Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Järjestäjä ja 5’metylaatio sääntelyn tuumorisuppressorigeeneille on yhteinen piirre monissa syövissä. Tällainen tapahtuma johtavat usein vaiennettaisi näiden keskeisten geenien ja siten ne voivat edistää syövän kehittymistä, mukaan lukien eturauhassyöpä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Jotta voitaisiin tunnistaa metylaatiomuutokset eturauhasen syöpä, suoritimme genominlaajuisia analyysi DNA: n metylaatio käyttäen Agilent ihmisen CpG-saarekkeen taulukot. Laskennallisen ja geenispesifiseen validointi lähestyessä olemme tunnistaneet suuren määrän potentiaalisia epigeneettiset biomarkkerit eturauhassyöpää. Edelleen validointi kandidaattigeenejä erillisellä kohortin matalan ja korkean asteen eturauhasen syöpiä kvantitatiivisen MethyLightTM analyysi on antanut meille mahdollisuuden vahvistaa DNA hypermetylaatiota

HOXD3

ja

BMP7

, kaksi geeniä, jotka voivat olla rooli kehitettäessä korkealaatuista kasvaimia. Samalla osoitetaan, että promoottori hypermetylaation vastaa vaimentua näiden geenien ilmentymistä, että DU-145 PCa solulinjassa.

Johtopäätökset /merkitys

Tässä tutkimuksessa määritellään uusi epigeneettisellä biomarkkerit eturauhassyövän ja eturauhasen syöpä etenemistä, ja antaa yleisarvion DNA: n metylaation eturauhassyövän.

Citation: Kron K, Pethe V, Briollais L, Sadikovic B, Ozcelik H, SUNDERJI A, et al. (2009) Discovery of Novel hypermetyloitunut geenien Eturauhassyöpä käyttäminen Perimän CpG Island mikrosirut. PLoS ONE 4 (3): e4830. doi: 10,1371 /journal.pone.0004830

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 24. marraskuuta 2008; Hyväksytty: 17 helmikuu 2009; Julkaistu: 13 maaliskuu 2009

Copyright: © 2008 Kron et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Canadian Eturauhasen Cancer Research Initiative, National Cancer Institute of Canada (# 18568). Ontario Student Opportunity Trust Fund, Scace eturauhassyöpä Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuolemantapausta [1]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että PCA monimutkainen sairaus vaikuttivat geneettisen ja ei-geneettisten epidemiologiset tekijät ja varhainen diagnoosi on kriittinen kliinisessä hoidossa taudin. Yhteinen patologinen vaihteleva aikana annetut eturauhasen kasvain, korkeammat pisteet heijastaa huonosti eriytetty syöpä. Gleason pisteet ≤6 karsinoomat pidetään huono laatu, Gleason 7 on puolivälissä tason, ja ne, joilla Gleason pisteet 8 ja yläpuolella pidetään korkealaatuista (viimeaikaisten Arvioi pisteytysjärjestelmä, katso [3]).

Epigeneettiset muutokset on osoitettu vaikuttavan geenin ilmentymisen kuviot ja usein edistää patogeneesiin moniin syöpiin [4]. Esimerkkejä epigeneettiset histonimodifikaation kuuluvat metylointi spesifisten lysiinitähteistä, asetylaatio /deasetylaation lysiinitähteiden, ja fosforylaatiota histoni hännät, joilla kullakin vaihtelevia vaikutuksia geenien transkription säätelystä. Nämä muutokset aiheuttaa epänormaalia geeniekspressiomalleja ja siten pidetään myötävaikuttaa syövän kehityksen [5], [6]. Poikkeava CpG metylaatio on hyvin tunnustettu epigeneettisellä tunnusmerkki moniin syöpiin. Global genomista hypometylaatio löytyy yhdessä paikallisille alueille hypermetylaation, tyypillisesti CpG-saarekkeiden, joita esiintyy yleisesti promoottorit tai 5 ’alueiden geenisekvenssien [7]. Promoottori hypermetylaation toimii yhdessä erityisten histonimodifikaation vaientaa geenejä suoraan estämällä transkriptiotekijä biding [8], sitoutumalla metyyli-CpG sitovan domeenin proteiinit [9], tai vuorovaikutus histoni modifioivia entsyymejä [10]. Tämä epigeneettiset mekanismi voi antaa kasvuetua syöpäsolujen hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille. Niinpä DNA: n metylaatio tapahtumat voivat olla hyödyllisiä biomarkkereita [11], kuljettavat etsintä sekä ja ennustavia indikaattoreita.

