Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viime aikoina on ollut uutta kiinnostusta yhteys kolesterolin ja eturauhasen syöpä. Aikaisemmin on raportoitu, että

in vitro

, eturauhassyövän soluista puuttuu steroli välittämää palautetta sääntelyn suurista transkriptiotekijän kolesterolin homeostaasin, steroli-sääntely elementti sitova proteiini 2 (SREBP-2). Tämä saattaa selittää kolesterolin kasaantuminen kliinisissä eturauhassyövissä. Niinpä levoton palautesäätelylle lisääntyneeseen steroli- tasolle on tullut vallitseva käsite eturauhassyövän asetus. Täällä pyrimme tutustua syvällisemmin.

Menetelmät /Principal Havainnot

muuttamisen jälkeen solun kolesterolin tilaansa LNCaP ja PC-3 syöpäsolujen, tutkimme SREBP-2 käsittely, alavirran vaikutukset promoottorin aktiivisuutta ja ilmentyminen SREBP-2 kohdegeenien, ja toiminnallinen aktiivisuus (LDL-otto, kolesterolin synteesiä). Näin havaitsimme, että LNCaP-ja PC-3-solut olivat herkkiä lisääntyneen sterolin tasossa. Sen sijaan, alentaa kolesterolitasoa kautta statiinihoidon tuotti suuremman vasteen LNCaP kuin PC-3-solut. Tämä korostuu merkittävä ero näiden solulinjojen: pohjapinta SREBP-2 aktiivisuus näytti olevan suurempi PC-3-solut, vähentää herkkyyttä laski kolesterolia.

Päätelmä /merkitys

Niinpä eturauhassyöpä solut ovat herkkiä muuttuviin steroli- tasolle

in vitro

, mutta laajuus tämän asetuksen eroaa eturauhassyövän solulinjoissa. Nämä tulokset uutta tietoa säätelyssä kolesterolin aineenvaihduntaan kahdessa yleisesti käytetty eturauhassyövän solu-linjat, ja korostaa toteamiseksi, onko tarpeen kolesterolin homeostaasin häiritään eturauhassyövässä

in vivo

.

Citation: Krycer JR, Kristiana I, Brown AJ (2009) Kolesteroli Homeostasis in kaksi tavallista ihmisen Eturauhassyöpä Cell-Lines, LNCaP ja PC-3. PLoS ONE 4 (12): e8496. doi: 10,1371 /journal.pone.0008496

Editor: Immo A. Hansen, New Mexico State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 lokakuu 2009; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2009; Julkaistu: 30 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Krycer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AJB tutkimus- tukee avustusta Eturauhassyöpä Foundation of Australia (PR36, https://www.prostate.org.au). Jrk on vastaanottaja Petre Foundationin apurahan (https://www.petrefoundation.org.au). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tutkimus kolesterolin homeostaasin Eturauhassyöpätutkimuksessa (PCA) asetus alkoi 1942, kun Swyer julkaistu

in situ

havainnot kohonneet kolesteroliarvot hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun verrattuna normaaliin kudokseen [1] . Viime aikoina on ollut uutta kiinnostusta yhteyksiä kolesterolin ja PCa [2] – [4]. Esimerkiksi on ehdotettu, että syvällistä ymmärrystä kolesteroliin sääntelyn PCA eteneminen saattaa johtaa kehittää uusia lääkekohteita [5]. Tämän mukaisesti, useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä käytön statiinien (kolesterolia alentavia lääkkeitä) ja pienempi riski kehittyneiden PCa (tarkistetaan [2] – [4]).

Kolesteroli on merkittävä vaikutus kalvon eheys, signalointi ja aineenvaihduntaa, ja täten on tarvetta säännellä sen tasolle solussa [2]. Yksi merkittävä homeostatic mekanismi tapahtuu transkription tasolla, kautta isäntä transkriptiotekijä: steroli-sääntely elementti sitova proteiini 2 (SREBP-2). Sääntely Tämän transkriptiotekijän ovat tarkastelleet Brown ja Goldstein [6]. Lyhyesti, SREBP-2 syntetisoituu esiasteena, sidottu endoplasmakalvostoon (ER). Kun kolesterolin tasot ovat alhaiset, SREBP-2 kuljetetaan ER: sta Golgin laitteeseen, jossa se käsitellään vapauttaa N-terminaalinen domeeni. Tämä kypsä muoto SREBP-2 kulkeutuu tumaan, jossa se säätelee lisäävästi cholesterogenic geenejä, kuten ne, jotka koodaavat LDL-reseptorin (LDLR) ja 3-hydroksi-3-A-reduktaasi (HMGCR). Tämä edistää otto ja kolesterolin synteesiä, kunnes kolesteroliarvot ovat riittäviä, minkä jälkeen SREBP-2 säilyy ER, estäen sen aktivointi ja siten vähen- tämisessä kohdegeenin ilmentymisen. Tämä steroli riippuva palautemekanismin myös säätelee SREBP-1a /c-isoformeja. Yleisesti, SREBP-1c edullisesti ylössäätelee rasvahappojen liittyviä geenejä, SREBP-2 tavoitteet kolesteroliin liittyvien geenien ja SREBP-1 a voi aktivoida sekä [7], [8].

