Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut ovat syöpäsolut tunnusomaista kantasolujen ominaisuuksia ja edustavat pientä väestö kasvainsolujen joka ajaa kasvainten kehittymiseen, eteneminen, etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssin. Tähän mennessä molekyylitason mekanismeja, jotka tuottavat ja säännellä syövän kantasolut eivät ole hyvin määritelty. BORIS (veli Regulator painettu sivut) tai CTCFL (CTCF-like) on DNA: ta sitova proteiini, joka ilmentyy normaaleissa kudoksissa vain sukusolujen ja aktivoituu uudelleen kasvaimissa. Viimeaikaiset todisteet ovat osoittaneet korrelaatio

BORIS /CTCFL

ilmaisua huono eloonjäämisaste eri syöpäpotilailla. Olemme aiemmin osoittaneet yhteyden Boris ilmentävien solujen stemness geeniekspressiota alkion syöpäsoluja. Täällä tutkimme rooli Boris epiteelikasvainsolut. Käyttämällä BORIS-molekyylimajakka- joka oli jo validoitu, pystyimme osoittamaan läsnäolon

BORIS

mRNA syövän kantasolujen rikastettu populaatioiden (puoli väestö ja aloilla) kohdunkaulan, paksusuolen ja rintojen syöpäsoluja. BORIS hiljentäminen tutkimukset osoittivat laskua pallo muodostumisen kapasiteetin rinta- ja paksusuolen syöpäsoluja. Tärkeää on, BORIS-hiljentäminen johti alas-säätely

hTERT

, kantasolu- (

Nanog

,

Oct4

,

Sox2

ja

BMI1

) ja syövän kantasolujen merkkiaineita (

ABCG2

,

CD44

ja

ALDH1

) geenejä. Toisaalta BORIS-induktio johti säätely ylöspäin saman geenejä. Nämä fenotyypit havaittiin kohdunkaulan, paksusuolen ja invasiivisen rintasyövän syöpäsoluja. Kuitenkin, täysin erilainen käyttäytyminen havaittiin ei-invasiivista rintasyöpäsolut (MCF7). Todellakin, nämä solut hankki epiteelin mesenkymaalitransitioon fenotyyppi jälkeen BORIS hiljentäminen. Tuloksemme osoittavat, että BORIS liittyy syöpään kantasolujen rikastettu populaatiot useiden epiteelikasvainsolut ja eri fenotyyppejä riippuu alkuperästä syöpäsoluja.

Citation: Alberti L, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2015) Eri vaikutukset BORIS /CTCFL annetun Stemness Gene Expression, Sphere Formation and Cell Survival in epiteelisyöpäsolujen Stem Cells. PLoS ONE 10 (7): e0132977. doi: 10,1371 /journal.pone.0132977

Editor: Gabriele Saretzki, Newcastlen yliopisto, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 17 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Alberti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Taloudellinen tuki annettiin Sveitsin National Science Foundation (31003A-113505) ja Emma Muschamp Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Yksi kirjoittajista (JB) työskentelee molekyyli- patologian laboratorio (Biopath Lab). Biopath Lab tuettiin muodossa palkoista, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Yksi kirjoittajista (JB) työskentelee molekyyli- patologian laboratorio (Biopath Lab). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Valtava todisteet tukevat näkemystä, että ihmisen syövän voitaisiin pitää kantasoluja tauti [1- 3]. Syöpä kantasolut (CSCS) teoria olettaa, että syövät nähdään monimutkaisia ​​kudoksia, joissa poikkeava solu kasvun taustalla on pieni populaatio soluja, määritellään kasvaimen aloittamista soluihin. Nämä solut voidaan jakaa karkeasti kolmeen ominaisuudet: hallitsematon leviämisen kapasiteetti, kyky itseuudistumisen ja kyky erilaistua ei-CSC jälkeläisten [3, 4]. Mielenkiintoista, ominaisuuksia näiden pahanlaatuisia soluja ovat läheisesti samanlaisia ​​kuin kolme ominaisuutta, jotka luonnehtivat normaalit kantasolujen: mahdollinen lisääntyä laajasti, itsensä uudistaminen ja kyky kehittää useisiin linjoihin. Näin ollen kasvainsolujen näitä ominaisuuksia kutsutaan myös syövän kantasoluja. Ensimmäiset havainnot läsnä CSCS suoritettiin ihmisen akuuttia myelooista leukemiaa [5], ja näin ollen on kehitetty erilaisia ​​ihmisen kiinteiden kasvainten, kuten rintasyövän [6], aivojen [7], paksusuolen [8, 9], haiman [10 ] ja munasarjojen [11] kasvaimia. On osoitettu, että monet syöpäpotilailla, erityisesti kiinteitä kasvaimia, vastaavan huonosti tavanomaisiin hoitoihin, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa, ja sen jälkeen alustavan osittainen remissio, kasvaimen uusiutumisen. Syyt tällaisesta tapauksesta voi selittyä huumausaineisiin ja radio vastus CSCS. Lisäksi on osoitettu, että CSCS ovat yleisempiä korkeasti aggressiivinen ja tulenkestäviä kasvaimissa [6-7]. Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa CSC populaatioiden ja niiden merkkiaineiden kehittää CSC kohdistetun hoitojen vastuksen voittamiseen CSCS tavanomaiseen syöpälääkkeet. Kokeellisin lähestyessä CSCS monien kasvainten tyyppejä on ominaista fenotyypiltään ja useita CSC markkereita on identifioitu [4, 12]. Kuitenkin useimmat tunnistetut markkerit eivät ole täysin spesifisiä CSCS, koska ne ovat myös ilmentyy normaaleissa soluissa, ja näin ollen, käyttämällä useita markkereita tarvitaan. Monet ponnisteluista syöpätutkimukseen on välttämätöntä optimoida kohdistamista CSCS hoitoja. On olemassa useita lähestymistapoja rikastuttaa CSCS populaatiot, joita käytetään pääasiassa

