Krooninen sairaus

tiivistelmä

endostatiini on tärkeä endogeeninen inhibiittori uudissuonittumisen, joka on laajalti käytetty anti-angiogeneesin terapian syövän hoitoon. Kuitenkin sen kliininen käyttö on suurelta osin heikensi huono teho. Ihmisen istukasta peräisin olevan mesenkymaaliset kantasolut (hpMSCs) ovat erityisen houkuttelevia soluja kliiniseen käyttöön solu-hoidoissa. Esillä olevassa tutkimuksessa, hpMSCs eristettiin ja karakterisoitiin. Sitten arvioitiin kasvaimen kohdistuksen ominaisuudet ja antituumorivaikutukset hpMSCs kuin geenikuljettimia munasarjojen syövän hoidossa. Me tehokkaasti suunniteltu hpMSCs toimittaa endostatiinista kautta adenoviruksen transduktio välittämiä Lipofectamine 2000 tropismi kapasiteetti suunniteltu hpMSCs kasvainsoluja kohtaan varmistettiin sitten

in vitro

muuttoliike määrityksiä ja

in vivo

intraperitoneaalisesti injektio hpMSCs nude-hiiriin. HpMSCs ilmentää ihmisen endostatiini geenin osoitettu etuoikeutettu homing kasvainkohtaan ja vähensi merkittävästi tuumorin tilavuus ilman selvää systeemistä toksisia vaikutuksia. Nämä havainnot liittyivät merkittävästi vähentynyt veren ituja ja kasvainsoluproliferaation sekä dramaattisesti lisääntynyt kasvaimen apoptoosin indeksi. Nämä tulokset viittaavat siihen, hpMSCs ovat potentiaalisesti tehokas kuljetusvehikkelinä terapeuttisten geenien hoitoon munasarjasyöpä.

Citation: Zheng L, Zhang D, Chen X, Yang L, Wei Y, Zhao X (2012) Kasvaintenvastainen toiminta ihmisen istukan-Derived mesenkyymikantasoluista ilmaiseminen endostatiini on munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (7): e39119. doi: 10,1371 /journal.pone.0039119

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, Belgia

vastaanotettu: 24 joulukuu 2011; Hyväksytty: 16 toukokuu 2012; Julkaistu: 24 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National 973 Program of China avustusten (2011CB910703). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on yksi yleisimmistä gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia, ja se on edelleen neljänneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman naisten [1]. Huolimatta monista kehitys kirurgisista, kemoterapiaa, ja sädehoitoa viime vuosikymmeninä, ennuste joilla on pitkälle edennyt munasarjasyöpä on edelleen heikko, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 30% potilailla, joilla etäispesäkkeitä. Tämä alhainen eloonjäämisaste johtuu pääasiassa lopulta kasvaimen uusiutumisen ja syntyminen lääkeresistenssideterminantit [2]. Näin ollen uusia terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan pikaisesti muuttaa tulevaisuuden näkymiä munasarjasyöpäpotilaalle.

Angiogeneesi on ratkaiseva merkitys biologisessa ja patologisia prosesseja syövän. Monirivisille todisteita ovat osoittaneet, että kasvua ja etenemistä useimmat kiinteiden syöpien ovat angiogeneesistä riippuvaisia, ja kasvaimen angiogeneesi on erittäin johtamasta tasapaino positiivisten ja negatiivisten sääntelyviranomaiset [3], [4]. Tähän mennessä useita Antiangiogeneesiaineita on tunnistettu. Endostatiini, 20 kDa: n karboksyylipään fragmenttia, α1 ketjun kollageeni XVIII, joka estää endoteelisolujen migraatiota, proliferaatiota ja indusoi apoptoosin verisuonten endoteelisolujen, on pidetty kaikkein angiogeneesin estäjä. Se on vakiintunut, että endostatiinista voidaan tehokkaasti estää erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten pienten Lewisin keuhko- karsinooma [5], paksusuolen syöpä [6], ihmisen rintasyövän [7], maksasyövän [8], [9], munasarjasyöpä [ ,,,0],10], [11], ja pahanlaatuinen melanooma [12]. Koska proteiinilääkettä, endostatiinista on lyhyt puoliintumisaika

