Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tällä hetkellä klinikalla, ihmiset käyttävät hematoksyliinillä ja eosiini tahra (H Hyväksytty 11 joulukuuta 2012 mennessä; Julkaistu: 18 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Dong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (No.30870683 ja 81171451). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

uusien tekniikoiden osalta diagnoosi ja hoitaa syöpien kuolleisuus syöpäpotilaiden on vähentynyt viime vuosikymmeninä. Kuitenkin tavoitteena parantaa syöpiä on vielä kaukana. Tällä hetkellä keskeiset kohdat lisäämään kovettumisnopeus ja elämän laatua syöpäpotilaiden ovat aikaisemmin ja tarkan diagnoosin ja tehokkaan hoidon sellaisia ​​pahanlaatuisia sairauksia. Sovellus herkkien luminescent reagenssien ja kohdennusmolekyylejä syöpäsoluja tarjoaa hyödyllisiä työkaluja tarkan diagnoosin ja tehokkaan hoidon syöpiä. Novel luminoivien aineiden kuten kvanttipistei- [1], upconversion nanomateriaaleja [2] ja nanobubbles [3] on yritetty soveltaa syövän kuvantammisjärjestelmiin. Erilaisia ​​molekyylejä, kuten vasta-aineita, [4], peptidit [5], [6] ja aptameerit [7] on käytetty kohdennusmolekyylejä syövän diagnosoinnissa ja hoidossa. Vaikka on olemassa jonkin verran edistystä kehittämiseen luminoivien aineiden ja kohdennusmolekyylejä, tehokkaita järjestelmiä syövän diagnosoinnissa ja hoidossa ei ole täysin selvitetty. Aiemmin ja tarkempi diagnoosi menetelmiä yhdistämällä kohdennusmolekyylejä luotettavalla kuvantamisen molekyylien houkuttelevat yhä enemmän tutkijoiden mielenkiintoa [8]. Tutkimuksemme aikoo perustaa uusi järjestelmä, joka sisältää kohdistaminen peptidit ja loisteputki bakteereja varten tarkan diagnoosin syöpien. Kohdistaminen peptidejä voidaan seuloa ja tunnistaa bakteerit pintaesiintuonnin menetelmä kehitettiin 1990-luvulla [9], [10]. Käyttäen fluoresenssi soluerottelijaa (FACS), erilaisia ​​peptidejä, joilla on erityisiä sitoutumisaktiivisuutta on saatu suurikapasiteettisten tavalla bakteerit näyttää menetelmällä [11], [12]. Tällä hetkellä tällä menetelmällä, kohdistamisen peptidit rintasyövän solujen [13] ja alustan peptidien proteinaasi [14] on tunnistettu. Tutkimuksessamme tunnistamisella spesifisen sitovan peptidejä keuhkosyöpään A549-soluja, uusi tekniikka havaitsemiseksi keuhkosyövän soluista käyttäen peptidi-fluoresoivia bakteereita järjestelmä perustettaisiin. Lisäksi peptidi-fluoresoiva bakteereja järjestelmää voitaisiin käyttää diagnostinen reagenssi kliinisen sovelluksen syöpäpotilaille tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

1. Soluviljely ja materiaalit

Ihmisen keuhkokarsinooman solulinjat (A549-soluja ja H460-solut), ihmisen rinta- adenokarsinoomasolulinja (MCF-7), ihmisen hepatosellulaarisen karsinooman solulinjassa (HepG-2), ihmisen kohdunkaulansyövän solulinja (HeLa) ja ihmisen kurkunpään karsinooma (Hep-2) käytettiin tässä tutkimuksessa. Nämä solulinjat kasvatettiin RPMI-1640 (Hyclone Corp., USA) ja ihmisen keuhkojen fibroblastisoluja (HLF) viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Hyclone Corp., USA) 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Elatusaine, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone Corp., USA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (China National Medicine Corp., Kiina). A549, H460 ja HLF soluja sellainen lahja tohtori Biliang Zhang [15], [16] (Guangzhou laitokset biolääketieteen ja terveyden, CAS, Kiina). MCF-7, HepG-2, HeLa ja Hep-2-solut olivat ystävällisiä lahjoja tri Haiyan Liu [17], [18] (Cyrus Tang hematologiaan, Soochow yliopisto, Kiina). Toinen kemialliset aineet Tässä tutkimuksessa hankittiin China National Medicine Corporation.

