Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä aiheuttaa noin 1,2 miljoonaa kuolemaa vuodessa maailmanlaajuisesti, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) edustaa 85% kaikista keuhkosyövässä. Ymmärtäminen molekyyli- tapahtumia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on olennaisen tärkeää parantaa varhaisen diagnoosin ja hoidon tähän sairauteen.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Yrittäessään tunnistaa uusia NSCLC liittyvä geenit, suoritimme genominlaajuisten seulonnasta kromosomi kopioluvun muutokset vaikuttavat geenin ilmentymistä käyttäen microarray perustuva vertaileva genominen hybridisaatio ja geeniekspressio taulukot 32 radikaalisti resektoitiin kasvain näytteet vaiheen I ja II NSCLC potilaat. Integroiva analyysityökalu käytettiin sen määrittämiseksi, kromosomi kopioluku vaikuttaa geenien ilmentyminen. Olemme tunnistaneet poiston 14q32.2-33 yhteisenä muutos NSCLC (44%), mikä vaikutti merkittävästi geenin ilmentymistä varten HSP90, oleskelevien 14q32. Tämä poisto korreloi paremmin kokonaiselinaikaa (P = 0,008), eloonjääminen oli myös pidempi potilailla, joiden kasvaimet olivat alhaiset ekspressiotasoja HSP90. Olemme laajentaneet analyysi kolme riippumatonta validointi sarjaa NSCLC potilaiden, ja vahvisti alhainen HSP90 lauseke liittyvät kauemmin kokonaiselinaikaa (P = 0,003, P = 0,07 ja P = 0,04). Lisäksi in vitro käsittelemällä HSP90 estäjän oli voimakas antiproliferatiivinen aktiivisuus NSCLC solulinjoissa.

Johtopäätökset

Suosittelemme, että kohdentaminen HSP90 on kliinistä vaikutusta pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Gallegos Ruiz MI, Floor K, Roepman P, Rodriguez JA, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) integrointi Gene Annostus ja Gene Expression in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, tunnistaminen HSP90 potentiaalisia kohde. PLoS ONE 3 (3): e0001722. doi: 10,1371 /journal.pone.0001722

Academic Editor: Christoph Plass, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 joulukuu 2007; Hyväksytty 4 helmikuuta 2008; Julkaistu 5 maaliskuuta 2008

Copyright: © 2008 Gallegos Ruiz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Paul Roepman työskentelee Agendia BV

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) edustaa 85% keuhkosyövässä. Parempi ymmärrys molekyylitason tapahtumien taustalla kehittäminen ja taudin etenemistä voidaan edistää kliinisessä hoidossa NSCLC potilaiden. Useita geenejä, esim. P53, RAS, P16 ja EGFR, on osoitettu muuttua NSCLC [2]. Koska heterogeeninen ja monimutkainen luonne kasvaintyypistä, on todennäköistä, että monet geenit ajo NSCLC kasvaimien syntyyn ole vielä tunnistettu.

Kromosomipoikkeavuudet uskotaan olevan kriittiset tapahtumat ihmisen kasvainten synnyssä, ja useat genomialuetta usein kätkeminen DNA voitot (3q, 5p, 7q, 8q, 11 q ja 16p) ja tappiot (3p, 4q, 5q, 6Q, 8p 9P ja 13q, 17Q) on havaittu pienisoluista keuhkosyöpää [3]. Käyttämällä array perustuu vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) ja geenin ilmentymisen mikrosiruja, DNA: n kopioiden lukumäärä muutoksia ja geenin ilmentyminen voidaan mitata koko tuumorisolujen genomissa. Yhdistämällä tiedot näistä analyyseistä, on mahdollista saada integroitua genomin kattavan kuvan geenin annostuksen poikkeavuuksien ja niiden vaikutus geenien ilmentymisen, jotka voisivat auttaa tunnistamaan geenejä tärkeää NSCLC [4].

