Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimuksessa kuvataan herkistyminen mekanismin terminen stressiä histonideasetylaasi- inhibiittorit (HDACIs) keuhkojen syöpäsoluja ja osoittaa, että Ku70, joka perustuu sen asetylointi asemasta, välittää suojelu keuhkosyöpään hypertermia ( 42,5 ° C, 1-6 tuntia). Ku70 säätelee apoptoosin sitomalla proapoptoottisten Bax. Kuitenkin, sen rooli lämpökuormaa ei täysin ymmärretä. Tulosten mukaan, esikäsitellään keuhkosyövän soluja HDACIs, nikotiiniamidi (NM) tai Trichostatin A (TSA) tai molemmat merkittävästi parannettu lämmönnousua aiheuttama Bax riippuvaisen apoptoosin PC-10-soluissa. Huomasimme, että lämmönnousua indusoi SIRT-1, Sirtuin, säätelyä mutta ei HDAC6 tai SIRT-3, siis transfektio hallitseva negatiivinen SIRT-1 (Y /H) on myös eliminoitu suojaa ja johti enemmän solukuoleman kuume, vuonna H1299 soluihin Bax aktivaation. Hypertermia yksin pohjustettu keuhkosyöpään solujen apoptoosin ilman näkyvästi kuolema. Sen jälkeen hypertermia Bax oli voimistunut, Bcl-2 oli vaimentua, Bax /Bcl-2-suhde oli käänteistä ja Bax /Bcl-2-heterodimeeri hajotettiin. Vaikka lämmönnousua ei vaikuttanut yhteensä Ku70 ekspressiotaso, se stimuloi Ku70 deasetylaatiolla, mikä puolestaan ​​voi sitoa enemmän Bax PC-10-soluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen paeta mekanismi lämmönnousua aiheuttama Bax aktivaation. Voit tarkistaa aseman Ku70 tässä suojamekanismi, Ku70 oli vaiennetaan siRNA. Ku70 hiljentäminen huomattavasti herkistynyt keuhkojen syöpäsoluja hypertermiaan. Ku70 KD solut tehtiin sytotoksinen G1 pidätys ja kaspaasiriippuvaisen apoptoosin verrattuna salattuja transfektanttien joka osoitti vain G2 /M sytostaattista pidätykseen solulinjoissa tutkittu, mikä viittaa ylimääräinen solusyklin riippuvaista, romaani, rooli Ku70 suojelemisessa lämmönnousua. Yhdessä meidän tiedot osoittavat Ku70 riippuvaisen suojaa mekanismia lämmönnousua. Kohdistaminen Ku70 ja /tai sen asetylointi aikana lämmönnousua voi edustaa lupaavaa terapeuttista lähestymistapaa keuhkosyöpään.

Citation: Hassan MK, Watari H, Salah-Eldin A-e, Sultan AS, Mohamed Z, Fujioka Y, et al. (2014) histonideasetylaasi- estäjät herkistää Lung Cancer Cells hypertermiaan: osallistuminen Ku70 /SIRT-1 Thermo-suojaus. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10,1371 /journal.pone.0094213

Editor: Sue Cotterill St. Georges, University of London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 30 elokuu 2013; Hyväksytty: 14 maaliskuu 2014; Julkaistu: 11 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Hassan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain avustus-in-tuki HW tieteellisen tutkimuksen (C 22591844 ja 20659255) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pitkäaikainen tutkimus osuus on suunnattu erityisiä mekanismeja vastuussa kehittämisestä syöpäsolujen vastustuskyky eri hoitomuotoja. Kohdistaminen nämä mekanismit voivat lisätä erityinen tuhoamista syöpäsoluja. Hypertermia on liikennemuotojen käytetty hoitopaikassa, että monien syöpien hoidossa; se on yleensä käytetään yhdessä sädehoidon ja /tai kemoterapian [1], [2]. Kuitenkin merkittävä este tehokkuuden hypertermian on kehittää solujen resistenssin, joka estää apoptoottinen signalointi ja parantaa solujen selviytymistä [3], [4]. Tämä ominaisuus aiheuttaa rajoitus apoptoosin jälkeen hypertermia [5], [6]. Siten tunnistaminen mekanismien kehittämisestä vastaaville termopehmenemisjärjestelmät resistenssi syöpäsoluissa, voi auttaa parantamaan kohdistamisesta parantaa solujen herkkyyttä hoitotuloksia hypertermiaan. Resistenssi apoptoosia on yhteistä se, että syöpäsoluja [3], [7]. Apoptoosi on indusoitu, ulkoisten ja sisäisten reittien [8]. Ligandien on kuoleman reseptori aktivoi ulkoinen tie; luontainen polku aktivoituu solu stressi, kuten DNA-vaurioita. Bcl-2-proteiinin perheen säätelee sisäisen reaktiotien; se vaikuttaa läpäisevyyttä ulomman mitokondriokalvon [9]. Jäsenten Bcl-2-perheen on jaettu proapoptoottiset proteiineja, kuten Bax, Bak, ja Bok, ja antiapoptoottisten proteiinien, mukaan lukien Bcl-2, Bcl-x L, Bcl-w, ja Mcl-1 [10] – [13].

