Krooninen sairaus

tiivistelmä

Telomerase tarvitaan rajaton elinikä syöpäsoluja. Valtaosa haiman adenokarsinooman yliekspressoimaan telomeraasiaktiivisuudelle ja esto telomeraasi voisi rajoittaa niiden elinikä. GRN163L (Imetelstat) on lipidi-konjugoitua N3 ’→ P5 ”tio-fosforamidaattia oligonukleotidi, joka estää mallin alueella telomeraasi. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää vaikutuksia pitkäaikaisen GRN163L altistuminen ylläpidosta telomeres ja käyttöikä haiman syöpäsoluja. Telomere koko, telomeraasiaktiivisuus ja telomeraasin eston vaste GRN163L mitattiin paneeli 10 haimasyövän solulinjoissa. Solulinjat esillä suuria eroja tasojen telomeraasiaktiivisuuden (46-kertainen vaihtelu), mutta suurin osa linjat oli hyvin lyhyt telomeres (2-3 kb kooltaan). GRN163L esti telomeraasia kaikkiaan 10 haimasyövän solulinjoissa, jossa IC

50 alueella 50 200 nm. Jatkuva GRN163L altistuminen CAPAN1 (IC

50 = 75 nM) ja CD18 solujen (IC

50 = 204 nM) johti aluksi nopea lyhentäminen telomeres seurasi ylläpito äärimmäisen lyhyt mutta vakaa telomeres. Jatkuva altistuminen huumeiden lopulta johti kriisiin ja täydellinen menetys elinkelpoisuuden jälkeen 47 (CAPAN1) ja 69 (CD18) kahdentumisen. Kriisi Näissä soluissa oli mukana aktivoituminen DNA-vaurioita vastaus (γ-H2AX) ja merkkejä sekä vanhenemista (SA-β-galaktosidaasin aktiivisuus) ja apoptoosin (sub-G1-DNA-sisältöä, PARP pilkkominen). Poistaminen lääkkeen pitkäaikaisen GRN163L altistumisen seurauksena aktivoituminen telomeraasi ja uudelleen venymään telomeres kolmannella viikolla viljely ilman GRN163L. Nämä havainnot osoittavat, että elinikä haimasyövän soluja voidaan rajoittaa jatkuvalla telomeraasia esto. Nämä tulokset pitäisi helpottaa suunnittelua tulevaisuuden kliinisissä tutkimuksissa GRN163L potilailla, joilla haimasyöpä.

Citation: Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) telomeraasiestäjä Imetelstat (GRN163L) rajoittaa Käyttöikä of Human Haimasyöpä Solut. PLoS ONE 9 (1): e85155. doi: 10,1371 /journal.pone.0085155

Toimittaja: Arthur J. Lustig, Tulanen yliopiston Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 23 marraskuu 2013; Julkaistu: 07 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Burchett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute (NCI) SPORE avustus (P50 CA127297) ja NCI koulutus avustus (T32 CA09476). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. GRN163L ja ristiriitaiset oligo tarjottiin maksutta Geron Corp. (Menlo Park, CA). Kirjoittajat haluavat ilmaista kiitollisuutensa neuvosta, palautetta ja muita reagensseja niille toimittamien Sergei Gryaznov, Robert Tressler, Ning Go ja Katia Bassett alkaen Geron Corp. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikkaa jakamisesta tiedot ja materiaalit.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän kuolema länsimaissa. Haimasyöpä on sairaus salakavala etenemisen ja korkea kuolleisuutta, jossa on 5 vuoden pysyvyys on vain 6%. Yhdysvalloissa yksin, arviolta 43920 potilasta odotetaan diagnosoitu sairaus vuonna 2012, ja 37390 potilaiden odotetaan kuolee siihen [1]. Valtaosa näistä tapauksista ovat haimatiehyen adenokarsinoomat, joka kehittyy kanavat haiman. Nämä erittäin invasiivinen kasvaimet koostuvat runsaasti desmoplastic strooman, johon on upotettu pahanlaatuisia syöpäsoluja ilmentävät merkkiaineita haimatiehyen soluihin [2], [3]. Potilaille, joilla haiman adenokarsinooma, ainoa parantava vaihtoehto on leikkaus [3]. Standardi menettely on pankreatikoduodenektomia (tai Whipple menettely), kirurginen toimenpide, joka poistaa pää haima mutta säästää jäljellä kudosta. Valitettavasti useimmat haimasyövän potilailla esiintyy leikkaushoitoon metastasoitunutta tai paikallisesti edenneessä taudissa. Itse asiassa vain 20%: lla potilaista on kokoisen kasvaimia aikaan diagnoosi [3]. Mutta myös niille potilaille, joille tehdään leikkaus, yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 20%, sillä useimmat näistä potilaista uusiutumisen vuoden kuluessa niiden leikkaus [3]. Siksi on olemassa kriittinen tarve uusia lääkkeitä, jotka voivat paremmin efficaciously kohdistaa näihin kasvainsoluihin ja /tai vähentämään toistumisen. Telomeraasi-inhibiittoreita on ehdotettu erityisen hyvin estää uusiutumista jäljellä syöpäsolujen jälkeen tavanomaisten syövän hoidossa [4], [5]. Paitsi että ne valikoivasti kohdistaa telomeraasia positiiviset syöpäsolut, mutta niiden kasvua estävä vaikutus kasvaa, kun kohdistettu solut suorittavat yhä useammat solunjakautumisten. Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu vaikutuksia telomeraasiestäjä, GRN163L, matkapuhelinverkon elinikä ja selviytymistä paneelin haimasyövän solulinjoissa.