Tässä tutkimuksessa olemme suorittaneet integroiva kromosomaalisen kopioluvun ja geenin ilmentymisen radikaalisti resektoitiin kasvainnäytteestä 32 NSCLC potilaiden. Kaksi uutta algoritmeja, ”CGH call” [5] ja ”ACE-se” [6], levitettiin tietojen analysointiin. Olemme tunnistaneet poisto kromosomissa alueen 14q32.2-33 44% NSCLC potilaista. Tämä poisto liittyi parantunut potilaan selviytymistä, ja liittyi vähentynyt ilmentyminen HSP90, molekyylitasolla chaperone useita onkoproteiineja joka tutkitaan uutena tavoite syövän hoitoon. Alhainen HSP90 ilmentyminen korreloi parantunut selviytymistä 32 pienisoluista keuhkosyöpää analysoitiin aluksi. Lisäanalyysi kolme itsenäistä NSCLC potilaiden vahvisti Merkitsevä yhteys potilaan selviytymisen ja HSP90 ilme. Lisäksi

in vitro

kokeet osoittavat NSCLC solulinjat olevan erittäin herkkiä HSP90 -estäjä 17-AAG. Tuloksemme viittaavat siihen, ja tärkeä rooli HSP90 NSCLC.

Methods

Potilaat ja näytteet

Koepakettia koostui radikaalisti resektoitiin kasvain yksilöitä 32 alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. Kolme potilasta oli elinaika on lyhyempi kuin 30 päivää, ja niiden katsottiin leikkauksen jälkeisen kuolemia. Näin ollen nämä kolme potilasta eivät sisälly selviytymisen analyysit. Potilaiden mediaani seuranta 86 kuukautta (vaihteluväli ,4-+135,5). Sanallinen tietoinen suostumus oli saatu kaikilta potilailta ja näytteiden käsittelyn oli protokollien mukaisesti hyväksymien eettisten board ”subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden Onderzoek” alkaen VU University Medical Center Amsterdam.

Ensimmäinen validointi joukko koostui 140 radikaalisti resektoitiin NSCLC potilaat Euroopan keuhkosyövän yhteenliittymä. Potilaiden mediaani seuranta 35 kuukauden. Kaikki potilaista oli ollut ennen pahanlaatuisuuden, patologinen kasvaimen vaiheesta 1 tai 2 (T1-2), solmu vaihe 0 + 1 (N0-1), ei kaukainen etäpesäke (M0) klo toiminta, eikä sairautta jäljellä resektio ( R0). Kukaan näistä potilaista saivat (neo) adjuvantti kemo- tai sädehoitoa. Toinen validointi koostui 111 alkuvaiheen NSCLC potilaiden Bild et al. [7]. Kolmas validointi joukko koostui yleisesti saatavilla ”aineistoja 1 ja 2” Lu et al. [8] ja sisälsi 54 alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. Täydellinen kuvaus potilasryhmät kaikkien neljän potilaan sarjaa annetaan taulukossa 1.

eristäminen perimän DNA: ja joukko vertaileva Perimän Hybridisaatio

Cryo-osiin jäädytetyn kudosnäytteiden, reunustavat osioista käytetään RNA: n ja DNA: n eristäminen, varmistettiin tutkimuksessa patologi (WM) sisältää vähintään 50% syöpäsoluja. Genomi-DNA: ta uutettiin jokaisesta näytteestä käyttäen Trizol valmistajan ohjeiden mukaisesti (Life Technologies, Breda, Alankomaat). DNA merkinnät ja -hybridisaatiolla CGH 30K oligonukleotidigeenisirumenetelmää suoritettiin kuten ovat kuvanneet van den IJssel ym. [9]

RNA: n eristys ja geenin ilmentyminen mikro paneelit

RNA: n eristys ja cDNA merkinnät seurasi vakioprotokollia . Hybridisaatio suoritettiin Agilent alustalla standardimenetelmien mukaisesti valmistajan ilmoittamissa ja muualla [10].

