shRNA (Sh-S3) osoitettiin vasemmassa paneelissa. Fosforylaatiota Smad2 ja Smad3 ja ilmentyminen VEGFA yllä käsitellyissä soluissa 4 ng /ml TGF-beeta osoitettiin oikeassa paneelissa. (E) Expression of PKACatα FET solujen tyhjä vektorisäätö (Ctr) tai PKACatα shRNA (Sh-PKA) osoitettiin vasemmassa paneelissa. VEGFA ilmentyminen edellä käsitellyissä soluissa 4 ng /ml TGF-beeta 48 tunnissa osoitettiin oikeassa paneelissa.

TGF-beeta signalointi välittyy etupäässä Smad aktivointia. Kuitenkin Smad-riippumaton TGF-beeta-signalointia on myös raportoitu eri solutyypeissä [23], [24]. Sen määrittämiseksi, onko TGF-beeta-estoa VEGFA ilmaisu on Smad riippuva tai riippumattaman, Smad2 ja Smad3 tippuu alas yksittäin FET soluissa shRNAs spesifisiä Smad2 tai Smad3. Expression of Smad2 tai Smad3 pienennettiin tehokkaasti ja erityisesti Smad2 tai Smad3 pudotus soluja (Fig. 2D, vasen paneeli). Tämän seurauksena kasvaa pSmad2 tai pSmad3 upon TGF-beeta-hoito poistuivat Smad2 tai Smad3 pudotus soluissa (kuvio. 2D, oikea paneeli). Western blot-analyysi osoitti, että esto VEGFA proteiinin ilmentymisen TGF-beeta oli osa poistuu Smad3 pudotus soluissa, kun taas knockdovvn Smad2 oli vain vähän vaikutusta (Fig. 2D, oikea paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että TGF-beeta estää ilmentymisen VEGFA on Smad3 riippuvainen ja Smad2-riippumattomalla tavalla. Osittainen kääntyminen TGF-beeta-välitteisten tukahduttaminen VEGFA ilmentymisen Smad3 pudotus soluissa voi johtua epätäydellisestä vaiennettu Smad3 ilmentymisen näissä soluissa tai olemassaolon Smad3-riippumaton mekanismi.

Kuten aikaisemmin, TGF -beeta säätelee XIAP downregulation kautta PKA-välitteisen reitin [25]. Me seuraavaksi määritettävä, PKA osallistuu säätelyyn VEGFA ilmentymisen TGF-beeta. Ilmaisu PKA katalyyttinen α-alayksikköä (PKACatα), joka pudotettiin tietyllä shRNA FET-soluissa (kuvio. 2E, vasen paneeli). Tämän seurauksena, TGF-beeta-estoa VEGFA ilmentyminen kumosi melkein täysin näissä soluissa (kuvio. 2E, oikea paneeli). Yhdessä sen havainnon kanssa, että PKA aktivointi Smad3-riippuvainen [25], nämä tulokset osoittavat, että TGF-beeta /Smad3 /PKA signalointi säätelee downregulation VEGFA ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa.

TGF-beeta signalointi estää VEGFA ilmaisun ja estää kasvaimen angiogeneesiä in vivo

VEGFA on keskeinen säätelijä verisuonten muodostumiseen ja on tärkeä rooli angiogeneesissä, joka edistää kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Olemme osoittaneet, edellä, että TGF-beeta-signaloinnin estää VEGFA ilmentymistä (Fig. 1 B). Koska TGF-beeta toimii etäpesäke vaimennin paksusuolen syöpäsoluissa [12], tutkimme, onko suppressio VEGFA ilmentymisen TGF-beeta edistää etäpesäkkeiden vaimennus toiminto TGF-beetan. Käytimme FETα /vektorin ja FETα /DNRII solumallin kuvattu aiemmin [12] käsittelemään tätä kysymystä. VEGFA ilme oli paljon suurempi FETα /DNRII soluja kuin että FETα /vektori soluihin

