Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime etukäteen sekvensointitekniikan on mahdollistanut kattavan profiloinnin geneettisiä muutoksia syövässä. Olemme perustaneet kohdistettu sekvensointialustamme käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tekniikka kliiniseen käyttöön, joka voi antaa mutaation ja kopioluvun vaihtelua tietoja. NGS suoritettiin pariksi-end kirjasto rikastettu eksonit 183 syöpään liittyvien geenien. Normaali ja kasvainkudoksessa paria 60 peräsuolen adenokarsinoomien käytettiin testaamaan toteutettavuutta. Somaattiset mutaatiot ja kopioluvun muutos analysoitiin. Kaikkiaan 526 somaattisen kuin synonyymi sekvenssivariaatioita löytyivät 113 geenejä. Näistä 278 yhden nukleotidin vaihtelu oli 232 eri somaattisten pistemutaatioita. 216 SNV olivat 79 tunnettujen yhden nukleotidin polymorfismien dbSNP. 32 indeleitä olivat 28 eri Indel mutaatioita. Mediaani määrä mutatoidun geenin per kasvain oli 4 (vaihteluväli 0-23). Kopioi vahvistuksenkertojan ( X2 kertainen) havaittiin 65 geenien 40 potilaalla, kun taas kopioluvun tappio ( X0.5 kertainen) havaittiin 103 geeniä 39 potilaalla. Yleisimmin muuttunut geenejä (mutaatio ja /tai kopioluku muutokset) oli

APC

35 potilaalla (58%),

TP53

34 (57%), ja

KRAS

24 (40%). Muunneltu geeni lista paljasti ErbB signalointireitin kuin yleisimmin mukana reitti (25 potilasta, 42%). Kohdennettu sekvensointialustamme avulla NGS tekniikkaa on mahdollista kliinistä käyttöä varten ja tarjoaa kattavat geneettinen muutos tiedot.

Citation: Han S-W, Kim H-P, Shin J-Y, Jeong E-G, Lee W-C, Lee K-H, et al. (2013) Kohdennettu sekvensointi syöpään liittyvien geenien peräsuolen syövän käyttäminen Next-Generation Sequencing. PLoS ONE 8 (5): e64271. doi: 10,1371 /journal.pone.0064271

Editor: Noam Shomronin, Tel Avivin yliopisto, Israel

vastaanotettu: 18 helmikuu 2013; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Korean Healthcare Technology R Perhe-, Korean tasavalta (A091081). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat haluavat ilmoittaa, että Jong-Yeon Shin ja Jong-Il Kim ovat konsultteja for Psoma Therapeutics ja Jeong-Sun Seo on konsultti Macrogen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Useita geneettisiä tapahtumia kertyy etenemisen aikana peräsuolen syövän synnyn [1]. On olemassa useita molekyyli- alatyyppejä paksusuolen syövän, mukaan lukien microsatellite epävakautta ja kromosomi-epävakaus [2], [3]. Kuitenkin alatyyppejä rajoitettu ennakoivaa tai ennusteen arvioinnissa ja eivät vaikuta hoidon päätöstä Metastasoituneessa. Sen sijaan

KRAS

mutaatio on tärkein yksittäinen ja laajalti käytetty molekyylitason -testi metastasoitunut kolorektaalisyöpä. Mutaatiostatuksesta asema

KRAS

ohjaa hoidon päätöstä, koska läsnäolo mutaatio voi ennustaa puute hyötyvät

EGFR

-targeted vasta [4].

