Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä (PDAC) on ominaista runsas sidekudoksen runsaasti Tenaskiini-C (TNC), iso ECM glykoproteiini lähinnä syntetisoida haiman tähtisolut (PSC ). Ihmisen haiman kudoksissa, TNC ilmentyminen lisää etenemisessä huonolaatuisesta esiasteleesioita on kohdunkaulan syöpä. Tutkimuksen tavoitteena oli toiminnallisen kuvauksen vaikutusten TNC on biologinen merkittävät ominaisuudet haiman syöpäsoluja.

Methods

leviämisen, migraation ja adheesion määritykset suoritettiin haimasyövän solulinjoissa käsitelty TNC tai kasvatetaan TNC-rikas matriisi. Ekspressoivat stabiilit transfektantit

suuri

TNC silmukointivariantti luotiin testata vaikutukset endogeenisen TNC. TNC-riippuvaista integriiniä signalointi tutkittiin immunoblottauksella, immunofluoresenssilla ja farmakologinen esto.

Tulokset

Endogeeniset TNC edistää haiman syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike. TNC-rikas matriisi myös lisätä maastamuuttoa sekä kiinnittyminen päällystämättömän kasvua pinnalla huonosti eriytetty solulinjoissa. Sen sijaan tarttumisen fibronektiiniin väheni huomattavasti, kun läsnä oli TNC. Vaikutukset TNC soluadheesiota oli paralleled muutokset aktivoinnin tilasta paksilliini ja Akt.

Johtopäätös

TNC vaikuttaa jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja tarttuvuus huonosti eriytetty haimasyövän solulinjoissa ja saattaa siksi osansa PDAC leviämisen ja etäpesäkkeiden

in vivo

.

Citation: Paron I, Berchtold S, Vörös J, Shamarla M, Erkan M, Höfler H, et al. (2011) Tenaskiini-C Parantaa Haimasyöpä Cell Growth ja Liikkuvuus ja vaikuttaa Cell Adhesion kautta aktivointi Integriini Pathway. PLoS ONE 6 (6): e21684. doi: 10,1371 /journal.pone.0021684

Editor: Cara Gottardi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 joulukuu 2010; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2011; Julkaistu: 29 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Paron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Deutsche Krebshilfe (Grant numero: 108038). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

haiman adenokarsinooma (PDAC) edustaa 85-90% kaikista haiman kasvaimet. Vuonna 2010 43140 ihmistä Yhdysvalloissa arvioitiin olevan haimasyöpä ja 36800 kuolla tämän tappava tauti, mikä PDAC neljänneksi yleisin syy kasvaimeen liittyvää kuolleisuutta huolimatta esiintyvyys oli vain 3% kaikista tapauksista [1 ]. PDAC eloonjäämisprosentti laski vain viimeisten 30 vuoden aikana ja PDAC potilaat ovat silti hyvin huono ennuste, joiden kokonaispituus 5 vuoden elossaolo alle 5% ja mediaani eloonjäämisprosentti joka vaihtelee 2 kuukautta potilailla etäpesäkkeitä 8 kuukauteen potilailla, joilla on ei-etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi [2]. PDAC tuloksia ei juuri muuttunut viimeisten vuosien lähinnä myöhäinen diagnosointi. PDAC paikallisiksi ja alueellinen tauti on pääasiassa oireettomia ja työkaluja varhaisen havaitsemisen puuttuu vielä. Kun diagnosoitu, haimasyöpä on usein tulenkestävä mitään kemoterapiaa ja sädehoitoa hoidon ja monet kliiniset kokeet eivät ole osoittaneet merkittävää parannusta kokonaiselossaoloaikaa viimeisen kymmenen vuoden aikana [3]. Siksi parempaan ymmärtämiseen liittyviä mekanismeja PDAC kehittäminen, ylläpito ja leviäminen tarvitaan kehittämään uusia kohdennettuja terapiat tämän nykyään yhä kuolemaan johtava sairaus.

ominaista PDAC on niin sanottu ” desmoplastic ”reaktio, runsas sidekudos, joka ympäröi syöpäsolujen ja koostuu pääasiassa verisuonten ja stroomasolujen levitä rakennejäljitelmissä soluväliaineen (ECM). Kehittäminen desmoplastic reaktio johtuu pääasiassa haiman tähtisolut (PSCs). PSC: t ovat strooman soluja, jotka, sen jälkeen kun muuntaminen levossa aktiiviseksi myofibroblastin kaltainen fenotyyppi, erittävät ECM proteiinit ja matriisi hajottavia entsyymejä, jolloin syntyy ympäristö, joka edistää voimakkaasti syövän etenemiseen ja samaan aikaan asettaa esteen lääkeannostelun [ ,,,0],4] – [7].