Tietojen analysointi

array CGH, spot analysointi ja laadunvalvonta suoritettiin käyttämällä BlueFuse versio 3.2 ( BlueGenome, Cambridge, UK). Raja-arvot, voitot, tappiot ja monistukset havaittiin algoritmiin CGH puhelu. Tämä algoritmi muuntaa raaka log2ratios ehdottomaan toimenpiteet ”menetys”, ”normaali”, ”voitto” tai ”vahvistusta” käyttämällä segmentointialgoritmi yhdistettynä todennäköisyydellä seoksen malli [11]. Jotta tilastollisesti testata onko geenien ilmentyminen vaikutti geeni annostus haimme array CGH ilmaus integrointityökalu, ACE-se [6], jossa kutsutaan array CGH ja normalisoitu log10 tunnusluvut ilmaisun paneelit käytettiin lähtötietoina. ACE-se käyttää yksipuolista Wilcoxonin summa tilastojen testata, mikä kromosomaalisen kopiomäärä kromosomipoikkeavuuksien toistuvasti vaikuttavat RNA ilme. Laskettu p-arvot on säädetty useille testaus käyttäen Benjamini Hochberg menetelmä [12]. ACE-se testaa vain geenejä, jotka täyttävät saastumisen ja tasapaino, joita ohjataan läpi rajan näytteiden lukumäärästä. Tässä kynnys asetettiin kiinteään Oletusasetuksella 9 näytettä, mikä tarkoittaa, että vain ne kromosomaalisen kannat otettiin huomioon, että oli vähintään 9 näytettä CGH kutsuvan aseman ja enintään 9 muissa tila. Koko joukko CGH datasarja koesarjan (n = 32) on saatavilla GEO tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, hakunumero GSE7878). Geeniekspressiota tiedot sekä testipakkauksesta (n = 32) ja validointi asettaa 1 (n = 140) varten 359 geenien tunnistaa ACE-se on saatavilla Array Express tietokannan (www.ebi.ac.uk/aerep/kirjautuminen, hakunumero Array muotoilu: A-MEXP-749, Koe tiedot: E-TABM-270).

Geenien ilmentyminen tietojen validointi asetettu 2 saatiin käyttämällä Affymetrix Hu133plus2 pelimerkkejä (GEO hakunumero GSE3141). Keskimääräinen arvo MAS5 laskettu signaali-intensiteetit neljästä probesets havaitsemiseksi HSP90AA1 käytettiin meidän laskelmissa.

Kolmas validointi sarja sisälsi geenin ilmentyminen tietoja Affymetrix Hu95 ja Hu133 pelimerkkejä (GEO hakunumero GSE6253). Hu95 siru sisälsi yhden probeset havaita HSP90AA1 ja Hu133 siru sisälsi neljä probesets, joista keskiarvo RMA laskettu signaali-intensiteetit käytettiin meidän laskelmissa.

Tilastot

univariate Coxin analyysi suoritettiin tutkimaan suhteessa geenin ilmentymisen arvot elinaika. Survival konstruoitiin käyttäen Kaplan Meier menetelmän ja eroavaisuuksia yleisessä arvioitiin käyttäen log-rank-testi. Testissä asetettu, kolme potilasta vähemmän kuin 30 päivää elinaika jätettiin selviytyminen analyysin, koska niiden kuolema pidettiin leikkauskuolleisuusriski. Voit selvittää riippumattomia vaikutuksia HSP90 ilmaisun, histologisen alatyypin, kasvain vaihe, ikä ja sukupuoli, Monimuuttuja cox regressioanalyysi suoritettiin. AP arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Multiplex Ligaatioseoksista riippuvainen Probe Vahvistus (MLPA) B

Multiplex Ligaatioseoksista riippuvainen Probe Vahvistus (MLPA), The subtelomere koetinsarjaa P070 (MRC Holland, Amsterdam, Alankomaat), joka sisälsi koettimen sijaitsee nauhan 14q32.33 (alue 104874216-105070384) käytettiin. MLPA suoritettiin valmistajan ohjeiden käyttäen 100 ng DNA: ta tulo. DNA eristettiin verestä allas terveiden luovuttajien käytettiin vertailunäytteellä. Koetin signaalit normalisoitiin jakamalla piikin pinta-kromosomissa 14 q jonka piikin pinta-kromosomin 14p. MLPA syntyy 14 q /14p-suhteet piirretään keskimääräinen normalisoitu log2ratios, että oligot alueella 104787271-105071522 jonosta (yhteensä 11 oligojen). Tämä alue kattaa alueen MLPA koetin.