Laajamittainen sekvensointi analyysit hyödyntäen tavanomaisia ​​sekvensointi menetelmiä on esittänyt geneettisen maisema paksusuolisyövän osoittaa, että on olemassa muutamia geeni ”vuoret” mutatoitunut suuri osa kasvaimia ja monta ”mäkiä” mutatoitunut harvoin [5], [6]. Lisäksi genominlaajuisia kopioluvun analyysi paljasti, että peräsuolen syöpä on vähemmän kopioluku muutoksia verrattuna rintasyövän [7]. Viimeaikaiset etukäteen sekvensointitekniikan käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on helpottanut analyysi koko genomin yksittäisissä syöpien ja tunnistaminen uusia geneettisiä muutoksia [8], [9]. Tutkimuksissa kolorektaalisyövän, novel toistuvat geneettiset fuusiot on havaittu [10], [11]. Kuitenkin suurin puute koko genomin tai exome sekvensointi lähestymistapa on tunnistaminen monia toiminnallisesti epäselviä, melko harvinainen, mahdollinen ”matkustaja” mutaatioita tuntemattomalla kliinistä merkitystä. Lisäksi suhteellisen alhainen kattavuus laajamittaisten lähestymistapa on rajoituksen herkkyys ja tarkkuus, mikä on tärkeä asia sovellettavaksi kliinisessä ympäristössä. Geneettiset muutokset tunnistetaan alhainen kattavuusanalyysi tarvitse todentaa käytettäväksi kliinisessä päätöksenteossa.

Kohdennettu sekvensointi voisi olla parempi vaihtoehto kliininen käyttö NGS tekniikkaa. Etuna kohdennettu lähestymistapa on kasvu kattavuus syvyys verrattuna koko exome lähestymistapaa vähentämällä geenien analysoitiin vastaava määrä emäsparia sekvensoitiin. Tämä mahdollistaa sukupolven luotettavien tietojen riittävän sekvensoimalla syvyys kohdennettua kiinnostavat geenit.

Olemme luoneet kohdistettu sekvensointialustamme avulla NGS teknologiaa, joka sisältää 183 geenit ja tarjoaa mutaatio ja kopioluvun vaihtelua tietoja. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata toteutettavuutta kohdennettuja sekvensointialustamme tulevalle kliinisen sovelluksen avulla peräsuolen kasvain kudoksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimusprotokolla tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (SNUH). Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus kudospankkeihin ja geenitestien ennen leikkausta. Tutkimus toteutettiin suositusten mukaisesti julistuksen Helsingin biolääketieteellisen tutkimuksen ihmiseen kohdistuvan.

Tutkimus yleiskatsauksen

yhteensä 183 geenien (taulukko S1) on valittu seuraavien kriteerien : tiedetään ennustaa vastaus, terapeuttisesti kohdistettavia, mukana suurissa signalointireitteihin, ja korkea mutaatio taajuus Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer tietokantaan (COSMIC). Tuore primaarikasvaimen ja viereisen normaali kudosnäytteet hankittiin SNUH Kasvain Bank. Näytteet deidentified ja kliinis-patologisten tiedot saatiin, kun kasvain Bank. DNA uutetaan kudoksesta lähetettiin Genome Medicine Institute, Seoul National University. Sekvensointi tulokset raportoitiin 3 viikon kuluessa (kuva S1).