Tenaskiini-C (TNC) on suuri ECM glykoproteiini koostuu kuudesta monomeerit liittyvät niiden N-päiden kanssa disulfidisidosten muodostamiseksi 1080-1500 kDa heksameeri. Jokainen monomeeri koostuu erilaisten rakenteellisten motiivien järjestetty lineaarisesti järjestyksessä, mukaan lukien välillä 8 ja 15 fibronektiinin tyypin III (FN-III) kaltainen toistoa [8], [9]. Vaihtoehtoinen silmukointi FN-III: n kaltaisia ​​toistoja voi moduloida biologisen toiminnan TNC muuttamalla sen vuorovaikutusta muiden ECM-proteiinien, kuten fibronektiinin (FN), tai solun pinnan reseptoreihin, kuten integriinit tai anneksiini II, ja antamalla joskus päinvastainen rooleja TNC solun leviämisen, tarttumista ja lisääntymistä [10], [11].

TNC ilmentyy pääasiassa alkionkehityksen aikana. Aikuisilla TNC on rajallinen ilmentymiskuvio (kellarissa kalvo ihon, kanaviin sylkirauhaset, paksusuolessa limakalvon ja astian seinät eri elimissä), mutta proteiinin tasot nousevat dramaattisesti erilaisissa fysiologisissa ja patologisia tiloja, kuten kudoksen uudelleen, uudissuonittuminen ja tulehdus [12], [13]. Lisäksi useimmat kiinteät kasvaimet ilmentävät korkeita TNC. TNC voi vaikuttaa syövän kasvua vaikuttamalla soluadheesion ja liikkuvuus siten, että voidaan edistää ja metastaasit [14], ja vaikuttamalla solun ilmentyminen kasvainten synnyssä, onkogeenien ja liittyvät geenit ylläpito genomin vakautta [15]. Normaalissa haima, TNC ilmentyy lihaksessa seinässä verisuonten ja strooman ympäröivästä kudoksesta interlobular kanavat. TNC ilmentymistä säädellään ylöspäin akuutti ja krooninen haimatulehdus [16], ja kasvaa etenemistä huonolaatuisen esiasteleesioita (haiman intraepiteliaalisten neoplasia, Panin) ja PDAC [17]. In PDAC TNC on ainoastaan ​​ilmaistu stroomaan noin neoplastisen rauhaset [16], [17]. Up-regulation TNC syövän etenemiseen näyttää tarkoittavan sitä, erityisesti

suuria

silmukointivariantin, koska suurin TNC transkriptio, joka vastaa silmukoitumattoman muodossa TNC, löytyy haimasyövän ja krooninen haimatulehdus, mutta ei normaali haima [17]. PSC: t on osoitettu olevan pääasiallinen lähde TNC

in vivo,

taas PDAC solut eivät osoittaneet ilmentymistä TNC joko immunohistokemiallisella tai immunoblottauksella. Kuitenkin alhainen TNC mRNA havaittiin haimasyövän solulinjoissa reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR [17].

Tässä tutkimuksessa suoritimme laajan analyysin ulkosyntyisten TNC on haimasyöpä solutoiminnoista ja olemme tutkineet vaikutusta endogeenisen TNC yli-ilmentymisen haiman syövän solulinja PANC-1. Tuloksemme viittaavat tärkein tehtävä TNC sääntelyssä välisten vuorovaikutusten epiteelisolujen ja ECM etenemisessä haimasyövän.

Tulokset

ulkosyntyisten TNC haiman syöpäsolujen kasvua

Aluksi se testattiin, jos TNC lisätään elatusaineeseen eri pitoisuuksia voisi vaikuttaa solujen elinkykyyn. Nostamalla elinvoimaisten Capan-1, AsPC-1 ja SU.86.86 soluja (jopa 25%) on TNC pitoisuutena 0,01-0,1 ug /ml havaittiin, mitattuna MTT-määritystä 72 tunnin kasvun seerumittomalla väliaineella (Fig. 1A). Kasvu AsPC-1 ja Capan-1 estyi korkeimmalla TNC konsentraatio (10 ug /ml, 41 ja 34%: n lasku, vastaavasti). TNC oli estävä vaikutus elinkelpoisuuden PANC-1 ja MIA PaCa-2 solulinjoissa (Fig. 1A). Koska TNC kykenee sen vaikutus kuin ECM-proteiinia, solut kasvatettiin TNC-matriisissa. Kun ympättiin TNC levyillä ja kasvanut jopa 72 tuntia seerumittomassa väliaineessa, PANC-1 ja MIA PaCa-2 osoitti 44% ja 27%: n nousu elinkelpoisuutta, vastaavasti, kun taas kasvu Capan-1 ja AsPC- 1 vähentynyt (23% ja 45%, vastaavasti) (Fig. 1 B).

