Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

diabetes liittyy haimasyöpä. Oletimme rooli haiman tähtisolut (PTK) on hyperglykemia aiheuttama heikkeneminen haimasyövän ja siksi tutkittiin kahden ihmisen solulinjoja (RLT-PSC, T3M4) in hyperglykeemisessä ympäristössä.

Menetelmät /Principal Havainnot

vaikutus krooninen hyperglykemia (CHG) on PSCs tutkittiin mRNA ilmaisun array reaaliaikaisella PCR validointi ja bioinformatiikan polku analyysi, ja vahvistava proteiinin tutkimuksiin. Stressi kuidunmuodostukseen (IC: αSMA) osoitti, että PSCs taipumus transdifferentiate on myofibroblastin kaltainen tila altistumisen jälkeen CHG. Fosforylaatio p38 ja ERK1 /2 korotettiin peräkkäisen säätelyä CDC25, SP1, talousjohtajien ja p21, ja downregulation PPARy jälkeen PSCs altistui krooninen hyperglykemia. CXCL12 nousivat merkittävästi PSC supernatantissa jälkeen CHG altistuksen riippumatta TGF-β1 hoito (3,09-kertaisesti 2,73-kertainen ilman TGF-β1, p 0,05). Upregualtion SP1 transkriptiotekijän PSCs jälkeen CHG altistus voi olla osallinen lisääntynyt CXCL12 ja IGFBP2 tuotantoa. Syöpäsoluissa, hyperglykemia indusoi lisääntyneen ekspression CXCR4, joka on CXCL12-reseptori, joka indusoitui myös PTK: n kunnostettua alustaa. Reseptori-ligandi-vuorovaikutuksen lisäsi fosforylaatiota ERK1 /2: n ja p38 johtaa aktivaatioon MAP-kinaasireitin, yksi tehokkaimmista ärsykkeiden solujen proliferaatiota. Varmasti, väliaine PSC lisääntynyt haimasyövän soluproliferaatiota ja tätä vaikutusta voitaisiin osittain estävä vaikutus CXCR4 estäjä. Koska PSC väliaine (normaali glukoosipitoisuus) kasvatti ERK1 /2 ja p38 fosforylaatio, päättelimme, että PSCs tuottavat muu tekijä (t), jotka vaikuttavat (t) haimasyövän käyttäytymistä.

Johtopäätökset

Hyperglykemia indusoi kasvoi CXCL12 tuotantoon on PSCs, ja sen reseptorin, CXCR4 syöpäsoluja. Ligandi-reseptori-vuorovaikutuksen aktivoi MAP-kinaasin signalointia, joka aiheuttaa lisääntynyttä syöpäsolujen proliferaatio ja migraatio.

Citation: suudella K, Baghy K, Spisák S, Szanyi S, Tulassay Z, Zalatnai A, et al. (2015) Krooninen Hyperglykemia indusoi Trans-erilaistuminen Ihmisen Haiman tähtisolut ja Parantaa pahanlaatuiset Molecular Kommunikointi ihmisen haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (5): e0128059. doi: 10,1371 /journal.pone.0128059

Academic Editor: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 28 tammikuu 2015; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2015 Julkaistu: 26 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 kiss et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja. Kaikki mikrosirujen tulokset ladataan Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta kartat (hakunumero: GSE59953).

Rahoitus: Tämä tutkimus on tuettu osittain OTKA 100904 avustusta. Tasapaino tuki tuli: School of Ph.D. Studies, Semmelweis University, Unkari. Kirjoittajat eivät olisi olisi voinut tehdä mitään näistä kokeista ilman lahjakas materiaalit seuraavasti: JML, RJ siirsi ikuisti ihmisen haiman tähtisolut (RLT-PSC) solulinjan Semmelweis University alle MTA sopimuksen. T3M4 ihmisen haiman adenokarsinooma solulinja oli ystävällinen lahjoitus Euroopan haima Centerin Heidelbergissä. Reagenssit käytettiin mRNA: n ilmentymisen array oli ystävällinen lahja GF, kuten AMD3100 ja reagenssit, joita käytettiin arvioimaan CXCL12, IGFBP2, CXCR4, CXCR7 on proteiini ja mRNA-tasoja. Rahoittajat at OTKA ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: GF on lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia intressejä: JML, RJ, GF on vireillä patenttihakemus P1300509 (PCT /HU2014 /00007), joka on aineellisia merkitystä tässä käsikirjoitus on. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. OTKA avustuksia ei osallistunut rahoitukseen kokeiden johti P1300509 (PCT /HU2014 /00007) sovellus eikä vaikuttanut muunlaista siihen.