in vitro

analyyseihin ja seulontamenetelmiä. Yksi lähestymistapa perustuu solun valintaa alapopulaatio joka pystyy pumpata väriaineita. Ulosvirtausta Näiden väriaineiden on kapasiteetti CSCS jotka ilmentävät geenejä, jotka koodaavat ATP-sitova kasetti (ABC) lääkkeiden kantaja, kuten ABCG2 [13-15]. Eniten käytetty väriaine on Hoechst 33342, joka on DNA: ta sitova väriainetta. Alaryhmässä valitsema tätä menetelmää kutsutaan puolella väestöstä (SP). Aldehydi (ALDH) aktiivisuus on toinen toiminnallinen ominaisuus kantasoluja, käytetään eristämään rikastetun CSCS väestöstä [16, 17]. Ylimääräinen

in vitro

lähestymistapa perustuu tarttumattomat seerumittomassa kulttuuri [8, 18]. Käyttämällä tätä menetelmää, solut eri tyyppisiä kasvaimia (mukaan lukien aivot, rinta ja paksusuoli), joka on kapasiteettia itseuudistumisen ja säilyttää kantasoluja ominaisuudet, voivat muodostaa pallojakaantuminen pesäkkeitä nimetty aloilla [19].

BORIS (veli Regulator painettu Sites) on DNA-sitovan proteiinin, joka jakaa sen paralogi CTCF, 11 sinkki-finger domain, siis myös kutsutaan CTCFL (CTCF kaltainen) [20]. BORIS proteiini liittyy epigeneettisellä uudelleenohjelmointi ja se kuuluu syöpä kives antigeeniperheen, koska se ilmentyy normaaleissa sukusolujen ja aktivoitu kasvaimia. Viimeaikaiset raportit osoittavat, että BORIS ilmentyminen liittyy pitkälle eri syöpiä, kuten munasarja-, eturauhas-, ruokatorven ja maksan syöpien [21-24]. Vuonna munasarjasyöpiä, BORIS ilmentyminen voi myös antaa huonon ennusteen [21]. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut yhdistys Boris ilmaisutapoja kantasolujen ja CSC markkerigeenit alkion karsinoomasolut [25]. Kaikkiaan nämä todisteet sai meidät tutkimaan tarkemmin läsnäoloa ja molekyylitason toimintojen Boris että CSCS rikastetun väestön muunlaisia ​​kasvainsolujen ja erityisesti kohdunkaulan, paksusuolen ja rintojen syöpäsoluja. Koska ei ole validoitu vasta-ainetta BORIS, käytimme BORIS-molekyylimajakka- (BORIS-MB), joka oli aiemmin testattu ja validoitu

in vivo

havaitseminen

BORIS

mRNA [25 ]. BORIS-MB antoi meille mahdollisuuden visualisoida BORIS-positiivisten solujen analysoitiin epiteelikasvainsolut. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että

BORIS

ilmenee vahvasti CSC-rikastettu väestön eristetty SP ja aloilla. Lisäksi toiminnalliset tutkimukset paljastivat, että BORIS voisi olla tärkeä rooli itseuudistumisen kasvaimissa ja hankinnan epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) allekirjoitus pohja alkuperästä kasvaimen soluihin.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kuulat valmisteen

ihmisen solulinjoja (HeLa, kohdunkaulan adenokarsinooma, HT29, paksusuolen adenokarsinooman, NCCIT, alkion karsinooma) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja ihmisen rintojen solulinjojen (MCF7 ja MDA-MB-231) toimitti Dr. Stéphanie Renaud (Biotechnology Institute, University of Lausanne). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 joko Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco, Invitrogen) ja HeLa ja HT29-soluja, tai RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Invitrogen) ja NCCIT, MCF7 ja MDA-MB-231-solut, jota on täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco, Invitrogen).