in vivo

ja helposti menettää sen tehokkuutta. Lisäksi vaatimus usein annostusohjelmaa ja suuria kalliita puhdistettua proteiinia heikentää sen tulevaa kliinisissä sovelluksissa. Näiden puutteiden korjaamiseksi, soveltaminen geeniterapian on selvitetty. Kuitenkin geeni toimitus hyötysuhde plasmidivektorien on erittäin huono, ja ne tuottavat myös erittäin alhainen ilmentyminen endostatiiniaktiivisuus. Muut strategiat ovat yrittäneet ratkaista joitakin näistä kysymyksistä yritetty pidentää ilmaus endostatiini. Adenovirus pidetään yksi tehokas geenien vektoreita ja on osoitettu tuottaa korkean ilmentymisen endostatiinin useita päiviä [4]. Kuitenkin rajoitukset johtuvat suhteellisen lyhyt elinaika virus, ja nämä vektorit voi siirtää erityisesti tuumorikohtaan, mikä edellyttää, sijainti injektio. Siksi tarvitaan uusia ja tehokkaampia terapeuttisia välineitä tarvitaan jotka on kohdistettu erityisesti endostatiinin ekspressio kasvaimen soluihin.

Mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ovat multipotentteja kantasoluja, joilla on kyky erilaistua eri solutyyppejä, mukaan lukien kondrosyyttien , osteoblastien, adiposyyttien, lihakset, neuronien, stroomasolut, ja muiden solutyyppien [13]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen istukasta peräisin oleva mesenkymaaliset kantasolut (hpMSCs) muistuttavat kantasoluja luuytimen suhteen solujen ominaisuudet ja niiden mahdollisuuksia multilineage eriyttämisen [14] – [16]. Kuten istukkakudoksista peräisin ensimmäisten vaiheiden alkionkehityksen, nämä kudokset voivat sisältää soluja, jotka ovat säilyttäneet prosperities varhaisen alkion soluja, joista ne ovat peräisin. Lisäksi istukka on perustavanlaatuinen ylläpitämiseksi fetomaternal suvaitsevaisuutta raskauden aikana, mikä viittaa siihen, että solut läsnä istukkakudokset voi olla immonomodulatory ominaisuuksia. Samaan aikaan, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että mesenkymaaliset eristetty istukkakudokset on kyky spesifisesti kotiutuva useita tuumorikohtaan. Nämä kolme avaintekijää tehdä solu istukasta erittäin houkutteleva ehdokas mahdollista käyttöä soluhoidossa lähestymistapoja suorassa syövän hoidossa [17]. Joissakin tutkimuksissa on suunniteltu MSC: ilmaista interferoni β (IFNp) glioomis- [18], metastaattinen melanooma [19], ja rintasyövän malleja [20]. MSC-toimitetaan IFNP on osoitettu tukahduttaa kasvainsolujen kasvua indusoimalla syövän solujen erilaistumista ja apoptoosia, mikä lisää eloonjäämistä näissä malleissa [18], [19]. Nämä tutkimukset osoittivat asiaa molekyylimekanismin välittävä rajat tukahduttavaa vuorovaikutusta suunniteltu MSC: ja kasvaimen kasvu voi osallistua useita ominaisuuksia kuten: a. MSC: t voivat matkustaa samaan homing määränpään vaeltavat syövän kantasolujen epätavallinen kyvyt siirtyä oncogenetic päällä; b. sytokiini piilotettu MSC voi kiertää immuunijärjestelmän valvonnan ja hyvin siedetyksi vastaanottavan aiheuttamatta kohtuuttomia immuunivaste; c. virus transduktoitu- MSC: t voidaan toimittaa viruksen aloitteisesti kasvaimen sivustoja ja myös lisätä paikallista virusannoksessa jatkuvalla virusreplikaation ja vahvistus [21]. Nämä tulokset osoittivat, MSC: iden voisi olla mahdollinen ehdokas vektorin geeniterapiaan. Samalla hpMSCs on osoitettu olevan edullinen solujen hankinta, varastointi, ja elinsiirrot kuin luuytimestä peräisin MSC:. Lisäksi mesenkymaaliset stroomasolut luuytimestä on riski virusinfektio [22] ja niiden erilaistumista kapasiteetti laskee merkittävästi luovuttajan ikä [23]. Lisäksi istukka on yleensä heitetään pois syntymän jälkeen; sellaisenaan, tämä kudos on saatavilla suuria tarjonnan, ja eristäminen kantasolun tästä kudoksesta ei liity mitään invasiivisia luovuttajalle ja vältetään eettisiä ristiriitoja. Nämä keskeiset seikat tekevät solut eristettiin istukasta hyviä ehdokkaita mahdollista käyttöä soluterapiassa. Ensisijainen Tässä tutkimuksessa on keskitytty onko endostatiinista suunnitelluksi hpMSCs voisi konkreettisesti siirtyä tuumoripaikkaan ja voittaa syövän etenemiseen ja etäpesäkkeitä ihmisen munasarjasyövän mallissa.