CpG-saarekkeen hypermetylaation PCA on yhteinen tapahtuma, jossa on yli 30 hypermetyloitunut loci selvittänyt [12]. Paras tunnettu Näiden tapahtumien,

GSTP1

promoottori metylaatio, esiintyy 90% syövistä ja 70% edeltäjä eturauhasen korkean luokan intraepiteelisen neoplasia (PIN) vaurioiden [13], [14] ja voi myös olla verestä ja virtsanäytteistä [15]. Siten

GSTP1

metylaatio saattaa olla hyödyllinen diagnostinen markkeri PCa. Viime aikoina huomattavaa edistystä on tapahtunut suurikapasiteettisten epigenomic seulonta tunnistamista varten uusia tavoitteita DNA: n metylaatio [16]. Myöhemmin muita hyvin tunnettu hypermetyloitunut geenit on tunnistettu PCa lukien

RASSF1A

,

CDH1

, ja

CDKN2A

, muutamia mainitakseni. Ei kuitenkaan geeni tutkittu tähän mennessä on havaittu erityistä diagnostista /prognostista biomarkkereiden PCA samanlainen

GSTP1

[17], [18].

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet analysoimaan metylaatio on genomin laajalti käytetään ihmisen CpG-saarekkeen mikrosiruja paljastaa uusia methylatled loci sisällä eturauhassyöpää. Joukossa paneeli uusia ja /tai differentiaalisesti metyloidut loci että olemme määritelleet, olemme edelleen tunnettu siitä,

HOXD3

ja

BMP7

yhdistämällä MassARRAY® EpiTYPER analyysin ja määrällisen MethyLight määritys, ja arvioidaan ekspressio DU-145 PCa soluissa.

Methods

Potilasnäytteet

20 tuore PCa kudosnäytteistä (10 Gleason pisteet 6 tai puhdasta kuvio 3 (PP3), ja 10 Gleason 8 tai puhdasta kuvio 4 (PP4)) saatu eturauhasen näytteitä potilaista, joilla on eturauhasen syöpä diagnosoidaan vuosien 2001 ja 2007 kerättiin kudospankki yliopiston Health Network (UHN), Toronto. Potilailla, joilla oli hoidon ennen leikkausta jätettiin pois. Toinen sarja yksilöitä koostuu 39 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) PCa näytteet (20 PP3 ja 19 PP4) potilaista diagnosoidaan vuosien 2006 ja 2008 otettiin samalla kerätty validointi asetettu. Kaikki potilaat suostunut lahjoituksen poistetun kudoksen UHN kudospankki ja näytteet saatiin protokollien mukaisesti hyväksymien tutkimuseettiseltä Mount Sinai Hospital (MSH) ja UHN, Toronto, ON, Kanada. Eturauhassyövän näytteet altistettiin histologinen tutkimus asiantuntijan patologi (TVDK) varten riippumatonta vahvistusta Gleason laadut.