Target rikastuminen genomi-DNA- ja sekvensointi

Genominen DNA uutettiin pariksi näytteistä käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Kolme mikrogrammaa DNA leikattiin käyttäen Covaris S2 (Covaris, Inc., Massachusetts, USA) ~250 nt 20%: n kuormituksella, taso 5 intensiteetti ja 200 jaksoa räjähtää 180 s. Viivakoodilla fragmentti sekvensointi kirjastot tehtiin käyttäen Parilliset-end DNA-näytteen valmistelu Kit (Illumina, Kalifornia, USA) ja Illumina multiplexing sovitin (Illumina) mukaan valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen ligaatio Illumina sovitin, kirjastot valmistettiin käyttämällä AMPure helmi (Beckman Coulter, Inc., Kalifornia, USA) sen sijaan, että geeli puhdistusta. Kirjasto laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Analyser ja DNA 1000-sirut (Agilent Technology, Kalifornia, USA). Suunnitella RNA syöttejä talteenotolle, käytimme COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic) ja Agilent Technologies eArray sivustosta (https://earray.chem.agilent.com/earray /). Kohdealueilla sisältyvät kaikki eksonit 183 geenien erilaisia ​​syöpiä ja kokonaispituus jää oli ~ 1 M. Syötit olivat 120 bp pitkä, ja keskimääräinen syötti kattavuus kunkin tukiaseman kohdealueen oli 2X. Me välttää standardin toista naamioitu alueiden lisäksi sallitaan kukin syötti päällekkäisiä toistuva alue jopa 20 bp. Havaitsimme myös sekvenssit sisällä toistuvia alueita, jotka olivat riittävän ainutlaatuinen palvelemaan kohtuullisena syöttejä. Ekvimolaarisen kahdeksan-Plex allas tuotettiin rikastukseen käyttämällä SureSelect Target Enrichment System Kit (Agilent Technology) ja modifioidun protokollan. Viisisataa nanogrammaa yhdistettyä DNA 5 ui (100 ng) mukautetun syötit käytettiin rikastamiseen, jossa esto oligonukleotidien spesifistä pariksi-end sekvensointi kirjastot ja 24-h hybridisaation. Biotinylated RNA kirjasto hybridit otettiin talteen streptavidiinihelmillä. Kaapattu kirjastot monistettiin ja sekvensoitiin sen Illumina Genome Analyser IIx 2 x 69 sykliä. Olemme linjassa tuloksena lyhyen järjestyksessä lukee vertailutasoon genomin (NCBI ihmisen genomin kokoonpano rakentaa 37) käyttäen Genominen Lyhyen lukea Nucleotide Alignment Program (GSNAP) linjausohjelmaan [12], jotka sallivat 5% yhteensopimattomuus huomioidaan PCR kaksoiskappaleet ja lukee, että ei tuoreinta vangiksi alueille viitteen genomin. Sekvensointigeelit Tiedot ladataan EBI Euroopan Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena/home) hakunumerolla ERP002442.

Yhden nukleotidin muunnos (SNV) ja Indel havaitseminen

kutsui genomista variantteja kunkin näytteen (SNVs ja lyhyt indeleitä) käyttämällä modifioitua kriteerit meidän aikaisemmin julkaistu kokonaisina Genomikartoituksen [13], [14]. Lyhyesti, SNVs ja indeleitä määriteltiin perustuen tyydyttävällä seuraavat kolme ehtoa: (1) määrä ainutlaatuisesti kartoitettu lukee siihen kohtaan pitäisi olla kaksi tai enemmän; (2) keskimääräinen pohjan laatu (

Phred

Q pisteet) tehtävään on 20; ja (3) luku–alleelin taajuus asennossa pitäisi olla 20%. Havaitsemista varten somaattisista mutaatioista (SNVs ja indeleitä) syövän kudoksissa, käytimme seuraavat ehdot: (1) nonsynonymous SNVs tai indeleitä syövän kudoksissa; (2) SNV alleeli määrä tulisi olla nolla kohdennettua järjestyksessä normaalin kudoksen; (3) villityypin alleelin määrä tulisi olla 10 tai enemmän kohdennettua järjestyksessä normaalin kudoksen; ja (4) ehdokas kantoja ei pitäisi olla polymorfismien mukaan dbSNP132. Toiminnallinen seuraukset romaani missense variantteja ennustettiin käyttämällä Lajittelu Intoleranssi peräisin Suvaitsevainen (SEULOA) [15]. Mutaatio

KRAS

varmistettiin käyttämällä Sangerin sekvensointia. Seuraavia alukkeita käytettiin: codon12 ja 13, eteenpäin 5′-CGTCTGCAGTCAACTGGAAT-3 ’ja reverse 5′-GAGAGTGAACATCATGGACC-3′; kodonin 61, eteenpäin 5’-CAGACTGTGTTCTCCCTTCTCA-3 ’ja reverse 5′-CTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3′; ja kodonien 146, eteenpäin 5’-TGGACAGGTTTTGAAAGATATTTG-3 ’ja reverse 5′- ATTAAGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3’. Kaikki sekvensointireaktiot tehtiin sekä eteen- että taaksepäin, ja kaikki mutaatiot vahvistettiin vähintään kahdesti riippumattoman PCR isolaateista.