Telomerase on entsyymi, joka vastaa ylläpidosta telomeres, olennaista rakenteet, jotka korkki ja suojaavat päät lineaarisen kromosomeja. Ihmisen telomeres on valmistettu tandem kopioita (TTAGGG)

n DNA toistaa ja niihin liittyvien proteiinien, jotka yhdessä muodostavat suojaavan rajaamisen monimutkainen [6], [7]. Tämä suojus suojaa kromosomi päättyy hajoamiselta, kromosomien välisen fuusiot ja todistaessa kaksijuosteinen (ds) DNA taukoja, eräänlaista DNA-vaurioita [7], [8]. Ongelmien vuoksi, jotka liittyvät replikaatioon päiden lineaarisen DNA-molekyylien, niin sanottujen end-replikaation ongelmia, telomeerit lyhentää aina ihmisen somaattisten solujen jakautuessa, ja tämä poistuman rajoittaa niiden käyttöikä [9]. Kun lyhin telomere tullut rajaamattomiin, DNA vaurioita aiheuttaa reaktion, joka mobilisoi p53 ja p16 /pRB reittejä, jotka sitten toimivat yhdessä aiheuttaa vanhenemista, toimintakykyisen valtion peruuttamatonta quiescence [10], [11]. Jos p53 ja p16 /pRB reitit eivät ole käytössä, solut ohittaa nämä kasvua estävän signaalit ja jatkaa jakaa ja lyhentää niiden telomeres. Lopulta terminaali telomere lyhentää lukemiin kriisi, elinkelvottomat tila, johon liittyy ohjelmoidun solukuoleman [10], [11]. Crisis laukaisee toistuvista telomere-telomere fuusiot, Anaphase siltoja ja kromosomin hajoamista [12]. Kun läsnä, telomeraasin voi estää induktio vanhenemista ja kriisi ja laajentaa solujen elinikää synteesiä ja uusien telomeerinen toistoja on telomeres. Telomerase on kaikkialle läsnä alkuvaiheessa inhimillisen kehityksen. Mutta syntyessään, ilmaisun entsyymin on tukahdutettu ja telomeraasin tulee poissa useimpien somaattisten kudoksista [13], [14], mukaan lukien haiman [15], [16], [17]. Syöpä yksilöt, jyrkässä ristiriidassa normaaleissa kudoksissa, ovat lähes aina positiivisia telomeraasiaktiivisuutta [18], mukaan lukien haimatiehyen adenokarsinooman [15], [16], [17]. Havaitaan yli 85% syövistä, riippumatta kasvaimen tyyppi, telomeraasi on yksi parhaiten tunnetuista markkereita syöpäsolujen [18]. Lisäksi tämä ilmaus telomeraasi syöpäsoluissa tarvitaan niiden rajoittamaton leviämiseen tai kuolemattomia, tunnusmerkki syöpä. Näin ollen inhibitio telomeraasin syöpäsoluissa johtaa telomeerien poistuman ja rajoittaa elinikä näiden solujen [19], [20], [21], [22]. Sen jälkeen riittää telomere poistuma on tapahtunut, telomeraasia esti syöpäsolujen periksi joko vanhenemista tai apoptoosin, riippuen matkapuhelinjärjestelmä. Tämä riippuvuus telomeraasin niiden rajaton kasvu ja lähes universaali ilmentymä telomeraasin syöpäsoluissa tekevät telomeraasin houkutteleva kohde syövän hoidossa. Mahdollinen haittapuoli ovat kuitenkin viiveet tarvitaan ennen kohdennettua syöpäsoluja ovat menettäneet riittävästi telomeres varten vanhenemista tai kriisin indusoituvan. Tämä hidastin saattaa estää niiden käyttö ensimmäinen rivi hoitoa syöpään, vaan estää regrowth sairautta jäljellä tavanomaista hoitoa, telomeraasiestäjät voinut odottaa olevan hyvät terapeuttista potentiaalia [4], [5].