in vitro

vuoksi kumota TGF-beeta signalointia (Fig. 1 D). Kuten on esitetty aikaisemmin, FETα /DNRII solut osoittivat huomattavasti metastaattisen potentiaalin verrattuna FETα /vektori soluista potilaalle tehdä malli

in vivo

[12]. Ensisijainen tuumorisektioiden valmistettiin kustakin hiirestä ortotooppisesti oli siirretty FETα /vektorin tai FETα /DNRII soluja tutkittiin TGF-beeta-signalointia. Koska FETα-solut ekspressoivat sekä Smad2 ja Smad3-(tietoja ei ole esitetty), Smad2 fosforylaatio käytettiin indikaattorina aktiivisen TGF-beeta /Smad2 /3 signalointia. IHC analyysit käyttäen anti-fosfo-Smad2 (anti-pSmad2) vasta-aine, osoitti, että ydin- Smad2 fosforylaatio oli merkittävästi vähentynyt primäärikasvaimissa on FETα /DNRII soluissa verrattiin FETα /vektori-solut (Fig. 3A, vasen paneeli). Kvantifiointi värjäys tiheys ydin- pSmad2 vuonna useiden näytteiden osoitti, että TGF-beeta signalointi estyi kasvaimissa FETα /DNRII soluista noin 40% (kuvio. 3A, oikea paneeli, *

P

0,001) . Sen määrittämiseksi, onko TGF-beeta-signaloinnin estää VEGFA ilmaisun

in vivo

, me tutkimme VEGFA ilmentymisen primäärikasvaimissa käyttäen IHC analyysit. Tulokset osoittivat, että VEGFA ekspressio oli paljon korkeampi kasvaimissa FETα /DNRII soluja kuin valvonta-soluissa (kuvio. 3B, vasen paneeli). Kvantifiointi värjäys tiheyden VEGFA vuonna useiden näytteiden osoitti, että VEGFA ilmentyminen kasvoi yli kaksinkertaiseksi näissä kasvaimissa (Fig. 3B, oikea paneeli, *

P

0,001), mikä vahvistaa tukahduttava roolia TGF-beetan VEGFA ilmaisun

in vivo

. Sen määrittämiseksi, ovatko VEGFA ilmaisulla on biologista seurauksia

in vivo

, me seuraavaksi analysoidaan pienten suonten muodostumisen sisällä kasvaimia käyttämällä anti-CD31-vasta-ainetta. CD31 on merkki verisuonten endoteelisoluissa. Kasvaimissa FETα /DNRII soluja, mikroverisuonitiheys oli enemmän kuin 3 kertaa suurempi kuin havaittu kontrollinäytteissä (Fig. 3C, *

P

0,001). Nämä tulokset osoittavat, että inhibitio TGF-beeta-signaloinnin johtaa koholla VEGFA ilmentymisen, mikä vaikuttaa lisääntyneeseen angiogeneesiä. Yhdessä tulosten kanssa lisääntynyt metastaattisen potentiaalin FETα /DNRII soluja potilaalle tehdä mallissa, meidän tutkimusten mukaan TGF-beeta signalointi estää VEGFA-välitteisen angiogeneesin ja kasvaimen etenemistä.

Kuvat ovat IHC värjäämällä fosforia Smad2 (A), VEGFA (B) ja CD31 (C) primäärikasvaimissa on FETα /vektorin ja FETα /DNRII solujen (vasemmanpuoleiset paneelit). Värjäys tiheys mitattiin ja määrä määritettiin ImagePro plus 7.0 Software käyttäen 20 × tai 40 × kuvien (oikea paneeli). Neljä eläintä analysoitiin kullekin soluista. Viisitoista kaksikymmentä histologisesti samanlaisia ​​kenttiä valittiin satunnaisesti kustakin dia analysointiin värjäystä tiheys. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE.