2. Seulonta Binding Monoclonal peptidi-fluoresoiva Bakteerit A549-solujen

Bakteerien peptidi kirjasto

E. coli

Tässä tutkimuksessa käytettiin oli lahja Patrick S. Daugherty Department of Chemical Engineering, University of California, Santa Barbara. Tässä bakteeri peptidin kirjasto, joka

E. coli

pinta esitetään 13-meerinen peptidi (X2CX7CX2) sulattamalla toisessa solunulkoisen silmukan ympyrämäisesti permutoidun ulkokalvoproteiini OmpX (CPX) [13], jossa ilmaistaan ​​peptidejä ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) indusoitiin lisäämällä L – (+) – arabinoosi (0,02% w /v), jolloin log-kasvuvaiheessa [13], [19].

Jäädytetyt alikvootit 1 x 10

9 bakteerit sulatettiin ja viljeltiin yön yli Super maalinen liemi (SOB) 37 ° C: ssa ja jota oli täydennetty 34 ug /ml kloramfenikolia (CM) ja 0,2% (w /v) D – (+) – glukoosia. Seuraavana päivänä, bakteerit alaviljelmä 1:50 lysogenian liemessä (LB), jota oli täydennetty 34 ug /ml CM: ssa 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja indusoitiin 0,02% (w /v) L – (+) – arabinoosi ja 1 h huoneenlämpötilassa varmistaa GFP ja peptidit ilmaistaan ​​bakteereissa. Sen jälkeen viljelty (48 h jälkeinen kylvö) A549 ja HLF solut kerättiin trypsinoinnilla ja resuspendoitiin putkiin. 10

7 HLF soluja yhteistyössä inkuboitiin 100-kertainen ylimäärä bakteerisolut 45 min inversio ravistelijalla 4 ° C: ssa. Solususpensiot sentrifugoitiin 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti otettiin talteen. Tämä menettely voidaan toistaa toisella kertaa johtuu lisääntyneestä epäspesifisen sitoutumisen tapahtumia varten HLF soluja. Supernatantti co-inkuboitiin 10

7 A549-soluja 45 min inversio ravistelijalla 4 ° C: ssa ja solususpensiot sentrifugoitiin 1000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä. Sedimentti suspendoitiin uudelleen 5 ml kylmää PBS: ää ja analysoitiin välittömästi FACS (BD FACS Aria II, BD Corp. USA). Lajittelusta portti FACS kokeessa määritys perustuu fluoresoivien signaalien negatiivisen kontrollin näytteitä. Kun fluoresenssi asetukset oli optimoitu negatiivisen kontrollin, sopivan sort portti vedettiin lajitteluun kirjaston perustuu fluoresenssiin. Eräänlainen portti laadittiin jättää niin paljon negatiivisen kontrollin kuin mahdollista samalla syömällä positiivinen tapahtumia kirjastossa [13] kantavassa vihreitä fluoresoivia soluja aidatulla lajitteluun, koska jos peptidejä, jotka olivat pinnalla vihreä fluoresoiva bakteereja voisi sitoutua A549-soluja ja vihreä fluoresoiva signaaleja solujen kasvaisi. Ainakin 10

5 tapahtumaa tallennettiin ja kasvainsolujen lisääntynyt vihreä fluoresoiva signaaleja ja pudotettu oranssi portista kerättiin FACS. Kerätyt solut viljeltiin yön yli SOB, joka sisälsi 0,2% D – (+) – glukoosia ja 34 ug /ml CM. Bakteerit sitova syöpäsolujen nimenomaan monistettiin seuraavaa kierrosta seulonnan. Vuodesta seuraavalla kierroksella, 10

6 solua riittivät FACS-analyysiä ja lajittelua. Kunnes fluoresoiva signaali syöpäsolujen kasvu pysähtyy vuonna peräkkäin kaksi kierrosta, menettely seulonnan sitovien peptidien lopetettiin. Valitut bakteerit sitovat peptidit viljeltiin LB väliaine levy sisälsi 1% agaria ja 34 ug /ml CM. Sen jälkeen, kun niitä viljeltiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, monoklonaalinen peptidi-fluoresoivia bakteereita poimittiin ja niitä viljeltiin 5 ml SOB, joka sisälsi 0,2% (m /v) D – (+) – glukoosia ja 34 ug /ml CM 37 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, sitoutumisaktiivisuutta Yksittäisten kloonien tutkittiin mittaamalla GFP fluoresoivat signaalit soluja sen jälkeen, kun A549-soluja inkuboitiin näiden monoklonaalisten peptidi-fluoresoivia bakteereita. Sekvenssit sitovien peptidien pinnalla monoklonaalinen peptidi-fluoresoivia bakteereita saatiin lähettämällä nämä bakteerit Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai, Kiina sekvensointiin.