ihmisen telomeraasin sisältää kaksi olennaista alayksiköstä: proteiini hTERT (human telomerase käänteistranskriptaasi) ja pieni ydin- RNA hTR (ihmisen telomerase RNA). Ensimmäisen tarjoaa katalyyttinen aktiivisuus ja toinen sisältää lyhyen sekvenssin (5′-CUAACCCUAA-3 ’), joka toimii templaattina synteesille telomeerinen toistojen [23]. Alustan telomeraasin on yksijuosteisen 3′- telomeerisesti uloke, joka peittää aivan kaikkien telomeres. Entsyymi toimii käänteistranskriptaasin ja käyttää RNA hTR templaattina synteesille ja lisäämällä telomeerinen DNA toistaa 3′-telomeerisesti ulokkeita. Sillä telomeraasin eston, malli alueen ihmisen telomeraasin RNA (hTR) esittää käytettävissä kohde oligonukleotidi-inhibiittoreita [4], [24]. Oligonukleotidit suunniteltu hybridisoitumaan mallin alue voidaan käyttää inhiboimaan telomeraasi [25], [26]. Oligonukleotidit eri kemiat on testattu ja N3′-P5 ”tio-fosforoamidaatti oligonukleotidien ovat tuottaneet joitakin kaikkein tehokkaita ja selektiivisiä telomeraasin [25], [27], [28]. Nämä yhdisteet ovat myrkyttömiä, veteen liukeneva, nukleaasiresistenteiksi ja näyttää suuri lämpöstabiilisuus duplekseja, jotka on muodostettu niiden komplementaarisen RNA: n juosteiden. GRN163L on toisen sukupolven N3′-P5 ”tio-fosforamidaattia telomeraasiestäjä suunnitteli Geron Corp. (Menlo Park, CA) [20]. Tämä inhibiittori, joka tunnetaan myös nimellä Imetelstat, kantaa 5’-terminaalista palmitoyyli osan konjugoitu N3 ’ P5 ”tio-fosforamidaattia rungon (5’-palmitaatti-TAGGGTTAGACAA-NH

2-3′). GRN163L on rasvaliukoinen ja ei vaadi transfektion soluunottoa. Nanomolaarisilla pitoisuuksilla, GRN163L estää telomeraasin suuri kirjo syöpäsolulinjoissa [20]. In seurantatutkimukset, pitkäaikainen GRN163L altistus voi rajoittaa elinikä viljeltyjen syöpäsolujen johdettu glioblastooma [29], multippelimyelooma [30] ja Barrettin ruokatorven adenokarsinooma [31] sekä rintojen [32], [33], keuhko [34] ja maksassa [35] syöpiä. Hiirimalleissa, inhibiittori voi estää kasvua ksenograftien tuotettu hiirissä kiinnittymisestä näiden ihmisen syöpäsoluja [29], [30], [31], [33], [34], [35]. GRN163L on tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla on multippeli myelooma (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01242930), olennaisia ​​trombosytemiaa tai polysytemia vera (NCT01243073), ja ensi- tai toissijainen myelofibroosi (NCT01731951).

The effects of telomeraasin eston, puhumattakaan GRN163L, ei ole koskaan tutkittu haimasyövän, yksi tappavimmista ja useimmin toistuvat syöpäsairauksia. Tässä raportissa olemme testanneet vaikutuksia GRN163L paneelissa 10 haimasyövän solulinjoissa. IC

50 nanomoolialueella, GRN163L efficaciously esti telomerase kaikkiaan 10 solulinjoissa. Jatkuva GRN163L altistuminen CAPAN1 ja CD18 solujen johti aluksi nopea lyhentäminen telomeres seurasi ylläpito erittäin lyhyt, mutta vakaata telomeerit. Jatkuva altistuminen huumeiden lopulta johti kriisiin ja täydellinen menetys elinkelpoisuuden jälkeen 47 ja 69 oli kaksinkertaistunut, vastaavasti. Nämä tulokset osoittavat, että jatkuva altistuminen GRN163L voi kääntää kuolematon fenotyyppi haimasyövän soluja. Nämä havainnot pitäisi helpottaa suunnittelua tulevaisuuden kliinisissä tutkimuksissa GRN163L potilailla, joilla haimasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