On ehdotettu, että että tämä palaute sääntely SREBP-2 puuttuu PCA kautta havainto, että hoito sterolien vähensi SREBP-2 kohdegeenin ilmentymisen, sekä LDL (LDL) ottoa, normaaleissa soluissa, mutta ei PC-3 ja DU145 PCa solut

in vitro

[9]. Häiriöiden steroli välittämän palautteen selittäisi kertyminen kolesteroli PCA yksilöt [10], [11], ja on tullut laajalti hyväksytty käsite PCA asetus (tarkistetaan [3], [4]). Tämä säätelyhäiriötä merkitsee sitä PCa soluja, ja ehkä syöpäsolujen yleensä (esimerkiksi [9], [12] – [15]), ovat erikoistapaus, koska ne eivät vastaa tällä hetkellä pidettäviä paradigma solun kolesterolin homeostaasin [16]. Kertyminen kolesterolin solun sisällä olisi esimerkiksi jäykistää mitokondrion kalvon, vähentää oksidatiivisen fosforylaation – tämä edistää glykolyysin jopa hapen läsnäollessa (Warburg vaikutus [17]), metabolisen fenotyyppi yleisesti havaittu syöpäsoluissa ja suuri kiinnostus syöpätutkimuksessa [18].

tavoitteena meidän tutkinta oli tutkia kolesteroli sääntelyn syvällisemmin kaksi tavallista PCa solulinjojen, PC-3 ja LNCaP, käyttäen erilaisia ​​ehtoja ja lähestymistapoja. Olemme pyrkineet vahvistamaan aiempia havaintoja SREBP-2 aktiivisuus ei vaikuttanut steroleja [9], ja onko tämä dysregulation vaikuttaa vaste Eturauhassyövän solujen alensi sterolin tasolle. Meidän tulokset, tarjoamme uuden näkökulman kolesterolin homeostaasin näissä PCa solulinjojen, joilla on vaikutusta sekä laboratoriokokeisiin PCa terapia.

Tulokset

Sterol välittämää sääntely SREBP-2 kohdegeenien olemassa eturauhasen syöpäsolujen

tarkastella steroli sääntely SREBP-2 ensisijaisesti, olemme analysoineet mRNA ilmaisun kahden SREBP-2 kohdegeenien (

LDLR

,

HMGCR

), kun manipuloimalla kolesterolin tilan PC-3 ja LNCaP-soluissa. Kokeet suoritettiin alle lipoproteiini-puutteellisia olosuhteissa (lipoproteiini-puutteellinen vasikan sikiön seerumia [FCLPDS]) parantaa vaikutuksia hoidettaessa solujen 25-hydroksikolesteroli- (25-HC), joka on hapetettu kolesterolijohdannainen (oksisteroleja), ja LDL. LDL toimittaa kolesterolin kautta LDLR, esittää fysiologisen vaihtoehdon lisäten solujen sterolin tasoja.

Jos sääntely SREBP-2 on läsnä, lisäämällä sterolien, joko 25-HC tai LDL hoito, vähentäisi SREBP- 2 käsittelyä ja SREBP-2 kohdegeenin ilmentymisen. Toisaalta, statiini kompaktiini (tunnetaan myös mevastatiini) estää HMGCR, joka katalysoi nopeutta rajoittava vaihe kolesterolin synteesiä, ja näin pitäisi lisätä SREBP-2 aktiivisuutta. Ei-syöpäsolujen-linjat, eturauhasen epiteelisolut (PrEC) ja fibroblasteissa (FB), toimi kontrollina, mikä osoittaa molempien palautteen asetuksen (Fig. 1A). Samanlaisia ​​steroli-säätelyyn havaittiin myös PCA solulinjojen (Fig. 1A), toisin kuin aiempien tulosten [9].

Soluja käsiteltiin statiinin kompaktiinia (CPN, 5 uM), oksisteroleja 25 -HC (1 ug /ml), tai LDL (50 ug /ml) 24 tuntia. RNA kerättiin ja mRNA ilmaus

LDLR

ja

HMGCR

geenit analysoitiin qRT-PCR. MRNA-tasot on tehty suhteessa ajoneuvon kunnon, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat keskiarvo + SEM, 3 eri kokeesta kullekin solulle verkossa. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto. (A) esitetyt tiedot Solukohtaisesti-line. *

p

0,05, **

p

0,01, kahden otoksen

t

-testi vastaan ​​ajoneuvon kunnon. (B) Tiedot (A) on päällekkäin jokaisen geenin, esitetty keskiarvona ± SEM kunkin tietokohtaan. PCA solulinjojen edustaa yhtenäisillä viivoilla, kun taas ei-PCa solulinjojen edustaa katkoviivoilla.