Solulinjat ja DNA: n eristämiseksi

Ihmisen PCa solulinjat LNCaP (ATCC # CRL- 1740 ), DU-145 (ATCC # HTB-81), PC-3 (ATCC # 59500) ja 22RV1 (ATCC # CRL- 2505) saatiin Drs. M. Zielinska, R. Bristow, ja E. Diamandis. Kaikki solut viljeltiin yksikerrosviljelminä RPMI 1640 media (Life Technologies), ja johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki solulinjat kasvatettiin kosteutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa. DNA uutettiin Solujen keräyksen jälkeen trypsinaatiolla seurasi DNA: n eristämiseksi käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen Inc, Mississauga, ON, Kanada), käyttäen protokollaa toimittajan suosittelemaa.

5-atsa 2 ’-deoxycitidine (DAC) hoitoon ja RT-PCR

250 ug /ml kantaliuosta, jossa oli 5- atsa-2-deoksisytidiini (DAC) (Sigma-Aldrich, Oakville, oN, Kanada) valmistettiin veteen ja pidettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. DU-145-soluja maljattiin 6 cm: n maljoihin ja inkuboitiin elatusaineessa, jossa on 2 ug /ml DAC 4 päivää keskipitkän vaihtuvat 2 päivää. Solut kerättiin ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), käyttäen protokollaa toimittajan suosittelemaa.

Alukesekvenssit RT-PCR

BMP7

ja

HOXD3

on kuvattu aiemmin [19], [20] ja ovat seuraavat: (

BMP7

eteenpäin) 5′-AGA GCA TCA ACC CCA AGT-3 ’, (

BMP7

käänteinen) 5′-CTA CTC AGG CCC CAG CTT-3 ’; (

HOXD3

eteenpäin) 5′-AGG ATC CTG GTC TGA ACT CAG AGC AGC AGC3 ”, (

HOXD3

reverse) 5′-ACT CGA GTT CAT CCG CCG GTT CTG GAA CCA-3 ”.

DNA eristys

tuore arkistoitu kudosta oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä, murskataan, ja genominen DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA mini kit (Qiagen) mukaan kitin. FFPE kudos leikattiin (7 um) ja kuivattiin ilmassa päälle dioja. Alueet, joilla on selkeä Gleason arvosana H 2; sivuuttaa tila: 0, maksimi todennäköisyys: 0,95 perimän rappeutuminen: 10000, sigma: 1. Sellaiset havaittu genomialuetta oli lisätty huomautusta vastaavien geenien käyttäen PGS geeniä käsinkirjoitustyökalun kanssa Affymetrix HuGene-1_0-st-v1.na24.hg18.transcript .csv-tiedosto. Sen lisäksi, että suoraan päällekkäisiä geenit, proksimaalinen geenit (ennen ja jälkeen 1000 nukleotidia) on rikastettua /köyhdytettyä alueita myös merkinnät.

Huomattavat erot rikastamiseen välillä PP3 ja PP4 kasvaimia tunnistettiin laskemalla keskimääräinen kertainen ero välillä PP3 ja PP4 normalisoitu signaali kaikissa antureista käyttäen PGS ANOVA työkalu, ja myöhemmät HMM alue havaitsemiseen ja geeni merkintä käyttämällä edellä mainittuja parametrejä. Tällaiset genomiset alueet olivat edelleen suodatetaan sisällyttää sekvenssejä pienellä 1,3 kertainen rikastus, ja pienin -1,3 kertainen ehtyminen. Visualisointi dataa lämpöä karttoja, .wig tiedostoja UCSC Genome selain, genomin katsella tiedostoja, ja vastaava datataulukot /luetteloita suoritettiin käyttäen PGS kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [26].