Materiaalit ja menetelmät

rekombinantti adenovirusvektori rakentaminen

rakentaminen rekombinantti endostatiini- adenovirus on kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [10]. Lyhyesti, täyspitkä ihmisen endostatiini-cDNA (noin 570 bp) monistettiin RT-PCR: llä. Sen jälkeen sekvenssi vahvistuksen, cDNA kloonattiin sukkulavektoriin pelastamiseksi rekombinantti E1- /E3-deletoidun adenoviruksen (AdEasy järjestelmä) [24]. Viruspartikkelit monistettiin 293-soluissa, puhdistettiin kaksivaiheisella cesiumkloridia (CsCl) gradienttia ultrasentrifugaatio, ja mitattiin absorptio 260 nm: ssä. Virustiitteri kvantitoitiin käyttäen standardia TCID50-määrityksessä.

Soluviljely ja reagenssit

A2780s solulinjan ja ihmisen alkion munuaisen (HEK293-solut) saatiin ATCC: stä (American Type Culture Collection, Manassas , VA, USA) ja niitä viljeltiin RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rutiininomaisesti täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia plus ampisilliinia ja streptomysiiniä kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa . Nainen karvattomia hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) hankittiin laboratoriossa Animal Center Sichuanin yliopiston.

hpMSC eristämistä ja viljelyä

Full aikavälin ihmisen istukan saatiin terveen äidin jälkeen luovuttajan kirjallinen lupa kudoksen kokoelma protokolla hyväksymän toimielimen Institutional Review Board (IRB) West China Second sairaala. Asiantunteva luvat kirjattiin ylös ja kaikki asiakirjat pidettiin West Kiinan Second sairaalan luottoluokitusmenetelmään. Steriilillä menettelyjä, sikiön deciduas istukkakudos leikattiin paloiksi noin 1 cm

3 koko, pestiin PBS: llä, ja hajotettiin 1 mg /ml-I-tyypin kollagenaasi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten solut erotettiin sentrifugoimalla Ficoll-Hypaque erottaminen väliaineessa 1,088 g /cm

3 tiheysgradientti poistaa ei-toivotut solut. Kerätyt solut suspendoitiin kulttuurin L-DMEM-alustassa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), jota oli täydennetty 20% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 U emäksinen fibroblastikasvutekijä (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mmol /l L-glutamiinia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 100 U /ml penisilliiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Sitten soluja siirrostettiin 75 cm

2 pulloihin ja viljeltiin 37 ° C, 5% CO

2 inkubaattorissa kyllästyskosteus. 48 h jälkeen tarttumattomat solut poistettiin korvaamalla viljelyalusta. Tuoretta väliainetta vaihdettiin joka 3-4 päivä. Solut kerättiin trypsinisaatiolla (0,25% trypsiiniä ja 0,1% EDTA: ta), sen jälkeen kuljetettiin, ja sitten käytetään neljännen kanavan kokeissa.

solunpintafenotyyppi ja multipotenteista ero arvio

erottaa hpMSCs, fenotyyppinen karakterisointi CD29, CD44, CD105, CD73, CD166, CD90, CD34 ja CD-45 analysoitiin käyttäen virtaussytometriä (Coulter EPICS Elite ESP) [25]. Solut hajotettiin ja inkuboitiin vasta-aineen kanssa 25 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Värjäytymättömät, nonincubated solut toimivat kontrollina. Sitten solut kiinnitettiin 4% formaliiniin ja analysoitiin virtaussytometrillä. Alhaisimmat solujen 8000-porteilla tapahtumia hankittiin kullekin näytteelle. Osteogeenisen ja adipo- geenistä erilaistumista, hpMSCs viljeltiin 5 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille OsteoDiff tai Adipodiff induktion väliaineessa (Miltenyi Biotec GmbH) ja 3 viikkoa, sitten alitsariinipunaisella S ja öljy-Red-O käytettiin visualisoida kalkkeutumista ja rasvaa pisaroita erikseen. Sen määrittämiseksi, onko transfektion adenovirus vaikuttaisi multipotenteista ominaisuudet, 48 tuntia sen jälkeen, kun on transfektoitu adenovirus, soluja viljeltiin OsteoDiff tai Adipodiff induktio väliaineena 3 viikkoa, sitten öljy-Red-O ja alitsariinipunaisella S käytettiin visualisoida kalkkiläiskiä ja rasvan pisaroita vastaavasti.