PC-3-solut, lisäämällä solujen sterolia asema 25-HC tai LDL vähensi lipogeeniset geenin ilmentymisen, verrattuna ajoneuvon kunnon (Fig. 1A). Samankaltaisuus ajoneuvo- ja kompaktiini-käsitelty PC-3-solujen on epätodennäköistä, koska vastus kompaktiini, koska olemme havainneet, että kompaktiinin estää kolesterolin synteesiä PC-3-solujen metabolinen leimaus (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, kompaktiini huomattavasti lipogeeniset geenin ilmentymistä LNCaP-soluissa ja sterolin käsiteltyjen LNCaP-soluissa oli samanlainen ekspressiokuvioiden ajoneuvon käsiteltyjä soluja (Fig. 1A). Päällekkäisyys suhteellinen mRNA ekspressiotietojen jokaisesta solusta-line (Fig. 1 B) osoitti, että PCA-solut (yhtenäiset viivat) oli vasteen heikkenemisen kompaktiini verrattuna PrEC soluihin, ja oli vähemmän vaikutusta LDL kuin sekä ei-PCa solulinjoja . Kuitenkin nämä PCa solulinjat olivat molemmat herkkiä muutoksille kolesterolin tila.

Sterol-säätelyyn on spesifinen SREBP-2

Koska ilmaisua kahden SREBP-2 kohdegeenien (

LDLR

,

HMGCR

) reagoivat samalla muuttuviin kolesteroli asemaan (Fig. 1), etsimme enemmän suoria todisteita, että tämä vaikutus oli välittämä SREBP-2 transkriptiotekijä.

Koska kypsän SREBP-2 sitoutuu sterolifraktion-säätelyelementti (SRE) tavoitesummalla geenin promoottorialue, kehitimme SRE-erityisiä lusiferaasianalyysissä hyödyntäen LDLp-588luc plasmidista [19], joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasia transkriptionaalisen sääntely

LDLR

promoottori. Käyttämällä kohdennettua mutageneesiä, me häiritsi SRE promoottorialueella tuottaa negatiivinen kontrolli plasmidin, LDLp-mutSRE. Huomasimme, että villityyppinen promoottori (LDLp-588luc) osoittivat ennustetut muutokset lusiferaasiaktiivisuudessa (lisääntyy kompaktiinia hoito, pienenee 25-HC tai LDL hoito), kun taas mutantti promoottori (LDLp-mutSRE) tuotti vähäpätöisiä muutoksia (kuvio . S1). Mutantti-promoottori lusiferaasiaktiivisuus vähennettiin että villityypin promoottori hoito-olosuhteilla, jolloin saatiin SRE-spesifinen aktiivisuus. Tämä lusiferaasi määritys paljasti, että palautteen asetus on tapahtunut PCa soluissa vasteena muuttuneisiin kolesterolia (Fig. 2A).

(A) Solut transfektoitiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Hoitoon kuului statiinin kompaktiinia (CPN, 5 uM), oksisteroleja 25-HC (1 ug /ml), tai LDL (50 ug /ml) 24 tuntia. SRE-spesifinen lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja normalisoitiin ajoneuvon kunnon. Villityypin ja mutantti-promoottorin arvot on esitetty kuviossa. S1. Tiedot ovat keskiarvo + SEM, 3 eri kokeesta kullekin solulle verkossa. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto. *

p

0,05, **

p

0,01, kahden otoksen

t

-testi vastaan ​​ajoneuvon kunnon. (B) Tiedot (A) on päällekkäin, esitetty keskiarvona ± SEM kunkin tietokohtaan. PCA solulinjat edustavat kiinteät viivat, kun taas ei-PCa solulinjoja ovat edustettuina katkoviivoilla. (C) Soluja käsiteltiin CPN (5 uM) tai 25-HC (1 ug /ml) 24 tuntia. Solulysaatit altistettiin SDS-PAGE ja Western blotattiin IgG-1C6 anti-SREBP-2-vasta-aine. C-pään katkaisukohta tuote SREBP-2, SREBP-2 (C), on merkitty nuolella – oletetaan, että kaistan alla on ei-tietyllä taajuusalueella. Probing for α-tubuliinin toimi sisäisenä latauskontrollina. Blot esitetty edustaa vähintään 2 erillisessä kokeessa kullekin solulinjalla.