Johdanto

epidemiologisia tutkimuksia ja niiden meta -analyses perustettiin selvää näyttöä yhdistyksen välillä diabeteksen (DM) ja haimasyövän (PAC) ja totesi, että DM ei ole vain aikaisin ilmentymä, mutta myös etiologinen tekijä PAC. [1] Carstensenin ja työtoverit perustuvat tiedot yli 4 miljoonan htv vahvisti yhdistyksen välillä tyypin 1 DM (T1DM) ja PAC ja totesi, että suuri karsinogeeninen vaikutus ulkoisen insuliinin on epätodennäköistä T1DM. [2]. Vuonna yleisempiä tyypin 2 DM (Tyypin 2 diabeteksen) yhdistys Pac näkyy myös näkemyksen meta-analyysi 36 tutkimuksissa [3].

Mahdollinen kohortin raportoitu, että kohonneet paastoverensokerin (FPG) tasot ovat riskitekijöitä PAC [4]. Lisäksi annos-vaste meta-analyysi saatuja tietoja 2408 PAC potilaista vahvisti, että jokainen mmol /l lisäystä FPG jo yli 4,1 mmol /l liittyy 25% lisäys määrä haimasyövän [5]. Vuonna riskimalli käyttää henkilöiden lisääntynyt riski haimasyövän, diabetes 3 vuotta aiheutti samanlaisen riskin kuin, suvussa haimasyövän väestössä [6]. Haimasyöpä, joista 90% tapauksista ovat adenokarsinooma, tarkoittaa kurja ennusteen osalta 5 vuoden selviytymisen 7% [7]. Tämä tarkoittaa ainutlaatuisen korkea tarvetta ymmärtää paremmin sen molekyyli patologian.

Huolimatta määrä tukea epidemiologisiin tutkimuksiin solu- ja molekyylitason mekanismeja evoluution tämän järjestön välillä DM ja Pac on epäselvempi. Siksi hypoteesi, että krooninen hyperglykemia lisäksi suoraa vaikutusta syöpäsoluihin voivat myös epäsuotuisasti muuttaa välistä viestintää syöpäsoluja ja microenvironment, etenkin haiman tähtisolut jotka ovat merkittäviä solujen peruskudoselementeistä PAC. Seuraukset fibroblasti aktivointi-prosessi ohjaa alunperin muuttamalla kasvutekijä beeta (TGF-β) kehittyi parantaa haavojen paranemista-ovat epäedullisia syöpäsairaus [8]. Kokeellinen tiedot osoittivat, että kasvainten vastainen immuniteetti tukahdutettiin stroomasolut ilmentävien fibroblastien aktivoitumista proteiinia (FAP) ja ainetta kohdistaminen FAP-ilmentävien solujen parannettu kasvaimia torjuvaa immuniteetti [9]. Tämä konsepti on hiljattain vastustanut perustuvat havaintoihin kanssa αSMA + myofibroblastin poistettu siirtogeenisiä hiiriä haimasyövän malli viittaa vieläkin monimutkaisempaan sääntelyä [10].