kvantitatiivinen RT-PCR

Voidakseen vahvistaa ilmaisun saatujen arvojen kautta geeniekspression paneelit, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä Taqman® tekniikkaa ja ABI PRISM 7500 Sequence Detection System väline varustettu SDS version 1.3.0 ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Eteenpäin ja käänteinen alukkeita ja koettimia suunniteltiin ja valmistaja Applied Biosystems varten HSP90AA1 (Hs00743767_sH), ja endogeenisen ohjaus geenin GUSB (Hs00939626_mi). PCR suoritettiin 25 ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 50 ng cDNA, 1 x TaqMan Universal PCR Master Mix, sekä pohja- ja koetin sarjat HSP90AA1 ja GUSB. Jokainen näyte analysoitiin kahtena kappaleena, ja keskimääräinen kynnysarvo (Ct) arvot jokaisen näytteen GUSB, vähennettiin keskimääräiset Ct-arvojen HSP90AA1. Taqman syntyvän ACt arvot log muunnetaan ilmaisun arvoihin ja pidon Δlog2ratios välillä GUSB ja HSP90AA1 ilmaisusta jono.

Solun kasvun estäminen tutkimukset

Kasvunestymistutkimus seuraavat

in vitro

altistuminen kliinisesti käytetyn Hsp90 -estäjä 17-AAG (InvivoGen, San Diego, CA) tutkittiin 4 EGFR villityypin NSCLC solulinjoja (H460, H157, H441 ja A549, saadut Tohtorit. P. Dennis ja F. Kaye , NCI, Bethesda, MD). Lyhyesti, 10

5-solut ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), annettiin kiinnittyä ja sen jälkeen jatkuvasti alttiina eri pitoisuuksia 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 nM) 24, 48, tai 72 tuntia. Kullakin ajanhetkellä, solut irrotettiin kuopista, inkuboitiin trypaanisinisellä ja elinkelpoisten (trypan blue-ilman) solujen lukumäärä määritettiin kolmena kappaleena käyttäen hemasytometriä. Keskimääräinen solujen lukumäärä standardeilla virhepoikkeamilla on esitetty kunakin ajankohtana. Lisäksi IC

50 (lääkeaineen pitoisuus, jossa 50% kasvun inhibitio saadaan) 17-AAG 72 tuntia määritettiin kustakin solulinjasta.

Tulokset

Gene annostus -aiheiset geeniekspression muutoksia NSCLC

Kromosomipoikkeavuudet esiintyi runsaasti 32 pienisoluista keuhkosyöpää analysoitu. Jotta voitaisiin tunnistaa raja-arvot ja -tappioista haimme algoritmin CGH puhelu [11]. Taulukossa 2 kromosomi alueisiin, joissa voitot tai tappiot olivat läsnä vähintään 20%: lla potilaista on lueteltu. Tilastollinen työkalu ACE-se [6] käytettiin määrittämään onko geenikopiomäärä vaikuttaa geenien ilmentyminen. Kaikkiaan 359 selostukset osoittautui vaikuttaa merkittävästi kopiomäärä. Kuviossa 1 aloilla vaikuttaa geenejä tarkoitettu 32 pienisoluista keuhkosyöpää, näkyy vihreällä (saadut alueet) tai punainen (menetetty alueet).