LNCaP-soluissa, SRE-spesifinen aktiivisuus (Fig. 2A) näytti herkempi kuin SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä ( kuva 1) ja sterolin hoitoon. Näin ollen päällekkäin tiedot kunkin solulinjassa (Fig. 2B) paljasti, että jokainen solu-linjaa vaikuttavat samalla tavalla steroli hoitoa. Sen sijaan, kompaktiini käsittely osoitti jälleen, että PC-3 ja LNCaP-solut eroavat laajuuden homeostaattisten vasteiden: SRE-spesifinen aktiivisuus lisääntyi suuresti LNCaP-soluissa verrattuna ei-PCa solulinjoja (katkoviivat), toisin kuin PC-3-solut (Fig. 2B). Mielenkiintoista on, että PrEC-soluissa, vastaus kompaktiini (Fig. 2A) on pyöristetty verrattuna SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä (Fig. 1A). Tämä viittaa siihen, että muut transkriptiotekijät voivat muuttaa vaikutuksia SREBP-2 kohdegeenin ilmentymisen, oikeuttavat SRE-erityinen lusiferaasianalyysissä.

Kuitenkin SREBP-1a isoformi myös sitoutuu samaan SRE kuin SREBP-2 voimakas affiniteetti [7], mahdollisesti sekoittavat nämä tulokset. Näin ollen testasimme, onko tämä vaikutus oli SREBP-2-spesifinen Western-blottauksella. Koska IgG-1C6 anti-SREBP-2-vasta-aine sitoutuu C-päähän [20], se havaitsee C-terminaalinen lohkomistuote, josta käy ilmi SREBP-2 käsittelyä. Esimerkiksi sterolit edistäisi säilyttämistä SREBP-2 esiaste ER [21], vähentää lohkaista SREBP-2. Olemme havainneet, että 25-HC vähensi SREBP-2 pilkkominen kaikissa kolmessa eturauhasen solulinjojen, kun taas kompaktiini lisääntynyt SREBP-2 lohkaisu PrEC ja LNCaP-soluissa, mutta ei PC-3-solut (Fig. 2C). Siten aste SREBP-2 käsittely korreloi säätelyssä promoottorin aktiivisuutta (Fig. 2A, B) ja SREBP-2 kohdegeenin ilmentymisen (Fig. 1) havaittu tässä PCa solulinjoja. Kaiken kaikkiaan tämä data osoittaa, että PC-3 ja LNCaP-solut ovat herkkiä sterolien, mutta eroavat vasteita kompaktiini hoitoon.

Muutokset SREBP-2 aktiivisuus kääntää toiminnallisella tasolla PCA soluissa

jos haluat nähdä transkription säätelyyn kiinnostavuus homeostatic vaikutuksia kolesterolin aineenvaihduntaan PCA soluissa, tutkimme vaikutuksia muuttamalla sterolin tilan LDLR toimintaa ja kolesterolin synteesiä.

aktiivisuus LDLR määritettiin käyttäen LDL oton määritystä . Inkuboinnin jälkeen Dil-LDL (LDL leimattiin fluoresoivalla väriaineella Dil), sen jälkeen fluoresenssi tarjoamien solujen osoitus LDL oton. Koska LDL sisäistetään 37 ° C: ssa, mutta ei 4 ° C: ssa [22], kukin koe suoritettiin kahdesti samanaikaisesti, yksi joukko soluja inkuboitiin Dil: n kanssa LDL 37 ° C: ssa ja toinen 4 ° C: ssa – ero fluoresenssi kahden sarjojen mitta sisäistetty Dil-LDL. Tämä on myös ohjattu ei-spesifinen sitoutuminen Dil-LDL. Tämä määritys paljasti, että suhteessa ajoneuvon kunnon, 25-HC aiheutti merkittävän vähenemisen Dil-LDL internalisaation kaikki solutyyppejä (Fig. 3A). Sen sijaan kompaktiini lisääntynyt LDLR aktiivisuus LNCaP vain, joilla ei ole merkittävää vaikutusta PrEC soluihin ja aiheuttaa laskua (joskaan ei merkitsevä,

p

= 0,08) PC-3-solut (Fig. 3A).