sikiön seerumia (FBS) oli Hyclone ( Logan, UT, USA). T4-polynukleotidikinaasia, proteinaasi K, gentamysiini, penisilliini /streptomysiini, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), RPMI-1640-väliaine, Iscoven modifioitu Dulbeccon väliaine ja McCoyn 5A-väliaine ostettiin Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Restriktioentsyymejä AluI, MspI, HaeIII, Hinfl ja RsaI oli New England BioLabs (Ipswich, MA, USA) taas CfoI saatiin Promega Corporation (Madison, WI, USA). Nisäkkään proteaasiestäjäseostabletit oli Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA). Palmitoyyli-konjugoitu N3 ’ P5 ”tio-fosforoamidaatti GRN163L oligo (5’-palmitaatti-TAGGGTTAGACAA-NH

2-3) ja yhteensopimattomien oligo (5′-palmitaatti-TAGGTGTAAGCAA-NH

2-3 ”epäsuhta alleviivattu) toimitti Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA). N3 ’ P5 ”tio-fosforamidaattia oligot liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), jotta 1 mM kannat, jotka pidettiin jäädytettyinä -80 ° C: ssa. Kaikki muut kemikaalit olivat Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA).

Cell Lines

käytetyt solulinjat on kuvattu aikaisemmin muiden [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40], [41]. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Kaikkia solulinjoja viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja joko 50 ug /ml gentamysiiniä tai 100 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Media olivat seuraavat: DMEM useimmissa solulinjoissa (VA13, HeLa, HPAF, CD18, Hs766T, CAPAN1, MiaPaCa2, Panc1 ja L3.6pl solut); RPMI-1640-väliaineessa AsPC1 soluja; Iscoven modifioitu Dulbeccon väliaine CFPAC1; ja McCoyn 5A-alustassa CAPAN2 soluja.

Telomeeri Koko analyysi

Yhteensä genomi-DNA eristettiin jäädytetyistä pellettejä soluja. Lyhyesti, solut suspendoitiin uudelleen 2 tilavuudessa puskuria, joka sisälsi 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) ja 25 mM EDTA (pH 8,0), jonka jälkeen 0,4 mg /ml proteinaasi K lisättiin. Natriumdodekyylisulfaattia (SDS) lisättiin sitten loppupitoisuuteen 0,5% (w /v) ja näytteitä pyöritettiin yön yli 50 ° C: ssa. Seuraavana päivänä, näytteet uutettiin kahdesti Tris-puskurilla-kyllästettyä fenolia ja sitten kerran vedellä kyllästettyä CHCl

3. Seuraavaksi näytteet dialysoitiin yön yli 4 ° C: ssa kahta muutokset TE-puskuria (1 mM EDTA: ta ja 10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Genomi-DNA-näytteet säilytettiin 4 ° C: ssa.

genomista DNA: ta (5-10 ug) pilkottiin 37 ° C: ssa 2-4 tunnin ajan 100 ul: ssa reagoimaan 1-puskuria (10 mM MgCl

2 ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,0), jossa on cocktail restriktioentsyymejä, jotka eivät leikkaa telomeerisen DNA: AluI, CfoI, HaeIII, Hinfl, MspI, ja RsaI (16 yksikköä kutakin). Digestoidut näytteet ladattiin 25 cm pitkä 0,7%: sessa agaroosigeelissä, 0,5 x TBE-puskurissa (Tris-EDTA-boraatti), yhdessä leimattiin päästään [

32P] -molecular paino DNA-markkeri. Elektroforeesi tehtiin yön yli 50 volttia, minkä jälkeen geeli siirrettiin 3 M paperin ja kuivattiin alipaineessa 60 ° C: ssa tunnin ajan. Geeli liotettiin 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH: ssa 15 minuuttia, jona aikana 3 M paperi irrotettiin. Geeli neutraloitiin 2 x 15 minuuttia 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4 ja siirretään sitten 6 x SSC: tä (750 mM NaCl, 75 mM natriumsitraatti, pH 7,0). Pre-hybridisaatio suoritettiin 2 tuntia 30 ° C: ssa puskurissa, joka sisältää 5 x SSC, 5 x Denhardtin liuos, 1 mM EDTA, 0,1% SDS: ää (paino /tilavuus) ja 10 mM LiCl: a. Hybridisaatio suoritettiin samassa puskurissa 37 ° C: ssa yön yli, käyttäen 0,5-1,0 x 10

6 cpm /ml leimattiin päästään [

32P] – (TTAGGG)

4-koettimella. Geeli esipesty 5 x SSC: tä (kaksi kertaa 10 minuuttia kukin 37 ° C: ssa) ja sen jälkeen 0,1 x SSC: ssä, joka sisälsi 0,1% SDS: ää (kolme kertaa 10 minuuttia kulloinkin huoneen lämpötilassa). Geeli kuivattiin imupaperilla, peitetty Saran Wrap ja altistetaan phosphoimager kasetin.

