Krooninen sairaus

tiivistelmä

syövän kehittymiseen liittyy geneettinen alttius ja erilaisia ​​ympäristöaltisteiden. Genominlaajuisten sidos analyysit tarjoavat näyttöä merkittävästä sidos monien sairauksien alttiuteen loci kromosomissa 8p23, sijainti ihmisen defensiinisekvenssin geenin klusterin. Ihmisen β-defensiinien (HBDS) ovat tärkeitä molekyylejä luontaisen immuniteetin. Tutkimuksen tavoitteena oli analysoida ilmaisun ja geneettisen vaihtelun HBDS (HBD-1, HBD-2, HBD-3 ja HBD-4) ja niiden otaksuttu yhdessä paksusuolensyöpä. HBD geenien ilmentyminen ja suhteellinen proteiinin ilmentyminen arvioitiin Real-Time polymeraasiketjureaktio (qPCR) ja immunohistokemia vastaavasti 40 normaaleilla potilailla ja 40 ikä-haun potilailla, joilla on paksusuolen syöpä Saudi-Arabiassa. Lisäksi HBD polymorfismit genotyypattiin eksoni sekvensointi ja promoottori metylointi. HBD-1, HBD-2, HBD-3 ja HBD-4 pohjapinta lähetti-RNA: n ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi kasvaimen kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Useita lisäys mutaatioita havaittiin eri eksonien analysoidun HBDS. Kuitenkaan mitään metylointi missään HBDS promoottorit havaittiin koska rajallinen määrä CpG-saarekkeiden näillä alueilla. Osoitimme ensimmäistä kertaa yhteyden HBD ilmaisun ja paksusuolen syöpä. Tämä viittaa siihen, että on olemassa merkittävä yhteys luontaisen immuniteetin vapauttamisen kautta häiriöitä kationista peptidit (HBDS) ja mahdollinen kehittyminen paksusuolen syöpä.

Citation: Semlali A, Al Amri A, Azzi A, Al Shahrani O, Arafah M, Kohailan M, et al. (2015) Expression and New eksoni mutaatiot ihmisen beeta defensiinien ja niiden yhdistys Colon Cancer Development. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10,1371 /journal.pone.0126868