hpMSC transfektion ja proteiinin ilmentymisen määrityksissä

eristetty MSC väestön positiivinen fenotyyppi laajennettiin jatkuvasti viikon ajan, kunnes levy-politiikkaa hpMSCs saavutti 90% konfluenssiin ja hallussaan riittävä ankkurointi aktiivisuus ja vakaus kestämään rasitukset virusvektorijärjestelmiä infektio korkealla useita (yleensä populaation kaksinkertaistumista 4 ja 7). Ennen transduktio, kasvualusta poistettiin ja solut pestiin kerran seerumittomalla DMEM. Ad-Hendo-GFP transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) infektiokertoimella (MOI, virukset /solu) 2000 (valittu optimaalisen joukossa Mõis 1000, 2000, ja 3000). 48 h jälkeen, vektori ja mock-transdusoidut solut analysoitiin alla käännettyä mikroskooppia (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA) ja virtaussytometrillä oli arviointiin käytetyt vihreän fluoresenssin.

soluja transfektoitu Ad-Hendo (hpMSC-Ad-Hendo) ja ohjaus- adenovirus (Ad-null) MOI 2000 (2,5 * 10

8 pfu /10

6 solua 1,0 ml: ssa täydellistä media) oli sitten saatu, ja supernatantti kerättiin, konsentroitiin ultrasuodatuksella (Centricon YM-3, Millipore, Bedford, MA, USA), ja analysoitiin Western blot. Proteiinit erotettiin käyttämällä 12% SDS-PAGE geelillä ja transblotatuilla PVDF-kalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraani blokattiin sitten 5% rasvatonta maitoa 0,1% Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa Tween 20 (TBST) 1 h huoneen lämpötilassa ja myöhemmin koettimena kaniinin polyklonaalista anti-endostatiini-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) laimennettuna 1:400 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen blotteja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-immunoglobuliinin (1:5000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL havaitseminen kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Lisäksi olemme suoritettiin ELISA-määrityksessä sen määrittämiseksi, ilmentymisen taso endostatiinin erittämien suunniteltu hpMSCs

in vitro

. Kuten edellä on kuvattu, eristetty hpMSCs transfektoitiin adenovirus kuljettavat endostatiini, ja 48, 72 ja 96 tuntia transfektion jälkeen supernatantit kerättiin ja niistä määritettiin ihmisen endostatiini-geenin ilmentymisen tasoa käyttäen Human endostatiini Quantikine-ELISA Kit (R Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA). Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

määritys hpMSC itseohjautuva kasvainkohtaan

Kasvaimet perustettiin hiirissä vatsaonteloon (i.p.) injektiona 5 * 10

6 A2780s soluja. Sen jälkeen, kun 14 päivää kasvaimen haaste, kun kasvaimen kyhmyjä olivat palpoitavissa, hpMSCs transfektoitiin Ad-GFP käyttämällä Lipofectamine kuten edellä on kuvattu. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin, pestiin kerran PBS: llä ja suspendoitiin tuoreeseen elatusaineeseen. Sitten solua injektoitiin i.p. 2 * 10

5 solua injektiota kohti. Ei-kasvain kantavia hiiriä käytetään kontrollina. Kolme päivää ja 2 viikkoa injektion jälkeen, kasvaimen kyhmyjä ja orangs (sydän, maksa, perna, keuhkot, munuaiset) kerättiin ja jäädytettiin Optimal Cutting Lämpötila yhdisteen (MMA), vastaavasti. Fluoresoiva hpMSCs havaittiin tuoreen kryoleikkeet (3-5 um) kasvaimen näytteitä ja elimet käyttäen fluoresoivaa mikroskooppia.

hoito kokeellisen ksenograftimallissa

nainen nude BALB /c-hiirten 6- 8 viikkoa vanhoja hankittiin koe-eläimen keskellä Sichuanin yliopiston. Tutkimus protokolla tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja hoito komitean Sichuanin yliopistossa. Ihmisen munasarjasyövän perustettiin i.p. injektio nude-hiirten kanssa 5 * 10