kertyminen Bcl-2 ja Bcl-x L voi suojata soluja apoptoosilta, edistävät solun eloonjäämistä ja nopeuttaa kasvaimen kasvua sitomalla pro-apoptoottisen Bax. Ku70 on toinen anti-apoptoottisen molekyylin; se luonnollisesti sitoo Bax, metalleja sitovia sen aktivointia tai mitokondrion translokaatio stressaamattomista soluissa [14], [15]. Ku70 on yksi komponenteista Ku70 /Ku80 heterodimeerin, joka on osallisena DNA-vaurioiden korjaamiseen [16]. Asetylaatio kaksi kriittistä lysiiniä, on karboksyylipää Ku70, säätelee sitova /dissosiaatio Bax ja tämä vaikuttaa myöhemmin herkkyys solun apoptoottisten ärsykkeille [14]. Vain deasetyloidulle Ku70 voivat sitoutua Bax. Korkea ilmentymistä Ku70 syöpäsoluissa parantaisi DNA korjaukseen kykyä ja alentaa Bax-välitteisen apoptoosin; siksi, Ku70 saattaa olla merkitystä hoidossa vastarintaa. Apoptoosi liittyvä aktiivisuus Ku70 on riippumaton sen rooli DNA: n korjaukseen [17]. Ku70 asetylointi /deasetylaatio sykli säätelee histoni asetyyli transferaasit ja histonideasetylaaseja (HDAC: t). Ku70 on tavoite joidenkin jäsenten luokka I /II HDAC ja luokka III HDAC [18], [19]. HDAC proteiinien perhe on jaettu kahteen ryhmään: sinkki riippuvaisia ​​entsyymejä (HDAC1-11), jaettu luokan I ja luokan II estyvät Trichostatin A (TSA) ja NAD

+ – riippuvaisten entsyymien (luokka III; SIRT1-7), joka inhiboi nicotinimide (NAM). Tarkemmin sanottuna SIRT-1, joka kuuluu luokan III HDAC: ien, on keskeinen rooli Ku70 deasetylaatiolla, joka parantaa suojaa soluja peräisin Bax aikana kalorien rajoittaminen [19]. Suurin osa syöpäsolujen yli-ilmentävät SIRT1 [20]. Siten kohdistaminen Ku70 riippuvan suojan apoptoosin, HDAC-inhibiittorit estävät SIRT-1, voi olla tehokas strategia herkistävät syöpäsoluja eri hoitomuotoja. Tässä tutkimuksessa, meidän malli on keuhkosyöpä solut merkittävästi tapetaan kuume kun esikäsitelty HDACIs verrattuna hypertermian vain. SIRT-1 ja sen tavoite, Ku70, ovat keskeisiä mekanismia, jolla keuhkosyöpä solut voivat paeta lämpö aiheuttama kuolema. Muutokset aktiivisuus Bax, Ku70 asetylointi ja solukierron tutkittiin altistumisen aikana hypertermian. Lisäksi tehokkuus sekvenssin kohdentaminen Ku70 käyttäen siRNA, tutkittiin myös suhteen herkistävä keuhkosyöpäsoluissa hypertermiaan. Ku70 näyttää ratkaiseva rooli suojelussa solujen hypertermia todennäköisesti sitomalla sääteli Bax.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Kaksi ihmisen, ei- pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat: PC-10 [21], ja H1299, ostettiin (American Type Culture Collection, ATCC) ja niitä viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (Gibco, Grand Island, NY, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ( Sigma, St. Louis, MO, USA) (täydellinen elatusaine) kostutetussa ilmakehässä, 5% CO

2 37 ° C: ssa. Elatusaine korvattiin tuoreella täydellistä alustaa joka kolmas päivä.

Vasta-aineet ja reagenssit

Anti-ihmis-Bax kanin polyklonaalista vasta-ainetta (pAb) ja anti-ihmisen Ku70 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (mAb), olivat hankittiin BD Bioscience (Erembodegem, Belgia); toinen anti-ihmisen Ku70 hiiren mAb immunosaostus anti-ihmisen HDAC-6 ja anti-ihmis-SIRT-3 kanin (pAb) ostettiin Abcam (Cambridge, UK); anti-ihmisen Ku80 hiiren mAb Signaalinvälittyrnismääritykset (USA), anti ihmisen SIRT-1 ja anti pan-K (Asetyloitu lysiiniä) Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA); anti ihmisen Bcl-2 hiiren mAb hankittiin DAKO (Glostrup, Tanska). Havaitseminen immunoblottaus suoritettiin anti-hiiri- tai anti-kaniini-HRP-konjugoitua vasta-aineita (Dako) laimennettuna 1: 2000. Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin käyttäen anti-kaniini FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Dako) laimennettuna 1: 50 histonideasetylaasi-estäjät (HDACIs), Nicotinamide (NAM) ja trikostatiini (TSA) ostettiin Wako Chemicals, Japani.