Academic Editor: Isabelle A. Chemin, CrCl-INSERM, FRANCE

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2015; Julkaistu: 03 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Semlali et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: kirjoittajat laajentaa arvostavansa Deanship tieteellisen tutkimuksen king Saud yliopiston rahoitusta työstä kautta tutkimusryhmä hankkeen nro: RGP-VPP-260 ja by avustusta Fonds Émile-Beaulieu (Laval University Foundation).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä ( CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja neljänneksi yleisin naisten keskuudessa kaikkialla maailmassa [1]. American Cancer Society arvioi, että tulee olemaan yli 96000 uutta tapausta paksusuolen syöpä joka johtaa noin 50000 kuolemantapausta vuonna 2014 (American Cancer Society 2014). Vuonna Saudi Arabia (KSA), paksusuolen syöpä on yksi yleisimmistä sairauksista [2], jossa mediaani-ikä oli 60 vuotta ja miehillä ja 58 vuotta naisilla [3]. Syöpä kehitys on raportoitu ottamaan geneettiset tekijät [4] ja myös erilaisia ​​ympäristöaltisteiden [5]. Geneettinen alttius syöpään on monitekijäinen, somaattisten geneettiset muutokset, kuten mutaatioita oncogenes tai tuumorisuppressorigeeneille [6], ja muutokset geeniekspressioprofilointi tai DNA: n metylaatio. Geeniekspressioprofilointi on tarjonnut uuden tavan luokitella ihmisen kasvaimista [7]. Perustuen mRNA-ekspressiotasot spesifisten geenien, eri alatyyppien syöpä voidaan tunnistaa. DNA: n metylaatio on laajimmin tutkittu epigeneettisellä markkeri [8]. DNA hypermetylaation aiheuttama geenien on yleinen tapahtuma monissa maligniteettien, palvelevat vaihtoehtona mekanismi geneettinen mutaatio vaikuttaa menetys tuumorisuppressorin toimintojen [9,10]. Löytö maailmanlaajuisen DNA hypometylaatio ihmisen kasvaimissa seurasi tunnistaminen hypermetyloitunut tuumorisuppressorigeeneille, ja äskettäin, inaktivaatio mikroRNA (miRNA), jonka DNA: n metylaatio on myös kuvattu [11,12]. Tämä muoto epigeneettiset muutos voi edistää kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen kautta transkription vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille. Itse asiassa, useita geenejä, on osoitettu olevan epigeneettiseltä inaktivoitu ina erilaisia ​​kasvaimia [13]; Siten käsite ”hypermetylaation profiilia” kasvaimia voi olla mahdollinen kliininen sovelluksia [14-16]. Hypermetyloitunut geenit voivat sisältää osallistuvien solukierron säätelyssä (p16INK4a, p15, Rb) [17], DNA korjaus (BRCA1, MGMT), vastus (MGMT), solujen erilaistuminen, angiogeneesiä (THBS1) ja etäpesäkkeiden [13]. Kuitenkin vähän tietoa olemassa roolista vapauttamisen luontaisen immuniteetin geenien ja niiden uskottava yhdessä paksusuolensyöpä. Lisäksi näyttöä rooli luonnollisen immuunijärjestelmän suojaa kasvaimen kehitys on osoitettu tutkimuksissa, joissa on immuunijärjestelmän potilaista [18]. On hyvin dokumentoitu, että heikon immuunivasteen on suora ja käänteinen korrelaatio monien syöpien [19,20]. Kaikki solut ihmiskehossa on useita rivejä puolustuslinja solutransformaatioon, ja ihmisen immuunijärjestelmä on hieno ja hyvin koordinoidun solujen, elinten ja rauhaset, joka suojaa elimistöä sopimatonta fysiologisia sääntelyn purkaminen. Optimoitu immuunijärjestelmä on avain hyvän terveyden ja pitkäikäisyys. Lisäksi luontainen immuunivaste on huomattavaa spesifisyyttä vastaan ​​konservoituneita molekyyli malleja mikro-organismin komponentteja, joita kutsutaan taudinaiheuttajista liittyvä molekyyli kaavoja (PAMPs). Reseptorit, immuunijärjestelmän soluja, jotka tunnistavat PAMPs kutsutaan hahmontunnistus reseptorit (PRRS). Toll-like-reseptorien (TLR) ovat merkittävä luokka PRRS, ja kukin TLR tunnistaa eri PAMP [21-23]. Aktivointi luontainen immuunivaste etenee, vaikka sitoutuminen hahmontunnistuksen reseptoreihin, kuten TLR. Nämä TLR ovat keskeisiä anturit valtaavat taudinaiheuttajia, pitkälti aktivoidaan luontaisen immuniteetin toimijat, kuten epiteelisolujen [23]. TLR signalointikaskadissa voi käsittää aktivointi Jatkemolekyylin MyD88, ja molemmat kaskadeja johtaa NF-KB: n edistämään transkription proinflammatoristen sytokiinien, kemokiinien ja kationiset peptidit tunnetaan myös ihmisen beeta-defensiinien (HBDS). Nämä HBDS kuuluvat perheeseen mikrobilääkkeiden peptidejä, jotka ovat tärkeä osa luontaisen immuunipuolustuksen. Tähän mennessä neljä HBDS (1-4) on tunnistettu ihmisen kudoksissa. HBD-1 konstitutiivisesti tuotettu eri epiteelikudosten kuten hengitysteiden ja ihon [24], kun taas ilmaisuja HBDS ovat indusoituvia [25]. Erityisesti, HBD-2 on erittäin ilmentyy normaaleissa epiteelisoluissa seuraavat kosketuksissa mikro-organismien tai sytokiinin (TNF ja IL-1) stimulaatio [26,27].

Niiden genominen rakenne koostuu kahdesta eksonia ja yksi introni. Ensimmäinen eksoni koodaa signaalipeptidiä, ja toinen koodaa kypsää peptidiä, jota edeltää lyhyt anioninen pro-peptidi. Kypsä peptidi on saatu sen jälkeen, kun proteolyyttisen signaalisekvenssin. Huolimatta alhainenkin yhtäläisyyksiä näiden proteiinien, niiden 3D rakenteita on samanlainen defensiinisekvenssin kaltainen topologinen kertainen koostuu kolmesta-säikeiden järjestetty kolmeen anti-rinnakkaista levyt rajoittavat kolmen molekyylin sisäisten disulfidisiltojen [28,29]. Beeta-defensiinien on klusterin kationisia tähteitä (Lys, Arg) lähellä karboksyylipäät peptidejä. C-terminaalin positiivisesti varautuneita aminohappoja olla ratkaiseva rooli antimikrobinen aktiivisuus [30,29]. Positiivinen nettovaraus ja vedenhylkimisominaisuuksilla edistää HBDS vuorovaikutusta mikrobien kalvoja. HBDS käyttää suoraa mikrobeja tuhoava vaikutus ja ovat aktiivisia bakteereja, sieniä ja viruksia; rinnakkain Uusimpien tietojen, niillä useita biologisia vaikutuksia, etenkin, immuno-modu niitä [29], ja ne osallisena kasvaimen vastaisen vasteen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää sääntelyn purkaminen HBDS geeniekspressioprofiili, HBDS eksonin mutaatioita, ja promoottori metylaatio HBDS sekä yhdistys näiden havaintojen kanssa paksusuolen syövän edistämiseen ihmisillä. Eräästä kliinisestä näkökulmasta, proteiineja, jotka ovat mukana näiden reittien voivat toimia kohteina syöpähoitoa kautta mahdollinen käyttö HBD /TLR-immunoterapiaa.