Haiman tähtisolut (PSCs) aktivoinnin trans-erilaistuvat myofibroblasteja -kuten solut, jotka ovat merkittävin lähde solunulkoisen matriisin (ECM) proteiinin kertymistä aikana kudosfibroosi [11-13]. Haiman adenokarsinooma on tunnusomaista runsas desmoplastic strooman seurauksena PSC aktivointi [14].

on voimakas välistä viestintää kasvaimeen liittyvien PSCs ja syöpäsoluja. Aktivoitu PSCs vapauttaa erilaisia ​​kasvutekijöitä, sytokiineja ja kemokiinien, jotka edistävät pahanlaatuinen käyttäytymistä haimasyöpäkasvainsoluissa, on avainasemassa syövän kehittymistä ja kasvua [15-18] Aktivoidut setllate soluja suojaavat myös haiman kasvain säteilyltä-ja gemcitabine- aiheuttama apoptoottinen vaikutus [19]. PSCs välillisen yhdessä viljelemisen parannettu kantasolun fenotyyppejä syöpäsolujen ja indusoi ilmentymistä syövän kantasoluja liittyviä geenejä, viitaten rooliin syövän kantasolujen kapealla [20].

arvioi vastetta ihmisen PSCs alttiina krooninen hyperglykemia (CHG, 21 päivää), käyttäen monivaiheista lähestymistapaa tunnistaa molekyyli polkuja, jotka voivat säädellä PSC aktivointi. Pac-solut myös suoraan arvioitiin altistuessaan hyperglykemiaa tai ilmastoitu PSC viljelyalustaan ​​(CCM).

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, soluviljelmissä

Kaikissa kokeissa olemme käytetyt RTL-PSC ja T3M4 ihmisen solulinjoissa. RLT-PSC on ihmisen haiman stellate solulinjaa, joka oli aiemmin kuolemattomiksi transfektoimalla SV40 large T-antigeenin ja ihmisen telomeraasin (hTERT) ja analysoitiin stellate solumarkkerien [13]. Lisäksi T3M4 ihmisen haiman adenokarsinooma solulinjaa käytettiin joka oli ystävällinen lahja Euroopan haima Center Heidelberg [21].

PSC-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Dulbeccon Modified Eagle Medium, Sigma, St. Louis, MO) ja 1000 mg /l (5,5 mmol /L) glukoosipitoisuus, T3M4 soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Sigma) sekä täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma) ja 1% penisilliini /streptomysiini ( Sigma). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2: n ja siirrostettiin 85-90% konfluenssiin käyttämällä trypsiini-EDTA-liuosta (Sigma).

kasvutekijät ja muut yhdisteet

transformoiva kasvutekijä β1 (TGF-β1, Sigma) lisättiin 5 ng /ml lopullinen pitoisuus soluihin. AMD3100 octahydrochloride hydraatti (2 ug /ml, Sigma) käytettiin estämään CXCR4-reseptoriin. Aikana solumigraation arviointi soluja käsiteltiin mitomysiini C (10 ug /ml, Sigma, osanumero .: M4287) estämään solujen proliferaatiota. BSA (naudan seerumialbumiini, Sigma, osanumero .: A3294) käytettiin spesifinen esto in useita menetelmiä.

Hoitoaikataulu PSC ja T3M4 solujen

PSCs olivat altistuneet CHG ja TGF- β1 seuraavalla protokolla:

”ohjaus” olosuhteet soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla. Tapauksessa ”suuren glukoosipitoisuuden” hoito-soluja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi 15,3 mmol /L glukoosia 3 viikkoa (21 päivää), kuten alustavat kokeet osoittivat paras vastaus ECM-proteiinin tuotanto tällä ajassa. Sen jälkeen soluja ilman ravintoa 24 tuntia FBS-väliaineessa ja sen jälkeen 48 tuntia FBS-alustassa tai ilman TGFp 1 verrata vaikutukseltaan Muut. Kaksi biologista yhtäläisyyksiä käytettiin kunkin hoito.