HDACI hoidon optimointi

Jokainen HDACI käytetään seulottiin sen subletaalisia annos on kokeilu. Solujen elinkyky arvioitiin käyttäen MTT-määritystä, kanssa tai ilman pelkästään DMSO, ja lisäksi eri annosten kunkin HDACIs; 300 nM TSA ja 20 mM NAM valittiin myrkyttömiä annoksia ja edelleen käytetään seuraavissa kokeissa.

Lämpökäsittely

Solut kiinnitetään pohjaan viljelymaljoihin, olivat esiviljelmää 48 tuntia, ja sitten inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 joko 37,0 ° C (kontrolli) tai 42,5 ° C: ssa 1-9 h.

Virtaussytometria, solusyklin analyysi ja anneksiini V-värjäys

altistuksen jälkeen kuume, soluja uudelleen inkuboitiin 37 ° C: ssa 0 tuntia, 24 tuntia tai 48 tuntia. Sitten solusyklivaiheista analysoitiin. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Pestiin Ca

2 + -Mg

2 + vapaata Dulbeccon PBS, soluja käsiteltiin 0,1 mg /ml RNaasia (tyyppi IA, Sigma, St. Louis, MO, USA) ja värjättiin sitten 100 ug: /ml propidiumjodidia (PI; Sigma), pimeässä, huoneen lämpötilassa 20 minuutin ajan. Läpi kulkemisen jälkeen 40 nm: n nailonverkko, näytteitä pidettiin jäillä, kunnes mittaukset. Saatuja tietoja, käyttämällä FACS kalibraattorin, käytettiin analysoimaan solusyklin vaihe mittasuhteiltaan ModFit ohjelmisto. Solu osa DNA: ta, alle sub-G0 /G1 huippu, merkitty apoptoottisten solujen; DNA-histogrammit käytettiin estimoinnissa.

anneksiini V-värjäyksellä, solut suoraan värjättiin PI ja anneksiini-V Flous (Roche) 10 minuutin ajan ja sitten pestiin inkubointipuskurilla. Solut tunnistettiin FACS calibrator asettamisen jälkeen jännite käyttämällä käsittelemättömiä värjätään ohjaus soluja. Solut analysoitiin Cell Quest ohjelmistoja ja luokitellaan neljään eri vaiheeseen: unstained eläviä soluja, varhaisesta iästä apoptoottiset solut värjätä ainoastaan ​​anneksiini-V, keski-ikä apoptoottiset solut kaksinkertaisesti värjätään, ja myöhäinen ikä apoptoottisten ja nekroottisten solujen värjättiin PI vain.

immunosaostus

soluja (5 x 10

6 /malja) pestiin kylmällä PBS: llä, hajotettiin jäällä RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7, 150 mM NaCl: a, 0,5% natriumdeoksikolaattia ja 0,1% NP-40) (NP-40; Nacalai Teque, Kioto, Japani) tai CHAPS lyysipuskuria (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 1% CHAPS: ia) [22] täydennetään proteaasiestäjäseostabletit (Sigma) 1 tunnin ajan, ja sitten sentrifugoitiin 15000 rpm: ssä 10 min. Supernatantti sekoitettiin proteiini A-Sepharose (ja pAb) tai proteiini G-Sepharose (mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), esiturvotettu PBS: llä ja pre-päällystetty haluttua vasta-ainetta vastaan, Bax, Ku70, Asetyloitu lysiini tai SIRT-1 varovasti ravistellen 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 1 min 3000 rpm: ssä. Pesun jälkeen hajotuspuskurilla, immunokompleksin fraktioitiin SDS-PAGE (10-12% geelit), ja sitten tehtiin Western blot -analyysi.

Western blot -analyysi

jälkeen SDS-PAGE: n jälkeen proteiinit siirrettiin PVDF-membraanille (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membraani blokattiin 4 ° C: ssa yön yli estopuskurilla. Kaivoa inkuboitiin 1 h huoneen lämpötilassa, jolla on haluttu Ab. Kun oli pesty kolme kertaa TPBS, kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan sekundaarisen Ab: n, huoneenlämpötilassa, jota seurasi kolme pesua TPBS: llä. Kalvo kehitettiin käyttämällä ECL-reagensseilla (Amersham). Kemiluminesenssi visualisoitiin Polaroid kamera (Amersham Pharmacia) ja kvantitoitiin käyttäen tiheysmittaus.