Tulokset

Kliiniset tiedot potilaiden diagnosoitu paksusuolen syöpä kautta kolonoskopia

kliininen ominaisuudet 40 Saudi potilailla, kuten ikä, kansallisuus, suvussa, tupakointi, vaiheessa paksusuolen syöpä, lääkkeitä ja läsnäolo muiden sairauksien, kerättiin ja verrattiin paksusuolen syöpä ja ohjata potilaita. Kokoukseen ilmoittautuneiden väestö koostuu tupakoimattomien ilman suvussa paksusuolen syövän ja ilman allergioita. Tutkimusaineisto ikä vaihteli 45 ja 75 vuotta, ja keskimääräinen 60 ± 16,56 vuotta miehillä ja 55 ± 13,74 vuotta naisilla (taulukko 1). On myös mielenkiintoista huomata, että suuri määrä osallistujia kärsii paksusuolen syöpä ei kemoterapiaa tai sädehoitoa.

Differential HBD geeniekspressio paksusuolensyöpä kudoksissa

analysoimiseksi ekspressio eri HBDS (1-4) mRNA-tasolla, kvantitatiivisen tosiaikaisen käänteistranskriptio-PCR suoritettiin käyttämällä paksusuolen syövän ja normaalit kudokset eristetty samasta potilaasta. Kuten kuviossa 1, ekspressiotasoja kaikista HBDS laskivat syöpäkudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin. Tarkemmin sanottuna HBD-1 tasot laskivat merkitsevästi (p 0,0001) välillä 0,99 ± 0,02 normaaleissa kudoksissa 0,29 ± 0,14 syövän kudoksissa (kuvio 1A). HBD-2 tasossa laski 1,03 ± 0,08 kontrolleissa 0,36 ± 0,18 syövän kudoksissa, joissa p 0,0001 (kuvio 1B). HBD-3 laski 1,11 ± 0,11 kontrolliryhmässä kudoksen 0,48 ± 0,09 syövän kudoksissa (kuvio 1 C), ja HBD-4 laski 0,99 ± 0,03 kontrolliryhmässä kudoksiin 0,46 ± 0,10 syövän kudoksissa (kuvio 1 D) .

Yhteensä RNA juuri uutettiin normaalista ja paksusuolen syövän kudosten käänteiskopioitiin cDNA: ta ja sen jälkeen käytetään mittaamaan HBD mRNA: n ilmentymisen (Panel1A 1D).

immunohistokemiallinen vertailu eri antimikrobiset peptidit

vahvista mRNA ekspressiotietojen, määritimme HBDS proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti. Kuten on esitetty kuviossa 2A, positiivisen immuno-värjäystä HBDS yleisesti havaittu normaalissa paksusuolen epiteelisoluissa ja myös joissakin stroomasoluissa. Kuitenkin intensiteetti värjäämällä kaikkien HBDS oli pienempi adenokarsinooma paksusuolen kasvaimen kudokset. Jotta määritetään kvantitatiivisesti ero ilmentymistä HBDS paksusuolen syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin, laskimme positiivisten solujen ja määritettiin mielivaltaisesti ilmentymisen tasolla, kuten on esitetty kuviossa 2B 2D. Nämä tulokset vahvistivat alhainen HBDS syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Havaittu vähäinen HBD proteiinien vahvistaa havainto alhainen HBD geenin ilmentymisen.

Kudokset immunovärjättiin käyttäen spesifisiä HBD vasta-aineita (Panel 2A). hBD- solujen määrässä kudoksia arvioitiin seuraavasti: 0 pistettä, mitään positiivista väriä; 1 piste, 20% positiivista värjäytymistä; 2 pistettä, 21-50% positiivista värjäytymistä; 3 pistettä, 51-75% positiivista värjäytymistä; ja 4 pistettä, 75% positiivista värjäytymistä. Tämä on esitetty paneeli B.

yleisyys HBD eksonin mutaatioiden paksusuolen syöpäpotilaiden

tutkimiseksi yhdistyksen HBD mutaatioiden ja niiden alempi ilmaisun paksusuolensyöpä potilailla, eksoni sekvensointia varten kaikki HBDS analysoitiin.