(A) Soluja kasvatettiin 72 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia TNC (0,01, 0,1, 1 ja 10 ug /ml). (B) Soluja kasvatettiin 72 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa päälle TNC päällystetyillä levyillä (1 ug /cm

2). Kasvu määritettiin MTT-määritys. Tiedot on laskettu keskiarvona +/- s.e.m. kolmesta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​prosentteina verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, Opiskelijan kaksisuuntainen t-testi).

Eksogeeninen TNC moduloi motiliteettia haimasyövän solulinjoissa

testaamiseksi vaikutuksen TNC siirtyvien haimasyövän solulinjoissa, haavojen määritykset suoritettiin säilyttäen solut seerumivapaassa väliaineessa minimoimiseksi solujen lisääntymistä. TNC ei ollut vaikutusta haavan sulkemiseen, kun lisätään kasvualustaan ​​(Fig. 2A). Kun kasvatettiin TNC-rikas matriisi, haimasyövän soluja suljettu haava annosriippuvaisella tavalla, mutta kukin solulinja näkyy aivan yksilöllisestä vasteesta eri pitoisuuksilla TNC. Yksityiskohtaisesti, solujen vaeltamiseen nostaa 1,7 ja 1,1-kertaiseksi SU.86.86 ja PANC-1 solulinjoissa, vastaavasti, oli tilastollisesti tärkeä aikana TNC pitoisuutena 0,5 ug /cm2 SU.86.86 soluissa ja 0,1 ug /cm 2 in PANC-1-soluissa. Toisaalta, haavan sulkeminen pieneni merkittävästi (jopa 0,8-kertaisesti) Capan-1-solut, joissa TNC pitoisuuksilla 0,5 ja 2,5 ug /cm 2 (Fig. 2B). TNC-pitoisuus 2,5 g /cm 2 oli myrkyllisiä vaikutuksia PANC-1-soluissa, ja haavan paranemista määritys ei voitu suorittaa tässä tilassa.

(A) Soluja maljattiin päällystämättömän levyille ja 24 tunnin kuluttua yksikerroksista raaputettiin kanssa 10 ui pipetin kärki. Soluja inkuboitiin sitten seerumivapaassa väliaineessa tai väliaineessa, johon on lisätty TNC eri pitoisuuksilla (0,2 ug /ml, 1 ug /ml ja 5 ug /ml) 48 tuntia. (B) Soluja maljattiin 24-kuoppaisille levyille päällystettiin kolmella eri pitoisuuksia TNC (0,1 ug /cm

2, 0,5 ug /cm

2 ja 2,5 ug /cm

2) tai sen päälle päällystämättömiä levyt ja 24 tunnin kuluttua yksikerroksista raaputettiin kanssa 10 ui pipetin kärjen. Soluja inkuboitiin sitten seerumivapaassa väliaineessa jopa 48 tuntia. Migration solujen osaksi haavoittunut alueille arvioitiin counting siirretty solujen käsin ja jonka TScratch ohjelmisto [36] ja yhteensä 2-8 kenttien laskettiin ryhmää kohti kussakin kokeessa. Tiedot on laskettu keskiarvona +/- s.e.m. ja ilmaistiin kertamuutosta verrattuna ei käsitellyt solut (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, Opiskelijan kaksisuuntainen t-testi).

Effects of endogeenisen TNC solun elinkelpoisuuden ja muuttoliike

jotta lisätukea havaitut edistävät vaikutukset TNC haiman syöpäsolujen kasvua ja potevilla päällystyskäsittely, PANC-1 soluja käytetään tuottamaan vakaa transfektantit ilmentävät