Mediaani telomere koot arvioitiin densitometrinen skannaus kunkin kaistan. Signaalin voimakkuus oli ensimmäinen funktiona muuttoliikkeen etäisyyden. Radioaktiivisuusmerkittyä molekyylipainomarkkerit käytettiin kalibrointikuvaaja, jolla voidaan laskea uudelleen koko eri matkan siirtynyt. Telomere signaalin intensiteetin sitten piirretään funktiona arvioitu koko, sen sijaan, että etäisyys (esim. Kuva S4). Mediaani arvioitiin koko, joka vastasi puoli kumulatiivisen summan kaikkien signaalin intensiteettiä.

määritys Suhteellinen telomeraasiaktiivisuuden

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä ei-radioaktiivista muuttamista TRAP määrityksen (telomeerisesti Toista Amplification Protocol), mukaan Herbert

et al

. [42]. Testi suoritettiin käyttäen TRAPeze telomeraasin detektioreagenssipakkaus (cat # S7700; Millipore, Billerica, MA), joka korvaa [

32P] -leimattua TS oligo kanssa Cy5-konjugoidulla TS oligo (5′-Cy5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ”Integroitu DNA Technologies, Coralville, IA). Määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden, paitsi että: 1) täyteväriä ei sisältänyt ksyleenisyanoli; 2) PCR suoritettiin 33 sykliä; 3) geelistä tutkittiin suoraan ilman kuivausta. Puolireaktio erotettiin 10% polyakryyliamidi /0,5 x TBE-geeli 165 minuuttia 200 voltin jännitteellä, minkä jälkeen skannaus geelistä käyttäen Molecular Dynamics Typhoon Imager System (Molecular Dynamics). Määritys sisältää sisäistä standardia (ITAS), johon normalisoida signaalit eroja PCR tehokkuutta. Kun ImageQuant-ohjelman (Molecular Dynamics), telomeraasiaktiivisuus laskettiin suhde intensiteetti telomeerinen tuotteiden yli kuin ITAS. Vertailemaan määriä telomeraasiaktiivisuuden välillä solulinjoja, sarjalaimennoksia (50, 100, 200, 500 solua /määritys) jokaisen rivin analysoitiin rinnakkain telomeraasiaktiivisuuden (telomeraasin tuotteet /ITAS suhde). Piirtämällä telomeraasiaktiivisuuden funktiona solujen määrä, datan kunkin linjan sovitettiin pienimmän neliösumman regressiolla lineaarinen käyrä. Kaltevuus jokaisen käyrän ja 95%: n luottamusväli voitaisiin sitten käyttää vertaamaan suhteellisia tasoja telomeraasiaktiivisuuden.

määritys IC

50 GRN163L

IC

50 määritykset olivat suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Solut ympättiin 5 x 10

4 /kuoppa, annetaan liitteenä, ja altistetaan sitten kolmena rinnakkaisena muuttujaan annoksen GRN163L (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 nM) tai virheellinen oligo (0, 4000 nM). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, solut pestiin kolme kertaa 100 ul: lla jääkylmää fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja sitten hajotettiin 50 ul: ssa 1 x CHAPS-puskuria (TRAPeze kit). Hajoaminen tapahtuu keinutuoli jäissä 30 minuuttia, minkä jälkeen 96-kuoppaisen levyn pakastettiin. Päivä määrityksen, levy sulatettiin ja laimennettiin 1:20 päälle uusi levy käyttäen jääkylmää 1 × CHAPS-puskuria (lopulliset konsentraatiot = 50 solua /ul). Kaksi mikrolitraa kutakin laimennettua näytettä (100 solua) analysoitiin sitten edellä kuvatulla tavalla käyttämällä ei-radioaktiivista TRAP määrityksessä. Telomeraasiaktiivisuus (telomeraasin tuotteet /ITAS suhde) laskettiin kullekin aineiston pisteelle, ilmaistiin sitten prosentteina keskimääräisestä arvosta käsittelemättömän näytteen (n = 3), ja sen jälkeen raportoi sirontakuvaajan funktiona log [ ,,,0],GRN163L]. With SigmaPlot versio 11.0, datapistettä myöhemmin asentaa epälineaarinen regressio 2 parametter sigmoidikäyrä (Prosentti telomeraasin = D + (100-D) /(1 + 10

((log [GRN163L] -log [IC50 ]) * 1,59)), jossa D on minimaalinen jäännösaktiivisuus), josta arvioimme arvo ja 95%: n luottamusväli tukin [IC

50].