de novo

mutaationopeus HBDS on arvioitu taulukossa 2, ja HBD-1; kolme mutaatiota havaittiin eksonin 1 (kaksi 5’UTR alueella ennen käännetty sekvenssi ja yksi promoottori). Nämä mutaatiot eivät vaikuta proteiinin rakenteeseen, mutta se voi vaikuttaa ilmaisun ja mRNA: n stabiilisuudessa. Kaksi muuta lisäys mutaatioita havaittiin käännetty alueella eksonin 2, joka johti epäkypsä proteiini. Olemme myös löytäneet viisi mutaatiota 3′-alue (3’UTR). 3’UTR tiedetään sisältää säätely- elementtejä, jotka ovat olennaisia ​​asianmukaisen useiden geenien ekspression. Kahdenlaisia ​​mutaatioita havaittiin: 8 (80%) oli insertioita ja 2 (20%) oli siirtymiä. Kuten taulukossa 2 on esitetty, on sama potilas voi sisältää yhden tai useamman mutaation, että hBD1 alueella (esimerkiksi T17 = paksusuolen syövän potilaan numero 17 oli 3 eri mutaatiot HBD-1-geeni). Siirtyminen mutaatio 3’UTR HBD-1-geeni ei liity paksusuolensyöpä, mutta on sen sijaan liittyy Saudi väestölle, koska todettiin kaikissa normaaleissa ja syövän osallistujien yhtä tapausta lukuun ottamatta (T4).

HBD-2, neljä yhteensä mutaatioita havaittu paksusuolen syövän kudoksissa, mutta ei normaaleissa kudoksissa: kolme promoottori (yksi siirtymä mutaatio ja kaksi lisäys mutaatiot), ei ole mutaatioita käännetty sekvenssit eksonin 1 ja eksonin 2, ja kaksi siirtyminen mutaatioita 3’UTR alueella (yksi siirtymä 3’UTR ei liity paksusuolensyöpä mutta Saudi väestöstä). HBD-2, kolme mutaatiota havaittiin: 1 (20%) oli transversion, 2 (20%) oli insertio ja 3 (60%) oli siirtyminen mutaatioita. Kaikki mutaatiot havaitaan HBD-2 ei ole seuraus proteiinien rakennetta, mutta voivat vaikuttaa HBD-2 ilmaisun ja geenin vakautta. HBD-3, kaikki mutaatiot (100%) havaitut insertion mutaatioita (taulukko 2): yksi insertio havaittiin 5’UTR alueella, yksi insertio havaittiin käännetty sekvenssin eksonin 1, joka indusoi täydellisen sekvenssin muutos alkaen jäännös 4 sekä kolme muuta mutaatiota käännetty alue eksoni 2 (yksi näistä lisäyksiä oli lähellä lopetuskodonin), ja kolme insertiot havaittiin 3’UTR alueella HBD-3-geenin. Insertiot 7 ja 8 olivat ominaisia ​​Saudi väestölle ja ei ole liittynyt paksusuolensyöpä; kaikki kasvaimet ja kaikki normaaleissa kudoksissa esitetään nämä mutaatiot (taulukko 2). In HBD-4, yhteensä kolme mutaatiota havaittiin: yksi 5’UTR- jotka eivät vaikuttaneet HBD-4-proteiinin rakenne ja kaksi eksonissa 2, jotka tuottavat epätäydellisen järjestyksessä, jossa täydellinen sekvenssi muutos alkaen tähteiden 22 ja 56. Kaksi tyyppisiä mutaatioita havaittiin HBD-4: 1 (30%) oli siirtyminen ja 2 (60%) oli insertioita (taulukko 2). Kuitenkaan mitään metylointi missään HBDS promoottorit havaittiin koska rajallinen määrä CpG-saarekkeiden näillä alueilla.