Soluja käsiteltiin statiinin kompaktiinia (CPN, 5 uM) tai oksisteroleja 25-HC (1 ug /ml) 24 h Medium C. (A) Soluja valmistetaan, käsitellään ja niistä määritettiin Dil -LDL sisäistämisen, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Määrä Dil-LDL sisäistänyt antaa viitteitä LDLR toimintaa. Tiedot esitetään keskiarvona + SEM, vähintään 3 erillisestä kokeesta ja kukin solu-line. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto. (B) käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS: llä ja radioleimattu [1-

14C] etikkahappo 2 tuntia. Radioleimaus suoritettiin läsnäollessa hoito, lukuun ottamatta CPN hoito (jolloin CPN oli poissa). Sitten solut otettiin talteen ja lipidiuutteita tehtiin ohutkerroskromatografia ja phosphorimaging, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Phosphorimages Esitetyt tulokset edustavat vähintään 3 erillisestä kokeesta ja kukin solu-line. Densitometria tehtiin ja tiedot esitetään keskiarvona + SEM kullekin solulle verkossa. *

p

0,05, **

p

0,01, kahden otoksen

t

-testi vastaan ​​ajoneuvon kunnon.

määrittämään kolesterolin synteesiä, solut olivat radioleimattuja käsittelyn jälkeen. 25-HC hoito säilyi radioleimausta, kun taas kompaktiinin hoito poistettiin – koska kompaktiinissa vähentäisi kolesterolin synteesiä, me sen sijaan yritetty simuloida ”statiini rebound vaikutus” [23]. Tämä ilmiö on homeostaattisesta vastaus kompaktiini: normaalisti, kompaktiiniin kasvattaa SREBP-2 käsittely (Fig. 2B), upregulating ilmentymistä kolesterolin synteettisiä entsyymejä. Näin ollen, kun kompaktiini poistetaan, koska korkea entsyymit, tulee olemaan suuri virtaus läpi reitin. Tämä ironisesti aiheuttaa akuuttia kasvua kolesterolitasoa. Tämä voidaan havaita PrEC ja LNCaP-solut (Fig. 3B). Kuitenkin kompaktiiniin esikäsittely yllättäen vähensi kolesterolin synteesiä aikana radioleimaukseen PC-3-solut (Fig. 3B). Tästä huolimatta 25-HC lakkautetaan kolesterolin synteesiä kaikissa kolmessa solulinjoja (Fig. 3B).

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että sääntely sekä kolesterolin ottoa (via LDL) ja synteesi ovat herkkiä steroli- tasolle PCA soluissa.

Basal SREBP-2 aktiivisuus on suurempi PC-3-solujen kuin LNCaP

Vaikka sekä PC-3 ja LNCaP solu- linjat ovat steroli reagoivaa, SREBP-2 aktiivisuutta PC-3-solut näyttivät vähemmän herkkiä alentaa kolesterolia (kompaktiinin hoito, kuviot. 1, 2). Nämä kokeet suoritettiin alle lipoproteiini-puutteellisia olosuhteissa (Medium C), kun taas kaksi-kertainen SRE-spesifisen aktiivisuuden havaittiin kompaktiinia hoitoon (suhteessa ajoneuvon käsittely) täydellä-seerumin olosuhteissa (Fig. 4). Tämä viittaa siihen, että PC-3-solut, Kompaktiininäyte vaikutus on naamioitu ”kylläisyys” of SREBP-2 käsittely lipoproteiinin puutteesta media, niin että lisää kolesterolin puute kautta kompaktiinissa hoito vaikuttaisi vain vähän. Tämä taas tarkoittaa, että PC-3-solut eivät ole herkkiä kompaktiini

sinänsä

, mutta vaativat vähemmän steroli puutteen maksimoida SREBP-2 aktiivisuus verrattuna muihin solulinjojen, kuten LNCaP.

PC-3-soluja transfektoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Hoito sisälsi statiinin kompaktiinia (CPN, 5 uM) tai oksisteroleja 25-HC (1 ug /ml) 24 tunnin, joko koko seerumin (Alusta A) tai lipoproteiiniin puutteellinen seerumia (Medium C). SRE-spesifinen lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, ja normalisoitiin ajoneuvon kunnon. Tulokset ovat + SD edustava 2 erillisen kokeen. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena kohti kunnossa.

Tämä tärkeä ero LNCaP ja PC-3-solut tutkittiin tarkemmin. Kuten tapaustutkimus, perustason sääntelyä ja toimintaa LDLR pidettiin alle lipoproteiiniin puutteellisia olosuhteissa kokeista on kuvattu kuvioissa 1-3. Ensinnäkin mRNA ilmaisu Aineisto huomioon, ovat ACk

t-arvot kynnykseen 10

-1.5 normalisoitu fluoresenssiyksiköinä verrattiin välillä PC-3 ja LNCaP. C

t arvot taloudenhoito geeni, porfobilinogeeni deaminaasia (

PBGD

), oli samanlainen kahden solulinjojen (

p

≈0.73), joiden perusteella tässä vertailussa. Keskimääräinen

LDLR

ACk

t-arvo oli ~ 2 yksikköä alempi PC-3-solut, mikä viittaa 4-kertainen pohjapinta

LDLR

mRNA ilmaisu kuin LNCaP-soluja (kuvio. 5A) . Sen jälkeen, pohjapinta LDLR aktiivisuus oli myös merkitsevästi suurempi PC-3-soluissa (kuvio. 5B).