Kopioi numero muutos

arvioitu kattavuutta geenien käyttämällä sekvensointia lukee kartoitettu kohdealueilla. Havaita kopioluvun muutos tietyn parin syövän ja normaaleissa kudoksissa, kattavuus kertainen suhteet (kasvain /normaali) 183 kohdegeeneissä laskettiin. Kun normalisointi askel harkitsee yhteensä lukea emäksiä saatu kustakin kudoksesta, kattavuutta kertainen suhdetta säädettiin arvioitiin kasvainsolu puhtaus kuvattu alla. Me määritelty, että geeni näyttää kopioi vahvistuksenkertojan kun sen kattavuus kertaiseksi suhde ≥2.0 ja menetyksen kun ≤0.5.

arvioida kasvain puhtaus, käytimme lukea laskee somaattisten SNVs tunnistettu. Kun otetaan huomioon, somaattisten SNVs kunkin syöpäkudoksessa, on oletettu, että syöpä muodostuu suuri kloonin ja SNVs ovat peräisin klooni. Lisäksi olemme pitäneet SNVs kuin heterozygootit joiden alleelin taajuus on 0,5. Näillä oletuksilla, kasvaimen puhtaus arvioitiin seuraavasti. Odotettu määrä villityypin lukee peräisin syövän kloonin ja normaalit solut laskettiin. Sitten osuus villityypin plus SNP lukea laskee syöpä kokonaismäärästä luku laskee pidettiin vastaava kasvain puhtautta. 3 näytettä, jolla ei ollut kasvainta erityisiä SNV, mediaani 57 näytteiden analyysissä käytetyt kopioluvun muunnelmia.

Kopioi numero muutos vahvistettiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä iCycler IQ tunnistusjärjestelmä ( Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) käyttämällä SYBR vihreä I (Molecular Probe, Eugene, OR) kolmena kappaleena reaktioita. Käytetyt alukkeet PCR-reaktiossa olivat seuraavat:

ErbB2:

, eteenpäin 5′-TGCTGGAGGACGATGACATG-3 ’ja reverse 5′-CTGGACAGAAGAAGCCCTGC-3’;

SRC

, eteenpäin 5’CGGTTACTGCTCAATGCAGA-3 ’ja reverse 5′- CAAGAGCGCTCGTACCTTTC-3’;

TP53

, eteenpäin 5′-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3 ’ja reverse 5’ACTGACCGTGCAAGTCACAG-3’;

PTEN

, eteenpäin 5’TGGCACTGTTGTTTCACAAG-3 ’ja reverse 5’TGTTCCAATACATGGAAGGATG-3’;

BRCA1

, eteenpäin 5’GTTTGCCAGAAAACACCACA-3 ’ja reverse 5′-TTTATGCAGCAGATGCAAGG -3’;

BRCA2

, eteenpäin 5′-TGCCTGGCCTGATACAATTA-3 ’ja reverse 5’TTGCTGCTTCCTTTTCTTCC-3’; ja

ACTB

, eteenpäin 5′- AGAGCTACGAGCTGCCTGAC ja reverse 5’GGATGCCACAGGACTCCA-3 ’. Fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) analyysi

erbB2 Twitter /CEP17 suoritettiin käyttäen PathVysion Kit (Vysis, Downers Grove, IL) mukaan valmistajan ohjeiden.

mikrosatelliitti tila

microsatellite tilan kunkin kasvaimen määritettiin tutkimalla 5 mikrosatelliittimarkkerin (D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, ja BAT26), kuten aiemmin on kuvattu [16]. Joko eteen- tai taaksepäin aluketta kullekin markkeri leimattiin fluoresenssi, ja PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa ja analysoitiin. Olemme luokiteltu MSI tila seuraavasti: MSI-korkea, epävakaus kahdessa tai useammassa mikrosatelliittimarkkerin, MSI-alhainen, epävakauden yksi merkki, ja MSS, ei epävakautta merkki.