6 A2780 solua 200 ul PBS: ää. Ennen i.p. antoa, hpMSCs transfektoitiin Ad-Hendo tai Ad-null MOI 2000 kuten edellä on kuvattu. Hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 5 eläintä /ryhmä): (a) hiirillä, joita hoidettiin 0,9% normaalia suolaliuosta (NS); (B) hiiriä hoidettiin hpMSCs 2 * 10

5 /hiiri; (C) hiirillä, joita hoidettiin Ad-null-transfektoitujen hpMSCs 2 * 10

5 /hiiri; (D) hiiriä hoidettiin Ad-Hendo transfektoiduissa hpMSCs 2 * 10

5 /hiiri. Hoito aloitettiin 5 päivän kuluessa kasvaimen solujen haaste ja sen ylläpitäjä kautta i.p. injektio joka 3. päivä kaikkiaan 6 kertaa. Hiiriä seurataan päivittäin tuumorikuorma, vatsan turvotus, kakeksia, ja muita poikkeavuuksia. Hiiret tapettiin 1 viikon kuluttua viimeisen annon, ja i.p. kasvaimet leikataan sitten ja painotetaan.

kvantitointi solujen lisääntymisen ja angiogeenisen mikroverisuonitiheys

Ensisijainen kasvainnäytteestä viereisten kudosten ja asiaan sisäelimet kerättiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydi, ja sitten upotettu parafiini. Immunohistokemiaa analyysi, osat 3-5 um leikattiin parafiiniblokit, parafiini ksyleenillä, ja nesteytyksestä on useita porrastettu EtOH. Antigeeni haku toteutettiin autoklavoimalla osiot haku puskurissa (10 mmol /l EDTA sitraattipuskurissa [pH 6,0], Dako, Glostrup, Tanska) 4 min kylläistä höyryä jälkeen ajan paine saamassa (126 ° C, 1,6 bar, 23 psi). Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan ilman valoa, ja epäspesifinen sitoutuminen reagenssien pysäytettiin inkuboimalla osasta 20 min 10% normaalia vuohen tai kanin seerumia. Sitten leikkeitä inkuboitiin vuohen anti-ihmisen Ki-67 polyklonaalisia vasta-aineita (1:150; Maixin-Bio, Fuzhou, Kiina) ja polyklonaalisella rotan anti-humaani-CD31 (1:200; Maixin-Bio, Fuzhou, Kiina) yön yli kosteassa kammiossa 4 ° C: ssa; tätä seurasi inkubointi biotinyloidun kanin anti-vuohi /rotta-IgG ja sitten streptavidiini-biotiini-piparjuuriperoksidaasi kompleksin 37 ° C: ssa 45 min. Immunoreaktioita kehitettiin lopuksi (visualisoitu diaminobentsidiinillä [DAB] ratkaisu kromogeeniä) käyttäen DAKO Liquid DAB + substraatti-kromogeeni järjestelmä, ja Crimson keltainen sakat tunnistettiin positiivista värjäytymistä. Counterstaining varovasti suoritettiin parantava Gillin hematoksyliinillä ja dioja poistettiin vesi ja asennettu lasipeitinlevyille. Sitten leikkeitä visualisoitiin käyttäen mikroskoopilla 400x suurennuksella (Olympus, Tokio, Japani). Ki-67-positiivisia soluja tai verisuonten laskettiin kolmesta alueet kussakin jaksossa pidennetyn tavalla.

Alginaattijäämät kapselointi määritys

Alginaattijäämät helmi sisältävien kasvainsolujen määritys on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmin [ ,,,0],26]. Lyhyesti, viljellyt A2780 solut suspendoitiin uudelleen 1,5%: lla (m /v) natriumalginaattia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ja sitten kasvainsolujen alginaatti tiputettiin pyörteisiin kylpy 0,25 M CaCl2 voidakseen muodostaa pisaroita, jotka sisältävät noin 1 x 10

5 kasvainsolujen helmeä kohden. Sen jälkeen nukutettiin, nude-hiiriin istutettiin s.c. neljällä helmiä osaksi viilto selässä, viillot ommeltiin kirurgisten pihdit. HpMSCs-Ad-Hendo (MOI 2000) injektoitiin i.p. päivänä 3, 6, 9, 12 jälkeen helmi istutusta, jossa hpMSCs-Ad-null, hpMSCs tai suolaliuoksella kontrollina. Tällä 14 päivää, hiiriin injektoitiin i.v. 100 ui FITC-dex- TRAN-liuosta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (100 mg /kg) ja tapettiin 20 minuuttia myöhemmin. Kuva alginaatti implanttien ottanut käyttäen SPOT FIEX kameraa. Alginaattihelmistä siirrettiin putkiin, jotka sisälsivät 2 ml suolaliuosta. Putkia sekoitettiin vortex 20 s ja sentrifugoitiin (3 min; 1000 x g). Lopuksi fluoresenssi supernatanttia mitattiin määrällisesti verisuonten muodostumista.