Rakenne-Funktioanalyysi

Olemme tutkineet geenituotteen kunkin eksonin vaikuttaa heistusmutaation seurauksena havaittujen nukleotidin insertioita. Näin saatu sekvenssi käännösten kunkin HBD vaikutusalueella eksonin tuotteet kuvioissa 3 ja 4. Molemmat lisäykset on eksonin 2 HBD-1, kuten on esitetty taulukossa 2, aiheuttavat runko-shift mutaatioita jälkeen peptidi signaalisekvenssin (kuvio 3A) . Tämän vuoksi ei kypsä hBD1 proteiini voidaan syntetisoida. Ei lisäys löydettiin eksoni 2 ihmisen HBD-2-geenin (kuviot 3B ja 4B). Viisi lisäykset löydettiin HBD-3-geenin paksusuolen syöpä. Insertion 1 johtaa heistusmutaation tähteestä 3 peptidissä signaalisekvenssin, jossa ei ole kypsä HBD-3 synteesi (kuva 3C). Insertion 2 aiheuttaa heistusmutaation vaikuttavat 5 6 C-terminaaliset tähteet, C63 → L, R64 → P, R65 → K ja K66 → E (kuvio 3C). Lisäksi, joka on asetettu isoleusiini löytyy sekvenssin mutatoidun HDB-3: n C-terminaaliseen päähän (kuvio 3C). Arvioimaan seurausta mutaation rakenteesta HBD-3, rakensimme HBD-3 molekyyli malli, jonka mutaatiot vaikuttavat C-pään. Kuvio 4C ja 4D havainnollistaa mutaatioiden on kolmiulotteinen malli HBD-3 verrattuna villityypin proteiinia. Kuten on esitetty kuviossa 4C ja 4D, syöpäkudoksessa, mutantti 2 puuttuu kolmas disulfidisidoksen Cys63-Cys45 johtuen Cys63 → Leu mutaatio. Olemme ennustaa, että tämä mutantti on vähemmän stabiili rakenne kuin villityypin proteiini. S3 Taulukko luetteloi vaikutuksia muiden mutaatioiden. Olemme laskeneet ennusteita proteiinin vakauden molekyylirakenteen HBD-3 käyttäen sekä popmusiikin [31] ja CUPSAT [32] ohjelmia. Kuva 3C ja kuvio 4C ja 4D luettelee havaitut heistusmutaation tyyppejä ja vastaavat vakauttava /epävakautta vaikutuksia HBD-3 rakenne. Mutaatiot Cys63 → Leu ja Arg64 → Pro vaikuttaa aminohappoja, jotka on haudattu rakenne ja määritettiin olevan energeettisesti epävakautta, mikä viittaa vähenemiseen proteiinin vakautta. Mutaatiot Arg66 → Lys ja Lys67 → Pro vaikuttaa liuottimella altistuvat jäämiä ja määritettiin olevan energeettisesti vakauttava (taulukko 3). Lisäys 3 eksonin 2 tuotettu Lys67 → Glu ja lisäksi jäännös I68, joilla ei ole vaikutusta rakenteen vakautta. Insertion 4-2 tuottaisi proteiinin ylimääräinen C-päätteen leusiinia (kuvio 3C).

Mutaatiot on korostettu punaisella kullekin HBDS geeniä.

Mitä HBD-4, lisäys 1 voi aiheuttaa frame-shift-mutaation alkaen kaksi tähdettä jälkeen signaalipeptidisekvenssiä, jolloin eston kypsän HBD-4-proteiinin synteesiä. Insertion 2 lisätään heistusmutaation alkaen jäämiä 55-63, tuottaa katkaistun HBD-4 mutantti proteiini

Keskustelu

Colon syöpä on huomattava riski kansanterveydelle; on havaittu olevan toiseksi yleisin syöpään Saudi väestöstä [33] ja sijoittui toiseksi syövän kuolleisuus Yhdysvalloissa [34]. Monet geneettiset ja epigeneettiset mekanismit on määritetty edistää paksusuolen syöpä, mukaan lukien CpG-hypermetylaatio, ei-koodaavat RNA: n muutokset, somaattisten mutaatioiden ja lysiinin asetylaatio histonien [35]. Hyvin harvoissa tutkimuksissa on keskitytty epigeneettiset muutokset vastaavat tämän taudin kehitystä. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme ensimmäistä kertaa selvä yhteys HBD ilmaisun /tuotanto ja paksusuolen syöpä. Tuloksemme osoittivat vähentämään merkittävästi HBDS syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Nämä tiedot ovat tukevat niitä, joita on aiemmin raportoitu HBD-1in munuaisten tai eturauhassyövän [36-38] ja myös suun levyepiteelisyöpä (OSCC) [39,40]. Mielenkiintoista, samanlainen raportoitu HBD-2, joka osoittaa, että HBD-2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen oli merkitsevästi väheni sylkirauhasen syöpä [41]. Muut tutkimukset käyttävät erilaisia ​​syöpä solulinjoja ovat myös osoittaneet, että HBD-2 voi ohjata solujen kasvun kautta pidätys G1 /S siirtyminen ja aktivointi pRB pahanlaatuisia epiteelisolujen [42]. HBD-3: n tiedetään tukahduttaa syövän solujen vaeltamiseen [43]. Suun okasolusyöpä, ihmisen beeta-defensiini 1, 2 ja 3 osoittavat vastakkaiset vaikutukset soluproliferaatioon. Siksi HBD-1 voitiin määritellä tuumorisuppressorigeeniä, kun taas HBD-2 ja -3 ehkä esikasvaintekijät [44].