Yhteenveto kuvaaja kutsutaan voitot ja tappiot 32 resektoitiin pienisoluista keuhkosyöpää DNA kopio numero muuttuu merkitty harmaalla. Positiiviset arvot tarkoittavat prosentuaalista näytteiden löytyi voitto. Negatiiviset arvot tarkoittavat prosentuaalista näytteiden kätkeminen tappio määritettyyn kromosomissa sijainti. Geenit määritellyillä alueilla vaikuttaa kopiomäärä voitto on merkitty vihreällä ja geenien vaikuttavat kopiomäärä tappio on merkitty punaisella. Valikoima vaikuttaa geenien on osoitettu. Täydellinen luettelo 359 vaikuttanut selostukset löytyvät täydentäviä taulukossa S1.

univariate Coxin eloonjääminen analyysi suoritettiin ilmentämiseen kaikkien 359 geeniä, jotka havaittiin olevan vaikutusta kopiomäärä (ks täydentävä taulukko S1). Toistuvassa testaus korjauksen (käyttäen Benjamini Hochberg menetelmä) yksikään 359 geenien säilyi merkitsevänä hengissä tällä pienellä potilaiden joukko (n = 32). Top lista geenien korreloi selviytymisen (sijalla raaka p-arvot) sisälsi pääasiassa geenit sijaitsevat kromosomeissa 3 ja 5 saadut alueilla. Havaitsimme myös yksi geeni top-20 lista, HSP90AA1, sijaitsee kromosomissa 14. HSP90AA1 geeni (yleensä kutsutaan HSP90), joka sijaitsee 14q32.2, oli ainoa geeni tämän alueen vähensi ilme potilailla vaikuttaa menetys tällä alueella (P = 0,05). Nämä havainnot sai meidät tutkimaan tässä lokuksessa tarkemmin.

Perimän poikkeavuuksien päälle 14 q ja HSP90AA1 geenin ilmentymisen korrelaatio selviytymisen

Tässä tutkimuksessa korrelaatio toistuvien tiukka häviämä alue 14q32.2- 33, kanssa selviytyminen. Mielenkiintoista on, potilaille, joilla tällä alueella on poistettu oli parannettu yleiseen eloonjäämiseen (OS) verrattuna potilaisiin, kätkeminen normaali geeni annostus tässä lokuksessa (5 vuotta OS 69% vs. 41%, P = 0,004, kuvio 2A).

(A) Kaplan-Meier -käyrät kokonaiseloonjäämiselle on esitetty 29 potilasta suhteessa geeni annostus kromosomi alueella 14q32.33. (B) Kokonaiselossaoloaika 29 potilasta suhteessa HSP90 ilme. Alhainen ilmentyminen määritettiin ilmaisu pienempi kuin mediaani koko 32 näytettä, ”normaali” ilmentyminen määritettiin korkeampi kuin mediaani 32 näytettä. Kolme 32 potilaista analysoinnissa geenin annostuksen ja ilmaisun jätettiin selviytyminen analyysin takia elinaika on alle 30 päivää.

Tutkiakseen HSP90 ilmaisun suhteessa selviytymisen, jaoimme 32 potilasta kahteen ryhmään niiden selviämistila kahden vuoden kuluttua kasvaimen resektiota. Noin puolet potilaista luokiteltiin ”korkean riskin” ja puolet ”matalan riskin”. Tunnistaa, ovatko sekä riskiryhmiä voitaisiin syrjiä geenien ilmentyminen HSP90 rakensimme Kaplan Meier eloonjäämisennusteet kaksi yhtä suurille ryhmille ”matala” ja ”normaali”, joka perustuu mediaani HSP90 ilmaisua. Alhainen ilmentyminen HSP90 liittyi parempi eloonjäämiseen (5 vuotta OS 70% vs. 40%, P = 0,13-kuvio 2B), vaikka erot kahden ryhmän välillä olivat aluksi ole merkittäviä, koska todennäköisesti yhdistelmä matala suuruus eron ja pieni määrä potilaita analysoitu.

Tekninen validointi 14 q poistetaan ja HSP90 ilmaisun

validoimiseksi poisto havaittiin alueella 14q32.2-33 suoritimme multiplex ligaatio riippuvainen koetin monistamisen [13] (MLPA) analyysi käyttäen subtelomere probeset sisältää anturi alueella 14q32.33. Korrelaatiokerroin (R

2) väliin menetys tällä alueella havaitaan array CGH ja MLPA oli 0,439.

validoimiseksi HSP90 ilmaisun saadut tiedot mikrosiruja suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR käyttäen TaqMan® teknologiaa. Hyvä korrelaatio ilmaisu HSP90 mitattuna kahdella eri tekniikoita havaittiin (R

2 = 0,6431).