3. Luonnehdinta sitoutumisspesifisyys ja tehokkuus välillä peptidi-fluoresoiva bakteerit ja solut

Kokeet suoritettiin sekä kiinnittää ja irrottaa solut. Fluoresenssi mikroskopia Koe ensin suorittaa tutkia sitovan monoklonaalisen peptidi-fluoresoiva bakteereja kiinnittyneitä soluja. A549-soluja, HLF solut, H460, MCF-7-soluissa, Hep-2-solut, HepG-2-solut ja HeLa-solut (3 x 10

5) maljattiin 12-kuoppaisille soluviljelylevyille päivää ennen koetta. Induktion jälkeen, 100 ui bakteerisuspensiota (≈8 x 10

7) 1 ml: ssa PBS: ää inkuboitiin erilaisten solujen huoneen lämpötilassa, joka on osoittautunut varmistamiseksi proteiineja solujen pinnalla ilmaistaan ​​yleensä inkubaation aikana [13] 45 minuutin ajan ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Solut valokuvattiin fluoresenssimikroskopiaan (Nikon Ti, Nikon Corp. Japan) vahvistaa sitoutumisaktiivisuutta monoklonaalisen peptidin-fluoresoiva bakteereja solujen kanssa. Sitova aktiivisuus välillä monoklonaalisia peptidin-fluoresoiva bakteereja irrotettuja soluja tutkittiin virtaussytometrialla. Menettely tutkittaessa sitovan aktiivisuuden peptidi-fluoresoiva bakteereja on samanlainen kuin seulonta sitovien peptidien soluilla.

4. Yritä ylläpitämisen Bakteerit Binding Activity eri kiinnitysmenetelmiä

Kiinnitys tehtiin eri kiinnittäminen reagenssit (etanoli [20], metanoli [21], asetonia [22] ja 4% paraformaldehydi [23]). Sen jälkeen sentrifugoitiin 5000 rpm: llä 5 minuutin ajan, supernatantti poistettiin ja bakteerit vahvistetaan kiinnitys reagenssit 20 min huoneen lämpötilassa. Ylimääräinen kiinnitys reagenssit poistettiin ja kiinteä bakteerit suspensoitiin PBS ja varastoitiin 4 ° C: ssa.

Virtaussytometrianalyysi ja fluoresenssimikroskopiaa kokeet suoritettiin kuten aiemmin tutkia sitoutumisaktiivisuutta kiinteän bakteerien solujen kanssa. Verrattuna tuore monoklonaalisia peptidi-fluoresoivia bakteereita, suhde kiinteän bakteerien soluihin vaihteli 100:1 ja 500:1 saada selvät ja havaittiin fluoresoivia signaaleita soluissa. Normaalisti kun bakteerit oli vahvistettu, vihreät fluoresoivat signaalit bakteerien väheni jonkin verran. Tutkittava, sitoutumisaktiivisuutta kiinteiden bakteerien soluihin riippui ajallaan, fluoresenssimikroskopia ja FACS analyysit tehtiin toistuvasti päivänä 1, päivänä 7 ja päivänä 30 kuluessa tallentamisesta.