MassARRAY EpiTYPER Analysis

kvantitatiivinen analyysi CpG-metylaatio suoritetaan käyttämällä massaspektrometriaa lähestymistapaa saatavilla MassARRAY® EpiTYPER analyysi (Sequenom). EpiTYPER analyysi on MALDI TOF massaspektrometrillä perustuva menetelmä, joka antaa kvantitatiivisen näkymä CpG metylaatio yhteen tai useampaan dinukleotidi resoluutio. DNA on ensimmäinen bisulfiitti modifioitu, koodattu T7-promoottorin, ja transkriptoidaan RNA. Sitten tämä pilkotaan RNaasi A ja pilkkoutumistuotteet eri massa voidaan ratkaista MS väline. Analyysin suoritti analyyttisen Genetics Technology Centre (AGTC), Prinsessa Margaret Hospital, Toronto, ON kohti valmistajan ohjeiden avulla osajoukko tuore kudoksesta DNA, jota käytettiin CpG-saarekkeen mikrosiruanalyysillä. Alueet analysoitiin EpiTYPER vastasivat niitä, jotka osoittivat rikastettu signaalin CpG-saarekkeen array tuloksia. Kaikki analyysit suoritettiin kolmena kappaleena ja keskiarvot ja keskivirheet laskettiin.

Natrium bisulfiittimodifikaatio ja MethyLightTM

Natrium bisulfiittimodifikaatio genomi-DNA suoritettiin käyttäen EZ DNA Metylointi Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) valmistajan protokollan 0,8 ug parafiini- upotettu kudoksen DNA.

metylointi tasoja kahden geenin kiinnostavia määritettiin kvantitatiivisella metylaatiospesifisen PCR: llä (MSP), MethyLightT määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Alukkeita ja koettimet on suunniteltu erityisesti bisulfiitti muunnetut, metyloitua DNA ja ovat seuraavat: (

BMP7

eteenpäin) 5′-CGT TTT TTT GGT TCG GAT CGC-3 ’, (

BMP7

koetin ) 6FAM-5′- GTG TCG AGA GGG TAG GGT CGG TTT CG-3′-BHQ1, (

BMP7

reverse) 5′-CTA AAA CCT AAC GAA ACG TCG CG-3 ’; (

HOXD3

eteenpäin) 5′- GTT TTG GTA TTT CGG GTT TTT ATC G-3 ’, (

HOXD3

koetin) 6FAM-5′- AAG AGC GTT TGG GGG AGG GGG GC- 3′-BHQ1, (

HOXD3

reverse) 5′-TAA AAC TCC TAA CTT CGC GCT ACG-3 ’; (

Alu

eteenpäin) 5′-GGT TAG GTA TAG TGG TTT ATA TTT GTA ATT TTA GTA-3, (

Alu

koetin) 6FAM-5′-CCT ACC TTA ACC TCC C- 3′-MGBNFQ, (

Alu

reverse) 5′-ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA-3 ’. Kaikki reaktiot suoritettiin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR väline. Standardikäyrät muodostettiin käyttämällä sarjalaimennoksia positiivisena kontrollina supermethylated DNA mielenkiinnon kohteena olevan geenin ja

Alu

toistaa. Prosenttia metyloitu suhde (PMR) on geeni laskettiin

Alu

toistuu viitteenä seuraavasti: (geeni /

Alu

fluoresenssin määrän suhde muunnetun näytteen DNA) /(geeni /

Alu

suhde supermethylated DNA) x 100%. Positiivinen pisteet metylaation annettiin jos PMR tietylle kasvain ≥10%.

Tulokset

Analyysi genomista metylaation

erotettu analysointiin meidän microarray data kaksi osajoukkoja. Ensimmäinen alaryhmä koostui kaikista 20 syövän yksilöitä verrattuna viite DNA. Luettelo geenien havaittiin merkittävästi hypermetyloitunut tilastollisista menetelmistä suoritetaan syöpää vastaan ​​viittaus aineisto (PP3 PP4 versus viite DNA) on esitetty taulukossa 1. Mielenkiintoista, 27 top 100 metyloitu geenejä (paremmuusjärjestykseen yksittäisten koetin kertaiseksi muutos) päässä syöpään /viittaus aineisto ovat homeobox tai T-box geenien (taulukko 2), yhdenmukainen nykyisen kirjallisuuden analysointi metylaatiovyöhykkeiden muiden syöpien mukaan lukien keuhko-, rinta-, ja paksusuolen [28], [29], [30 ]. Olemme myös löytäneet 2-kertaiseksi signaalin geenien aiemmin tunnistettu metyloitavaa eturauhassyövän kuten