suuria

TNC silmukointivariantti. Koska TNC fysiologisesti toimii solunulkoisen proteiinin, positiiviset kloonit edelleen valittu sen perusteella, niiden kyky erittää TNC kasvualustaan. Kuten kuviossa 3A, ilmentymistasojen eritetyn TNC olivat varsin erilainen eri positiivista kloonia. Eri ekspressiotasoja näkyy joitakin biologisia aktiivisuuksia TNC, kuten sen kyky vaikuttaa solujen elinkykyyn. Itse asiassa, elävien solujen lukumäärä, mitattuna MTT-menetelmällä 24, 48 ja 72 tunnin kasvun täydellistä alustaa, oli suurempi TNC-positiivisia klooneja verrattuna sekä ei transfektoitu sekä valetransfektoiduilla PANC-1 solut (Fig. 3B ja C). Vahvin vaikutus (verrattuna ei-transfektoitujen solujen), havaittiin T2-klooni, joka myös osoitti korkeinta ekspressiotasot eritettyjen TNC (Fig. 3A ja B). Yksityiskohtaisesti, verrattuna ei-transfektoitujen solujen, PANC-T2-solut osoittivat lisäys solujen elinkelpoisuuden 2,06-kertainen +/- 0,01 24 tunnin kuluttua, 2,49-kertainen +/- 0,04 48 tunnin kuluttua ja 3,88 +/- 0,09 72 tunnin jälkeen. In PANC-T24 lisäys oli 1,21-kertainen +/- 0,01 24 tunnin kuluttua ja 1,14-kertainen +/- 0,02 48 tunnin kuluttua, ja PANC-T27 1,43-kertainen +/- 0,02 24 tunnin kuluttua, 1,32 kertainen +/- 0,03 48 tunnin kuluttua ja 1,08-kertainen +/- 0,05 72 tunnin jälkeen. Solujen elävyys hinnat PANC-1-solut yli-ilmentävät TNC verrattuna valetransfektoiduilla solut olivat 55% korkeammat 24 tunnin, 68% korkeammat 48 tunnin ja 99% suurempi 72 tunnin kuluttua (Fig. 3C).

PANC-1-solut transfektoitiin stabiilisti vektorilla, ajo ilmentymisen

suuri

TNC (PANC-T2, PANC-T24 ja PANC-T27-soluissa) ja tyhjällä vektorilla (PANC-C21, PANC-C23 ja PANC-C27-solut). (A) Immunoblottaus saostetun soluviljelyväliaine transfektoitujen PANC-1-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin. Sen varmistamiseksi, että vertailukelpoinen määrä transfektoituja soluja oli lähde eritetyn TNC, GAPDH ilmentyminen kokosoluekstraktien testattiin. PANC-T2-soluja osoittavat korkeimman eritetyn TNC, kun taas alemmilla tasoilla havaitaan PANC-T24 ja PANC-T27. Ohjaus kloonit verrattuna eivät osoita TNC eritystä. (B) Soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa. Kasvu määritettiin MTT-määritys eri ajankohtina (24, 48 ja 72 tuntia). Tiedot on laskettu keskiarvona +/- s.e.m. kolmesta kokeesta ja ne ilmaistaan ​​prosentteina verrattuna PANC-1-soluja (° p 0,05, * p 0,01, ** p 0,001, Opiskelijan kaksisuuntainen t-testi). Lisääntyminen korko on huomattavasti suurempi PANC-T2 kaikkina ajankohtina (p 0,001), ja PANC-T24 24 tuntia (p 0,001) ja 48 tuntia (p = 0,022) ja PANC-T27 24 (p 0,001 molemmissa aikapisteissä) ja PANC-T27 (p = 0,042 24 tuntia; p = 0,009 48 tuntia). (E) Kaikki yhdessä, PANC-1 positiivisia klooneja (PT) vaeltavat huomattavasti nopeammin verrattuna valetransfektoiduilla solut (PC) sekä ajankohtina (p 0,001).

Solun muuttoliike on Toisaalta ei vaikuttanut ekspressiotasot eritetyn TNC. Vakaa transfektoidut PANC-T2, PANC-T24 ja PANC-T27-soluissa sulki haavan nopeammin kuin transfektoidut ja valetransfektoiduilla soluja. Verrattuna ei-transfektoitujen PANC-1-soluissa, tämä vaikutus oli merkitsevä 24 tuntia (1,52-kertainen +/- 0,09), ja 48 tunnin (1,46-kertainen +/- 0,08) ja PANC-T2 ja 24 (1.66- kertainen +/- 0,13) ja 48 tuntia (1,46-kertainen +/- 0,08) ja PANC-T27 (Fig. 3d). Kaikki positiiviset kloonit yhdessä oli suurempi maahanmuuttoluku verrattuna valetransfektoiduilla klooneista (62% 24 tunnissa ja 43% 48 tunnin kuluttua, Fig. 3E).

Eksogeeninen TNC edistää solujen kiinnittymistä päällystämättömän levyille ja vähentää solunlevitys- FN