5. Tarkastelu Binding Activity of Peptide-fluoresoiva Bakteerit System Tuumorikudoksen Hiirien Vieraslajisiirteen

Binding koe suoritettiin parafiiniin upotettu kudokseen. A549 hiiret -tuumoriksenografti näytteitä parafiinia dioja oli ystävällinen lahja Dr. Laura Cerchia ja tohtori Vittorio De Franciscis (Istituto di endokrinologia ed Oncologia Sperimentale, CNR, Napoli, Italia). Tähän liittyvä paperia noin näytteiden valmistelu on jo julkaistu PLoS One lehdessä [24]. Vahanpoisto menettely parafiini näytteet tehtiin jälkeen hyväksytty menetelmä [25]. 1 x 10

6 (100 ui) tuore peptidi-bakteerit ja 5 x 10

6 kiinteä peptidi-bakteereita inkuboitiin erikseen parafiini tuumorisektioiden 1 h huoneenlämmössä. PBS-pesun jälkeen kolme kertaa, tuumorisektioiden havaittiin alle Nikon A1R konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (Nikon Corp. Japan).

Tulokset

1. Rikastaminen Erityiset sitovien peptidien kirjasto A549-soluja

Jotta eristää solu- spesifistä sitoutumista ligandeja tietyn kasvainsolun fenotyypin päätimme perustaa malli järjestelmän sisältää normaalit (ei-kasvain) solulinja (HLF) ja keuhkokarsinoomasolulinja (A549). HLF soluja työskenteli vastavalintaa seulonnassa prosessissa. A13-mer kirjasto kysteiini hillitty peptidejä käytettiin valitsemiseksi sitovat peptidit vastaan ​​ehjien solujen (kuvio 1A). Jokaisella kierroksella A549-solut valinnan vaiheessa yksi tai kaksi vastavalintaa askelta vastaan ​​HLF solut tehtiin. Valintaprosessin aikana, olemme vähitellen lisänneet selektiivinen paine muuttamalla inkubointi ehto, pesu kunto ja alueen portti FACS. Aikana pyöreä 6 ja 7, suhde vihreitä fluoresoivia soluja kokonaisiin soluihin pysyi muuttumattomana, mikä viittaa siihen, että väestö oli pysähtynyt kehittyä alla valinnan paineen. Todellakin, uima-allas kierros 6 rikastettiin peptidejä näkyy pinnalla bakteerit, jotka sitoutuvat ensisijaisesti A549-soluja (kuvio 1 B). Kuusikymmentä yksittäisiä klooneja bakteerien tästä poolista valittiin ja kasvatettiin seuraavassa vaiheessa analyysin.

(A) Kaavamainen esitys peptidien seulonta ja valinta bakteeri-display -kirjastosta. 1. Rakennettu kirjaston muuttamalla plasmidit

E. coli

MC1061; 2. Käytöstä poistetut bakteerit sitovat normaalien solujen kanssa jälkeen esihaudonta; 3. Hautomakoneesta seos syöpäsolujen ja jäljellä bakteerit; 4. analysoi sitovaa vaikutusta syöpäsolujen bakteereja käyttäen FACS; 5. Lajittelu sitovan bakteerien syöpäsolujen virtaussytometrialla ja viljeltiin sitovan bakteerien väliaineessa; 6. Esityskieli seuraavalla kierroksella sitovan bakteerien seulontaan 7. Eristetty sitovan bakteerien syöpäsolujen ja sekvensoitiin esiteltyjen peptidien pinnalla bakteerien. (B) edistymistä rikastaminen bakteerien sitoutumisen syöpäsolujen FACS 6 seulonta kierroksilla.

2. Tunnistaminen Monoklonaaliset peptidi-fluoresoiva Bakteerit High Binding Efficiency

Monoklonaalinen peptidi-loisteputki bakteerit suurella sitovia hyötysuhde tunnistettiin 60 klooneista lisäkokeita varten. Ennen kloonit lähetettiin sekvensointiin, käytimme FACS verrata sitovat tehokkuuden bakteerien HLF ja A549-soluja. Inkubaation jälkeen indusoitu monoklonaalisella peptidi-fluoresoivia bakteereita, prosenttiosuus fluoresoivien solujen ja kokonaisten solujen edustaa sitoutumisen määrä peptidien pinnalla klonaalisen bakteerien solujen kanssa. Tulokset osoittivat, että sitoutuminen nopeus kaikki bakteerit kuin 60 klooneista oli noin 10% -80% ja A549-soluja, kun se oli alle 5% HLF soluja (tietoja ei esitetty). Vertaamalla niille, joilla 20% sitova korko, peptidit-fluoresoiva bakteereja 80% sitova korko voi olla korkeampi affiniteetti soluihin. Sitoutumisen määrä monoklonaalista peptidin fluoresoiva bakteerien (klooni 4), jolla on korkein sitova tehokkuus oli 80% A549-solujen ja 0,4% HLF soluja (kuvio 2). Sekvensointi Tulokset osoittivat, että seitsemän ainutlaatuinen klooni sekvenssit saatiin 60 kloonia (taulukko 1). Ei ollut säilyvät sek- havainnoitu kaikkien näiden kloonien.

sitova osa A549-soluja bakteerien (show oranssi portti) oli 80% ja HLF soluissa oli 0,4%.