Validation HSP90 ilmaisun ja suhdetta hengissä riippumaton potilaan sarjassa

jotta voitaisiin edelleen tutkia yhdistyksen välillä alhainen HSP90 ilmaisun ja NSCLC potilaan ennustetta, käytimme kolme riippumatonta validointi sarjaa NSCLC potilaiden. Kaikissa kolmessa potilas asetetaan, ”alhaisen riskin” /”korkean riskin” potilas jakautuminen potilasaineistoihin oli noin kaksi kolmasosaa vs. kolmasosa. Siksi käytimme 33-prosenttipiste HSP90 ilmaisun kuin katkaista erottelu potilaille, joilla on ”normaali” (eli korkean riskin) ja ”matala” (eli alhaisen riskin) ilmaisua. Kaikkien kolmen validointi sarjaa, alhainen ilmentyminen HSP90 korreloi parannetun kokonaiselossaolo. Tämä korrelaatio oli merkittävä ensimmäisen ja kolmannen validointi sarjaa (P = 0,003 ja P = 0,04), ja raja merkittävä toinen sarja (P = 0,07) (kuva 3). Monimuuttuja-analyysi paljasti, että HSP90 ennusteen arvioinnissa oli riippumaton lavalta, histologiset alatyypin, ikä ja sukupuoli potilaiden (taulukko 3).

Kokonaiselossaoloaika varten (A) 140 potilasta NSCLC, validointi asetettu 1 (B) 111 NSCLC potilaat, validointi asettaa 2 ja (C) 54 potilasta NSCLC, validointi asettaa 3. katkaista varten ero matalan ja ”normaali” ilme perustui 33-prosenttipiste ilmaisun arvoista.

validointi Hsp90 toteuttamiskelpoisena molekyylikohteena paneelissa NSCLC solulinjojen

Hsp90 on molekyyli chaperone joka stabiloi useita onkoproteiineja, kuten EGFR, ja muodostaa uusi potentiaalinen kohde syövän hoitoon. Edellä mainitut tiedot osoittivat, että Hsp90 ilmentymistaso on prognostinen indikaattori pysyvyyttä suuri joukko NSCLC potilaiden, ja viittaavat siihen, että Hsp90-inhibiittorit voivat olla laajempia käyttökelpoisia tämän sairauden kuin aiemmin tunnustettu. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, testasimme ovatko farmakologinen estäminen Hsp90 toiminta vaikuttaisi

in vitro

solujen kasvua paneelin NSCLC solulinjoissa. Kasvu näistä solulinjoista, joihin kaikkiin on villityypin EGFR, oli syvästi inhiboitu, annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, osa-mikromolaarinen pitoisuuksia 17-AAG, joka on Hsp90 estäjä [14] parhaillaan vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa (kuvio 4). 72 tuntia, IC 50 oli alle 50 nM 17-AAG kaikissa tapauksissa, ja korkeammat lääkeainepitoisuudet johdonmukaisesti johtanut merkittävään sytotoksisuuteen.

(A-D) aika- ja annosriippuvaisia ​​esto in vitro kasvuun H460, H157, H441, ja A549 NSCLC solulinjojen altistuminen 17-AAG. Solut ympättiin 105 /kuoppa, ja elävien solujen lukumäärä määritettiin seuraavina päivinä Menetelmät kuvatulla tavalla. 17-AAG pitoisuudet (H441) tai yli (A549, H460 H157) 30 nM tasaisesti johti ajasta riippuva menetys solujen elinkelpoisuuden. IC50-arvo 17-AAG (jatkuva altistus 72 h) kullekin solulinja on seuraava: H460 = 30 nM, H157 = 15 nM, H441 = 8 nM, ja A549 = 20 nM.