Kuten soluadheesiota yhdessä maahanmuutto- ja invasiivisuus on kriittinen vaihe osallisina syövän leviämistä ja etäpesäkkeiden, tarttumista haimasyövän soluja TNC tutkittiin tarkemmin. Koska TNC yliekspressio korreloi huonon kasvaimen erilaistumiseen

in vivo

[16], fokusoimme tutkimuksen huonosti eriytetty solulinjoista PANC-1 ja SU.86.86 [18], [19]. TNC pinnoite voimakkaasti parannettu tarttuvuus molemmissa solulinjoissa (PANC-1: 7.0-kertainen, p 0,001; SU.86.86: 4,6-kertainen, p 0,001) arvioima kristalliviolettimäärityksellä absorbanssi spektroskopia kiinnittyneitä soluja (Fig. 4A, vasen paneeli). Kudoksessa yhteydessä solujen vuorovaikutuksessa TNC yhdessä muiden ECM proteiineihin. Näistä, FN on usein yhteistyössä ilmaistaan ​​TNC [20]. Näin ollen, jotta testata, jos TNC moduloi soluadheesiota läsnäollessa FN, PANC-1 ja SU.86.86 solut maljattiin sekoitettu alustalle FN ja TNC. TNC läsnäolo määritetään merkittävä lasku kiinnitys molempien solulinjojen FN 3 tunnin kuluttua plating (PANC-1: 1,6-kertaiseksi, p 0,001; SU.86.86: 1,2-kertaiseksi, p = 0,003) (Kuva. 4A, vasen paneeli). Sen testaamiseksi, onko tämä vaikutus voi johtua substraatin välistä kilpailua kahden proteiinin, kun sitä käytetään yhdessä päällystää muovi pintaan, substraatin sitoutumisen tehokkuutta komposiitin matriisin tutkittiin ELISA: lla. Sitoutumisen tehokkuutta FN tai TNC yksinään ei ollut vaikutusta, kun levyt päällystettiin molemmat proteiinit samanaikaisesti, kuten on esitetty kuviossa 4B ja C. Solujen elinkelpoisuus oli myös ei vaikuttanut merkittävästi, kun soluja kasvatettiin päälle FN /TNC päällystetyillä levyillä verrattuna FN päällystetyn levyt (MTT-määritystä, tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TNC häiritsee solun tarttumisen FN, mutta sillä on vastakkainen vaikutus päällystämättömän levyille.

(A) Solut maljattiin, joka sisälsi 1% FBS: ää, inkuboitiin 3 tuntia ja kiinteä . Farmakologisen inhibition, soluja inkuboitiin AZD0530 2 uM 15 minuuttia, ennen kuin pinnoitus. Vasen paneeli: TNC lisää soluadheesiota verrattuna päällystämättömän levyt ja vähentää solun tarttuminen FN. Oikea paneeli: Kun käsitellään AZD0530, soluilla pienempi adheesio verrattuna käsittelemättömiin soluihin kaikissa testatuissa olosuhteissa. Tiedot lasketaan keskiarvona +/- sem kahden kokeen ja ilmaistaan ​​kertamuutosta kontrolliin verrattuna (Ctrl) (vasen paneeli) tai käsittelemättömistä soluista (oikea paneeli) (* p 0,01, ** p 0,001, ANOVA-testi). (B, C) 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin TNC (0,5 ug /cm

2), FN (1 ug /cm

2) tai molempia proteiineja samaan aikaan (FN /TNC) ja ELISA suoritettiin, kuten on kuvattu Methods. Alustan sitova aktiivisuus TNC tai FN ei vaikuta kun molemmat proteiinit areused päällystää muovipintaan. (D, E) PANC-1 (D) ja SU.86.86 solut (E) levitettiin 45 min ennen kokonaisproteiinin uutto suoritettiin. Fosforylaatio paksilliini on Tyr 118 (pPAX) ja Akt Ser 473 (Pakt), ja yhteensä paksilliinin ja Akt ilmentymistasot tutkittiin immunoblottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita, ja sen jälkeen käsittelemällä soluja Src-inhibiittori AZD0530. GAPDH tunnistus käytettiin varmistamaan yhtäläiset Proteiinilisäyksen.

TNC ja FN vaikutuksesta paksilliini ja Akt aktivaatio fosforylaation

Tutkiakseen polkuja mukana liima käyttäytymistä haimasyöpäsoluissa päälle TNC ja /tai FN alustoille, fosforylaatiota taso paksilliini at Tyr 118, varhainen vaihe integriinin välittämä signalointi, samoin kuin fosforylaation taso Akt Ser 473 ja ekspressiotasot vinkuliini, proteiini osallistuu yhteyden polttovälin tarttumia aktiinitukirankaan, analysoitiin immunoblottauksella.