3. Arviointi Binding erityisyys Monoclonal peptidi-loisteputki Bakteerit

tunnistaminen pieni joukko peptidi-fluoresoiva bakteereja, jotka voivat erottaa A549 solut HLF soluista herättää kysymyksen siitä, oliko peptidi-loisteputki bakteerit voivat sitoutuvat myös muiden solutyyppien kanssa. Tämän tavoitteen päätimme tutkia suhteellinen sidontapotentiaali kaikkien peptidi-fluoresoiva bakteerien useissa solulinjoissa. Ensin määritetään solutyyppispesifisyyden mittaamalla sitoutumisaktiivisuus kaikki peptidi-fluoresoiva bakteereja paneelissa liity solulinjoissa. Olemme havainneet, että mikä tahansa seitsemästä peptidi-fluoresoiva bakteerit eivät sitoudu muihin ihmisen kohdunkaulan solutyyppejä, mukaan lukien maksan (HepG-2), kurkunpään (Hep-2), kohdunkaulan (Hela) ja rinta (MCF-7) karsinoomasoluja. Tulokset havainto fluoresenssimikroskoopilla ja -virtaussytometriä on kiinnittää ja irrottaa solut tarkasti sitovan spesifisyyden peptidillä fluoresoiva bakteereja. Kuvio 3 osoitti tyypilliset tulokset peptidi-fluoresoiva bakteereja, jotka oli korkein sitova tehokkuus A549-soluihin (klooni 4). Lisäksi bakteerit vain CPX telineen proteiini ei sitoudu A549-soluja, mikä tarkoitti peptidit esitellään pinnalla bakteerien välittämien sitovan tapahtuman bakteerien välillä ja A549-soluja. Enemmän huomiota on kiinnitettävä muihin keuhkosyövän soluihin esim H460. Tuloksemme havainnollistaa, että monoklonaalinen peptidi-fluoresoiva bakteereja ei tunnista H460 soluja -another solulinjan myös kuuluvat luokkaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, joka merkitsi sitä, että monoklonaalinen peptidi-loisteputki bakteerit ovat mahdollisuutta tunnustaa eri genreihin keuhkosyövän soluja.

(A) fluoresenssimikroskooppiin kuvia bakteerien kloonien inkuboitiin soluilla. A549

△ inkuboitiin CPX vain bakteereja ja muita soluja inkuboitiin valittu monoklonaalisten peptidi-fluoresoivia bakteereita, mittakaavassa baari oli 20 um. (B) FACS tulokset erilaisista solujen sitoutumisen monoklonaalisilla peptidi-fluoresoiva bakteereja vaihdekertoimella 1:100. (C) Prosenttiosuus sitova osa monoklonaalinen peptidi-fluoresoiva bakteereja eri solujen FACS tiedot. Data oli keskiarvo ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