alalla kulttuurin (HT29, MCF7 ja MDA-MB-231) on ensimmäinen irrotettiin 0,25% trypsiiniä liuos (Invitrogen) ja pestiin kahdesti PBS: ssä (Invitrogen). Sitten solut suodatettiin kahdesti käyttäen solu-siivilä 40 pm silmäkoko (Falcon) ja viljeltiin seerumittomassa alustassa, joka sisälsi DMEM /F-12-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty B27 (Invitrogen), 5 ug /ml hepariinia (Sigma ), 20 ng /ml EGF: ää (epidermaalinen kasvutekijä, BD Biosciences), 20 ng /ml FGF (Fibroblast Growth Factor, BD Biosciences) ja 5 ug /ml insuliinia (Sigma). Solut siirrettiin ultra-low kiinnitys 6-kuoppaisille levyille (Corning) tiheyteen 1000 solua /ml 10-15 päivää. Kuulat laskettiin ja kerättiin RNA. Alikvootti pallojen ympättiin normaalissa, seerumia sisältävää elatusainetta, jotta erilaistumista.

Fluoresenssi-analyysi käyttäen BORIS-MB

Solut valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, solut suspensiossa (1 x 10

6 solua /ml) inkuboitiin 37 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan seerumittomassa DMEM-alustassa, jossa Cy3-BORIS MB (200 nM) ja Hoechst 33342 (5 ug /ml) läsnä ollessa Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfektioreagenssia (Invitrogen). Solut pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS-5 mM EDTA: ta ja cytocentrifugated päälle lasilevy käyttäen cytospin sentrifugia ja sitten tutkittiin fluoresoivalla (Axioplan2 Imaging, Zeiss) tai konfokaalisella (LSM 710 Quasar, Zeiss) mikroskoopilla.

Jos ABCG2 fluoresenssivärjäyksellä, solut valmistettiin, kuten on kuvattu muualla. Jälkeen cytospin, solut kiinnitettiin jääkylmällä asetoni 8 minuutin ajan ja värjättiin 4 ° C: ssa yön yli kanin anti-ihmis-ABCG2-vasta-aineen (Sigma) käytettiin 1:20 laimennos PBS: ssä. Objektilasit pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä aasin anti-kani sekundääristä vasta-ainetta leimattiin Alexa Fluor 488 (Sigma), käytettiin 1: 500 laimennos PBS: ssä. Sitten lasit tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla.

FACS-analyysi ja lajittelu SP

HeLa-soluja (1 x 10

6 solua /ml) inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 37 ° C: ° C: ssa 1,5 tunnin ajan Hoechst 33342 (Invitrogen), jonka lopullinen pitoisuus on 12,5 ng /ml joko yksin tai yhdessä 50 uM verapamiilia (Sigma) kontrollina. Solususpensiot määräajoin sekoitettiin inkubaation aikana. Inkubaation jälkeen solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen PBS-5 mM EDTA. Ennen analyysiä soluja inkuboitiin propidiumjodidilla (2 ug /ml) ja suodatettiin käyttäen solu-siivilä 40 pm silmäkoko (Falcon). SP analyysit suoritettiin käyttäen LSRII (Becton Dickinson) ja lajittelun SP ja NSP (ei-SP) käyttäen FACS Aria (Becton Dickinson) laitoksessa on EPFL (Ecole Polytechnique Fédérale Lausannen). Hoechst 33342 väriaine viritettiin 355 nm ja sen fluoresenssi analysoitiin dual-aallonpituus emissio, 445 nm Hoechstin sininen ja 650 nm Hoechstin punainen.

Ectopic BORIS ilmaisu

Hela-soluja transfektoitiin pCMV-BORIS plasmidi käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), kuten aiemmin on kuvattu [25].

BORIS pudotus mukaan indusoitavissa shRNA lentiviruksen järjestelmän

Stables solulinjoissa indusoituvan ilmentävät shRNAs kohdistaminen ihmisen

BORIS

mRNA valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. HeLa, HT29, MCF7 ja MDA-MB-231 kasvaimen solulinjoja käytettiin näissä kokeissa.