CDKN2A

(keskimäärin 15,8-kertainen rikastaminen),

RUNX3

(2,8-kertainen), ja

PTGS2

(2,9-kertainen). Geeni näytetään suurimmassa määrin metylaatio oli

FOXC1

joiden keskimääräinen kertainen muutos 60,9 verrattuna viite DNA. Käyttämällä PGS, joka rajoittuu analyysi useita koettimia osoittavat rikastamiseen, suurimmassa määrin metylaation on tunnettu geeni oli

HOXD9

(3,2 kertainen muutos poikki 8 antureista).

toinen osajoukko dataa verrattuna kymmenen PP3 asiat 10 PP4 tapauksissa jota kutsutaan etenemistä aineisto. Käyttämällä 2-kertainen keskimääräinen rikastaminen signaali ero kaksi kuviota kuin cut-off, huomasimme joukko 493 array koettimia, jotka pystyvät erottamaan PP3 ja PP4 syöpiä. Sitten suodatettu pois useita koettimia, jotka edustavat samaa geeniä ja koettimet edustavat tuntemattomia paikkoja, jolloin lopullisen luettelon 223 yksittäisten geenien. Yksi erityinen koetin edustaa CAP-Gly domain sisältävä linkkeri proteiini perhe, osa 4 (

CLIP4

) osoitti suurinta kertainen ero kaksi kuviota (6,5). Käyttämällä PGS tilastollista analyysia, vatsa- anterior homeobox 1 (

VAX1

) näkyy suurin keskimääräinen kertainen ero (2,7) usean koettimia (6 yhteensä). Edustava näkymä geenien PGS analyysi on esitetty taulukossa 1. Samoin kuin syöpä /viittaus aineisto, 23 alkuun 100 geenit paremmuusjärjestykseen koetin kertainen muutos etenemistä aineisto ovat homeobox geenejä (taulukko 2).

Me seuraavaksi valitaan kaksi geeniä näiden listojen tarkempaa analysointia yhdistämällä metylaation ja ilmaisun pohjaiset tekniikat. Valintakriteerit olivat biologinen geenin toiminta, osallistuminen /panos eturauhassyövän, ja tilastollisen merkittävyyden CpG mikrosirujen tuloksia.

Gene erityisiä metylointianalyysi

geenit analysointiin valittu olivat:

BMP7

[luun morfogeneettisen proteiini] (kromosomi # 8p21), geeni jo sekaantunut PCa etenemistä [31], joka on aikaisemmin raportoitu metyloituja käytettäessä oligodendrogliooman solulinjassa ja syöpien [32] , [33]. Päätimme tutkia tarkemmin sen metylaatio profiilia, koska se on otaksuttu downregulation PCA etenemistä [31] ja noudatetaan metylaation signaali meidän syövän /viittaus aineisto (3,2-kertainen rikastus), mikä viittaa siihen, että metylaatio tämä geeni voi olla rooli PCa etenemiseen.

HOXD3

[Homoebox transkriptiotekijä] (kromosomi # 2q31-37), geeni havaittu metyloitavaa keuhkosyövän solulinjoja ja primaarisia kasvaimia [34], joka ilmeni selvä yhä metylaatio kasvaimen tarkoitetun sarjan keskiarvo rikastus erotus (6,4), mikä viittaa siihen, että metylaatio tämän geenin voi olla osallisena sairauden etenemiseen samoin.

Partek graafisen ja heatmap visualisointi microarray data on on esitetty, että kaksi geeniä kuvassa 1.