Data yhdistettiin kokeista, joissa LNCaP-ja PC-3-solut, jotka ajoneuvon käsittely Medium C: ssa 24 tuntia. (A) Kunkin qRT-PCR kokeessa ACk

t arvoja (kynnys = 10

-1.5 normalisoitu fluoresenssi yksikköä) varten

LDLR

geenin suhteen

PBGD

taloudenhoito geeni, katsottiin. Expression on edustettuna kertainen muutos (suhteessa PC-3-soluja), jolloin yhden yksikön lisäys ACk

t johtaa kahden kertaisesti alentunut mRNA: n ilmentymisen. Tiedot esitetään keskiarvona + SEM, vähintään 4 erillisessä kokeessa kullekin solulinjalla. (B) raaka-LDL oton, mitattuna fluoresenssin normalisoida proteiinipitoisuus LDL oton määritystä, oli keskimäärin kokeiden välillä, ja tehdään suhteessa PC-3-soluja. Tiedot esitetään keskiarvona + SEM, vähintään 3 erillisestä kokeesta ja kukin solu-line. (C) Kunkin SRE-erityisiä lusiferaasianalyysissä, tulikärpäsen /

Renilla

lusiferaasi suhteet syntyvät LDLp-mutSRE plasmidin normalisoituivat kuin LDLp-588luc plasmidiin. Tiedot esitetään keskiarvona + SEM, vähintään 5 erillisessä kokeessa kullekin solulinjalla. Kukin koe (A) – (C) suoritettiin kolmena rinnakkaisena per ehto. *

p

0,05, **

p

0,01, kahden otoksen

t

-testi vs. PC-3-solut. (D) malli kuvaa eroja kolesterolin homeostaasin välillä PC-3 ja LNCaP. Kynnys taso solun kolesteroli, jossa SREBP-2 aktiivisuus tulee vähentänyt dramaattisesti, voi olla suurempi PC-3-solut. Tämä vähentäisi vaikutusta statiinien suhteessa pohjapinta kunnossa.

Yhdessä kuvassa. 2C, tämä merkitsee sitä, että pohjapinta SREBP-2 aktiivisuus on suurempi PC-3-solut. Kuitenkin muut transkriptiotekijät voivat myös osaltaan ilmentymisen SREBP-2 kohdegeenien. Näin ollen edellinen SRE-specific lusiferaasi kokeissa analysoitiin uudestaan. Jotta ajoneuvon kunnon suhteellinen lusiferaasiaktiivisuutta tuottamat LDLp-mutSRE (mutatoitunut SRE in

LDLR

promoottori) pidettiin osuutena, joka on LDLp-588luc (villityyppinen

LDLR

promoottori) . MutSRE-fluc lusiferaasiaktiivisuus oletetaan olevan ei-SRE toimintaa, koska kompaktiinia ja 25-HC hoito oli vähän vaikutusta LDLp-mutSRE aktiivisuutta kaikissa solulinjoissa (kuvio. S1). MutSRE-fluc /LDLR-fluc osuus oli suurempi PC-3-solut kuin LNCaP-soluja (kuvio. 5C), mikä muiden transkriptiotekijöiden voi myös edistää eroja

LDLR

mRNA: n ilmentymisen havaittiin näiden solu- linjat (Fig. 5A). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että perustason aktiivisuus alavirtaan SREBP-2 on yliaktiivista PC-3-solut, jolloin maksimaalisen vasteen perusolosuhteissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa etsittiin perehtyä solun kolesterolin homeostaasin PCA ympäristössä. Poikkeava palaute-vaste sterolien näyttää olevan yleinen ilmiö syöpäsoluissa [9], [12] – [15], ja se selittää kolesterolin kasaantuminen kliinisissä PCa [10], [11]. Tulosten perusteella näyttää, että steroli-säänneltyjen käsittely SREBP-2 olemassa PCa soluissa (Kuva. 2C). Niinpä sterolin palaute asetus oli alavirtaan vaikutuksia SRE (Fig. 2B), ilmenemistä koskevat SREBP-2 kohdegeeneissä (Fig. 1 B), ja toiminnallisella tasolla (Fig. 3). Pidimme myös vastaus näiden solujen vähentyneeseen sterolien tasoilla, löytää että PC-3 ja LNCaP erosivat toisistaan ​​astetta asetuksen (Fig. 5).