Soluja kasvatettiin T75-pulloissa, kerättiin ja käytettiin mRNA: n ja proteiinin analyysi, soluviljelmän alusta kerättiin proteiinin analyysiin. Immunosytokemiaa soluja kasvatettiin peitinlaseilla 6-kuoppalevyillä. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

T3M4-soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin T75-pulloihin, sitten nälässä yön yli FBS-vapaa RPMI. Tämän jälkeen viljelyväliaine, joka sisälsi PSC-CCM ja RPMI, jossa on 10% FBS: ää 50% -50% suhde lisättiin soluihin 48 tuntia. Kuten valvonnan T3M4 kokeita FBS-DMEM (5,5 ja 15,3 mM glukoosipitoisuus) lisättiin rinnakkain täyden FBS RPMI. 48 tunnin kuluttua hoidon T3M4 solut ja soluviljelmän supernatantit kerättiin proteiinin tutkimuksiin.

valmistaminen soluviljelynesteestä (CCM) B

valmistettu CCM RTL-PSCs viljelemällä niitä T75- pulloissa 12 ml: lla DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää 3 päivää. DMEM 1000 mg /l (5,5 mmol /L) tai 2750 mg /l (15,3 mml /l) glukoosia käytettiin. CCM kerättiin kustakin pullosta, steriili suodatettiin, ja säilytettiin 20 ° C: ssa käyttöön asti.

mRNA: n ilmentymisen array

Kokonais-RNA eristettiin (Mean RNA Integrity määrä [RIN] = 9,2 ± SD 0,4) käyttäen RNeasy (Qiagen, Hilden, Saksa). Kaksi biologista kaksoiskappaleet yhdistettiin kussakin ryhmässä ja kaksi teknistä kaksoiskappaleet hybridisoitiin jokaisesta yhdistettyä näytettä ryhmän päälle GeneChip- PrimeView Human Gene Expression Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Biotinyloitu monistettu RNA (Arna) koettimet syntetisoitiin 200 ng kokonais-RNA käyttäen 3 ’IVT Express Kit (Affymetrix). Merkityt Arnas Sitten puhdistettu ja hajanainen myöhempää hybridisaatiota. Fluoresoivat signaalit skannataan GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix). Tiedot poimittiin CEL tiedostot ”R” pinta Bioconductor ohjelmistopaketteja. Tukeva Multichip keskiarvo (RMA) normalisoinnin tehtiin ja tiedot muutettiin loki2 merkintätapa tehdä Feature valinta Lineaarinen ja SAM käyttämällä ”Limma” ja ”samtools” paketteja. Kaikki mikrosirujen tulokset ladataan Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta kartat (hakunumero: GSE59953).

Geenien ilmentyminen arvot kummallakin hoitoryhmään rankattiin heidän differentiaalikaavojen verrattuna näytteisiin eristetty ”ohjaus” PSCs . Kahdet geenejä, top 100 ja 300 valittiin antamaan parhaan erottaminen. (P-arvo: 10-4, Statistica- ohjelmistoversio 8, T-testi).

Bioinformatics /Pathway analyysi

MetaCore (Thomson Reuters) reitin tietokanta integroitu ohjelmisto käytettiin toiminnallista analyysiä mRNA ilmaisun microarray data [22]. Tämä analyysi tarjosi alustavan listalla signaalinvälitysreittien jotka todennäköisimmin muutettu PSCs jälkeen CHG altistuksen. Olemme valinneet 14 differentiaalisesti ilmentyvien geenien näistä suuntautumisen verkostojen edelleen reaaliaikaisen RT-PCR validointi, perustuu niiden mahdollisiin yhdessä diabetes tai panos PSC aktivointia, saareke erityisiä fibroosi tai haimasyöpä.

Reaaliaikainen RT PCR-vahvistus

ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: ta käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen Life Technologies Carlsbad, CA, USA) olosuhteissa valmistajan suosittelemia. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI Gene Expression Taqman (S1 taulukko.) Ja TaqMan Universal PCR Master Mix (osanro 4324018) ABI 7000 Sequence Detection System, kaikki hankkia Applied Biosystems Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) olosuhteissa valmistajan suosittelemia. Näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena 20 ul: n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 50 ng cDNA: ta [syklin olosuhteissa: denaturointi: 95 ° C (10 min), jota seurasi 40 sykliä: 95 ° C (15 s), hehkutus + laajennus: 60 ° C (1 min)] . Tulokset standardoitu 18S rRNA (osanro 4319413E). Cycle kynnys (CT) arvot rekisteröitiin ja suhteellinen geeniekspressioiden laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmällä.

Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) B

Type-1 ja tyyppi- 3 kollageenia sisältö arvioitiin käyttäen epäsuoraa ELISA-järjestelmän. Levyt päällystettiin yön yli soluviljelmän supernatanttia 4 ° C: ssa. Kun oli salvattu 3% w /v BSA: ta, ensisijainen vasta-aineita käytettiin yön yli 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, sopivan sekundäärisen vasta-ainetta. (Vasta-tiedot ja laimennuksia levitetään on merkitty S2 taulukossa.) Signaalit saavutettiin lisäämällä 3,3 ’, 5,5’- tetrametyylibentsidiiniä (Sigma, osanumero .: T0440), reaktio pysäytettiin 1,6 N rikkihappoa. Absorbanssi rekisteröitiin 450 nm: ssä (Labsystems MULTISCAN MS, Thermo Labsystems, Milford, MA, USA).

kvantifiointi CXCL12 ja IGFBP2 solujen supernatantista suoritettiin käyttäen Solid Phase Sandwich ELISA Kit (Quantikine R 0,05) ja ilman (3,47-kertainen ja 2,35-kertainen p 0,05) ennen CHG altistuminen.

Kun PSCs altistettiin vain CHG, lisääntymässä tyypin 1 ja -3 kollageenin tuotantoa (1,41-kertainen ja 1,40-kertainen) havaittiin (kuvio 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että krooninen hyperglykemia saattaa osaltaan PSC aktivointi ja liiallinen ECM tuotantoa.

Lisääntynyt α-SMA ja tyypin 1 kollageeni ilmaus löydettiin immunosolukemialliset jälkeen PSCs altistettiin sekä 21 päivän hyperglykemia tai 48h of TGF-β1

(a)

. Lisääntynyt tyypin 1 ja tyypin 3 kollageenin tasot havaittiin PSC soluviljelmäsupernatantista ELISA tutkimuksissa, mutta nousu oli tilastollisesti ainoa merkittävä jälkeen TGF-β1 hoitoja sekä ilman ennalta CHG altistumista, mutta ei sen jälkeen CHG altistuksen yksin

(b) b. Merkittäviä eroja (p 0,05) on merkitty *

mRNA: n ilmentymisen profiilit PSCs käsittelyjen jälkeen

tulosten perusteella mRNA ilmaisun array me sijoittui mahdollisesti muuttaa reittejä upon erilaisia ​​hoitoja , ja joukko differentiaalisesti ilmentyvien geenien valittiin lisävalidointia reaaliaikaisella RT-PCR (CXCL12, VCAN, FOS, LTBP2, COL5a1, THBS1, PPARy, RND3, MMP-1, DPP4). Biologinen uskottavuus on näkymä Metacore integroidun polku riveissä toimi perustana valittaessa geenejä lisävalidointia. Kaikki valitut 10 geenit näkyvät samanlaisia ​​muutoksia reaaliajassa PCR validointi kuin mikrosirulla.

suhteellinen mRNA ilmentymä CXCL12, FOS, LTBP2, THBS1 lisääntyi PSCs altistuksen jälkeen CHG, ja vaikutus TGF -β1 yksin rajoittui. Kun kuitenkin käyttää myöhemmin kun CHG altistuksen, TGF-β1 lisättiin vielä ylös-säätely CXCL12, LTBP2, THBS1 geeniekspressioiden. PPARy, RND3, ja MMP-1 mRNA ilmaisun jälkeen vähentynyt CHG altistuksen. Vakaan tilan taso VCAN ja Col5a1 mRNA lisääntyi vasta TGF-β1 hoitoa. Muutokset geenin ilmentymistä mRNA tasolla ihmisen RLT-PSC solujen erilaisten käsittelyjen jälkeen on merkitty S1 Kuva.

Lisääntynyt CXCL12, IGFBP2 proteiinin tasot RLT-PSC supernatantit

CXCL12 nousivat merkittävästi vuonna PSC supernatantti, kun RLT-PSC solut altistettiin CHG riippumatta myöhemmistä TGF-β1 hoitoon (3,09-kertainen ja 2,73-kertainen, p 0,05) (kuvio 3A). Hoito PSCs hoidettu aikaisemmin normaaleissa glukoosipitoisuuden-TGF-β1 48 h johti 2,69-kertainen CXCL12 tasoilla.