siRNA suunnittelu ja transfektio

siRNA oligomeerien vastaan ​​Ku70 mRNA (Ku70-siRNA) ja säätelysekvenssi, joka ei vastaa mitä tahansa geenisekvenssi (Cont-siRNA) joko hankittiin kuin validoitu yksi (Ambion, USA; Ku70-siRNA-2 ja jatk-siRNA-2, vastaavasti) tai suunnitellut tutkijoiden ja sitten syntetisoitiin Ambion mukaisesti seuraavassa järjestyksessä : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Ku70-siRNA-1) ja 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5; Cont-siRNA, 5_GCG CGC UUU GUA GGA UUC GdTdT_3 ja 3_dTdTCGCGCG AAA CAU CCU AAG C_5 (jatkoa-siRNA-1). Tämä sekvenssi kohdentaminen on validoitu [23]. siRNA oligomeerit vastaan ​​Bax mRNA (Bax-si) hankittiin Qiagene (Cat No. SI04948202). Bax-si, Ku70-siRNA: t tai jatk-siRNA: ita transfektoitiin keuhkosyövän soluja (10

5 solua /60 mm: n malja) käyttäen SIPORT

Neofex

(Ambion, USA) lopulliseen konsentraatio 200 nM, kaksi kertaa. Yhden päivän kuluttua viimeisestä transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja maljattiin 60 mm astiat (50.000 solua per malja) kolmena kappaleena. Sen jälkeen Solukiinnittymisen solut altistettiin hypertermian osoitettuna aikavälein mukaan koesuunnitelmasta. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme riippumatonta kertaa toistettavuutta ja tilastolliseen laskentaan.

Tilastollinen arviointi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Minitab Release (Ver.12). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E.M. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin arvioitaessa välisen tilastollisen merkittävyyden avulla. Erot keinot katsottiin merkitsevä p-arvot alle 0,05.

Tulokset

HDACIs merkittävästi helpottanut solukuolemaa hypertermian

sellaisena kuin se tosiasia, SIRT-1, ihmisen deasetylaasi oli erityisesti kohteena pieniä molekyylejä tunnetaan HDACIs, esimerkiksi NAM. Lisäksi Ku70 deasetyloitumista estyi estäjä molekyylejä, jotka kohdistuvat luokka I /II HDAC; esimerkiksi TSA. Ensin esikäsitellyt PC-10-solujen eri HDACIs, NAM (20 mM), TSA (300 nM) tai molemmat, 4 h juuri ennen altistumista hypertermian. Tämä yhdistetty käsittely lisäsi merkittävästi apoptoosin yli kaksi taittuu verrattuna hypertermia hoito yksinään, kuten havaittiin faasikontrastimikroskopiassa (kuva. 1A) ja anneksiini V värjäytymistä (kuva. 1 B). Bax ilmentymiskuvio analysoitiin kokosolulysaateista päässä käsitellyn ja käsittelemättömän PC-10-soluissa. Bax lauseke (21 kDa) korotettiin hypertermian. Mielenkiintoista on, HDACIs (NAM ja TSA) lisääntynyt tuotanto 18 kDa: n Bax, jonka tiedetään olevan N-terminaalisen pään katkaistu muoto Bax. Ottaen huomioon, että Bax aktivaation indusoidaan joko N-päähän altistuksen konformaation muutoksen, (palautuvan muutoksen) tai N-terminaalinen katkaisu (peruuttamaton muutos), nämä tulokset viittaavat siihen, että kestävä tehostettu apoptoosin hypertermian ja HDACIs on Bax-riippuvainen, ja tämän apoptoosin voi riippua on säätelyä Bax tai vapauttamaan Bax peräisin antiapoptoottisten proteiini (t) edistää apoptoosia (kuvio. 1 C). Tärkeää on, että hoito keuhkosyövän solujen HDACIs vain valituissa annoksilla, ei ollut merkittävää toksista vaikutusta. Samanlaisia ​​vaikutuksia HDACIs havaittu H1299-soluissa (kuvio. S1 ja S2). Yllättäen kolmoisyhdistelmä NAM, TSA ja hypertermia oli vähemmän tehokas H1299 kuin dual yhdistelmä. Vaikka tarkkaa molekyylitason mekanismia tämän ilmiön yhä epäselvä, yksi mahdollinen syy on, että kolmen aineen yhdistelmä voi parantaa jako eloonjääneiden solujen karannut haaste kolminkertainen hoito, joka voi tuottaa tuotannon uusien tytär solujen 48 tunnin kuluttua hoidon ( ennen anneksiini V: värjäys tunnistus) ja aiheuttaa vähentäminen anneksiini V-värjäys prosenttiosuus lopulta. Voit varmistaa, että Bax pelaa merkittävä rooli lämmönnousua aiheuttamaa apoptoosia kohdistettuaan Ku70 deasetylaatiolla, Bax oli suunnattu erityisiä siRNA PC-10-soluissa (katso materiaalit ja menetelmät). Bax oli vastaanottavaisia ​​siRNA transfektiota (Bax-si) verrattuna ohjaus salattu oligo siRNA (jatk-si) havaittuna western blot-analyysi (kuva. 1D; yläpaneeli). Kun jälleen Bax-pudotti PC-10-soluja käsiteltiin lämmönnousua 6 tuntia läsnäollessa HDACIs The lämmönnousua aiheuttama solukuolema inhiboitui merkittävästi (kuvio. 1D alempi paneeli). Samaan aikaan solukuolemaa ei ollut täysin tukossa alle lämmönnousua hoito yksinään (kuvio. 1D, alapaneeli ja kuvio. S3). Tämä tulos voi osoittaa osallistumista muiden pro-apoptoottisten molekyylien rajallisen solukuolema, kuume.