keskustelu

Perustuu array-CGH dataa NSCLC, on osoitettu, että useiden molekyyli- syövän synty reittejä olemassa, jotka todennäköisimmin liittyvät sukupuoleen ja tupakointi [15]. Lisäksi osoitettiin, että on olemassa suuri päällekkäisiä poikkeavuuksia havaitaan adenokarsinooma ja okasolusyöpä alatyyppi, paitsi 3Q voittoja, jotka näyttävät olevan spesifinen okasolusyöpä alatyyppi [16]. Eri geenien ilmentyminen allekirjoitukset ovat korreloineet selviytymiseen NSCLC potilaiden [17] – [19]. Lisäksi molekyyli- tutkimukset ovat voitu kehittää yksilöllisten lähestymistapojen olevan monilla kasvaintyypeissä [20] – [22]. On kuitenkin todennäköistä, että monet syöpään liittyvien kohdegeenien ei ole vielä tunnistettu. Tässä suhteessa, integroitu genomin laajuinen seulonta kopioluvun muutoksia ja geenin ilmentyminen käyttäen mikrosiruja on äskettäin suoritettu eri kasvaintyypeissä tunnistaa geenejä, joiden ilmentyminen on vaikuttaa geenin annostuksen [4], [23] – [26]. Näiden tutkimusten tarkoituksena on tunnistaa uusia syöpään liittyvien geenien ja määritellä uusien biomarkkereiden vastausta tai ennustetekijöiden allekirjoituksia. Sekä NSCLC ja ductal haimasyöpä, kahdelle keskeiselle amplifikaatioita 8p12 ja 20q11 on tutkittu yksityiskohtaisesti johtavat kahteen kandidaattigeenit (WHSC1L1 ja TPX2) tärkeä näissä sairauksissa [16]

Me täällä suoritetaan integroidun genomin laajuinen seulonta geenikopiomäärä muutoksia ja geenien ilmentymiseen 32 radikaalisti resektoitiin pienisoluista keuhkosyöpää, jotta löydetään uusia NSCLC liittyviä geenejä. Käyttämällä ACE-sitä, uusi tietotekniikan väline integraation geenin annostuksen ja geenien ilmentyminen tietojen tunnistimme 359 selostukset vaikuttaa merkittävästi kopiomäärä. COX selviytyminen analyysi kaikki 359 geenit eivät paljastaneet merkittävää yhteyttä toistuvassa testaus. Top-listalla liittyvien geenien säilymisen pääosin sisältyvät geenit oleskelevien saanut alueisiin 3q ja 5p. Nämä alueet kattavat monia geenejä ja paikantaa geeniä suurin merkitys on haastava tehtävä. Lisätutkimukset pitäisi valaista tärkeyttä näiden geenien suhteessa NSCLC, erityisesti niistä top luetteloon korrelaatio selviytymisen kuten SLC45A2, WDR70 ja NIPBL (katso täydentävä taulukko S1). Tässä tutkimuksessa keskityttiin toistuviin poistamista kromosomissa 14 ja geeni HSP90, joka oli myös top luetteloon suhteessa selviytymisen ja aiemmin tutkittu yksityiskohtaisesti. Deleetio alueella 14q32.2-33 korreloi parannetun selviytymisen lisäksi viittaa siihen, että se voi sisältää yhden tai useampia geenejä, jotka liittyvät NSCLC etenemistä. Poistetaan tämä alue on kuvattu aiemmin yksi ryhmä raportoi genomista poikkeavuuksia NSCLC, mutta ei tutkittu tarkemmin [27]. Niistä 109 geenien kartoitus on 14q32.2-33 alueelle, HSP90 oli ainoa geeni on huomattavasti alhaisemmat ilme potilailla kätkeminen 14q32.2-33 poisto. Alkuperäisessä sarjassa 29 potilasta (3 potilasta jätetty selviytyminen analyysi), havaitsimme parantunut selviytymistä potilailla, joilla on alhaisempi HSP90. Yhdistyksen välinen HSP90 ekspressiotasot ja NSCLC potilaiden ennuste vahvistettiin merkittävä kolmessa riippumattomassa validointi sarjaa NSCLC potilaiden. Monimuuttuja-analyysissä kuten vaiheessa histologia, ikä ja sukupuoli osoitti, että HSP90 pysyi itsenäisesti liittyvät selviytymisen.