BORIS cDNA ilmentyminen indusoituvan lentiviruksen järjestelmän

Stable solulinjoissa indusoituvan ilmentävät ihmisen

BORIS

cDNA luotiin käyttäen doksisykliini-indusoituva lentiviruksen järjestelmä [26]. BORIS cDNA pCMV-BORIS plasmidi kloonattiin pINDUCER20 Gateway Cloning järjestelmä (Invitrogen). Lentivirusvektorilla pINDUCER20 sisältää antibiootin valinnan markkeri G418 (Geneticin), joka mahdollistaa valita vain transdusoituja soluja. Tämä vektori sisältää myös kasetin, jossa on doksisykliini-indusoituvan promoottorin, joka ohjaa transkription kloonatun cDNA: n. Tuottaminen lentivirus, me seurasimme myös menettelyä, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Virussuspensio- yhdistettynä 8 ug /ml polybreeniä (Sigma) käytettiin infektoimaan kohdesolut (HeLa, HT29, MCF7 ja MDA-MB-231). Kaksikymmentäneljä tuntia infektion jälkeen elatusaine korvattiin elatusaineella, jota oli täydennetty 500 ug /ml G418: aa (Roche). 2 viikon kuluttua antibiootti valinta, 2 ug /ml doksisykliiniä (Sigma) lisättiin alustaan, jotta induktion

BORIS

cDNA ilmaisun ja doksisykliini sisältävä väliaine päivitetään joka 3 päivä.

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

qRT-PCR-analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. ΔΔCt menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen ekspressiotasot, jotka normalisoitiin

GAPDH

tasolla. Kuten jo raportoitu [25], kaikkien monistettu kohdegeeneissä PCR tehokkuutta pidennetään 94-101%, jossa korrelaatiokerroin (r2) vaihtelevat 0,96-1,0. Ct-arvot GAPDH mittasivat samalla tasolla (Ct = 10,07 ± 0,25) kaikista analysoitiin solut.

sekvenssit käytetty aluke lisäksi esitetään S1 taulukossa.

CD44 + /CD24 – analyysi virtaussytometrillä

CD44 + /CD24- ilmentyminen analysoitiin soluissa muokattu vakaasti näytteille knockdown

BORIS

mRNA- tai ilmaista

BORIS

cDNA. Solut trypsinoitiin ja 10

6 solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan PBS-1% FBS: ää. Monoklonaalinen hiiren anti-ihmisen CD44-APC-H7 vasta-aineella (BD Pharmingen) ja monoklonaalinen hiiren anti-ihmisen CD24-Alexa Fluor 647-ainetta (BD Pharmingen) lisättiin laimennoksina 1:20 ja 1: 5 vastaavasti suositusten mukaisesti valmistaja, ja inkuboitiin 40 minuutin ajan 4 ° C: ssa. DAPI lisättiin pitoisuutena 1 ug /ml viime 10 min inkubaation jälkeen. Kun oli pesty PBS-1% FBS: ää, virtaussytometria-analyysi suoritettiin käyttäen Gallios virtaussytometriä (Beckman Coulter). Vähintään 5 x 10

4 tapahtumaa laskettiin kaikille näytteille. Analyysi prosenttiosuus CD44 + /CD24- soluihin arvioitiin jälkeen ilman kuolleita soluja (DAPI positiiviset solut) ja ruiskutus on eGFP ja tRFP positiivisia soluja. Tulokset analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa. Kolme riippumatonta koetta suoritettiin.

Colony muodostavat määritys

Solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen väliaineessa. Kolmesataa solut ympättiin 6-kuoppaisille /levyille kolmena rinnakkaisena. Soluja viljeltiin juuri doksisykliini sisältävässä väliaineessa. 2 viikon kuluttua solut kiinnitettiin 1 ml: lla 4%: ista formaldehydiä 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja värjättiin 1 ml 0,1% kristalliviolettia 10 minuuttia. PBS-pesun jälkeen, kukin hyvin kuvattiin ja pesäkkeet (määritetty 50 solua /pesäke) laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmaa.

Migration määrityksessä

solumigraation määritettiin käyttäen soluviljelmän inserttejä (BD Falcon) 8 um huokoskoko. Lyhyesti, solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen seerumia, 5 x 10

4 solut maljattiin yläosaan inserttien sijoitetaan 24-kuoppaisille levyille. Alaosassa hyvin inserttien lisättiin 500 ui väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, ei-vaeltavat solut poistettiin pumpulipuikolla ja vaeltavien solujen (alapinnalle sisäkkeen) kiinteään 1 ml: lla 4%: ista formaldehydiä ja värjättiin sitten 1 ml: lla 0,1% kristalliviolettia 10 min. Sen jälkeen pestiin 3 kertaa PBS: llä, vaeltavat solut laskettiin alle kymmenen random suuritehoisia mikroskooppikentäs- kohti insertti ja keskimääräinen määrä vaeltavia solujen laskettiin jokaiselle ryhmälle soluja.