. Vaihekontrasti valokuvia PC-10-soluissa, kaksi päivää käsittelyn jälkeen HDACIs silloinen hypertermian 6 tuntia. Kuvan osoitti rajallinen määrä talteen solujen sekä pyöristetty ja kelluvat apoptoottisten solujen pesäkkeet esihoidetussa HDACIs sitten lämmönnousua.

B

. Esikäsittely PC-10-solujen HDACIs lisäsi merkittävästi hypertermia: n indusoiman apoptoosin. Vertaileva sytogrammeja osoittavat anneksiini V värjäyksen jälkeen hypertermiakohtauksia PC-10-solujen esikäsitelty nictotinamide (20 mM), Trichostatin A (300 nM) tai molempia (ylempi paneeli). Yhteenveto keskimääräinen anneksiini V tuloksista voidaan päätellä (alempi kuva).

C

. Bax ekspressiotasot, Western-analyysillä, PC-10-soluissa jälkeen lämmönnousua (6 h) esikäsitelty erilaisilla HDACIs. Alempi kaista (18 kDa) osoittaa katkaistu, aktiivinen, Bax vain lisääntyy, kun solut käsiteltiin yhdistelmällä HDACIs ja hypertermia.

D

. Edustava Western blot osoittaa muutoksen Bax on nimenomaisesti siRNA käytetty. PC-10-soluja joko transfektoitu Bax-si tai jatk-si kahdesti. Aktiini immunoblottaus käytettiin latauskontrollina (ylempi paneeli). Merkittävä väheneminen anneksiini V värjäyksen jälkeen hypertermia ja HDACIs Bax KD soluissa verrattuna ohjaus (t), joka osoittaa, että Bax on keskeinen proapoptoottiset pelaaja kaksinkertainen hoidon aiheuttaman apoptoosin (alempi kuva). Kukin datapiste edustaa keskiarvoa kolmesta kokeesta; baareja kuvaamaan SD; ** Osoittaa eroa ohjaus transfektantista P 0,01.

vaikutus lämmönnousua ilmentymiseen apoptoosin liittyvien proteiinien PC-10-soluissa

vaikutuksen tutkimiseksi hypertermia on Bax ja sen tärkeimpien sitovia molekyylejä, jotkut apoptoosiin liittyvien proteiinien (Bax, Bcl-2, Ku70 ja Ku80) tutkittiin western blot-analyysi edustavassa solulinja, PC-10. Koska useimmat taloudenhoito geenien reagoivat hypertermiaan, mikä Ponceau S värjäys käytettiin osoittamaan latauskontrollina. Hypertermia (42,5 ° C) 1-9 h aiheuttama määrällisiä muutoksia Bax ja Bcl-2: n ilmentymisen, ilman havaittavia muutoksia Bcl-xL, Ku70 ja Ku80 (kuva. 2A) Bax ilme oli hieman ylös-säänneltyjä, kun taas Bcl-2 ilmentyminen alassäädetty PC-10-soluissa. Bax /Bcl-2-suhde vähitellen jälkeen lämmönnousua hoidon (Kuva. 2B, yläpaneeli). Western blot-analyysi Bax ja Bcl-2, eri lastaus määrät proteiinia (20 ug, 40 ug ja 60 ug /kaista), kun 0 h ja 6 h hypertermia hoitoa vahvisti lisääntynyt Bax /Bc-l2-suhde (Kuva. 2B , alempi paneeli) on varmennettu denstimetrically (käyttäen Scion Image ohjelmistot). Samanlaisia ​​havaintoja saatiin myös vuonna H1299 soluissa (kuvio. S4). Siksi meillä oli paljon kiinnostusta vastaamaan kysymykseen miksi syöpäsolut, villin tyypin Bax, joka oli voimistunut, eivät osoittaneet näkyvästi apoptoosia lämmönnousua ellei DHACIs lisätään. Huomattavasti, immunosolukemiallisella Bax ja Bcl-2 osoittivat pääasiassa sytosolin lokalisointi solulinjoissa tutkittiin (kuvio. S5). Siksi muutimme opiskelemaan Bax dimerointiin.