P

arvot laskettiin käyttäen opiskelijan

t

-testi. *

P

0,001.

ilmentäminen VEGFA kääntäen korreloi TGF-beeta signalointi ihmisen paksusuolen syövän adenokarsinooman

Edellä

in vitro

ja

in vivo

tulokset osoittavat, että TGF-beeta-säätelee negatiivisesti VEGFA ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa. Me seuraavaksi tutkia, oliko mitään korrelaatiota TGF-beeta signalointi ja VEGFA ilmentymistä ihmisen paksusuolen adenokarsinooman. Osiot valmistettiin 10 normaalista paksusuolen ja 24 yksittäistä paksusuolen syöpäpotilaiden tutkittiin aktiivisen TGF-beeta signalointi ja VEGFA ilme. Koska Smad2 ja Smad3 harvoin mutatoitu paksusuolen syöpä [26], Smad2 fosforylaatio on käytetty tässä tutkimuksessa osoittaa aktiivisen TGF-beeta /Smad2 /3 signalointia. Normaalit ihmisen paksusuolen näkyi voimakas ja selvä tumavärjäystä varten Smad2 fosforylaatiota ja heikkoa värjäytymistä varten VEGFA kryptassa epiteelisolujen taas pahanlaatuisia epiteelisolujen adenokarsinooma tapauksissa näkyy korkeintaan heikko ja suodatettua värjäytymistä Smad2 fosforylaatiota ja vahva värjäytyminen VEGFA IHC analyysit ( kuva 4A). Kuviossa 4B on esitetty määrällisesti värjäytymisen tiheys ydin- Smad2 fosforylaation ja VEGFA ilmentymisen potilaan näytteestä. Kaiken normaalit paksusuolen epiteelisoluissa näyttää korkeampi ydin- Smad2 fosforylaatiota ja alempi VEGFA ilmaisun kuin adenokarsinoomat, tukee käsitystä, että ilmaus VEGFA kääntäen korreloi TGF-beeta signalointi ihmisen paksusuolen adenokarsinooma.

Osiot valmistettiin 10 normaalista paksusuolen ja 24 yksittäistä paksusuolensyöpä potilasnäytteiden värjättiin käyttäen anti-fosfo-Smad2 ja anti-VEGFA vasta-aineita. (A) Kuvat ovat IHC värjäytymisen fosfo-Smad2 ja VEGFA normaalissa paksusuolen ja paksusuolen syöpä yksilöitä. (B) Värjäys tiheys mitattiin ja määrä määritettiin ImagePro plus 7.0 Software käyttäen 40 × kuvaa kussakin näytteessä. Normaalit paksusuolen näytteet edustavat neliöt ja paksusuolensyöpä näytteitä kolmioita. Pylväät edustavat keskiarvoa kunkin ryhmän näytteitä.

P

arvot laskettiin käyttäen opiskelijan

t

-testi. *

P

0,001.

Keskustelu

TGF-beeta-signalointia on esitetty kasvaimien muodostumisen estämiseksi ja etäpesäkkeiden alaryhmässä koolonkarsinoomasoluissa monien erilaisia ​​mekanismeja kuten soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktion [4], [12], [25], [27]. Kyky pahanlaatuisten solujen kestämään ympäristön korostaa, etenkin sellaisten, jotka liittyvät etäpesäke, pidetään keskeisenä tekijänä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [28]. Koska ympäristön rajoittamiseen kasvu on hyvin yleinen kiinteissä kasvaimissa, kuten paksusuolen syöpä, mekanismi, joka mahdollistaa lisääntyneen angiogeneesin riittävän ravinteita ja happea olisi erittäin edullista pahanlaatuisia soluja ja parantaa niiden poikkeava selviytymistä kapasiteettia. VEGFA on tehokas angiogeeninen tekijä, joka on olennaisia ​​rooleja syöpä. Kasvainsolujen salainen VEGFA aiheuttaa verisuoniston kehittää, ja sallii riittävästi happea ja ravinteita, [14]. Näin ollen, VEGFA voisi olla potentiaalinen kohde syövän hoidossa. Olemme osoittaneet aiemmin, että paeta TGF-beeta-välitteisen apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa myötävaikuttaa niiden elonjäämisetua toimintakykyä ja kehittämällä metastaattista potentiaalia