Pathway analyysi

Pathway analyysi suoritettiin geenien joilla mutaatio tai kopiomäärän muuttaminen kunkin kasvaimen käyttää Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID) bioinformatiikan Resurssit versio 6.7 hyödyntämällä koulutusjakson tietokantoja BBID, BioCarta, ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) [17 ]. Toiminnallinen merkintä kaavion DAVID luotiin käyttäen ihmisen genomista tausta, ja raja-arvot lasketa 2 ja EASE pisteet kuin 0,1.

Tulokset

Potilaan ominaisuuksista ja sekvensointi profiili

Potilaiden ominaisuudet ovat kuten kuvattu taulukossa 1. Pariksi yksilöitä ensisijaisen peräsuolen kasvain ja vieressä normaali limakalvo poistaa käytön aikana käytettiin analyysiin.

keskiarvo kattavuus 120 tutkitusta näytteestä was175X (alue 99X-435X) (Taulukko S2). Se oli 181X (100X-435X) kasvaimen ja 170X (99X-312X) normaali limakalvo. Kasvainsolun prosenttiosuus tuumorinäytesylinterin voitaisiin arvioida käyttämällä kasvainspesifistä SNVs 57 näytettä. Mediaani prosenttiosuus oli 71% (vaihteluväli 42-100).

Mutaatiot

yhteensä 532 somaattisten nonsynonymous vaihtelut 113 geenien havaittiin (kuva 1). 494 yhden nukleotidin vaihtelut havaittiin 106 geeniä 60 potilasta ja 38 Indel mutaatioita (11 insertiot ja 27 poistot) 19 geenien 21 potilaan (taulukko S3).

SNV, yhden nukleotidin vaihtelu; SNP, yhden emäksen monimuotoisuus; NMD, ei-sense välittämä rappeutuminen.

Niistä 494 SNVs, 278 vaihtelu oli 232 eri pistemutaatioita (67 aiemmin raportoitu mutaatioita ja 166 uusia mutaatioita) ja 216 aiemmin raportoitu 79 eri polymorfismien dbSNP .

Pistemutaatiot koostuu 43 nonsensemutaatiota ja 189 missensemutaatioita. Löysimme 2 toistuvia uusia mutaatioita,

JAK1

c.1595C T (p.R532H) 2 potilaalla ja

EWSR1

c.1769A C (p.Q590P) in 2. Pistemutaatiot olivat useimmin havaittu

APC

(32 mutaatiot 29 potilasta), jonka jälkeen

TP53

(27 27),

KRAS

(24 24),

TTN

(36 21), ja

FBXW7

(15 14) (taulukko 2).

32 Indel mutaatiot olivat 3 tunnettuja mutaatioita ja 25 uusia mutaatioita , jotka olivat 2 yksinkertaisia ​​deleetioita aminohapon, 26 lukukehysmutaatioita. Niistä lukukehysmutaatioita, 14 ennustetaan johtavan nonsense välittämän rappeutuminen. 3 novel Indel mutaatiot toistuvasti havaittu:

ACVR2A

c.1303delA (p.K435fs) 3,

TGFBR2

c.449_450delAA (p.E150fs) 2, ja

BLM

c.1536delA (p.G512fs) in 2.

mediaani määrä mutaatio ja mutatoitunut geeni per kasvain oli 4,5 (vaihteluväli 0-32) ja 4,0 (0-23), tässä järjestyksessä. Yleisimmin mutatoituja geenejä

APC

(35 potilasta),

TP53

(27), ja

KRAS

(24). Suoritimme Sanger sekvensoinnin validointi

KRAS

mutaatio ja kaikki mutaatiot tunnistetaan NGS vahvistettiin.