analyysi apoptoosin tuumorikudoksissa

Apoptoosi analyysi suoritettiin käyttämällä TUNEL (terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi välittämää dUTP nick-end merkinnät) käyttäen DeadEnd fluorometrisen TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan protokollan. TUNEL-positiivisia ytimet, pyknotic ytimet tummanvihreä fluoresenssivärjäys, visualisoitiin ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani). Apoptoosi-indeksi määritettiin kaksi riippuvaisten tutkijat laskemalla TUNEL-positiivisten solujen viidellä HPF per slide.

Arvio mahdollisista myrkyllisyyden

Jotta voidaan arvioida mahdollisia sivuvaikutuksia ja myrkyllisyyttä hpMSCs, asiaa indeksit kuten laihtuminen, ruokahaluttomuus, ripuli, kuihtuminen, ihon haavauma, pörröiseksi ja toksinen kuolema havaittiin. Tappamisen jälkeen hiiristä, eri elinten (sydän, maksa, perna, keuhkot, munuaiset jne.), Otettiin talteen ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä. Jaksot 3-5 um värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Fenotyyppikuvaus analyysi ja multipotentteina ominaisuudet eristettyjä soluja

Virtaussytometria osoittivat, että väestö levyn kiinni soluissa oli positiivisia mesenkymaalisten kantasolujen merkkiaineita CD29 ( 95%), CD44 ( 95%), CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%), CD105 ( 95%) ja negatiivinen hematopietic markkereita CD34 ( 3%) ja CD45 ( 3%), mikä oli sopusoinnussa ominaisuudet MSC: eiden (kuvio 1A). Yleinen määritelmä MSC: sisältää sekä fenotyyppiset ja toiminnalliset kriteerit, joten haimme osteogeeninen ja adipogeenisen erilaistumisen määritys indentify multipotentit ominaisuudet ennen ja jälkeen adenovirus transfektion. Osteogeenisen ja adipo- geenistä erilaistumista, hpMSCs viljeltiin 5 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille OsteoDiff tai Adipodiff induktion väliaineessa (Miltenyi Biotec GmbH) ja 3 viikkoa, sitten alitsariinipunaisella S ja öljy-Red-O käytettiin visualisoida kalkkeutumista ja rasvaa pisaroita erikseen. Kuten osoitti kuvassa 1B, 1C, visualisointiin lipidivakuolit ja kalkkeutumista osoittaa laajempaa multipotentteina eriyttäminen kykyjä hpMSCs. Olemme myös päättäneet, onko transfektio adenovirus vaikuttaisi multipotentteina ominaisuuksiin. 48 tuntia sen jälkeen, kun on transfektoitu adenovirus, soluja viljeltiin OsteoDiff tai Adipodiff induktio väliaineena 3 viikkoa, sitten öljy-Red-O ja alitsariinipunaisella S käytettiin visualisoida kalkkeutumista ja rasvapisaroihin erikseen. Kuten osoitti kuviossa 1C, positiivinen lipidivakuolit ja kalkkeutumista voitiin visualisoida.

. Fenotyypin ominaisuuksien puhdistettua MSC: eitä varmistettiin virtaussytometrillä-analyysi, joka osoitti, että nämä laajennettu ja levyn kiinni solujen populaatiot (at kahdentumista 3 ja 5), ​​oli positiivinen CD29 ( 95%), CD44 ( 95%) , CD73 ( 99%), CD90 ( 95%), CD166 ( 95%) ja CD105 ( 95%) pintamerkkiaine ilmaisun ja negatiivisia CD34 ( 3%) ja CD45 ( 3%). Kiinteä viiva merkitsee unstained säätökennoja ja katkoviiva merkitsee eristetty mesenkymaaliset kantasolut. B. osteogeeninen ja adipogeenisiksi erilaistuminen määrittäminen eristetyissä mesenkymaaliset kantasolut. Vasen paneeli osoitti positiivisen kalsium talletus (nuolet), oikea paneeli osoitti lipidivakuolit (nuolet). C. osteogeeninen ja adipogeenisiksi erilaistuminen määrittäminen eristetyissä mesenkyymikantasoluista jälkeen transfektoitu adenovirus. 48 h transfektion jälkeen, solut pestiin PBS: llä ja viljeltiin OsteoDiff tai Adipodiff induktio väliaineena 3 viikkoa, sitten öljy-Red-O ja alitsariinipunaisella S käytettiin visualisoida kalkkeutumista ja rasvapisaroihin erikseen. Lipidivakuolit ja kalkkeutumista (nuolet) voidaan visualisoida (x 100).