SA-β-galaktosidaasiaktiivisuusyksikköjen

solut maljattiin tiheydellä 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaiselle levylle. Seuraavana päivänä solut kiinnitettiin ja altistettiin histokemiallisella ihmisen vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasin aktiivisuus. Kiinnitys ja värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [43]. Ilman faasikontrastimikroskoop- suodatin, sekä positiivisesti (sininen) ja negatiivisesti (värjäämätön) värjätään solut laskettiin mikroskoopin alla. Yhdistämällä tietoja kymmenestä erillisestä peltojen prosenttia sininen solujen taulukoitu kokonaismäärästä vähintään 200 laskettiin soluihin.

kasvukäyrät

Solut ympättiin tiheydellä 3 x 10

5 solua kohti 150 mm malja. Drugs (PBS ajoneuvon, 1 uM GRN163L, 1 uM yhteensopimattomia oligo) lisättiin heti, kun solut tuli liitteenä (4-8 tunnin kuluttua). Soluja viljeltiin 7 päivää, jona aikana tuoretta huumeita lisättiin 2-3 päivän välein. Kun viikon kasvun jälkeen solut trypsinoitiin ja laskettiin, ja määrä populaation kaksinkertaistumista tehdään kunkin näytteen lasketaan uudelleen. Solut asetettiin samaan alkuperäinen tiheys vielä viikon kasvun, kun taas loput solut varattu joko DNA eristämistä tai valmistetaan jäädytetty varastot. Soluja pidettiin viljelmässä, kunnes täydellinen menetys GRN163L-käsitellyissä viljelmissä.

Western blot -analyysi

Kiinnittyneet solut pestiin kahdesti jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kerättiin kaavinta lyysipuskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% nisäkkään proteaasiestäjäseostabletit, ja kukin seuraavista kinaasi /fosfataasin estäjät: 1 mM Na

3Vo

4, 50 mM NaF, 5 mM natriumpyrofosfaatti, 10 mM natrium-2-glyserofosfaatti, ja 1 uM mikrokystiinin. Kelluvat solut kerättiin sentrifugoimalla, jonka jälkeen solut hajotettiin samalla lyysipuskuria. Yhdistetyt kelluvat ja tarttuvat solut samasta astian olivat flash pakastettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Proteiinit kvantitoitiin käyttäen Bradford-menetelmällä (Bio-Rad). Näytteet (80-100 ug /kuoppa) eroteltiin 4-20% gradientti SDS-PAGE-geelien (Bio-Rad) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad). Esto vaiheet ja sitä inkuboitiin vasta-aineiden tehtiin TBS-T: n (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,05% Tween-20, pH 7,6), joka sisälsi joko 5% rasvatonta maitojauhetta ja 5% naudan seerumin albumiinia (kun käyttäen fosfospesifisiä ensisijainen vasta-aineet). Pesut suoritettiin käyttäen TBS-T. Signaalit havaittiin käyttämällä SuperSignal West Pico Kit (Thermo Scientifics). Vasta-aineita käytetään mukana vastaan ​​H2AX (kanin antiseerumia, kissa # 07-627) ja γH2AX (fosfo-Ser139, hiiri monoklonaalinen, klooni JBW301) olivat Upstate. Anti-PARP1 vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen, klooni C-2-10) oli Calbiochem /EMD Biosciences taas anti-aktiini vasta-ainetta (vuohen polyklonaalinen, sc-1616) oli Santa Cruz Biotechnology. Sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vasta-aineita hiiren, kanin tai vuohen IgG: tä (Jackson ImmunoResearch).

Virtaussytometrinen analyysi

Kiinnittyneet solut kerättiin trypsinoimalla ja sen jälkeen sentrifugoimalla. Kelluvat solut kerättiin sentrifugoimalla. Yhdistetyt pysyvä ja kelluvat solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, vahvistettu lisäämällä etanolia 80%, ja sitten niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. Kaksikymmentä tuhatta kiinteät solut värjättiin propidiumjodidia ja analysoitiin DNA sisällöstä noudattaen valmistajan ohjeita käyttäen FACS Calibur väline (Beckon Dickinson, Mansfield, MA, USA).