vapautuminen geeniekspression odotetaan vaikuttavan 1-3% of transcriptome [45], kuten luontaisen immuniteetin geenejä, joiden ilmentyminen on pääasiassa alassäädetty syövän kudoksissa. DNA: n metylaatio CpG-rikas promoottorialueille on saada tunnustusta keskeisenä mekanismi inaktivoinnissa saman geenien kuin luontaisen immuniteetin ja tuumorisuppressorigeeneille syöpäsoluissa [46]. Toinen mekanismi geenin toiminnan on somaattisia mutaatioita. Opinnäytetyöt mutaatiot edistävät syövän muodostumista. Meidän hypoteesi oli, että alas-säätely HBD geenin ilmentymisen paksusuolensyöpä kudoksissa voi johtua läsnäolosta epigeneettiset muutokset, erityisesti mutaatiot HBD eksonit. Sen sijaan ei ollut havaittavissa metylaation kaikissa HBDS promoottorit normaalin paksusuolen kudoksiin ja syövän paksusuolen syöpä (tuloksia ei ole esitetty). Tämä saattaa johtua siitä, että pienempi määrä CpG saaria HBD promoottorit. Olemme varmistaneet, että potilailla, joiden runko-shift mutaation HBDS proteiini olivat täysin poissa. Kasvava kiinnostus beta defensiinit on tasaisesti parantaa tietämystä eri näkökohtia geenin sijainti ja ilmaisun kuvioita ja transkriptiotekijät mukana niiden sääntelyä. HBD genominen rakenne koostuu kahdesta eksonista ja yksi introni. Ensimmäinen eksoni koodaa signaalipeptidiä, ja toinen koodaa kypsää peptidiä, jota edeltää lyhyt anioninen pro-peptidi. Sen lisäksi, joilla on samankaltainen proteiinin laskostumiseen ja rakenne, rakenteet HBD-1, -2, ja -3 ovat myös paljastaneet, että kukin proteiini on stabiloitu kolme disulfidisiltaa välillä konservoituneiden kysteiinien. Tässä tutkimuksessa, monia uusia mutaatioita, yleensä insertiot, havaittiin eri eksonit (1/2). Nämä mutaatiot edistävät merkittäviä muutoksia proteiinin rakenteessa HBDS (so HBD-1, HBD-3 ja HBD-4). HBD-1 mutaatioita ja mutaatio 1 HBD-3 ovat haitallisimpia, koska ne johtavat katkaistun preproteiinien ilman ennustettu kypsä HBD-1 proteiinisynteesiä. HBD-3 mutaatio 2-proteiini huomattavaan epätasapainoon, koska ei ole disulfidisillan aiheuttama vaihdosta Cys63 → Leu. Lisäksi, samalla mutantti, Lys67 → Glu korvaaminen tuo negatiivisesti varautunut, hapan jäännös positiivisesti varautunut, hydrofobinen C-terminaalinen kohta. Kuten todettiin, että yhdistäminen positiivisten varausten: n C-terminaalinen osa on tärkeä antimikrobisen aktiivisuuden [47], käyttöönotto negatiivisesti varautuneen tähteen ennustetaan vaikuttavan proteiinin toimintaan. Sekä HBD-4-mutanttien ennustetaan olevan mitään toiminnallista peptidi muutosten vuoksi proteiinin järjestyksessä. Ei rakenne ennustus voidaan suorittaa tämän mutantti, koska sen rakenne ei ole käytettävissä. Toinen mutaatiot löytyy HBD promoottorialueen ennustetaan vaikuttavan ilmaus /vakaus säätelyalueita (5’UTR ja 3’UTR) paksusuolen syövän kudoksissa, mikä selittää sen ilmentymistä näiden HBDS määrä väheni paksusuolen syövän kudoksissa verrattuna normaali kudosten. Useita muita mutaatioita havaittiin intronit kaikkien HBDS, jotka joko ensisijaisesti olemassa kaikissa kudoksissa Saudi väestön (normaali ja syöpä) tai havaittiin vain kudoksissa potilailla, joilla on paksusuolen syöpään (tuloksia ei ole esitetty). Nämä intronin mutaatiot voivat olla mahdollinen rooli paksusuolen syövän, ja tämä havainto vaatii lisätutkimuksia. Koska HBDS aktiivisesti rooli luonnollinen immuniteetti, läsnäolo eksonin mutaatioita HBDS voi johtaa dysregulaatio luontaisen immuniteetin ja myöhemmin vaikeuttaa immuunivalvonnan vastaan ​​paksusuolen syövän kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Yleiset reagenssit

RNA tikapuut saatiin Ambion /Life technologies (Burlington, oN, Kanada). DNA /RNA sarjat olivat Qiagen (Hilden, Saksa). Alukkeet saatiin Life technologies /Invitrogen (Burlington, ON, Kanada). Suuren kapasiteetin cDNA käänteistranskriptiolle pakki oli Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green saatiin Bio-Rad (Mississauga, ON, Kanada). HBD vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA.). HBD-1 (N-20) on anti-kani-lgG-N-pääte, HBD-2 (C-17) on anti-vuohen IgG: tä N-pään. HBD-3 (FL-67) on anti-Rabbit IgG N terminaaliin. HBD-4 (FL-72) on anti-Rabbit IgG N terminaaliin. Mega BACE Kitti sekvensointi saatiin GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, UK), ja EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit DNA: n metylaatio saatiin Qiagen (Toronto, Kanada).