In vitro

ilmentyminen hpMSC-Ad-Hendo

Koska ihmisen placenta- peräisin MSC: t ovat suhteellisen resistenttejä villityypin adenoviruksen infektion, koska niiden alhaisen ilmentymisen adenoviruksen reseptorin CAR, teimme Lipofectamine 2000-välitteisen adenoviruksen transduktion. Geenin toimitus tehokkuus Adenoviruksen hpMSCs määritettiin mikroskoopilla arviointi. Olemme havainneet, että transduktion jälkeen rekombinantilla Ad-Hendo-GFP MOI 2000 ja 3000, lähes kaikki solut lähettämän vihreän fluoresenssin seuraavat viljely levyn kiinni olosuhteissa (kuvio 2A). Kuitenkin ohella lisääntynyt infektion moninaisuus, solukuolema oli myös lisätty, mikä saattaa johtua soluvaurioita johtuu liiallisesta transgeeniekspression. Lisäksi virtaussytometrillä käytettiin mittaamaan transduktioteho. Tulokset osoittivat, että se oli tehokas MOI 2000, sillä noin 82,3% of hpMSC-Hendo solut jatkuvasti ilmaissut GFP tässä MOI (kuvio 2D). Yhdessä päätimme käyttää soluihin muokatut näissä transduktion olosuhteissa (MOI 2000) kaikissa seuraavissa kokeissa. Sen jälkeen, tarkistaa, onko endostatiini proteiini erittyi hpMSC-Ad-Hendo soluissa, Western blot-analyysi suoritettiin. Kuten osoitti kuvassa 2B, MOI 2000 erillisen bändi noin 20 kDa, mikä vastaa kokoa endostatiini, ilmaistiin Ad-Hendo käsiteltyjä soluja, mutta ei Ad-null käsitellyt solut. Lisäksi olemme myös suorittaa ELISA-määrityksessä havaitsemaan endostatiinista erittyy hpMSC-Ad-Hendo. Kuten kävi ilmi, kuviossa 2C konsentraatio endostatiinin solu- viljelmien supernatanteissa oli merkittävästi suurempi kuin verrokkiryhmässä ja taso endotatin myös lisääntyi ajan kuluessa ja säilyi korkealla tasolla 96 h transfektion jälkeen. Tämä määritys varmistaa, että endostatiinista voidaan erittää tehokkaasti rakennettuja hpMSCs.

. GFP-fluoresenssi arvioitiin FITC kanavalla. HpMSCs transfektoitu GFP-leimatun adenoviruksen osoitti vihreä. Alkuperäinen suurennus × 400. B. Solut, jotka on transfektoitu Ad-Hendo ja ohjata adenovirus (Ad-null) MOI-arvolla 2000 analysoitiin Western blot havaitsemiseksi ilmentymisen endostatiini proteiinia. hpMSCs transfektoitu Ad-Hendo osoitti selvää ilmentymistä endostatiinin proteiinin verrokkiin verrattuna. C. tarkistaa ekspressiotaso endostatiinin erittämien suunniteltu hpMSCs

in vitro

, ELISA-määritys suoritettiin arvioimaan endostatiinin supernatanteissa transfektoitujen solujen adenoviruksella kuljettavat endostatiini, hpMSCs ja hpMSCs transfektoitu Ad-null levitettiin kontrollina. 48 h, 72 h ja 96 h transfektion jälkeen, soluviljelmän supernatantit kerättiin ja endostatiini pitoisuus määritettiin. Pitoisuus endostatiinin solu- viljelmien supernatanteissa oli merkittävästi suurempi kuin verrokkiryhmässä ja taso endotatin myös lisääntyi ajan kuluessa ja säilyi korkealla tasolla 96 h transfektion jälkeen. D. Virtaussytometriaa käytettiin arvioimaan transfektion tehokkuutta Ad-Hendo-GFP. Transfektio nopeus MOI 1000, 2000 ja 3000 oli 60,3%, 82,3% ja 79% vastaavasti. Kontrolliin verrattuna, infektio MOI 2000 johti korkeampiin transfektion tehokkuutta. Punainen kehys edustaa positiivinen vyöhyke kullakin viljelmällä.