Kuten kuviossa. 4, TNC ja FN oli lievä tehostava vaikutus fosforyloitumisaste Aktin PANC-1 ja SU.86.86 solulinjat ensimmäisten vaiheiden aikana soluadheesion (45 min). Tämä vaikutus ei ollut ilmeinen enää 24 tunnin kuluttua ja myöhempinä ajankohtina (ei esitetty). Kuten soluadheesiota, TNC näytti päinvastainen vaikutuksia riippuen Koejärjestely. Itse fosfo-Akt oli hieman ylöspäin säädelty verrattaessa TNC päällystetyillä levyillä

vs

päällystämättömän levyt ja alassäädetty verrattaessa FN /TNC päällystetyillä levyillä

vs

FN päällystetyt levyt. Sama suuntaus voidaan nähdä, kun mitataan paksilliini aktivointi, kun taas vinkuliinin tasot eivät vaikuttaneet joko TNC tai FN (ei esitetty). Src-kinaasi-inhibiittorin AZD0530 (Saracatinib), joka estää fosforylaatiota paksilliinin ja Akt, käytettiin varmistamaan, että havaitut vaikutukset solujen kiinnittymistä todella välittyvät molekyylien integriinin signalointireitin. Tarttumisessa kokeissa inkubaation jälkeen AZD0530 eston paksilliini ja Akt fosfory- havaittiin (Fig. 4D ja E). Tämä vaikutus liittyy merkittävä väheneminen PANC-1 ja SU.86.86 tartunta kaikissa testatuissa olosuhteissa (PANC-1 FN: p = 0,004; kaikki muut olosuhteet p 0,001), lukuun ottamatta SU.86.86 tarttumisen päällystämättömiä levyt (Fig. 4A, oikea paneeli).

Seuraavaksi TNC vaikutus fokaalisen adheesion kokoonpanoon tutkittiin on morfologinen tasolla immunofluoresenssilla. Kuten on esitetty kuviossa. 5, PANC-1-soluja kasvatettiin 45 minuutin ajan TNC päällystetyn pinnan osoitti enemmän diffuusi co-lokalisaatio vinkuliinin ja fosfo-paksilliini kuin havaittu päällystämätön pinta, jossa paikallisessa tarttumisessa esiintyi enemmän pitkänomainen ja pääasiassa keskittynyt kehällä levityksen solu. On FN matriisi, vain hieman havaittavissa eroja fosfori-paksilliini ja vinkuliini jakautuminen solujen tarttunut FN ja FN /TNC havaittu. Molemmissa tapauksissa, fosfo-paksilliini /vinkuliinin alueet rajoittuu pääasiassa kehän kiinni soluja, jossa pidempi ja hajallaan tarttuvuus sivustoja läsnäollessa TNC.

PANC-1-solut anna kiinni päällystämättömiä tai TNC, FN ja FN /TNC päällystetty peitelaseja 45 minuuttia, varovasti pesty, kiinteä ja värjätään fluoresoivia sekundaarisia vasta-aineita. Focal tarttuvuus plakit osoituksena kolokalisaation vinkuliini (vihreä) ja fosfo-paksilliini (pPAX, punainen). Solujen tumat vastavärjättiin Hoechst 33342.

Keskustelu

PDAC on tunnusomaista merkittävä kasvu sidekudoksen joka ympäröi syöpäsoluja. Tärkeimmät avustajat tähän ns ”desmoplastic” reaktio ovat PSCs, alapopulaation haiman soluja, jotka, kun aktivoitu kasvutekijöiden, sytokiinien ja oksidatiivisen stressin, erittävät ylityksen ECM proteiinien ja liukoisten välittäjäaineiden perustamisesta rajat puhua syöpäsoluja. Useat tekijät osoittavat, että desmoplastic microenvironment avainasemassa säätelyssä nopean kasvun ja invaasion haimasyöpä, angiogeneesi ja kestävyys kemoterapiaa [4] – [7], [21] – [26].

TNC on suuri strooman ECM-proteiinia, joka on säädellään ylöspäin etenemistä PanINs ja PDAC [17] ja sen ilme on korreloinut huonosti eriytetty fenotyyppiä PDAC [16]. Lisäksi TNC ilmentyminen on korreloitu huonoon ennusteeseen sairastavien potilaiden keuhkojen ja aivojen syöpä [21], [27] – [29], kun taas mitään korrelaatiota ekspressiotasot ja ennuste on havaittu haimasyövän [16]. TNC pystyy olemaan vuorovaikutuksessa useiden ECM-proteiinien (kuten FN, perlekaani, aggrekaania, versikaani ja brevican) ja monet solun pinnan reseptoreihin (mukaan lukien integriinien α2β1, α7β1, α9β1, avp3, anneksiini II, EGFR ja syndekaani 4), moduloiva cellular signalointi ja vaikutetaan solujen muuttoliike ja lisääntymistä [11]. Lisäksi aikuisten organismi TNC on liimaa ja anti-liima ominaisuuksia ja ilmaistaan ​​aikana fysiologisia ja patologisia tiloja, joissa solujen vaeltaminen ja kudosten remodeling on mukana, kuten haavan paranemista tai aikana kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden [11]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joilla TNC vaikuttaa syövän etenemisessä ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Käsitellä tätä kysymystä vuonna PDAC olemme tutkineet kuinka TNC vaikuttaa biologiseen merkittävät ominaisuudet haiman syöpäsoluja.

Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että TNC pystyy tukemaan ja edistämään kasvua ja migraatio huonosti eriytetty haimasyövän solulinjoissa . Toinen mielenkiintoinen havainto on se, että TNC yksin esittää pro-liima vaikutus haimasyövän soluja, toisin kuin on raportoitu anti-liima vaikutus useimpiin muihin tutkittu solulinjojen, kuten glioblastooma ja rintasyöpäsoluihin [22]. Tämä pro-liima vaikutus haimasyövän soluja liittyy kasvuun fosforyloitumisaste Akt ja vähemmässä määrin paksilliini. Tämä viittaa siihen, mekanismi, johon integriini-välitteistä tarttumista TNC, analogisesti, mitä on aiemmin osoitettu kondrosarkoomasoluissa, jossa kasvua Ser 473 fosforylaation Akt soluissa noudattamalla TNC edistää solujen eloonjäämistä seerumin menettänyt väliaineessa [23]. Kuitenkin vaikutukset TNC on haimasyövän solujen elinkykyä ja lisääntymistä olivat varsin heterogeenisiä ja kasvun eston havaittiin joissakin solulinjoissa, enimmäkseen korkeimmat pitoisuudet TNC. Tämä tulos ei ole yllättävä, koska heterogeenisyys PDAC solulinjojen koskevat niiden alkuperästä ja erilaistuminen [19], [20] sekä pleiotrooppista ja usein päinvastainen vaikutuksia TNC riippuen solujen ja kudosten yhteydessä.

In vitro

tutkimuksissa usein ilmoittaa ristiriitaisista tuloksista, jossa TNC stimuloivaa [24] ja estämällä [25] solujen kasvua ja edistää sekä soluadheesiota ja irtoaminen [26]. Lisäksi vastapäätä liima ja muuttavien vastauksia TNC samassa glioomasolulinjaa riippuen integriinin reseptorin mukana [30] ja eri liima-vasteita välittävät saman integriinin eri solulinjoissa [31] on kuvattu. Mielenkiintoista, on FN päällystetyn pinnan TNC pienentää haimasyövän soluadheesiota ja fosfo-paksilliini ja fosfo-Akt tasolle. Tämä vaikutus on sekoitettu TNC-FN matriisi, joka muistuttaa läheisesti

in vivo

tilanteessa, jossa TNC ja FN vuorovaikutuksessa kasvainliitteisten ECM, on jo kuvattu glioblastoma ja -rintakarsinoomasolujen [20], [22]. Näissä kasvaimia, TNC vähentää solujen levittää FN häiritsee FN sitoutumisesta integriiniin koreseptorissa syndekaani-4, mikä vaarantaa polttoväli yhteystiedot ja stressi kuidunmuodostukseen [29]. Koska substraatin sitoutumisen tehokkuutta FN eivät vaikuttaneet TNC tutkimuksessamme, joka arvioidaan ELISA, vastaava mekanismi kilpailun solupintareseptorien Voidaan olettaa sisään PDAC soluissa. Tästä johtuen em aktivointi paksilliini ja fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) ja näin ollen aktiini stressi kuitu ja polttoväli yhteystiedot muodostumista sekä täysi solunlevitys- estyy, joiden kokonaispituus parannusta soluproliferaatioon [22]. Heikko sitoutuminen FN yleensä korreloi parannetun lisääntymistä monissa kasvainsoluissa [32]. Meidän kokeellinen perustettu, emme tarkkailla kasvua soluproliferaatioon varten PANC-1 ja SU.86.86 solujen sekoitettu alustalle FN ja TNC verrattuna FN yksin, luultavasti siksi vaikutukset TNC tarttumiseen rajoittuivat lyhyitä aikoja (3 tuntia) ja polttovälin tarttuvuus kokoonpano FN tarttumattomat solut oli vain hieman muutettu TNC, havaittuna immunofluoresenssilla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että mekanismeja, joilla TNC vaikuttaa syöpäsolujen tarttumista ja lisääntymistä on FN alustalle eivät ole yleisiä, mutta tiukasti riippuvaisia ​​tarkentaa solulinjassa ja kokeellisen perustaa käytetään.