4. Huolto sitova kyky of Peptide-fluoresoiva Bakteerit kasvainsoluja for Clinical Application

Yksi fiksaatiomenetelmä tarvitaan ylläpitämään sitova spesifisyys ja tehokkuus bakteerien solujen laajempia sovelluksia. Kautta verrataan sitovaa vaikutusta bakteerien solujen kanssa jälkeen bakteerit vahvistetaan etanoli, metanoli, asetoni ja 4% paraformaldehydi, päätimme paraformaldehydi kuten tallennuksesta reagenssina jatkotutkimuksiin. Vaikka kiinteä bakteerit säilytetään edelleen kyky sitoutua soluihin, sitoutumisen tehokkuus kiinteän bakteereja oli pienempi kuin tuoreen bakteereja. Saamiseksi vertailukelpoinen sitova vaikutus kiinteän bakteerit, lisäsimme suhde bakteerien solujen 100:1 ja 500:1. Tulokset on esitetty kuviossa 4A ja S1 osoitti, että kiinteät bakteerit yhä voimassa sitovan spesifisyyden. Lisäksi, sen jälkeen, kun vertailu negatiiviseen kontrolliin, jossa solujen, ei-kasvainsolulinjaa (HLF) noin kasvainsolulinjoja (H460 ja Hep-2), sitoutumisen spesifisyyden kiinteän bakteereja oli parempi kuin tuoreen bakteereja. Seuraavaksi tutkimme muutosta sen sitovat tehokkuuden kiinteiden bakteerien jälkeen Viivästys. Tässä kokeessa tavoitteita päätimme oli tuore bakteerit, juuri ennen fuusiota (päivä 1) ja kiinteät bakteerit säilytettiin 7 päivää ja 30 päivää. Tulokset (kuvio 4B, 4C ja 4D), osoitti, että kiinteät bakteerit säilytetään edelleen korkeampi sitovat tehokkuuden solujen kanssa sen jälkeen kun niitä varastoitiin 30 päivää, mikä osoitti, että kiinteä fluoresoivia bakteereita voitaisiin käyttää havaitsemaan A549-solut, vaikka varastoidaan varsin pitkään.

(A) Prosenttia sitova osa tuoreiden ja kiinteiden monoklonaalinen peptidi-fluoresoiva bakteereja eri solujen FACS tiedot. Solut sitoutuminen tuoreisiin bakteerien (musta) vaihdekertoimella 1:100 ja sitoutumisen kiinteään bakteerit (harmaa) vaihdekertoimella 1:500. (B) fluoresenssin mikroskooppi kuvat A549-solujen inkubointi tuoretta bakteereja ja kiinteiden bakteerit vaihdekertoimella 1:500, 1. päivänä, päivänä 7 ja päivänä 30 kuluessa tallentamisesta ja Mittakaavapalkki oli 20 um. (C) FACS tulokset A549-solujen sitoutumisen tuoretta ja kiinteän monoklonaalinen peptidi-fluoresoivia bakteereita suhde 1:500 eri ajankohtina. (D) Prosenttia sitova osa tuoreiden ja kiinteiden monoklonaalinen peptidi-fluoresoiva bakteereja A549 soluja FACS tiedot Soluja sitova tuoretta bakteereja ja kiinteiden bakteerit vaihdekertoimella 1:500 eri ajankohtina. Data oli keskiarvo ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

5. Detection of A549 Tuumorikudoksen hiiriltä Vieraslajisiirteen kanssa peptidi-fluoresoiva Bacteria

Kun Inkuboiduissa kasvainkudoksen A549 hiirillä ksenografti kanssa indusoi monoklonaalisia peptidi-fluoresoiva bakteerien (klooni 4 ja CPX vain), kasvain osio ksenografti emittoidun vihreän fluoresenssin koska peptidien pinnalla fluoresoiva bakteereja voisi tunnistaa kasvainsoluja. Kuitenkin kudoksen osassa vieressä kasvain osaan inkuboitiin kloonin 4 peptidi-bakteerien ja kasvainten osio inkuboitiin CPX vain bakteerit eivät tuota fluoresenssisignaalien (kuva 5). Nämä tulokset voidaan toistaa kiinteällä peptidi-fluoresoiva bakteereja (tuloksia ei ole esitetty).

Mittakaavapalkki oli 20 um. Tiedot edustivat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Keskustelu

Tutkimuksessamme spesifinen sitoutuminen peptidejä keuhkosyöpään solut tunnistettiin bakteerien pinta näyttö menetelmällä. Ei ollut konservoitunutta sekvenssit peptidit, jotka osoittivat, että nämä peptidit voisivat olla vuorovaikutuksessa eri proteiinien pinnalla syöpäsoluja. Vaikka nämä peptidejä voitaisiin käyttää kohdemolekyylejä diagnosointiin ja hoitoon syöpiä, tässä tutkimuksessa, yritimme tutkia mahdollisuuksia loisteputki