(A)

BMP7

ja (B)

HOXD3

. Linja kaavioita ylähavaksessa jokaista esitystä log

2 suhde arvot kullekin koetin, jossa on punaisia ​​edustaa PP4 tapauksissa A-J ja sininen edustavat PP3 tapauksissa 1-10. Alempi paneeli Jokaisen on lämpö kartan jokaiselle koetin yksittäisissä PP4 ja PP3 tapauksissa. Punaiset nuolet vastaavat alueet valitaan EpiTYPER analyysillä mustat nuolet vastaavat alueet valittu MethyLightTM analyysiä.

EpiTYPER kvantitoimiseksi CpG Metylointi

EpiTYPER analyysiin sisältyi osajoukon tapauksista, jotka osoittivat rikastuminen ≥3 kertaisesti tai puute metylaation signaalin (≤2 kertainen) on mikrosiruja. Saatuja tietoja EpiTYPER analyysi vahvisti rikastamiseen /metylaation profiilit

BMP7

ja

HOXD3

jotka olivat ilmi microarray johtaa Neljä microarray tapausten analysointiin valittu (kuviot 2, 3) . Sillä

BMP7

, metylaatio alueen tunnistaa meidän microarray analyysi vahvisti, että näytteiden B ja 3, oli huomattava määrä metylaation verrattuna viitteen DNA (jopa 76% CpG 4 näyte B) (kuvioiden 2A, B). Nämä näytteet oli keskimäärin metyloinnin 43% ja 52% (metyloitu /metyloitumaton suhteen, annetaan prosenttia), vastaavasti, kaikkien 35 CpG: t analysoitiin, kun taas näytteet I ja 4 osoitti keskimääräinen CpG metyloinnin 14% ja 17%, vastaavasti.

HOXD3

näkyy selvästi kuvioitu lisääntynyt metylaatio PP4 tapauksissa verrattuna PP3 tapauksiin. Analyysi tuore DNA-näytteitä F, I, 4, ja 8 vahvisti ero kuvion metylaation välillä PP3 ja PP4, ainakin suhteessa neljä tapausta analysoitiin (kuvio 3A, B). Laadukas tapauksissa F ja I oli keskimäärin metyloinnin 72% ja 43% vastaavasti, kaikissa 27 CpG dinukleotideissä analysoida, kun taas huono laatu näytteiden 4 ja 8 vastaavasti oli keskimäärin metyloinnin 19% ja 35%.

(A) PP3 tapaukset 3 ja 4 ja (B) PP4 tapauksissa B ja I. Reference lymfosyytti on esitetty kullekin. Värilliset palkit edustavat keskiarvoa metylaatio yli kolme toistoa standardeilla virhepoikkeamilla näyttöön.

(A) PP3 tapaukset 4 ja 8 ja (B) PP4 tapaukset F ja I. Reference lymfosyytti on esitetty kullekin. Värilliset palkit edustavat keskiarvoa metylaatio yli kolme toistoa standardeilla virhepoikkeamilla näyttöön.

MethyLightTM Analysis

Voit tarkistaa metylaation näistä geeneistä, me validoitu niitä itsenäisessä sarjassa parafiiniin Eturauhassyövän tapauksessa Hyväksytty normaalia kudosta samalta yksilöitä jos saatavilla, ja myös arvioi niiden metylaatiostatuksen PCA solulinjoissa (DU-145, PC-3, 22RV1, ja LNCaP) käyttäen MethyLightTM.

BMP7

metylaatio varmistettiin yhteensä 4 kasvaimen yksilöt (kaksi PP3, kaksi PP4) sekä kaksi normaalia näytettä eri tapauksessa (kuvio 4A).

HOXD3

metylaatio oli läsnä yhteensä kahdeksan yksilöt (kaksi PP3, kuusi PP4) (kuva 4B). DU-145-solut olivat positiivisia metylaation sekä

BMP7

ja

HOXD3

. PMR arvot DU-145 ja positiiviset tapaukset ovat taulukossa 3.

(A)

BMP7

ja (B)

HOXD3

MethyLightTM vahvistusta tontteja. X-akseli esittää syklin, kun taas y-akseli esittää delta-Rn-arvo. + Ctrl – supermethylated DNA.