Solulisääntyminen ja Chemo-herkkyys määrityksissä

Solujen lisääntyminen analyysin jälkeen BORIS hiljentämisen ja Boris-induktion arvioitiin MTT: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu [25].

In vitro

kasvun vaikutus 5-fluoriurasiili (5- FU) määritettiin MTT-määrityksellä. Lyhyesti, kunkin ryhmän soluja, kun BORIS hiljentämisen, ympättiin kolmena kappaleena tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille doksisykliini sisältävässä väliaineessa. Päivä sen jälkeen, 5-FU (Sigma) lisättiin eri pitoisuuksina: 0,5, 5, 50 ja 500 ug /ml. Soluja inkuboitiin 2 päivää, ja sitten solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Kasvun estäminen tai eloonjääntifraktio ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien kontrollien, joka mitattiin heti, seuraavan yhtälön avulla: (absorbanssi käsitellyn näytteen /absorbanssi käsittelemättömän näytteen) x 100.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen kaksisuuntainen Studentin t-testi-analyysi. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

BORIS

mRNA ilmentyy puolella väestöstä soluissa

tutkimiseksi läsnäolon

BORIS

mRNA CSC-rikastettu populaatioiden epiteelikasvainsolut, käytimme malleina ihmisen HeLa (kohdunkaulan), HT29 (paksunsuolen), MCF7 (ei-invasiivisen rintasyövän) ja MDA-MB-231 (invasiivinen rintasyöpä) kasvainsolulinjoja. Expression analyysi osoitti alhaisempi

BORIS

mRNA HeLa ja HT29 verrattuna alkion kasvainsolujen (NCCIT), kun taas MCF7 ja MDA-MBA-231-

BORIS

mRNA oli lähes mahdoton havaita ( kuvio 1A). Näin ollen, HeLa, HT29, MCF7 ja MDA-MBA-231 kasvaimen solut voidaan luokitella BORIS-low ilmentäviä tuumorisoluja.

(A)

BORIS

ilmentymistä ihmisen kasvainsolulinjoissa. Kokonais-RNA NCCIT (alkion), HeLa (kohdunkaulan), HT29 (paksunsuolen), MCF7 (ei-invasiivisen rintasyövän) ja MDA-MB-231 (invasiivinen rintasyöpä) kasvainsoluja uutettiin ja

BORIS

ilmentyminen analysoitiin by qRT-PCR. Tulokset normalisoitiin

GAPDH

ja liittyvät NCCIT soluihin. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). (B)

BORIS

ilmaisu kuten havaittiin käyttäen BORIS-MB. Edustavat kuvat HeLa, HT29, MCF7 ja MB-MDA 231-solut, 40X suurennus. Soluja inkuboitiin Cy3-BORIS MB (200 nM) ja Hoechst 33342 (5 ug /ml) 37 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan seerumivapaassa väliaineessa ja sitten tutkitaan fluoresenssimikroskopialla. Valkoinen nuolet osoittavat Hoechstin negatiivisia soluja, jotka ovat myös

BORIS

mRNA positiivinen havaittuna Boris-MB.

Hoechst puolella väestöstä (SP) analyysi on osoittautunut tekniikka rikastuttaa varsi ja varhainen kantasolujen eri solulinjoista [13-15]. Fluoresenssikuvantamiseen analyysi tehtiin käyttämällä Hoechst 33342 yhdessä

BORIS

mRNA havaitseminen käyttäen BORIS-Molecular Beacon (BORIS-MB), kuten aiemmin on kuvattu [25]. Fluoresenssikuvantamiseen analyysit osoittivat, että BORIS positiiviset solut ovat vain osa solujen kaikkien analysoitiin epiteelin kasvainsolulinjoja (kuvio 1 B), mikä on yhdenmukaista saadut tulokset alkion kasvainsoluissa [25]. Arvioitu taajuus BORIS positiivisten solujen on noin 0,1% HeLa, 0,5% HT29 ja alle 0,05% MCF7 ja MDA-MBA-231-; Toisin oli noin 5% NCCIT [25]. Mielenkiintoista on, että fluoresenssin kuvantamisen analyysit osoittivat, että suurin osa BORIS positiivisten solujen olivat myös Hoechst negatiivisia (valkoiset nuolet kuviossa 1B ja S1 kuviossa). Siksi

BORIS

ilmaus voisi liittyä Hoechstin negatiivinen fenotyyppi SP solujen kohdunkaulan, paksusuolen ja rintojen syöpäsoluja. Kuitenkin pieni prosenttiosuus (alle 10%), Boris positiiviset solut olivat Hoechst positiivisia.