Kopioi numero muutoksiin

Kopioi numero havaittu muutosta 132 geenien ja 51 kasvainten (85%) (kuvio 2 ja taulukko S4). Kopioi vahvistuksenkertojan ( X2 kertainen) havaittiin 65 geeniä 40 kasvaimista ja kopioluvun tappio ( X0.5 kertaisesti) 103 geeniä 39 kasvaimista. Niistä kasvaimet osoittaa kopioluvun muutos, mediaani määrä geenien oli 6 (vaihteluväli 1-44). Geenit useimmin osoittaa kopiomäärä voitto oli

SRC

(15 potilasta),

MAFB

(15),

TOP1

(14),

RECQL4

( 13), ja

Gnas

(13). Paitsi

RECQL4

sijaitsee kromosomissa 8q24, muut 4 geenit sijaitsevat 20q 11-13. Geenit näytetään usein menetys oli

TP53

(13 potilasta),

Smad2

(12),

Smad4

(12),

MAP2K4

(11),

BCL2

(11),

WRN

(10), ja

DCC

(10).

TP53

ja

MAP2K4

sijaitsivat 17p12-13, kun taas

Smad2

,

Smad4

,

BCL2

, ja

DCC

sijaitsivat 18q21, ja

WRN

sijaitsevat 8p12. Kvantitatiivinen RT-PCR käytettiin validointi kopioluvun muuttaminen

SRC

,

ErbB2

,

TP53

,

PTEN

ja

BRCA2

edustavissa näytteissä ja osoitti vertailukelpoisia arvoja.

ErbB2

edelleen validoitu käyttämällä FISH (kuva 3).

Näytteet linjassa mukaan näytteen tunnusnumero Y-akselilla ja geenit ovat linjassa mukaan kromosomaaliseen sijaintiin X-akselilla.

* Arvot ovat kattavuutta kertainen suhteet ole sovitettu kasvain puhtautta. Edustavia kuva FISH-analyysi

erbB2

(punainen) ja CEP17 (vihreä) osoittaa monistaminen

erbB2

.

Yhdistetty geneettiset muutokset

yhdistäminen mutaatio ja kopioluvun tiedot,

APC

oli geeni yleisin geneettinen muutos (35 potilasta). Kolme potilasta oli kopiomäärä menetys

APC

, mutta 3 kasvaimissa oli myös Indel mutaatioita. Mikäli

TP53

, 6 potilasta samanaikaisesti oli pistemutaatio ja kopioluvun menetys ja 7 potilaalla oli kopiomäärä menetys ainoana geneettinen mekanismi

TP53

inaktivoitumista. Ei ollut kopioluvun muutos

KRAS

. Kuitenkin, kopioiden määrä voitto

HRAS

todettiin 6 potilasta.

MSI-H kasvaimet yleensä on suurempi määrä geenejä mutaation verrattuna MSS /MSI-L (keskiarvo 10,8

vs

. 3,9, vastaavasti;

p

= 0.11 t-testi) ja pienempi määrä geenejä, joiden kopioluvun muutos (keskiarvo 3,2

vs.

8,6, vastaavasti;

p

= 0,22 t-testi). MSI-H kasvaimet olivat korkeampia taajuuksia geneettisten muutosten

ACVR2A

(1,9% MSS /MSI-L

vs.

50,0% vuonna MSI-H

p

= 0,002),

MLH1

(3,7%

vs.

33,3%,

p

= 0,046),

MSH6

(1,9%

vs.

33,3%,

p

= 0,024),

SPTAN1

(0%

vs.

33,3%,

p

= 0,008), ja

TGFBR2

(1,9%

vs.

33,3%,

p

= 0,024). Sen sijaan, geneettiset muutokset on

TP53

(63,0%

vs.

0%,

p

= 0,005) useammin havaittiin MSS /MSI-L kasvaimia.

Voisimme myös tunnistaa geneettisiä muutoksia, jotka voisivat olla mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia (taulukko 3).

ErbB2

kopioi vahvistuksenkertojan tunnistettiin 4 potilaalla (alue X2.0-X71.5) ja

ErbB2

pistemutaatio 5 potilaalla (1 potilaalla oli kopiomäärä voitto ja pistemutaatio). Geneettisten muutosten

BRCA1

ja

BRCA2

havaittiin 4 potilaalla:

BRCA1

tappio (X0.49),

BRCA1

pistemutaatio,

BRCA2

tappio (X0), ja

BRCA2

deleetiomutaation 1 potilaalla kussakin.