Potilasnäytteet

näytteitä kerättiin 40 potilaalla diagnosoitiin olevan paksusuolensyöpä (24 urosta ja 16 naarasta, välillä 45 ja 75 vuotta, ja keskiarvo oli 60 ± 16,56 vuotta miehillä ja 55 ± 13,74 vuotta naisilla ja 40 samanikäisiä normaali säätimet no syöpää. tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board eettisen komitean king Khalid University Hospital Riadissa, KSA numero 12/3352 /IRB. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Normaali kudosten kaukaisessa marginaali kasvain kerättiin aikaan tähystykseen. diagnoosi syövän perustui normaaliin kliiniseen, endoskooppinen, säteily- ja histologiset kriteerit. kliiniset ja demografisia ominaisuuksia rekisteröitiin myös ikä diagnoosin, sukupuoli, suvussa, tupakointi tavat, sairaus käyttäytyminen, tauti sijainti, ja leikkauksen tarve (taulukko 1). Kudosnäytteet käytetään RNA: n eristykseen, immunohistokemia ja genomisen DNA: n uuttoa.

kudosnäytteitä voidaan käyttää RNA-analyysiä varten otettiin heti upotettiin RNA myöhemmin liuokseen (Ambion, Courtabeuf, Ranska).

RNA: n eristys, käänteistranskriptio ja geenin ilmentyminen reaaliaikaisella RT-PCR

Yhteensä kudos-RNA uutettiin käyttämällä DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Pitoisuus, puhtaus ja laatu eristetyn RNA olivat kaikki määritettiin käyttämällä Agilent 2100 Bio-analysointijärjestelmissä ja Agilent Pieni RNA-analyysi Kit ohjeiden mukaisesti valmistajan toimittamien (Agilent Technologies, Waldbronn, Saksa).

RNA (1 ug kutakin näytettä), tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen suuren kapasiteetin cDNA käänteistranskription kit (Applied Biosystems, Warrington, USA). Edellytykset valmistamiseksi cDNA PCR-analyysi oli 10 minuuttia 25 ° C: ssa, 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja 5 min 85 ° C: ssa. Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [48-50]. Määrät mRNA transkriptien mitattiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Fast reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä. Reaktiot suoritettiin käyttäen PCR SYBR Green Supermix Applied Biosystems. Alukkeet lisättiin reaktioseokseen, jonka lopullinen konsentraatio oli 250 nM. Viisi mikrolitraa kutakin cDNA näytettä lisättiin 20 ui PCR-seosta, joka sisälsi 12,5 ui SYBR Green Supermix ja 0,5 ui spesifisiä alukkeita (HBDS tai GAPDH (S1 taulukko)) ja 7 ui RNaasi- /DNaasi-vapaaseen veteen. Jokainen reaktio suoritettiin 7500 nopea reaaliaikainen PCR Thermal Cycler. Termosyklisointireaktio olosuhteet HBDS määritettiin, kuten 5 min 95 ° C: ssa, jota seurasi 36 sykliä 15 s 95 ° C: ssa, 30 s 63 ° C: ssa (lukuun ottamatta HBD3 52 ° C: ssa), ja 30 s 72 ° C, jossa kunkin reaktion tehdään kolmena kappaleena. Spesifisyys kutakin aluketta parin varmistettiin, että läsnä on yksi ainoa sulamispiste huippu. GAPDH tuotetaan yhtenäinen ilme määrät vaihtelivat alle 0,5 CT välillä näyte olosuhteissa, ja näin ollen käytetään referenssinä geeni tälle tutkimukselle. Monistetut tuotteet ajettiin agaroosigeelillä sen varmistamiseksi, että ei ollut vääriä tuotteita monistettiin aikana sykliä. Tulokset analysoitiin käyttämällä 2

-ΔΔCt (Livak) suhteellinen ekspressio menetelmällä.