in vivo

[12]. Me osoitamme tässä, että sen lisäksi, että apoptoosin indusoimisessa, TGF-beeta-signalointia voi myös estää ilmentymisen VEGFA ja sen seurauksena, angiogeneesi koolonkarsinoomasoluissa

in vivo

ja että kumoamisen TGF-beeta mahdollistaa lisääntynyt VEGFA ilmentymistä ja angiogeneesiä, mikä voisi helpottaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kehitystä. Lisäksi käänteinen suhde TGF-beeta-signaloinnin ja VEGFA ilmentymistä havaitaan myös ihmisen paksusuolen syövän yksilöitä, osoittaa merkitys Tutkimustemme ihmisen syöpä. Näin ollen, inhiboivaa vaikutusta TGF-beta VEGFA ilmaisun ja angiogeneesi on toinen tärkeä ja uusi mekanistinen perusta TGF-beeta-kasvain ja etäpesäke vaimennin toiminto.

Vaikka ilmentyminen VEGFA voidaan säätää transkriptionaalisella tasolla HIF1α [19], sen sääntelyn TGF-beeta on transkription jälkeisellä tasolla (Fig. 2A). Tuloksemme osoittavat, että TGF-beeta-hoito vähensi vakautta VEGFA proteiinin kautta ubikitinaation ja hajoaminen (Fig. 2B 2C). Lisäksi TGF-beeta-välitteisten lasku VEGFA ilmaisu tapahtuu kautta PKA- ja Smad3-riippuvainen ja Smad2-riippumattoman reitin (Fig. 2D 2E). On osoitettu, että aktivaatio PKA TGF-beeta liittyy Smad3 mutta ei Smad2 ja että PKA aktivointi edistää proteiinien hajoaminen kautta ubikitinaation [25]. Näin ollen, on mahdollista, että TGF-beeta välittää VEGFA hajoamisen kautta Smad3 /PKA-reitin. Tämä on uusi mekanismi, jolla ilmentymistä VEGFA säätelee TGF-beeta-signalointia. Lisätutkimukset ovat tarpeen määrittää oleva mekanismi.

korkea tiheys Smad4 mutaation ja inaktivointi läheisesti liittyy lisääntynyt etäpesäkkeitä ja huonon ennusteen paksusuolensyöpä [29], [30]. Vaikka TGF-beeta-signaloinnin toimii tuumorisuppressori osajoukko paksusuolen syövän soluja (eli FET, GEO ja CBS, jne), jotka ekspressoivat villityypin Smad4 [4], [10], [11], Smad4-riippumaton TGF-beeta- signalointi on osoitettu edistävän paksusuolen syövän etäpesäkkeiden [31]. On raportoitu, että TGF-beeta indusoi VEGF: n ilmentymistä Smad4-null paksusuolen syövän soluja [32], mikä viittaa siihen, että TGF-beeta-aktivaatioon Smad4-riippumattomia reittejä (eli MEK-Erk: n ja p38-MAPK, jne) on mukana ylös-säätely VEGF ilmaisun, joka voi tehdä yhteistyötä muiden pro-onkogeenisen väyliä edistää etäpesäkkeiden. Siksi päinvastainen vaikutus TGF-beta VEGFA ilmaus voitaisiin hyödyntää sen ero rooliaan tuumorisuppressoriproteiinia tai kasvaimen promoottori eri solussa yhteydessä.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet uuden mekanismin, jolla TGF-beeta vaimentaa VEGFA ilmaisun, angiogeneesin ja metastaasin alaryhmässä paksusuolen syövän soluja. Tämä tutkimus on merkittävä, koska on osoitettu, että ilmentyminen VEGFA on lisääntynyt paksusuolen syövän ja liittyy tautiin lokalisointi, vaihe ja pitkän aikavälin tautikohtaisia ​​eloonjäämisen [33].