E. coli

MC1061, joka oli erityisiä peptidejä pinnalla, suoraan toimi diagnostiikkaan. Tulokset

in vitro

kokeessa osoitti, että valitut bakteerit peptidien kanssa pinnalla voisi konkreettisesti sitoutua A549-soluja suurella affiniteetilla, riippumatta siitä, onko solut kiinnitetään tai irrotetaan. Kyky peptidi-fluoresoivia bakteereita tunnistaa tiettyjä kasvainsoluja vahvistettiin hiirissä -tuumoriksenografti kokeissa. Kun tulokset

in vitro

kokeissa uusi menetelmä kehitettiin ensimmäisen kerran havaita keuhko- syöpäsoluja suoraan fluoresoivan bakteereja. Ottaen huomioon hylly aikaa ja turvallisuus bakteerien, manipulointi eläviä bakteereja oli välttämätöntä niiden edelleen sovelluksen. Kautta verrataan vaikutus eri kiinnityksen reagenssit (etanoli, metanoli, asetoni ja 4% paraformaldehydi), 4% paraformaldehydiä valittiin parhaaksi kiinnitys reagenssia. Bakteerit kiinnitettiin tämän reagenssin voisi säilyttää korkean sitova ja spesifisyyden soluihin vähintään yhden kuukauden ajan.

kliininen käytäntö ja penkki työtä, suurin osa ajasta, kuvantamisteknologian käytettiin diagnoosi keuhkosyöpään. Monet kuvantaminen molekyylejä jo kliinisiä ja subkliinisiä käyttö, esimerkkejä, toiminnallinen radioaktiiviset molekyylit PET kuvantamisen [26], uusia magneettisia materiaaleja MRI [27], uudet materiaalit ultraääni kuvantamisen [28] ja PET /MRI [29 ]. Vaikka on jo raportoitu edelleen bakteerin kuin Bioluminoivan kuvantamisen reagenssina diagnoosi [30], mutta sen soveltaminen rajoittui niukkuuden vuoksi tarkkuuden, herkkyyden ja luminescent vahvuus tämän kuvantamisen reagenssia. Uusi järjestelmä voi auttaa meitä paitsi syrjiä keuhkosyövän solut muista soluista, mutta myös määrittää genre keuhkosyövän soluja, mikä tekee tämän menetelmän tarkemman diagnoosin. Tällä hetkellä menetelmiä, joita käytetään kliinisesti määrittämään lajityypin soluista ovat hematoksyliinillä ja eosiinilla tahra (H & E värjäys) [31] ja immunohistokemia [32], mutta nämä kaksi menetelmää ovat monimutkaisempia ja kalliita ja subjektiivinen verrattuna uuden menetelmän . Alhainen investointi (vain yksi fluoresenssimikroskoopilla tarvita) ja lyhyt valmisteluaika näytteitä, meidän menetelmä tarjoaa uuden täydentävän tapa tehdä nopeita ja tarkkoja päätöksiä siitä kasvaimet ovat hyvänlaatuisia tai pahanlaatuisia, jossa on reuna kasvain jaksossa ja vaikka mitä genre kasvain potilaalla aikana kirurgisissa toimenpiteissä [33], [34].

Tutkimuksemme esitteli uuden menetelmän havaita keuhkosyöpään solut suoraan peptidi-loisteputki bakteerien luminescent reagenssien

in vitro

. Tällä menetelmällä on etuja edullisia, helppous hankinta, helppous suorituskykyä, lyhyt aika valmisteluun ja objektiivisuus. Kuitenkin tällä hetkellä emme voineet selvittämiseksi yksityiskohtaista molekyylitason mekanismi siitä sitova tapahtuma välillä peptidien ja solujen. Lisäksi tarvitsemme vielä enemmän kliinistä näytettä päteviksi järjestelmämme. Vaikka nykyisestä koetuloksista, uskomme, että tämä menetelmä on valtava potentiaali uutena kliinisen diagnostisen keinoin. Jatkossa tutkimus, tukea massa kokeellista tietoa tarvitaan edistämään käännös tämän menetelmän penkistä klinikalle.

tukeminen Information

Kuva S1.

FACS tulokset erilaisista solujen sitoutumisen kiinteällä monoklonaalisella peptidi-fluoresoiva bakteereja vaihdekertoimella 1:500.

doi: 10,1371 /journal.pone.0054467.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Dr Vittorio de Franciscis ja Laura Cerchia tarjota A549 hiirille -tuumoriksenografti näytteitä parafiini dioja. Kiitämme Dr Biliang Zhang ja Haiyan Liu tarjota solulinjoja.