Kun TGF-β1 hoidon jälkeen sovellettavasta jälkeen PSCs altistettiin CHG se johti merkittävään (3,78-kertainen, p 0,05) IGFBP2 proteiinin tason korkeus PTK supernatantti (kuvio 3B).

CXCL12 taso lisääntyi merkitsevästi PSC soluviljelmässä altistumisen jälkeen CHG taas 48h TGF-β1 hoidon normaalin glukoosipitoisuuden johti myös yli 2-kertainen lisäys

(a

). IGFBP2-proteiinin taso on kasvanut soluviljelyalustaan ​​altistumisen jälkeen joko CHG tai TGF-β1. Tämä muutos oli vain merkittävä, kun PSCs altistettiin TGF-β1 jälkeen kun CHG altistuksen.

(b) B. Merkittäviä eroja (p 0,05) on merkitty *

muuttaminen keskeisten signalointireittien vuonna PSCs

WB analyysi PSCs alttiina CHG sekä ilman myöhempää TGF-β1 käsittely osoitti merkittävin fosforylaation lisääntymiseen ERK1 /2: n ja p38 ja sitä seuraava induktio CDC25a ja SP-1-proteiinit. Proteiini ilmaisuja p21

waf1, HIF1α, myös lisääntynyt, kun taas määrä PPAR väheni jälkeen PSCs altistettiin CHG (kuva 4). Lisäksi, heksosamiinin reitti indusoitui myös kuten on osoitettu muuttunut β-O-sidottu N-asetyyliglukosamiinin (O-GlcNAc) proteiinin muutos kuviot PSCs alttiina CHG. WB tuloksia suhteellinen tiheys arvot (merkittävät ja kohtalainen muutokset) on merkitty kuvassa 4. Lukuun ottamatta marginaalinen muutoksia ei ollut ratkaisevia, merkittäviä tai suuria muutoksia määrän FAK, PTEN, AKT, PKC-α, c- FOS proteiinit PSCs erilaisten käsittelyjen jälkeen. (S2 kuvio) B

PSCs altistettiin CHG ja /tai myöhemmin TGF-β1 hoitoon. Paras edustavat kuvat keskeisten signalointi molekyylien tähtisolut osoitetaan Western blot kalvoja. Ponceau värjäys käytettiin arvioimaan yhtäläinen lastaus geelejä. Merkitsevä (p 0,05) * ja erittäin merkittäviä eroja (p 0,001) ** on merkitty.

Lisääntynyt leviämisen ja muutto T3M4 solujen ja vaikutus CXCR4 estäjän

leviämisen T3M4 solujen lisäsi merkittävästi 48 tunnin kuluttua viljelyn kanssa CHG alttiina PSC /CCM osoittaa lähes kaksi kertainen lisäys (10,48) verrattuna muihin hoitoihin (DMEM-5.5: 6.58¸DMEM-15.3: 6,43, p 0,05) on 72 pysyvää kaikkialla kokeen (96h). Tämä lisääntymistä edistävä vaikutus voi osittain esti käyttäen CXCR4 estäjä, AMD3100 co-hoitoa (14,91 vs. 17,54, p 0,05), mutta vasta 96 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 5A).

Leviämisen T3M4 soluja inkuboitiin eri kunnostettua PSC viljelyalusta ja CXCR4 estäjän AMD3100 jälkeen 24, 48, 72 ja 96 tuntia hoidon jälkeen. T3M4 solujen lisääntymistä (yhtenäinen viiva, käsittelemätön kontrolli) lisättiin merkittävästi inkubaation jälkeen PSC supernatantti (pisteviiva) edellyttäen, että PSC olivat ennen alttiina CHG. Läsnäolo CXCR4 estäjän AMD3100 (katkoviiva) voisi osittain estävät tämän leviämisen induktion jälkeen 96h.