PC-3-solut, steroleja aiheutti merkittävän laskun in SREBP-2 aktiivisuutta, ristiriidassa aiempien havaintojen [9]. Lisäksi menetelmiin näkökohdat, kuten kvantitatiivisia vs. semi-kvantitatiivisia menetelmiä mRNA määritys, muut tekijät voivat selittää poikkeamat havainnoista. Esimerkiksi on osoitettu, että koolonadenokarsinoomasoluissa ei vaikuttanut steroleja suuremmilla tiheyksillä, mutta osoitti palaute asetus, kun päällystetty alemmilla tiheyksillä [14]. Solut alemmilla tiheyksillä on eksponentiaalisesti kasvavat, korkeammat kolesterolin ottoa ja synteesi hinnat löytyvät sekä syöpä- ja normaalien solujen [14], [24]. Tämä voisi mahdollistaa yhteensovittamisen havaintojen täällä kuin edellisessä tutkimuksessa [9], varsinkin kun niiden kokeiden ajettiin pitemmät (30 ja 45 tuntia, verrattuna 24 h tästä). Me kullattu PC-3-soluja matalalla tiheydellä, jotta overconfluence 48 tuntia, ja sen on todettu herkkyys sterolien jopa 48 h (Fig. S2).

Samoin sterolien todettiin vähentää SREBP-2 aktiivisuutta LNCaP-soluja (Fig. 2). Täällä oli pientä laskua SREBP-2 kohdegeenin ilmentymisen (Fig. 1), kun taas kolesterolin ottoa ja synteesiä lakkautettiin (Fig. 3). Tätä tukee aiempaan toteamukseen sterolit vaimentua ilmentymistä HMG-CoA-syntaasi, toinen SREBP-2 tavoite, LNCaP-soluissa [25]. Siten PCA solut ovat todella herkkiä kasvoi sterolin tasolle. Tämä ei tee tyhjäksi ajatusta häiritsi steroli-palaute PCA soluissa, vaan herättää enemmän kysymyksiä: do laboratorio PCa solulinjoja kertyvät kolesteroli kuten nähdään kliinisessä PCa [10], [11]? Olisiko PCa solut olla vähemmän herkkiä sterolit käytettäessä

in vivo

yhteydessä, kuten ksenografteissa? On selvää, tämä oikeuttaa lisätutkimuksia.

tutki myös päinvastainen tilanne, vähentää kolesterolia käyttäen statiinia kompaktiinin. Samoin kuin PrEC-soluissa, tämä lisääntynyt SREBP-2: n aktiivisuuden (kuvio. 2), parannettu SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä (Fig. 1), ja indusoitiin statiinin-rebound vaikutus kolesterolin synteesiä (Fig. 3B) LNCaP-soluissa. Mielenkiintoista, kompaktiiniin ei vaikuttanut LDLR aktiivisuutta PrEC soluissa (Kuva. 3A), kun se on ehdotettu, että statiinit vähentävät veren kolesterolitasoja lisäämällä LDLR lauseke (nähtävissä täällä kuvassa. 1A) ja siten LDL otto [26]. Tämä näennäinen paradoksi voidaan selittää sillä PCSK9 (proproteiinina konvertaasi subtilisiinin /Kexin tyyppi 9), toinen SREBP-2 tavoite, on havaittu edistävän LDLR hajoamista, mikä rajoittaa tehokkuutta statiinien [27], [28]. LNCaP-solut näyttävät ohittaa tämän sääntelymekanismiin (Fig. 3A), jotka osoittavat lisääntynyt LDLR toiminnan yhteydessä kompaktiiniin hoitoa. Kaiken kaikkiaan tämä osoittaa, että LNCaP-solut reagoivat alhaisen steroli- tasolle.

Sen sijaan, kompaktiini ei aiheuttanut merkittävää kasvua SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä (Fig. 1) PC-3-soluja, suhteessa ajoneuvon kunnon. Kompaktiini vahvistettiin estävän kolesterolin synteesiä metabolinen merkintöjä. Näin ollen, ei ole kompaktiinin vaikutus johtuu todennäköisesti lähes maksimaalinen SREBP-2-käsittelyyn inkuboitu lipoproteiini-elatusalustoissa (Fig. 4). Tukee tätä, pohjapinta tasoja käsiteltyjen SREBP-2 näyttävät olevan eniten PC-3-solut (Fig. 2C), ja pohjapinta LDLR ilmentyminen ja aktiivisuus olivat korkeammat PC-3 kuin LNCaP-solut (Fig. 5A, B). Siten PC-3-solut vaativat vähemmän sterolin puutteen vedotakseen enintään vastausta SREBP-2-reitin. Lisäksi kompaktiini hoito yleensä vähentää LDLR aktiivisuutta (Fig. 3A) ja esikäsittelyn alentaa kolesterolin synteesiä (Fig. 3B), syistä, jotka ovat tällä hetkellä epäselvä.

Näin ollen PC-3 ja LNCaP-solut vaihtelevat niiden kolesterolia homeostaasiin. Radhakrishnan

et al.