EGFR

kopioi vahvistuksenkertojan todettiin 4 potilaalla (alue X2.0-8.2).

PIK3CA

pistemutaatio todettiin 4 potilaiden ja

PTEN

menetys ja pistemutaatio 4 potilasta (alue X0-X0.49) ja 1 potilas, vastaavasti.

Pathway analyysi

yhteensä 33 potilasta (55%) oli mahdollinen voitto-of-function muutoksen

RAS Twitter /

RAF

polku: 20 potilasta, joilla

KRAS

mutaatio vain, 3

KRAS

mutaatio ja voitto

HRAS

, 1

KRAS

mutaatio ja

BRAF

mutaatio, 3

sääntelyviranomaisten

mutaatio, 2

HRAS

voitto, 2

BRAF

mutaatio, 1

BRAF

mutaatio ja

HRAS

vahvistus, ja 1

RAF1

voitto.

analysoimalla listan muuttuneen geenien (mutaatio ja kopion numero muutos) käyttäen DAVID toiminnallinen huomautustyökaluja, jotka liittyvät polku todettiin 53 potilaalla (taulukko S5) . Mediaani määrä koulutusjakson potilasta kohden oli 19 (vaihteluväli 3-70). Ilman sairauteen liittyvien reittien (esim peräsuolen syöpä), ErB signalointireitin (Kegg hsa04012) oli yleisin mukana polku (25 potilasta, 42%).

Keskustelu

tulevalle aikakaudelle henkilökohtaisen lääketieteen syövän hoitoon, on tärkeää saada tarkkaa geneettistä tietoa yksilön syövän. Määrä geneettisen tiedon jo ohjaa hoitopäätökset päivittäisessä käytännössä. Esimerkkejä kohtelu kiinteiden kasvainten kuuluvat

erbB2

(HER2) geenivahvistus rinta- ja mahasyövän,

EGFR

mutaatio ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ja

KRAS

mutaatio peräsuolen syöpä [18], [19], [20], [21]. Henkilökohtainen syövän hoidossa pyritään alkuvaiheen lääkekehityksen kun on tavoitearvojen [22]. Kuitenkin monet kohdennettujen aineiden kehitteillä ei ole prediktiivisten biomarkkereiden. Perusteellista tietoa geneettisen potilaan asemaan kirjoilla osaksi alkuvaiheen kliinisten kokeiden ja analysointi yhdessä vaste saattaa kiihdyttää kohde potilaan henkilöllisyys.

Olemme luoneet kohdistettu sekvensointialustamme käyttää NGS teknologiaa tarjota kattavia geneettistä tietoa yksittäisille potilaille. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että NGS perustuvia kohdennettuja sekvensointialustamme on mahdollista kliinistä käyttöä varten. Vaikka emme vahvista jokainen geneettinen muutos tunnistettu, validointimenettelyssä on

KRAS

mutaatio ja edustava kopioluvun muutoksia (kuva 3) osoittaa, että tulokset alusta on luotettava. Lisäksi profiilia yleisesti mutatoitujen geenien ja kuvio geenikopiomäärä muuttaminen (voitot 8q ja 20q ja tappiot 8p, 17p ja 18q) ovat yhdenmukaisia ​​etukäteen tietoa geneettisiä muutoksia kolorektaalisyövässä [23].

Suurimmat etuna NGS perustuvia kohdennettuja sekvensointialustamme on, että tiedot koskevat useiden geenien ja useita geneettisiä muutoksia (pistemutaatio, Indel mutaatio, ja kopioi numero muutos) synnytetään yhdellä koe. Sekvensointigeelit alusta tarjoaa mutaatio ja kopioluvun muutos data vaatii vähemmän määrän DNA: n tai kudosten ja kustannuksia verrattuna testattaessa geneettinen muutos sekvensoimalla tai FISH joita yleisesti käytetään nykyisessä päivittäin käytännössä. Lisäksi ylivoimainen herkkyys yli Sangerin sekvensoinnin voidaan saada lisäämällä kattavuus syvyys, erityisesti tapauksissa, joissa pieni kasvain puhtaus.