.Whole solu-uutteet valmistettiin merkityillä kausien jälkeen 42,5 ° C lämmönnousua ja Bax, Ku70, Ku80 ja Bcl-2 analysoitiin immunoblottauksella . Lievä nousu Bax vasta 6 ja 9 h hypertermia ja rajoitettu Bax aktivaation jälkeen 9 h ovat havaittavissa. Hypertermia vähensi Bcl-2, kun Bcl-x L ja Ku70 ei ollut selvästi vaikuttanut. Anaysis suoritettiin samassa blot joten jokainen proteiini toimi latauskontrollina muille. Edustava Ponceau S värjäys kalvon osoitettiin todentaa normalisoitumista, koska suurin osa perus talon pitäminen geeneistä (esim: aktiini ja tubuliinin) reagoivat hypertermian.

B

. Kvantitatiivisia analyyseja Bcl-2: n ja Bax-proteiinin ilmentymisen aikana hypertermia. Kukin kaista kvantifioitiin densitimetrically. Edustava joukko Bax /Bcl-2-suhde on esitetty. Western-analyysi eri lastaus määrä PC-10-solujen lysaatit 6 h hypertermian varmentaa muutos Bax /Bcl-2-suhde, kun taas Bcl-xL: n ilmentymistä käytettiin latauskontrollina samasta blot.

häiriöt Bax hetero- kuume

jännityksetön soluissa, Bax heterodimerizes monia, anti-apoptoottiset, kumppani molekyylit; se pariutuu stressiä apoptoosin. Tutkimaan vaikutusta hypertermian on Bax dimerisaatio, Bax immunosaostettiin PC-10 solulysaattina 6 h altistuksen hypertermian. Figure.3A, näyttää laski Bax /Bcl-2 heterodimeeri muodostumisen; Bax /Bcl-x L-heterodimeeri ei vaikuttanut hypertermia, tulosten mukaan, että Western blot -analyysillä. Huomionarvoista oli, että määrä Ku70 sitoutuneen Bax kasvanut suurentunutta aikaa hypertermian. Ku70 immunosaostus vahvistetuilla parannettu Bax /Ku70 sitova 6 h altistuksen kuume, kun taas Ku70 /Ku80 sitova osoittanut mitään muutosta (kuva. 3B). Samanlainen havainto ei havaittu, kun CHAPS-puskuria käytettiin immunosaostuskokeissa (kuvio. S6) B

. PC-10-soluja inkuboitiin 42,5 ° C: ssa 0, 1, 3 ja 6 h. Bax on co-immunosaostettiin 2 mg kokonaisproteiinia, ja Bcl-x L, Bcl-2 ja Ku70 havaittiin immunoprecipitant western-analyysillä. Hypertermia indusoi Bax ylössäätöä ja Bax irtaantuu Bcl2 ja parantaa yhdistyksen välillä Bax ja Ku70, kun taas mitään vaikutusta Bax /Bcl-x L -alueella. Sen sijaan Ku70 oli co-immunosaostettiin samanlainen solulysaateista. Bax ja Ku80 näkyvät immunoprecipitant.

B

. Sen jälkeen kuume, yhteensä Ku70 tasot eivät osoittaneet muutoksia, mutta yhdistys välillä Ku70 ja Bax tiivistettiin.

Hypertermia vähennetään Ku70 asetylointi PC-10-soluissa

asetylointi joko K539 tai K542 on Ku70 C-terminaalinen linkkeri riittää täysin estää Ku70 tukahduttaminen Bax-välitteisen apoptoosin [14]. Hypertermian vaikutuksia on Ku70 asetylaatio tila oli siis tutkittiin luotaa blot of Ku70 immunoprecipitant kanssa antiacetylated lysiiniä Ab (kuva. 4A); tulokset osoittavat merkittävää vähenemistä Ku70 asetylaation 6 h altistuksen hypertermiakohtauksia PC-10-soluissa. Lisäksi määrä Ku70 havaittu, että asetyloitu proteiinin immunoprecipitant, väheni ajan riippuvalla tavalla (kuvio. 4B).

. Ku70 immunosaostettiin yhtä suuri proteiinipitoisuus (3 mg) PC-10 cell lysat jälkeen lämmönnousua ilmoitetuilla aikaa. Ku70 ja asetyyli lysiini havaittiin immunoprecipitant. Yhteensä Ku70 osoittanut mitään muutosta 6 h lämmönnousua (vuonna put), mutta asetyloitua Ku70 väheni.

B

. Kaikki asetyloitu proteiinit immunosaostettiin, fraktioitiin, blotattiin ja Ku70 havaittiin blot. Kaistojen asetyloitu Ku70 tuli himmeämpi yhä hypertermian ajan.