RT-PCR

seuraavaksi käsitellään DU-145-solujen kanssa demetyloiva aineen DAC ja suorittaa semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi käyttäen käsittelemätöntä ja käsitellyt solut vaikutuksen arvioimiseksi metylaation on ilme kaksi geenejä.

HOXD3

ekspressio näyttää poistetaan kokonaan hoitamatta DU-145-soluissa, kun taas

BMP7

on minimaalisesti ilmaistaan. Hoidon DAC indusoi

HOXD3

ilmaisun ja aiheutti lisääntymisen

BMP7

mRNA-tasoja (kuvio 5), mikä osoittaa, että metylaatio on osallisena alennettu ilmentyminen sekä

BMP7

ja

HOXD3

.

NTC – ei mallia valvonta. -DAC – Käsittelemätön. + DAC – käsiteltiin 5-atsa-2-deoksisytidiinin.

Keskustelu

Olemme käyttäneet ihmisen CpG-saarekkeen mikrosiruja tunnistaa metyloidut geenien PCa kokonaisuutena sekä differentiaalisesti metyloitavaa huono laatu, PP3 ja korkea laatu, PP4 PCa. Intermediate Gleason pisteet 7 kasvaimia ei tutkittu, koska ne koostuvat molemmat kuviot 3 ja 4, ja päätimme kaventaa keskitymme niihin kasvaimia, jotka koostuvat kokonaan Gleason kuvio 3 tai Gleason kuvio 4, jotta on rikastuttanut solukuvio populaatiot. Huomasimme, että pystyimme tunnistamaan CpG-saarekkeiden, jotka ovat sekä määrällisesti enemmän metyloidut ja denaturoidulla suurentunut taajuudella PP4 kasvaimissa verrattuna PP3 kasvaimia. Tämä saattaa heijastaa yleistä siirtymistä suuremman tilan metylaation promoottorin CpG saaria kasvaimen edetessä kohti laadukkaampaa.

Useimmat geenit paljastui kautta paneelit eivät joko ole koskaan osoitettu metyloitavaa PCa tai muissa syöpätyypit. Muut aiemmin kuvattu metyloituneiden geenien eturauhassyöpää, kuten

CDKN2A

,

PTGS2

, ja

RUNX3

, kaikki ilmeni merkkejä metylaation perustuu kertaiseksi muutoksia ja tilastollista merkittävyyttä. Tiukkuus tilastolliset analyysit, jotka suoritimme olisi voitu estää sisällyttäminen näiden geenien sisällä meidän top geenit etenemisen tai syöpä /viittaus aineisto. Sen vuoksi, tämä ei voi olla osoitus puute metylaation, mutta sen sijaan voidaan selittää kvantitatiivinen metylaatiotasoilla. On mahdollista, että metylaatio näistä geeneistä on saattanut tapahtua vähemmän soluja ja /tai vähemmän useita CpG dinukleotideissä, tuottaen siten vähemmän kiinteää signaali meidän näytöllä. Vaihtoehtoisesti ryhmittely tapauksissa tilastollisten analyysien saattanut suodattaa näitä geenejä pois, koska metylointi on vähemmän määrä näytteitä loisi alhaisempi keskimääräinen ja enemmän vaihtelua eri puolilla näistä tapauksista. Olimme yllättyneitä siitä, että paras tunnettu metylaation tapahtuma PCA, hypermetylaatiota

GSTP1

promoottori, ei jää meidän array näytöllä tuloksia. On mahdollista, että menetelmää käytettiin kohde DNA: n valmistus yhdessä microarray alusta on vastuussa ei ole havaittu

GSTP1

metylaatio signaalin. Sekvenssianalyysi

GSTP1

paljasti, että metyloitua DNA rikastamiseen menetelmä tuottaisi fragmentin noin 1900 bp, jotka voivat vaikuttaa hehkutus koettimiin merkittävästi pituudeltaan pienempi (noin 45-60 mer) tai se voi pysyä ennallaan seuraavia metylaatio herkkä ruoansulatus. Asiaa lähemmin tutkittaessa on

GSTP1

metylaation samassa 20 syöpä yksilöt kuitenkin voisimme havaita metylaation 80%: ssa tapauksista käyttäen MSP (tuloksia ei ole esitetty).