Euroopan vaeltavia kapasiteetti hpMSCs kasvainsoluja kohtaan

in vitro

ja

in vivo

on ehdotettu, että tekijät vapautuu syöpäsoluja, saattavat olla mahdollisia kemoattraktantteja mukana tropismi MSC: eiden. Arvioida muuttavien kapasiteettia hpMSCs kohti A2780 soluissa,

in vitro

maahanmuuton joissa käytetään Millicell inserttejä tehtiin. Väliaine 293-soluista, käytettiin kontrollina. Vain muutama hpMSCs-Ad-Hendo vaeltaneet solut kohti 293-elatusaine, kun taas migraatio hpMSCs-Ad-Hendo merkittävästi stimuloi kunnostettua alustaa ihmisen munasarjasyöpä A2780-soluja (P 0,01; kuvio 3A). Kun määrä siirtynyt solujen alapintaan Millicell-insertit laskettu, vahvistettiin, että modifioimaton hpMSCs siirtyneet väliaine A2780-soluja samanlaista mallia kuin hpMSCs-Ad-Hendo. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että kuvatuissa olosuhteissa, hpMSCs osoittivat merkittäviä vaeltavia kapasiteettia ja A2780 solut hallussaan suurempi kyky indusoimiseksi muuttoliike MSC: eiden verrattuna 293-solujen (P 0,05; kuvio 3B). Sen määrittämiseksi, hpMSCs ensisijaisesti ohjautui ihmisen munasarjan ksenografteja, loimme nude-hiiriin vatsakalvon munasarjasyöpä malli. 2 viikkoa i.p. injektio A2780 solujen ja kasvaimia olivat kouriintuntuva, me i.p. injektoidaan mesenkymaaliset kantasolut on transfektoitu adenovirus kuljettavat GFP, ja ei-kasvain kantavia hiiriä käytettiin kontrollina. Tuolloin pisteen 3 päivää ja 2 viikkoa sen jälkeen i.p. injektio transfektoitujen mesenkymaalisten kantasolujen, hiiret tapettiin ja kasvaimen kyhmyjä, maksa, perna, keuhko, munuainen ja sydän otettiin talteen ja GFP-signaali mitattiin. Kuten osoitti kuviossa 3C, 3 vuorokauden kuluttua i.p. injektio, GFP-signaaleja havaittu kasvaimen kehällä. 2 viikkoa i.p. injektio, mielenkiintoisesti Havaitsimme positiivinen signaali kasvain parenkymaalinen. Tämä havainto viittasi siihen, että pistetään mesenkymaaliset kantasolut sinnikkäästi ksenograftissa ja voi integroitua kasvain keskittyä. Lisäksi, ei ole mitään positiivista signaalia havaittu elinten kasvain ja ei-kasvain hiirille.

. Migraatio hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo soluihin 8 um Millicell kalvo. HpMSCs viljeltiin 24-kuoppaisella levyllä päälle 8 um huokosia kokoinen kalvoja, ja A2780s tai 293-soluja viljeltiin alemmassa kammiossa. Solut muuttivat alemman membraanin leimattiin metyyliviolettia. Alkuperäinen suurennus × 400. B. induktio hpMSCs /hpMSCs-Ad-Endo muuttoliikettä kannustanut A2780s tai 293-solut. Verrattuna 293-solut, A2780s solut edistänyt migraatio hpMSCs //hpMSCs-Ad-Endo merkittävästi. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. C. Voit tarkistaa tietyn itseohjautuva omaisuutta transduktoi- mesenkymaalisten kasvaimen sivuston, me transduktoi- hpMSCs adenoviruksella kuljettavat GFP ja ruiskutettiin i.p. nude-hiirten vakiintuneiden vatsakalvon munasarjakasvain. Jälkeen 3 päivää ja 2 viikkoa i.p. injektion jälkeen hiiret tapettiin ja kasvaimen kyhmyjä ja elimet kerättiin. Vasen paneeli: 3 vuorokauden kuluttua i.p. injektio, GFP-signaali (nuoli) havaittiin hyvin kasvaimen kehällä. Oikea paneeli: 2 viikon kuluttua i.p. injektio, positiiviset GFP-signaali havaittiin kasvaimen parenkymaalinen (nuoli), joka osoitti hpMSCs sinnikkäästi ksenograftissa ja voi integroitua kasvain keskittyä.