(b) B muutto T3M4 syöpäsoluissa arpeutumisprosessit määrityksessä. Huomattavia vaikutuksia hyperglykemiaan muuttoa syöpäsolujen: nopea suora vaikutus kohonnut glukoosi tason todettiin. Ei ollut silmiinpistävä vaikutus conditioned PSC elatusaineet on T3M4 solujen vaeltamiseen.

(c) B-Western blot analyysit keskeisten signaloinnin molekyylien T3M4 soluissa. Syövän solut altistettiin hyperglykemia tai erilaisia ​​kunnostettua PSC viljelyalustaan. Paras edustavat kuvat avaimen signalointimolekyylien syöpäsolujen on esitetty WB kalvoja. Ponceau värjäys käytettiin arvioimaan yhtäläinen lastaus geelejä. Merkittävä (p 0,05) erot on merkitty. *

Migration of T3M4 kasvainsolujen arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Sekä vastuu syöpäsolujen suoraan hyperglykemia (syöpäsoluja inkuboitiin 50% DMEM-korkean glukoosin ja 50% RPMI glukoosista konsentraatioon 13,2 mM) ja altistuminen PSC CCM-5.5 lisätä maastamuuttoa 20 tunnin kuluttua vertailuryhmän soluihin. Selvin muuttoliike edistävä vaikutus havaittiin, kun syöpäsolut inkuboitiin kunnostettua PCS keski korkea glukoosipitoisuus (CCM-15.3). (Kuvio 5B) B

muuttaminen keskeisten signalointireittien että T3M4 soluissa

T3M4 soluissa, massiivinen (yli 5-kertainen) nousu fosforyloitu ERK1 /2 rinnan merkittävään kasvuun in p21-proteiinin tuotannon todettiin jälkeen vastuita sekä hyperglykemia ja PTK-CCM huolimatta että T3M4 on KRAS-Villityypin ductal Pac solulinjassa. Merkittävä nousu p-p38 löytyi T3M4 altistuneiden solujen molempien PSC-CCM-sanomien. Hyperglykemia altistus vähensi p (Thr) Akt ja p (Ser) Akt in T3M4 soluissa, sen sijaan altistuminen syöpäsolujen PSC-CCM korotti p (Ser) Akt (kuvio 5C). Molemmat reseptorit CXCL12, CXCR4 ja CXCR7 otettiin kantaa T3M4 soluissa (kuvio 5C). T3M4 solut altistettiin suoraan hyperglykemia tai eri conditioned PSC elatusaineet ilmaistuna lisääntynyt määrä CXCR4, enimmäkseen käsittelyn jälkeen T3M4 solujen elatusaineeseen PSCs, jotka olivat aiemmin altistuneet CHG. Sitä vastoin emme havainneet muutoksen jälkeen CXCR7 proteiinin ilmentymisen T3M4 solujen erilaisten käsittelyjen jälkeen. WB tuloksia suhteellisen tiheyden arvot näkyvät kuvassa 5C. Vain vaatimaton, ei-merkitsevä lisääntyminen c-FOS ja FAK proteiinit havaittiin T3M4 altistuneiden solujen molempien PSC-CCM-sanomien eikä proteiinin ilmentymiä PTEN ja PKC-a oli muuttunut merkittävästi vuonna T3M4 soluissa erilaisten käsittelyjen jälkeen. (S3 kuvassa) B

Keskustelu

epidemiologisissa yhteys DM ja Pac [1-3, 6] motivoitunut tällaista tutkimusta. Oletimme, että CHG saattavat aiheuttaa trans-eriyttäminen (aktivointi) PSCs ja edistää ja etenemistä haiman fibroosi ja syöpään [15-18, 23]. Hypoteesi arvioitiin käyttäen ihmisen, ikuisti RLT-PSC solulinjassa [13] ainutlaatuisella kokeellinen setup. Erilaisia ​​PSC aktivoimalla tekijät (esim: EtOH, TGF-β1, PDGF, TNFa, interleukiinit [IL-1, -6, -13], ROS) on aiemmin tunnistettu, mutta rooli kroonisen (eli 14 päivää) hyperglykemian PSC aktivointi ei ole tutkittu tähän mennessä.