Olemme kehittäneet listan geenit verrataan koko syöpä aineisto vs. viittaus sekä erottamalla metylointi profiileja PP3 ja PP4 Gleason tulokset. Päätimme tehdä perusteellinen metyloituvuutta

BMP7

ja

HOXD3

, koska nämä ovat uusia tavoitteita metylaation PCA. Ne edustavat osajoukkoa geenien jossa hiljentäminen voi olla rooli kehitettäessä korkealaatuista eturauhasen syöpien perustuvat array tuloksiin, vaan perustuu myös saatavilla toiminnallisia tietoa nykyisestä kirjallisuudesta. Siksi nämä geenit eivät välttämättä vastaa suurin tilastollisen merkittävyyden tai suurin metylointi kertainen muutos joko kaksi aineistoja tuotimme. Geenit, joilla on suurimmat kertaiseksi muutoksia aineistoja,

FOXC1

ja

VAX1

, edellyttää uusia validointi suuremmassa sarjassa eturauhasen kasvaimia.

Bone morfogeenisiin proteiineista erittyy tekijöitä, jotka ohjaavat kehitystä ja ylläpitoa luun muodostumista ja kuuluvat TGF suurperheen signalointi proteiineja [35]. Sisällä PCa on osoitettu, että

BMP7

merkittävästi ali-ilmentynyt laser microdissected syöpäsoluja, mikä johtaa epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon [31]. Se kuitenkin näyttävät uudelleen ilmaistaan ​​metastasoitunut PCa pesäkkeitä luun [36]. Meidän löytö promoottorin metylaation

BMP7

ehdottaa mahdollista mekanismi, jolla alkuperäistä hiljentäminen saavutetaan, kun hoito DU-145-solulinjoissa DAC lisääntynyt

BMP7

ilme dramaattisesti. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet metylaatio

BMP7

mahalaukun syövistä ja oligodendroglioomasta solulinjat [32], [33], mikä viittaa siihen, että vaimentaminen

BMP7

tätä mekanismia ei rajoitu PCa yksin. Huomattavaa on, että

BMP7

metylaatio ei yksinomaan histologisesti syöpäkudokseen, mutta näkyi myös viereiseen normaaliin kudokseen. Tämä voidaan katsoa johtuvan kentän cancerization vaikutus, jolloin metylaatio tapahtuu ennen mitään histologisia syöpä muutoksia soluissa, joka on osoitettu esiintyvän eturauhassyövän [37]. Vaihtoehtoisesti, tämä metylaatio saattaa olla pääosin iästä, koska tämä ilmiö on myös osoitettu, ennen kuin normaalissa eturauhasessa kudoksessa [38]. Tulevaisuuden tutkimuksia edellytetään näiden kysymysten ratkaisemiseksi.

HOXD3

, toinen romaani PCa metylaatio tavoite, osoittivat selvästi siirtymistä suurempaan metylaation välillä PP3 ja PP4 PCa analysoitaessa meidän CpG array tuloksia. Rooli, että

HOXD3

pelaa tuumorigeneesiä ja /tai taudin etenemisen ole vielä tunnistettu, mutta aktivointi TGFp signalointi on esitetty A549-soluja oli transfektoitu

HOXD3

[39]. Poikkeamat tämän reitin on hyvin dokumentoitu PCA ja muiden syöpien [40]. On siis mahdollista, että metylaatio aiheuttama vaiennettu

HOXD3

on perturbing TGF signalointi, ja ehkä edesauttamaan korkealuokkaisesta PCa.