Lisäksi

KRAS

mutaatio, mutaatio muiden geenien koulutusjakson (

BRAF

,

sääntelyviranomaisten

, ja

PIK3CA

) on myös haitallinen vaikutus vastauksena setuksimabin [24]. On todennäköistä, että tutkitaan useita geenejä reittiin voi myös parantaa vasteen ennustamiseksi kohdistettujen hoitojen. Kohdennettu sekvensointialustamme on ihanteellinen vaihtoehto arvioida useita geenejä samaan aikaan. Lisäksi

KRAS

mutaatio, geneettisten muutosten

sääntelyviranomaisten

,

HRAS

,

BRAF

, ja

RAF1

löytyivät peräsuolen syövän analysoidut näytteet tässä tutkimuksessa.

löytäminen harvinaista geneettinen muutos voi tarjota uusia hoitovaihtoehto yksittäisen potilaan. Esimerkiksi potilailla, joilla on kasvaimia, joilla on

ErbB2

kopioluvun vahvistus voi hyötyä

ErbB2

-targeted aineita ja kasvaimet, joissa on mutaatio tai menetys

BRCA1

tai

BRCA2

alkaen PARP-inhibiittorit. Lisäksi geneettiset muutokset tai mukana reitti voi ohjata valintaa varhaisen vaiheen kliinisessä tutkimuksessa potilaat kirjoilla. Potilaat, joilla muuttaminen

RAS /RAF

polku saattaa olla paremmat mahdollisuudet hyötyä osallistumalla Kliinisessä tutkimuksessa estäjien kohdistaminen reitin.

Jotta voidaan havaita useita mutaatioita tiiviimmän herkkyys, massaspektrometria pohjainen mutaatio havaitseminen alusta on käytössä [25]. Kuitenkin vain rajoitettu määrä ennalta määritetyn mutaatioita voidaan havaita ja kopioluvun muutos ei voi havaita alustan. Siksi kohdennettuja sekvensointialustamme avulla NGS on ylivoimainen kannalta geneettisen tiedot ja joustavuus muodostavat geenin sarjat analyysiä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet käyttökelpoisuutta kohdennettuja sekvensointi lähestymistapaa tai NGS kliinisessä ympäristössä [9], [26], [27].

Major rajoita esillä tutkimus on, että alusta ei kykene havaitsemaan -fuusiogeenit ja vain tuore kudosta käytettiin analyysiin. Havaitseminen fuusio geenit voivat olla päällä lisäämällä heikko kattavuus RNA sekvensoinnilla. Olemme muuttaneet kokeellista menetelmää käyttää formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudosten ja on saatu samanlainen herkkyys. Olemme parhaillaan hyödyllisyyttä kohdennettujen sekvensointialustamme prospektiivisessa tavalla kliinisessä työssä. Tutkimuksessa käytetään joko tuoreena tai FFPE kudosten ja olemme modifioitu geeni lista edustaisi paremmin druggable reittejä ja lisääntynyt kattavuuden syvyys ( X500).

Yhteenvetona kohdennettuja sekvensointialustamme avulla NGS teknologiaa pystyi tarjoamaan kattavan geneettisen muutos tietojen peräsuolen kasvain näytteet ja voidaan käyttää kliinisessä ympäristössä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Study ääriviivat.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s001

(TIF) B Taulukko S1.

Gene lista.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s002

(XLSX) B Taulukko S2.

Kattavuus.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s003

(XLSX) B Taulukko S3.

geneettiset muutokset kohti potilasta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s004

(XLSX) B Taulukko S4.

Kopioi numero muutoksiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s005

(XLSX) B Taulukko S5.

DAVID polkuja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0064271.s006

(XLSX) B