valmistaminen koepaloja immunohistokemiaa

Parafiini-upotettu lohkojen paksusuolisyöpäkudoksessa ja normaalin paksusuolen kudos näytteet leikattiin 3-pm paksu osissa. Leikkeet asennettu suolaliuoksella päällystetty dioja ja inkuboitiin 15-20 minuuttia kuumassa ilmassa uunissa 60 ° C: ssa. Kudosleikkeet parafiini EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) 75 ° C: ssa, lämpö esikäsitellä Cell Conditioning 1 (CC1, Ventana, Arizona, USA) käyttäen ”standard cell conditioning” protokolla antigeenin haku 100 ° C, ja sen jälkeen inkuboitiin yksi tippa-inhibiittorin liuosta neljän minuutin ajan 37 ° C: ssa ja pestiin sen jälkeen. Levyjä inkuboitiin 32 minuuttia 37 ° C: ssa yksi seuraavista vasta-aineita (laimennettuna 1: 100): anti-humaani-HBD-1, anti-humaani-HBD-2, anti-ihmis-HBD-3 tai anti- ihmisen HBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Sitten sekundaarisen vasta-aineen UltraView yleinen HRP multimeeri lisättiin. ImmunolocalizedhBD-1, HBD-2, HBD-3 ja HBD-4 proteiinit tehtiin näkyviksi käyttäen kupari-tehostetun DAB reaktion. Negatiivinen tyhjä kontrollit valmistettiin aikana värjäytyminen, jossa ensimmäinen vasta-aine oli jätetty pois ja korvattiin PBS: llä. Levyjä vastapäivään värjättiin hematoksyliinillä II ja sinistämisaineita Reagent (Ventana, Arizona, USA) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen, neste kansi-slip (LCS) lisättiin esteenä välillä vesi- reagenssien ja ilman ja haihtumisen estämiseksi, mikä tarjoaa näyte vakautta. Tämän jälkeen näytteet asennettavaksi DPX oli kuivattu peräkkäisellä pesulla arvostellaan alkoholit: 70% etanolia, 96% etanolia ja absoluuttista etanolia ja kaksi muutosta ksyleeniin. Sen jälkeen lisäsimme pieni pisara DPX olevan mallin kuin määrä median. Immunoaktiivisuus värjätyt leikkeet analysoitiin Olympus BX51 valomikroskoopilla ja DP72 Olympus digitaalikamera (suurennus 200X ja 400X) (Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA).

Tulospalvelu annettiin tason mukaan ja alue väri seuraavasti: 0 pistettä, mitään positiivista väriä; 1 piste, 20% positiivista värjäytymistä; 2 pistettä, 21-50% positiivista värjäytymistä; 3 pistettä, 51-75% positiivista värjäytymistä; ja 4 pistettä, 75% positiivista värjäytymistä.

vetysulfiittikäsittelyä

Voit tarkistaa metylaatiostatuksen promoottorialueen bisulfiittikäsittelyn ja talteenotto näytteitä suoritetaan EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (QIAGEN) noudattamalla valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 2 ug DNA: ta 20 ul: n tilavuudessa käytettiin kussakin reaktiossa ja sekoitetaan 85 ui bisulfiitti sekoitetaan ja 35 ui DNA: ta suojaavat puskuria. Bisulfiittikonversion suoritettiin termosyklerissä seuraavasti: 99 ° C 5 min, 60 ° C: ssa 25 min, 99 ° C: ssa 5 min, 60 ° C: ssa 85 minuutin ajan, 99 ° C: ssa 5 min, 60 ° C: ssa 175 min ja 20 ° C: ssa loputtomiin. Vetysulfiitilla käsiteltyä DNA otettiin talteen EpiTect spin-pylvääseen ja sen jälkeen sekvensoitiin tehokkuuden bisulfiittikonversion. Eluoitu genomista DNA: ta käytettiin promoottorialue vahvistusta ja sekvensointi.

Polymeraasiketjureaktio ja sekvensointi

Genominen DNA uutettiin kaikista näytteistä käyttäen DNA-reagenssipakkausta Qiagen (Hilden, Saksa). DNA-pitoisuus kustakin näytteestä mitattiin käyttäen NanoVue UV-spektrofotometrillä. Kaikki eksonit HBDS (1, 2, 3 ja 4) monistettiin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) alukkeet (S2 taulukko). Eteenpäin ja taaksepäin eksonin alukepareja käytettiin PCR-reaktioissa on kuvattu S2 taulukossa. PCR-seos sisälsi 50 ng DNA: ta, 5 pmol /l kutakin aluketta, 2.5nmol /ml kutakin dNTP ja 1,25 U Taq DNA-polymeraasia 20 ui puskuria 0,04 mikromol /l Mg2 +. Alun denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 5 min, 35 PCR-sykliä, johon sisältyi 45 s denaturointi 94 ° C: ssa, 30 s hehkutus 60 ° C: ssa, ja 45 s pidennystä 68 ° C: ssa. PCR-tuotteet analysoitiin 1% agaroosigeelielektroforeesilla. Todettuaan selkeä ja tarkasti kokoinen bändejä, Monistamistuotteet Sitten puhdistettu ja sitä sekvensoitiin Sanger-sekvenssi tunnistusjärjestelmä (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, USA).

Rakenteelliset analyysi mutaatioiden

3D-rakenne ihmisen beeta defensiinit (Protein Data Bank entry 1KJ6) [51] käytettiin vaikutusten arvioimiseksi valitun geenin frame-shift mutaatiot rakennetta entsyymin. 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.