ABCG2 on kuvattu suurten effluksipumpun vastaa Hoechstin negatiivinen fenotyyppi SP-soluissa [27]. Näin ollen mahdollinen koekspressio

BORIS

kanssa chemoresistance kuljettaja proteiini ABCG2, tutkittiin ensin. HeLa-soluja käytettiin tässä kokeessa. Kuten voidaan nähdä kuviosta 2A, BORIS positiiviset solut ovat negatiivisia Hoechstin (valkoiset nuolet) ja positiivinen ABCG2 proteiinia. Vahvista läsnäolon

BORIS

mRNA CSC-rikastettu populaatio HeLa-solujen, SP soluja ja myös ei-SP (NSP) solut lajiteltiin FACS. Prosenttiosuus SP-soluissa oli 0,5% 1,5% koko soluissa (kuvio 2B), mikä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien [15, 27]. SP jae oli täysin alennettu lisäämällä verapamiili, estäjä ABC-kuljettajat, mikä osoittaa, että kanta on bona fide SP-soluissa. QRT-PCR-analyysi osoitti, että

BORIS

mRNA taso SP solujen oli merkittävästi suurempi (12 kertaisesti, p 0,05) verrattuna NSP ja vanhempien HeLa-soluja (kuvio 2C). Myös

ABCG2

mRNA oli korkeampi (noin 1,5 kertaisesti) SP lajitellut solut verrattuna NSP ja vanhempien soluja (kuvio 2D). Edelleen todentamiseksi läsnä

BORIS

SP CSC-rikastettu väestöstä, taajuus SP analysoitiin pCMVBORIS-transfektoiduissa HeLa-soluissa (kuvio 2E). Kuten odotettua, jotka yli-ilmentävät BORIS solut merkittävästi rikastettu SP-soluissa (2-kertaiseksi, p = 0,01) verrattuna HeLa emosoluilta. Kaikki nämä tulokset osoittivat, että eristäminen BORIS-positiivisten solujen voisi johtaa rikastuminen CSC väestön HeLa kasvainsoluissa.

(A) Immunofluoresenssianalyysi of ABCG2 HeLa-soluissa. Soluja inkuboitiin Boris-MB ja Hoechst 33342 37 ° C: ssa 1,5 h seerumittomassa väliaineessa. Jälkeen solusentrifugoinnin levyt kiinnitettiin kylmällä asetonilla ja sitten inkuboitiin kanin polyklonaalisen ABCG2 vasta-ainetta. BORIS positiivinen /ABCG2 positiivinen /Hoechst negatiiviset solut on merkitty valkoisilla nuolilla. 10X suurennus. (B) edustaja pistekuvaajan virtaussytometria analyysi SP. HeLa-soluja inkuboitiin Hoechst 33342 (12,5 ug /ml), joko yksinään tai yhdessä verapamiilin (50 uM). Analyysi suoritettiin käyttämällä LSRII ja lajittelu käyttämällä FACS Aria. Portit osoittavat lajitellaan SP ja NSP soluja. (C)

BORIS

mRNA: ta ja (D)

ABCG2

mRNA: n ekspression SP ja NSP eristetty HeLa-soluista. Kokonais-RNA uutettiin ja analysoitiin qRT-PCR: llä. Kuvaajat osoittavat mRNA tasot

BORIS

ja

ABCG2

geenejä normalisoitu

GAPDH

ja liittyvät vanhempien HeLa-solut. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD 3 erilliselle kokeelle. Tähti osoittaa p 0,05. (E) SP analyysi Boris yliekspressoitu soluissa. HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi BORIS ekspressiovektorilla (HeLa pCMVBORIS). 2 päivän kuluttua 1 x 10

6 solua inkuboitiin Hoechst 33342 (12,5 ug /ml) joko yksinään (ylhäällä) tai yhdessä (alhaalla) 50 uM verapamiilia. Analyysi suoritettiin käyttämällä LSRII virtaussytometriaa ja yksi edustava koe 3 itsenäisen kokeen on esitetty.

Colon-aloilla ja Mammo-aloilla ilmentävät korkeita

BORIS

mRNA

solujen kasvua suspensiossa, jossa on seerumia (pallo kulttuuri), on yhteinen lähestymistapa CSC-rikastaminen [7-8]. Koska tämä ominaisuus oli kuitenkin rajoitettu pysäyttämiseksi /esisolujen [19],

BORIS

ilmentyminen tutkittiin myös muodostettaessa-aloilla paksusuolen (HT29) ja rinta (MCF7) syöpäsoluja. Alikvootin pallojen ympättiin seerumia sisältävässä väliaineessa, jotta erilaistumista. Mielenkiintoista,

BORIS

ilmaus analyysi paljasti merkittävän korkeampi

BORIS

mRNA paksusuoli-aloilla (37,2 ± 7,3 kertaiseksi, n = 4) sekä Mammo-aloilla (30,9 ± 6,4 kertainen, n = 4), verrattuna vanhempien soluihin ja eriytetyn-aloilla (kuvio 3). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

BORIS

ilmaistaan ​​CSC-rikastettu aloilla paksusuolen ja rintasyöpäsoluja.