Aikaisemmat tutkimukset raportoitu hyperglykemiaa aiheuttama aktivointi rotan PSCs, mutta vain 72 tuntia ja ilman genomin laajuista lähestymistapaa. [24-26] Olemme havainneet, että ihmisen PSC lisäsi sytoplasmisen αSMA mikro-hehkulamppuja muodostumista ja taipumus lisätä suuria ECM proteiinirakenneosissa (tyypin 1 ja -3 kollageenien) altistettaessa CHG.

genominlaajuisten mikrosirujen lähestymistapaa käytettiin arvioimaan glukoosin indusoimaan muutokset mRNA ilmaisun kuvioita. MetaCore polku tietokantaohjelmisto käytettiin alustava identifiointi diabetekseen liittyvän polkuja, valinnan jälkeen alkuun 300 differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Jokainen rakenteisen johtui integrointi useita sarjaa geenien muuttuneeseen mRNA ilmaisuja mikrosirulla (esim .: CXCL12 todettiin integrointi 12 geenien kanssa merkittävästi muuttunut mRNA ilmaisuja yhdeksi signalointiryöpyn). Myöhemmin me validoitu mRNA ilmaisuja valitun joukon geenejä käyttäen reaaliaikaista PCR. Key signalointimolekyylien sitten arvioitiin proteiinin tasolla PSCs.

fosforylaatio p38 oli merkittävin muutos PSCs altistuksen jälkeen CHG. Emme voisi tarjota selkeä ylävirtaan koulutusjakson hyperglykemian aiheuttama lisääntynyt fosforylaatiota p38 in PSCs kuitenkin samanlaiset tulokset raportoitiin viljellyissä ihmisen vatsakalvon mesoteelisolujen altistuu korkealle glukoosipitoisuus, mikä osoittaa, että p38 MAPK aktivointi ollut merkitystä (vatsakalvon ) fibroosia kehittäminen [27]. Aktivointi p38-reitin oli myös olennaista suuren glukoosipitoisuuden aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ihmisen viljellyissä munuaistiehyiden epiteelisolujen [28] ja EMT rauhasrakkuloissa haimassa voi edistetään lopullisen PTK väestöstä [29]. Lisäksi p38-reitti on aktivoitunut gluko-lipotoxicity indusoiman apoptoosin insuliinia erittävien INS-1-soluja [30].

SP1 valittiin WB analyysin vuoksi, että proksimaalisen promoottorin CXCL12 on käytössä kuusi oletetun SP1 sitovat motiivit kuin vahvistanut toiminnallisia menetelmiä (in vitro mutageneesi) [31] ja koska se SP1 transkriptiotekijä sitoutuu myös 200 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta of IGFBP2. SP1 aiheuttaa myös transkription p21 ja CDC25-geenien [32, 33]. Löysimme merkittävän kasvun SP1 proteiinin määrä PSCs altistuksen jälkeen CHG ja tämä oli riippumaton vaikutus TGF-β1. SP1 yliekspressio kirurgisesti resektoitiin ihmisen PAC liittyi aggressiivinen tauti ja huonon ennusteen [34] ja SP1 oli laskennallisesti ennustetaan olevan tärkeä säätelijä transkriptiotekijän PAC [35]. Olemme päätellä, että signalointi kautta heksosamiinin koulutusjakson, ja CHG aiheuttama lisäys p-p38 ja p-Erk1 /2 koordinoidusti kaikki säänneltyjen aktivoinnin SP1 joka lopulta johti lisääntynyt transkriptio SP1-riippuvaisten geenien, kuten CXCL12, IGFBP2, CDC25a ja p21 PSCs (kuvio 6) [36-39].

Nämä tulokset viittaavat rooli metabolisen tekijöiden PSC aktivointi, joka voi tarjota profibrogenic virikkeitä vähemmässä määrin leviämisen signaalit näissä stroomasoluissa. Hyperglykemia indusoi myös syöpään liittyvän erityksen kuvio PSCs joka voi muuttaa haiman kasvain microenvironment.