kriittinen kysymys määriteltäessä ”matala” ja ”normaali” ilme on valinta asianmukaisen raja-arvo. Alkuperäisessä analyysien käytimme mediaani ilmaisun suhdelukuja katkaista välillä ”matala” ja ”normaali” ilmaisua, koska matalan riskin ja korkean riskin erottelu potilaiden oli sama. Kuitenkin validointi asettaa matalan riskin ja korkean riskin selviytymisen ryhmiä ole yhtä tasapainottavat (kaksi kolmasosaa versus yksi kolmasosa). Näin ollen katkaista arvoja käytetään näissä tietokokonaisuuksien ei ollut mediaani, mutta 33-persentiili.

Tässä tutkimuksessa käyttämällä genomin laaja integroiva analyysiin geenikopiomäärä ja ilmaisun pystyimme tunnistamaan ilmaisun HSP90 tärkeänä geeni alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää. HSP90 on kaperoniproteiinina mukana vakauttaminen useiden onkoproteiineja kuten EGFR, Her-2 ja Akt [28]. Viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että HSP90 on merkitystä säilyttää aktiivisen konformaation EGFR ja erityisesti EGFR-mutantit [29], [30]. Osoitamme tässä, että useat NSCLC solulinjat joissa villityypin EGFR ovat herkkiä HSP90 esto, mikä osoittaa, että estävää vaikutusta 17-AAG ei johtua ainoastaan ​​mutantti EGFR. HSP90 on hiljattain tunnustettu potentiaalinen syövän terapeuttisena kohteena ja tutkimuksia HSP90 estäjien ovat käynnissä [31], [32]. Tässä suhteessa, glioblastoomasolut yli-ilmentävät EGFR, mutta vastustuskykyinen inhibitiolle EGFR-kinaasin estäjät, olivat herkkiä HSP90 inhibition [33]. Näin ollen, vaikka Hsp90 voidaan vaatia vakauttaa yliekspressoitu tai mutantit EGFR, meidän tulokset tukevat aiempaa laaja-alainen ja monimutkainen rooli Hsp90 välittämisessä NSCLC kasvua ja selviytymistä. Alhainen nanomolaarinen herkkyys havaita 4 solulinjoissa testattiin kokeissa, on yhteistyössä toisen julkaisuja erittäin 17-AAG herkkä tuumorisolulinjoja [34] – [36]. Nämä pitoisuudet ovat helposti saavutettavissa potilailla pitkiä ajanjaksoja nykyisillä aikataulutus ja annosten [37].

Yhteenvetona havainto, että HSP90 ilmentymistaso on ennustetekijä varten NSCLC potilaiden eloonjäämisen (riippumatta EGFR mutaatiostatuksesta riippumatta ) yhdistettynä äärimmäisen herkkyys EGFR villityypin NSCLC-solujen Hsp90 -estäjä 17-AAG, viittaa siihen, että Hsp90-inhibiittorit voivat olla suurempia kliinistä käyttökelpoisuutta NSCLC kuin on aiemmin pidetty ja optio lisätutkimuksia riippuvuudesta muiden esikasvaintekijöiden päälle tämän kaperoniproteiinin NSCLC.

tukeminen Information

Taulukko S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001722.s001

(0,03 MB PDF) B

Kiitokset

Kiitämme Euroopan keuhkosyöpä konsortio tarjota microarray geenien ilmentyminen data 140 riippumatonta NSCLC potilaat; Alankomaat Cancer Institute: Sjaak hampurilaiset, Tony van de Velde; Medical University of Gdansk: Jacek Jassem, Amelia Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman; Medical University of Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Lech Chyczewski; Thoraxklinik Heidelberg: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann ja Hans Hoffman. Olemme myös antaa erikoisia kiitokset Sjoerd Vosse (Department of Pathology, VU University Medical Center, Amsterdam, Alankomaat) ja hyödyllisiä bioinformatiikan keskusteluihin ja Hans Gille (Kliinisen genetiikan, VU University Medical Center, Amsterdam, Alankomaat) suorittamiseksi MLPA analyysi.