Solut ympättiin alhaisella tiheydellä (1000 solua /ml) alalla viljelyalustassa alhainen kiinnityslevyt. Sen jälkeen 10-15 päivä palloja kerättiin RNA ja alikvootti pallojen ympättiin normaalissa väliaineessa seerumin kanssa, jotta eriyttäminen (eriytetty-aloilla).

BORIS

ilmentyminen analysoitiin qRT PCR (A) paksusuoli-aloilla (HT29 aloilla) ja eriytetty-aloilla (HT29 DIFF aloilla) ja (B) Mammo-aloilla (MCF7 aloilla) ja eriytetty-aloilla ( MCF7 DIFF palloja). Data normalisoitiin

GAPDH

ja liittyvät vanhempien (solut). Yksi edustava koe 4 itsenäistä kokeesta. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) välillä pallojen ja vanhempien soluja. (C) Kuvat ovat paksusuolen-pallojen ja Mammo-aloilla on esitetty, 4X suurennus. Musta asteikko pylväät osoittavat 250 um.

Geenien ilmentyminen ja CSC fenotyypin BORIS Knockdown soluissa

tutkimaan mahdollista roolia Boris CSCS, valitsimme knockdown strategian avulla lentivirus järjestelmää indusoituva ilmentävät shRNAs kohdistaminen ihmisen

BORIS

mRNA. BORIS sh-3, BORIS sh-4 ja salattuja-shRNA (CTR sh) lentiviruksien aiemmin luotu ja validoitu [25]. Nämä lentivirukset käytettiin infektoimaan HeLa, HT29, MCF7 ja MBA-MD-231 kasvainsoluja.

On osoitettu, että BORIS aktivoi

hTERT

ilmaisun [28] ja vaikuttaa ilmentymistä stemness geenejä alkion tuumorisoluissa [25]. Tässä tutkimuksessa näitä korrelaatioita selvitettiin epiteelikasvainsolut. 2 viikon kuluttua Boris Knockdown, ilmaus analyysit

hTERT

,

CTCF

, yleisin CSC markkereita (

ABCG2

,

CD44

,

ALDH1

) ja kantasolujen (

Nanog

,

Oct4

,

Sox2

,

BMI1

) geenit tehtiin. Kuvio 4A osoittaa, kaikkien analysoitiin geenien, keskiarvo kertamuutos Boris sh-3 ja Boris-sh-4-soluja verrattuna CTR sh solujen kunkin muokattu kasvainsolulinjaa.

hTERT

ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty kaikissa analysoidaan kasvaimen solut lukuun ottamatta MCF7, jossa huomattava ylössäätöä (13-kertainen) havaittiin.

CTCF

ilmentyminen väheni kaikissa soluissa, vaikka lasku ei ollut merkittävä (40%: sta 20% kontrolliin verrattuna). Erityisesti puuttuminen BORIS trigged laskua

ABCG2

lauseke (93% for MCF7, 25% MDA-MB-231, 80%, HT29 ja 60% varten HeLa).

CD44

oli alassäädetty kaikissa paitsi yhdessä solulinjassa MCF7, jossa 2,5 kertainen nousu havaittiin.

ALDH1

,

Nanog

,

Oct4

,

Sox2

ja

BMI1

olivat yleensä alassäädetty kaikissa tuumorisoluissa jälkeen BORIS hiljentäminen. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että BORIS voisi merkittävästi vaikuttaa säätelyyn

hTERT Twitter /telomeraasi, kantasolu- ja CSC merkki geenien epiteelikasvainsolut.

(A) MCF7, MDA-MB- 231, HT29 ja HeLa-solut suunniteltu vakaasti näytteille tippuu alas

BORIS

mRNA. BORIS sh-3, SH-4 ja CTR sh (kontrolli shRNA sisälsi sekoitetun sekvenssin) lentivirukset käytettiin infektoimaan näihin soluihin. Jokainen transdusoidut solut viljeltiin doksisykliini aiheuttaa BORIS shRNA ilmaisua. Doksysykliiniä sisältävässä alustassa on korvattu joka 3 päivä. 2 viikon kuluttua, RNA eristettiin BORIS sh-3, SH-4, ja CTR sh kunkin transdusoitujen solulinjassa. mRNA-tasot on esitetty geenien analysoitiin qRT-PCR: llä. Käyrät edustavat kutakin geeniä keinoja kertaiseksi induktio sekä BORIS shRNA (BORIS sh-3 ja sh-4) liittyvät että valvonnan tahansa soluja. Keskivirheet laskettiin ottaen virhe lisääminen sekä BORIS shRNA analyysejä. Käyrät osoittavat yksi edustava koe. (B) edustaja virtaussytometrialla dot tontit CD44 ja CD24 ilmaisun MCF7, MDA-MB-231, HT29 ja HeLa-solut muokattu vakaasti näytteille tippuu alas