C

. Hypertermia parannettu sekä Ku70 ilmaisun ja Ku70 /SIRT-1 sitova. SIRT-1 immunosaostettiin PC-10 jälkeen hypertermia (0-6 h). Blot osoittaa SIRT-1 ylössäätöä (in put; alempi paneeli) ja parannettu sitoutuminen Ku70 samassa blot oli säädelty (ylempi paneeli).

D

. Samanlaisia ​​hypertermia hoitoa H1299. Yhteensä Ku70 saostettiin. Ku70 ja SIRT-1 havaittiin immunoprecipitant Western-analyysillä. SIRT-1 /Ku70 sitoutuminen lisääntyi, mikä osoittaa parannettu Ku70 deasetylaatiolla keuhkojen syöpäsoluja kuume.

SIRT-1 välittää Ku70 riippuvaista solun suojaamista päässä lämmönnousua

On hyvin tiedossa että Ku70 asetylointi nimenomaan päinvastaiseksi SIRT-1, ihmisen deasetylaasin, lievissä stressin (esimerkiksi, kalorien rajoittaminen); Tällaisissa olosuhteissa Ku70 sequesters enemmän Bax ja suojaa soluja Bax-välitteisen apoptoosin [19]. Tutkia asetylointi esto, altistuminen hypertermian, johtui aktivointi SIRT-1, olemme analysoineet SIRT-1 ilmentymisen altistumisen jälkeen lämmönnousua (0-6 h). Western blot-analyysi osoitti, että SIRT-1 indusoitiin hypertermiakohtauksia PC-10-soluissa (kuvio. 4C). Edelleen, SIRT-1 immunosaostettiin PC-10 kokosolulysaateista ja sitten altistettiin Western blotting-analyysi. Määrä Ku70 immunosaostettiin SIRT-1 tehostettiin altistuminen hypertermian (kuva. 4C). Samoin määrä SIRT-1 immunosaostettiin Ku70 tehostui myös altistuminen hypertermian (0-6 h) vahvistaa, että Ku70 /SIRT-1 sitoutuminen parantaa hypertermiakohtauksia PC-10-soluissa (Figure.4D). Me arveltu, että säädelty SIRT-1, olosuhteissa hypertermia, sitoutuu Ku70 ja muuttaa sen asetyloitiin deacetylated muotoon, joka mahdollistaa Ku70 sekvesteroimaan enemmän Bax joko vapautunut Bcl2 tai hiljattain aiheutettujen alla hypertermia, estämään hypertermia aiheuttamaa apoptoosin lopulta. Nämä tulokset selittävät ainakin osittain, miksi HDACIs, kuten NAM, voi parantaa apoptoosin kuume, luultavasti kohdistamalla joitakin HDAC kuten SIRT-1. Erityisesti muut histonideasetylaaseja lukien HDAC6 ja SIRT-3, eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia ilmaisun profiilin altistumisen jälkeen lämmönnousua (kuva. S7). Vahvista yllä tuloksia, H1299-solut (suhteellisen korkea transfektiotehokkuus, 50% määritettynä Beta gal transfektiolla) transfektoitiin ohimenevästi joko villityypin SIRT-1 tai hallitseva negatiivinen H363Y /SIRT-1. Hypertermia: n indusoiman apoptoosin merkittävästi parannettu, että H363Y /SIRT-1-transfektoiduissa soluissa verrattuna ohjaamaan vektoriin transfektanttien (kuvio. 5A; P 0,01). Tärkeää on, että villityypin SIRT-1-transfektoiduissa soluissa osoitti vähäistä mutta merkittävää (P 0,05) suojaa hypertermia testatussa soluissa, mikä osoittaa, että anti-apoptoottiset vaikutukset eksogeenisen SIRT-1 on merkittävä, mutta rajallinen. Tämä oli todennäköisesti siksi, että endogeenisen SIRT-1 laukaisi useimmat spontaani suojaa hyerthermia kuten DNA pitoisuus kokeissa (Kuva. 5A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin anneksiini V-värjäys; H363Y /SIRT-1 transfektiolla H1299 soluihin merkittävästi parannettu apoptoosin altistumisen jälkeen hypertermian verrattuna tyhjän vektorin transfektantissa (kuvio. 5B). Erityisesti kumpikaan villityypin SIRT-1 eikä hallitseva negatiivinen H363Y /SIRT-1 transfektiota yksilöllisesti osoittivat tuntuvia muutoksia solusyklin.

. SIRT-1 on osallisena solusuojaus alkaen lämmönnousua. Western blot osoittaa yli-ilmentynyt SIRT-1. FACS-analyysi H1299 solujen jälkeen ohimenevän transfektion joko laaja tyypin SIRT-1, hallitseva negatiivinen SIRT-1 tai FLAG ekspressiovektoria. H363Y /SIRT-1 tehostaa merkittävästi lämmönnousua-solukuolema kun laaja tyypin SIRT-1 ei ollut merkittävää vaikutusta (ylempi paneeli).