Immunofluoresenssikoe Analyysi Telomeres

soluja viljellään peitelaseihin pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin metanoli: asetoni [1:01] -10 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Pesun jälkeen PBS: ssä, näytteet blokattiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan PBS: ssä, joka sisälsi 10% hevosen seerumia. Pesun jälkeen PBS: ssä, näytteitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli primaarisen vasta-aineen PBS: ssä, joka sisälsi 2% hevosen seerumia. Kolmen 5 minuutin pesua PBS: ssä, näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan toissijaisella vasta-aineella PBS: ssä, joka sisälsi 2% hevosen seerumia. Kolmen 10 minuutin pesua PBS: ssä, näytteet kiinnitettiin Vectashield kova sisältävät DAPI. Kuvat tehtiin näkyviksi Zeiss 510 Meta konfokaali Laser Scanning Microscope. Primaaristen vasta-aineiden käytettiin kanin anti-TRF2 (H-300, Santa Cruz) ja hiiren anti-γ-H2AX vasta-aineita (klooni JBW301, Upstate). Toissijainen vasta-aineet olivat FITC-konjugoidulla aasin anti-kani-vasta-aineen ja Cy5-konjugoidulla aasin anti-hiiri-vasta-ainetta, niin Jackson Immuno-.

havaitseminen ALT by Quantitative PCR

Detection of telomeerinen C rikas piireissä osoitus ALT suoritettiin kuten kuvataan Reddel ryhmä [44]. Kolmena rinnakkaisena, 20 ui reaktiot sisälsivät 32 ng genomista DNA: ta, 0,2 mg /ml naudan seerumin albumiinia, 0,1% Tween-20, 4 mM ditiotreitolia (DTT), 7,5 yksikköä Φ29 DNA-polymeraasia (New England Biolabs, Ipswich, MA) , 1 x Φ29 DNA-polymeraasi-puskuria ja 1 mM dATP: tä, dCTP: tä, dGTP: tä ja dTTP: tä. Polymeraasi Reaktioita inkuboitiin 30 ° C: ssa 8 tunnin ajan, minkä jälkeen 65 ° C: ssa 20 minuuttia. Reaktiot dot blotattiin nitroselluloosamembraanille (Bio-Rad). Sen jälkeen kun UV-silloitus, kalvo hybridisoitiin yön aikana [

32P] -leimattua (TAACCC)

4-koettimella. Hybridisaatio ja pesut suoritettiin kuvatulla tavalla Telomeeri koko analyysin osassa (katso edellä).

Tulokset

telomeeripituuden ja telomeraasiaktiivisuuteen vaihtelevat Haimasyöpä Solulinjat

Paneeli 10 haimasyövän solulinjoissa leimasi varten telomeeripituuden ja suhteellinen telomeraasiaktiivisuuteen. Perimän DNA eristettiin jokaisen rivin pilkottiin cocktail 4 emäsparin leikkureita, eroteltiin agaroosigeelillä ja alistettiin

in situ

hybridisoimalla [

32P] -merkityn (TTAGGG)

4 koetin . Signaalit paljasti preparaatti telomeerinen fragmentteja, joiden koko 1-7 kbp (kuvio 1A). Densitometri-analyysi sallittu määrittäminen mediaani koosta telomeerisesti signaalin kullekin solulinja (kuvio 1 B). AsPC1 oli lyhin telomeres (mediaani = 2,2 ke), kun taas CAPAN2 ja Panc1 oli pisin (mediaanit = 3,5 ja 3,7 kb, vastaavasti). Joissakin linjat, erityisesti CAPAN1 ja CFPAC1, telomeerivasta jakelu kaksivaiheisesti. Näissä linjat, runsaasti lyhyitä telomeres rinnakkain pienellä murto-osa paljon pidempään telomeres ( 5 kb). Odottaisi CAPAN2 ja Panc1, kaikki linjat oli hyvin lyhyt bulk telomeres, jossa mediaani koot vaihtelevat 2,2-2,8 kb. Vertailun telomeres normaalin ihmisen haima on välillä 9 ja 15 kb pituudeltaan, riippuen iästä luovuttajien [45].