BORIS

mRNA. CD44 ja CD24 ilmentymisen kuviot kaksi BORIS shRNA (BORIS sh-3 ja sh-4), ja ohjaus (CTR sh) on esitetty. Anti-CD24-vasta-aine on leimattu AlexaFluor 647 ja anti-CD44-vasta-aine on leimattu APC-H7 käytettiin. Prosenttiosuus CD44 + /CD24- väestön arvioitiin sen jälkeen, kun portittamisella eGFP ja tRFP positiivisia soluja (transdusoitu ja DOX-indusoidun shRNA, vastaavasti) ja lopullinen portit perustuvat isotyyppikontrollia vastaa kustakin solulinjasta. Kaikki kokeet suoritettiin riippumattomasti kolme kertaa ja yksi edustava koe on esitetty kullekin ryhmälle soluja.

CD44 + /CD24- alaryhmästä on todettu rikastettu kasvaimeen aloittamisen ominaisuuksia, erityisesti rintasyövän soluissa [6, 29]. Tässä tutkimuksessa CSC subpopulaatio analysoitiin virtaussytometrialla Boris-knockdownin syöpäsoluja. Eri käyttäytyminen MCF7 verrattuna muihin soluihin havaittiin (kuvio 4B). Analyysit paljastui merkittävä hankinta CD44 + /CD24- fenotyypin BORIS-pudotus MCF7 peräisin olevia soluja, nollasta CD44 + /CD24- solujen kontrolli noin 70%: in BORIS-knockdown soluissa. Ei merkittävää laskua CD44 + /CD24- alaryhmän havaittiin BORIS-shRNA MDA-MB-231-johdettuja soluja. Ei-rintasyöpäsoluja, HT29 ja HeLa, mitään muutosta havaittiin ekspression sekä soluilla tyypillisen CD44 + /CD24- epiteelin fenotyypin.

pudotus Boris vaikuttaa soluproliferaation MCF7 rintasoluista

Solujen eloonjäänti arvioitiin seuraavien BORIS knockdown. Solujen lisääntyminen ja kyky muodostaa pesäkkeitä mitattiin joka viikko yhden kuukauden. Siirtomaa muodostuminen (tai klonogeeniset) määritys tarkkailee kyky syöpäsolujen tuottamaan elävien pesäkkeiden käsittelyn jälkeen [30] ja sitä käytettiin analysoimaan

in vitro

kapasiteetti syöpäsolujen muodostamaan pesäkkeitä jälkeen BORIS knockdown. Tulokset osoittivat merkittävää eroa soluproliferaatioon kaikissa paitsi yhdessä kasvaimen solulinja. Lukuun ottamatta kyseessä MCF7-solut, joissa on merkittävä lisäys (3-4-kertaisesti, p 0,0001) soluproliferaation verrattuna kontrollisoluihin ei havaittu (kuvio 5A). Pesäkkeenmuodostusta analyysit vahvistivat solujen lisääntymistä tulokset (kuvio 5B). Kuukauden kuluttua Boris-Knockdown, numerot pesäkkeiden eivät olleet merkittävästi erilaiset HeLa, HT29 ja MDA-MB-231, kontrolleihin verrattuna. Sen sijaan, pesäkkeiden määrä oli huomattavasti korkeampi MCF7. Nämä tulokset osoittivat, että tällä lukuun ottamatta MCF7-rintasyöpäsolujen, BORIS hiljentäminen in epiteelikasvainsolut ei ollut merkittävää vaikutusta solun eloonjäämistä.

(A) Solujen lisääntyminen, yli 1 kuukausi DOX-indusoidun BORIS – ja CTR- shRNA soluja, analysoitiin viikoittain MTT: llä. Tulokset Kahden erityisen BORIS-shRNA (BORIS sh-3 ja sh-4) on osoitettu prosentteina verrattuna solujen lisääntymisen hallinnan solujen (salattu shRNA, CTR sh). Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) välillä BORIS sh ja CTR sh. (B) edustavat kuvat pesäkemuodostusta 1 kuukauden jälkeen Boris knockdown. Kolmesataa soluja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 6-kuoppalevyille doksysykliiniä sisältävässä alustassa, soluryhmäkohtaisesti valmistettiin kolmena kappaleena.