B

. Tulokset anneksiini V värjäytymisen H1299 soluja, samankaltaisista kokeilu, jossa vahvistetaan, että H363Y /SIRT-1-solukuolema on apoptoosia (alempi kuva).

kohdistaminen Ku70 siRNA tehostetun hypertermian-solukuolema

tutkia Ku70 oli keskeinen välittäjänä edellä mainitussa suojan solujen hypertermia, Ku70 mRNA kohdistettu sekvenssi erityisiä Ku70-siRNA-1, -2. Ku70 mRNA oli mukautuvia Ku7-siRNA-1 (custom design) ja sen jälkeen, taso proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi (annos, 200 nM) PC-10-soluissa (kuvio. 6A). Ohjaus siRNA (jatk-siRNA-1) transfektion ei vaikuttanut Ku70 ilmaisua. Lisäksi Ku70-siRNA-2 transfektio (katso materiaalit ja menetelmät) vahvistettiin tehokkaasti pudotus Ku70 (Kuva. 6A, alempi paneeli). Seuraavaksi molemmat Ku70 taintumisen (KD) ja kontrolli solut altistettiin altistuminen hypertermian. Ku70 KD PC-10-soluissa osoitti parannettu solukuolemaa jälkeen hypertermia altistuksen ajasta riippuva tavalla (kuva. 6B, C) verrattuna jatk-siRNA transfektantin, kaksi päivää käsittelyn jälkeen, kuten on osoitettu FACS-analyysi (käyttämällä Ku70- siRNA-1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä H1299-soluja (käyttäen Ku70-siRNA-2 ja jatkuu-siRNA-2 (Kuva. S8)). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ku70 välittää solusuojaus päässä lämmönnousua altistumisesta ja todennäköisesti on keskeinen rooli lämmönnousua aiheuttaman apoptoosin.

. Edustava Western blot osoittaa muutoksen Ku70 molempien siRNA käytetty. PC-10-soluissa ja H1299-solut transfektoitiin yhdessä siRNA kahdesti. Länsi tulos osoittaa merkittävää kaataa by Ku70-siRNA-1, -2 vertaamalla jatk-siRNA-1, -2, vastaavasti. Aktiini immunoblot käytettiin latauskontrollina. Koe toistettiin kolme riippumatonta kertaa toistettavuus. PC-10-solut transfektoitiin Ku70-siRNA-1 tai jatk-siRNA-1 (200 nM) kaksi kertaa. 24 h kuluttua viimeisen transfektion, yhtä suuri kuin solumäärät jatkoviljeltiin edelleen 24 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin hypertermian varten osoitetun aikavälein, ja sitten uudelleen viljeltiin 37 ° C: ssa 24 h (B) tai 48 h (C) Soluja hankittu FACS analysaattori solusyklin analyysi. Esitetyt tulokset ovat edustavia yksi, ainakin kolmen erillisen kokeen kunakin ajankohtana (24 h ja 48 h).

D

. Ku70 tarvitaan sytostaatit pidätys kuume. Histogrammit esittävät ero kertyminen solupopulaatioiden osaksi G2 /M-vaiheisiin soluissa kanssa tai ilman Ku70, yhden ja kahden päivän kuluttua 0, 1, 3 ja 6 h hypertermia hoitoon. Populaatiot eri solusyklivaiheista, G1, S ja G2 /M vaiheessa, laskettiin tietokoneella jälkeen lämmönnousua hoidon. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta.

E

. Merkittävä parannus anneksiini V värjäyksen jälkeen hypertermiakohtauksia Ku70 KD soluissa verrattuna kontrolli osoittaa, että Ku70 hiljentäminen perustuva solukuoleman kuume on apoptoosin. Kukin datapiste edustaa keskiarvoa kolmesta kokeesta; baareja kuvaamaan SD; * Tarkoittaa eroa ohjaus transfektantista P 0,001.

Ku70 välittämää lämmönnousua aiheuttama G2 /M kertymistä

Pulse-leimauskokeiden bromideoksiuridiinia (BrdUrd; 20 uM) in PC- 10-solut osoittivat, että altistuminen hypertermian indusoidun sytostaattinen mutta ei sytotoksinen pidätys (tuloksia ei ole esitetty). Hypertermia aiheuttama solukierron häiriö analysoitiin 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua 1-6 h vastuita hypertermiaan. G2 /M-alapopulaatioiden lisääntyivät merkitsevästi 24 h altistuksen jälkeen hypertermian ja sitten vähitellen laski normaaliin alapopulaatioiden 48 h altistuksen jälkeen hypertermia (kuva. 6D). Samalla prosenttia G1 ja S-vaiheessa -alapopulaatioiksi laski asteittain 24 tuntia altistuksen jälkeen hypertermian ja talteen 48 tunnin kuluttua poistamisen lämmönnousua.

B

.