On tunnettua, että kyky syöpäsolujen vuorovaikutuksessa soluväliaineen proteiinien, kuten FN, on ratkaisevan tärkeää solujen invaasiota ja muuttoliike. Tuloksemme osoittavat, että määrä haiman syöpäsoluja, jotka noudattavat FN lyhyessä aikoina on pienentynyt läsnäollessa TNC mutta on edelleen korkea ja alueella solujen määrän kiinni TNC yksin. TNC voi näin ollen toimia modulaattori varhaisen muuttavien tapahtumien, jotka sisältävät substraatin tunnistus ja tarttuvuus, ja se voi edistää solumigraatio vähentämällä solun tarttuvuus FN, mikä indusoi enemmän dynaaminen vuorovaikutus kasvainsolun ja ECM komponentteja. Lisätyötä tarvitaan ymmärtää, miten TNC vaikuttaa liimauksena aikana haimasyövän solujen vuorovaikutus FN, joka solureseptoreille ongelma koskee ja muita solunsisäisiä reittejä voidaan muuttaa.

Yhteenvetona esillä tiedot osoittavat, että TNC vaikuttaa kasvun, motiliteetin ja tarttuvuus haimasyövän soluja, nämä vaikutukset ovat erilaisia ​​riippuen solujen erilaistumista ja koostumuksesta soluväliaineen. Terapeuttinen strategioita, joiden tarkoituksena on häiritä TNC-rikas matriisi voi olla siis hyödyllinen vastakkaisia ​​ylimääräisen aggressiivisuus PDAC.

Materiaalit ja menetelmät

ylläpito solulinjojen

Haiman solujen linjat Capan-1, AsPC-1, PANC-1, MIA PaCa-2 ja SU.86.86 [18], [19], [33] (American Type Culture Collection, ATCC) ylläpidettiin suuren glukoosipitoisuuden DMEM väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja 1 X penisilliiniä /Streptomicine (Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa humified ilmakehässä 5% CO2: ta. Solut testattiin mykoplasmakontaminaation polymeraasiketjureaktiolla (TAKARA, Shiga, Japani).

Generation stabiilien kloonien yli-ilmentävät TNC

Plasmidi TNC-L, jossa suuret silmukoitumattoman isoformi TNC kloonataan pCMV-Script vektori (Stratagene, La Jolla, CA, USA), oli antelias lahja tri JH Pringle (Department of Cancer Studies molekyylilääketieteen, Leicesterin yliopiston School of Medicine, UK) [34 ]. Täydellinen TNC-L koodaussekvenssi tarkistettiin sekvensoimalla. Sitten TNC-L-plasmidi ja tyhjän vektorin pCMV-Script ensin linearisoitiin restriktioentsyymillä APA-L1 ja sitten transfektoitiin PANC-1 syöpäsolujen käyttämällä FuGENE-transfektioreagenssia (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa), mukaan valmistajan ohjeita. 2 päivän jälkeen solut altistettiin G418-valinnan pitoisuutena 1 mg /ml. 2 viikon kuluttua, kun läsnä on G418, useita pesäkkeitä havaittiin ja monistettiin. Pesäkkeet tarkistettiin läsnäolo transfektoidut-geenin PCR-määritys käyttäen alukkeita 5-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3 (on pCMV-Script) ja 5-GACACCAGGTTCTCCAGCTC-3 (TNC-geeni). Kyky PCR-positiivisten pesäkkeiden erittää TNC vahvistettiin Western-blottauksella. Positiiviset kloonit PANC-T2, PANC-T24, PANC-T27 ja ohjaus (valetransfektoiduilla) kloonit PANC-C21, PANC-C23, PANC-C27 valittiin seuraavat kokeet.

TNC ja FN pinnoite

TNC hankittiin Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach, Saksa) ja FN Biochrom (Berliini, Saksa). 96-kuoppaisille levyille (elinkelpoisuus ja tarttuvuus), päällyste suoritettiin TNC: n lopullinen konsentraatio 1 ug /cm2. 24-kuoppaisille levyille (haavan paranemista määritykset) TNC pitoisuudet 0,1 ug /cm 2, 0,5 ug /cm 2 ja 2,5 ug /cm2 käytettiin. 6-kuoppaisille levyille (immunoblottauksella) pitoisuutena 0,5 ug /cm2 käytettiin. FN pinnoite suoritettiin lopullinen konsentraatio 2 ug /cm2 96-kuoppaisille levyille ja 1 ug /cm2 24- ja 6-kuoppaisilla levyillä. Pinnoite proteiinit saa adsorboitiin yön yli 4 ° C: ssa, kuopat pestiin PBS: llä sitoutumattomien proteiinien poistamiseksi, ja blokattiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa lisäämällä 0,2% lämmöllä denaturoitua (85 ° C: ssa 12 min) BSA PBS: ssä. Levyt pestiin lopuksi kaksi kertaa steriilillä PBS: llä ja steriloitiin UV-altistus 20 minuuttia.