[29] ehdottaa ”kytkin kaltainen ohjaus” on SREBP-2 aktiivisuutta, jolloin jyrkkä lasku SREBP-2 käsittely tapahtuu, kun solunsisäinen (ER-) kolesterolitasoja saavuttaa tarkka kynnys. Ehdotamme, että tämä ”sääntely tulkki” on suurempi PC-3-solut (Fig. 4D), mikä vastaa 1) PC-3-solut, joilla on korkeammat pohjapinta SREBP-2 kuin LNCaP, 2) statiineja näyttäisi olevan vähän vaikutusta PC- 3-solut (suhteessa pohjapinta ehto), ja 3) steroleja vähentää SREBP-2 aktiivisuutta sekä PCa solulinjoja.

Tämä ero kolesteroli asetus voi johtua muista fenotyyppisiä eroja näiden solulinjojen, kuten androgen reagointikykyä. LNCaP-solut androgen-herkkien [30], kun taas PC-3-solut ovat suhteellisen androgeenistä riippumaton [31]. Androgeenien on upregulate SCAP ilmentymisen, jotka kasvavat SREBP-2 aktivointi [32]. Koska puute palautteen sääntelyn aiemmin havaittu androgeenisäädellyn riippumaton PCa solulinjoja (PC-3, DU145) [9], on väitetty, että häiriintynyt sterolien palaute voi liittyä androgeenideprivaatio koska SREBP-2 oli yläreguloituja LNCaP ksenografteissa

in vivo

upon isäntä kastraatio [33]. Tämä ei voida sovittaa meidän tuloksia, koska PC-3-solujen havaittiin olevan sterolipohjaisten herkkä täällä. Kuitenkin tekijä osallistuu androgeenista itsenäisyyttä voi suosia PC-3-solut, mahdollisesti nostaa perustason SREBP-2 aktiivisuutta. Vaihtoehtoisesti, muut transkriptiotekijät voivat myötävaikuttaa SREBP-2 kohdegeenin ilmentymistä (Fig. 5c), kuten onkostatiini M: n sitoutuminen SIRE (steroli-riippumaton vaste-elementti) sisällä

LDLR

promoottori [34], lisäten pohjapinta kolesterolin aineenvaihduntaan PC-3-solut. Lisätutkimukset ovat tarpeen rajata täsmällisesti mekanismeja, joiden kolesteroli homeostaasin eroaa näissä PCa solulinjoja – valossa tässä tuoreessa paperi on raportoitu eroja transkription profiilin välillä LNCaP ja PC-3-solujen [35], vaikka ei suoraan liittyvät kolesterolin homeostaasiin.

Näin ollen meidän havainnot tukevat väitettä, että nämä kaksi solulinjoista ei voida rinnastaa synonyymi esimerkkejä PCa solulinjojen varten

in vitro

tutkimuksissa [35], [ ,,,0],36]. On kuitenkin vaikea suhteuttaa Näiden havaintojen hoitopaikassa, koska parhaan tietomme mukaan ole tutkimuksissa on tarkasteltu steroli välittämää sääntely SREBP-2 ja kolesterolin aineenvaihduntaan soluissa eristetty eturauhasnäytteissä. Lisäksi on ollut ristiriitaisia ​​raportteja ilmaisun profiilia PCA sterolikon- liittyvässä. Esimerkiksi viime tutkimukset, joissa tutkitaan muuttuvat profiilin kanssa eteneminen metastaattisen, hormoni-tulenkestävät tila: joissakin tutkimuksissa havaittu lisääntyminen ilmaus SREBP-2 [37] ja sterolin biosynteettinen [38] geenejä, kun taas toinen havaittu laskua [ ,,,0],39]. Tällaiset konfliktit voivat johtua eroista potilasryhmissä, näyte valmisteita, tai mikrosiru alustojen (tarkistetaan [40]).

Tästä huolimatta on väitetty, että LNCaP solut ovat ominaisia ​​kliinisiä PCa kuin PC-3-solujen [41], [42]. Siten havainnot tässä voi olla kliinistä seurauksia: erityisesti, LNCaP on korkeampi LDLR aktiivisuus vastauksena kompaktiini hoitoon. Tämä viittaa siihen, että hoito kolesterolia alentava lääke (kuten statiini) voi aiheuttaa LDL-otto erityisesti PCa soluissa. Tämä merkitsee sitä, että samanaikainen tällaisten kasvainspesifisten kemoterapia-aineiden, sisällytetty LDL tai muihin LDLR sitova rakkuloiden [43], [44], voivat tarjota potentiaalinen hoitovaihtoehto PCA.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Ei syöpää ihmisen PrEC solut saatiin Lonza (Mt Waverley, Vic, AU), ihmisen esinahan FB-solua lahja tohtori Ingrid Gelissen (University of New South Wales, AU)