A) Telomeeri koon mittaukset. Genominen DNA pilkottiin restriktioentsyymeillä, erotettiin elektroforeesilla agaroosigeeleillä ja havaita in situ hybridisaatiossa [

32P] – (CCCTAA)

4. B) kvantifiointi telomere koon. Gel A skannattiin ja intensiteetti kunkin kaistan piirrettiin funktiona telomere koon, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Mediaani telomere koko arvioitiin koko, joka vastaa puolta kumulatiivinen summa intensiteetit. C) Detection telomeraasiaktiivisuuden että TRAP määrityksessä. Solu-uutteet, jotka sisältävät 300-soluja kunkin määritettiin käyttäen Cy5-leimattua TS oligo alustaan. PCR: n jälkeen samalla oligo ja telomeerisesti paluun aluke, tuotteet erotettiin elektroforeesilla ja tunnistettiin Typhon phosphoimager. Puskuri oli lyysipuskuria vain. ITAS, sisäinen Telomerase Pitoisuus Standard. D) kvantifiointi suhteellisen telomeraasiaktiivisuuteen. Suhteellinen telomeraasiaktiivisuus laskettiin suhde intensiteetti telomeraasin tikkaiden yli intensiteetti ITAS. Kukin mittaus on keskiarvona ± S.D. kolmesta näytteestä (n = 3). Telomeraasiaktiivisuus jokainen rivi ilmaistaan ​​prosenttia HeLa solujen toimintaa.

Muun kuin radioaktiivinen TRAP määritys (telomeerisesti Repeat Amplification Protocol), perustason telomeraasiaktiivisuutta mitattiin kvantitatiivisesti kussakin solulinjassa. TRAP määrityksessä käytetään PCR monistamaan tuotteita telomeraasin pidentymisen (Telomerase tikapuut) sekä sisäinen telomeraasin määritys standardin (ITAS). Telomeraasiaktiivisuus on määrällisesti suhde intensiteetti telomeraasin tikkaiden yli kuin ITAS. Kuviossa 1C esitetään edustava esimerkki TRAP määritys suoritetaan paneelissa, käyttäen sama määrä soluja kullekin riville. Suuret erot suhteellinen intensiteetti ITAS ja telomeraasin tikkaat havaittiin, osoittaa suuria eroja lähtötilanteessa telome- toimintaan. Jotta saataisiin enemmän tarkkoja mittauksia telomeraasiaktiivisuuden, laimennettiin sarjassa näytteitä kustakin linja otettiin samanaikaisesti analysoitiin ja verrattiin HeLa-solut. Densitometri-analyysi sallittu laskennassa perustason telomeraasiaktiivisuuden jokaiselle riville (kuvio 1 D). Haimasyövän solulinjoissa oli tasoja telomeraasiaktiivisuuden jotka vaihtelivat 0,5% (CD18) ja 23% (AsPC1) mainitun HeLa-solujen. Neljä riviä (L3.6pl, MiaPaCa2, HPAF, AsPC1) olivat osa ryhmää korkeasti telomeraasin (15,8 ± 4,8 prosenttia HeLa). Kuusi riviä (CD18, Panc1, Hs766T, CFPAC1, CAPAN1, CAPAN2) olivat osa ryhmää näyttämään 10-kertaisesti alhaisempi telomeraasin (1,53 ± 1,1% prosenttia HeLa). 46-kertainen ero telomeraasiaktiivisuuteen todettiin välillä AsPC1 (korkein aktiivisuus) ja CD18 (alin aktiivisuus) soluja. Ei korrelaatio löytyi koon telomeres ja taso telomeraasiaktiivisuuden (kuvio S1A).

Telomerase estoaktiivisuus GRN163L haimasyövän solulinjoissa

Seuraavaksi tutkimme telomeraasin estäviä vaikutuksia GRN163L kussakin 10 haimasyövän solulinjoissa. Jokaisella viivalla, telomeraasiaktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua lisäämällä kasvavia pitoisuuksia GRN163L soluihin (n = 3 kutakin annosta). Kuvio 2A esittää tämän analyysin tulokset on HPAF soluissa. Densitometrinen analyysi TRAP geelin annettiin suhteellisten telomeraasiaktiivisuuden, joka voi sitten ilmaista funktiona GRN163L pitoisuus. Nämä annos-vaste-käyrät sovitettiin epälineaarisen regression avulla, jotta laskennassa IC

50 jokaiselle riville. Kuvio 2B näyttää 95% välein luottamusta arvosta IC

50 jokaisella rivillä. Kaikki 10 haimasyövän solulinjoissa vastasi GRN163L, IC

50, jotka vaihtelivat 50 nM: sta 200 nM. Vähiten herkkä linja oli CD18 (IC

50 = 204 nM) ja kaikkein reagoiva ne olivat CFPAC1 ja MiaPaCa2 (IC

50 = 52 nM, molemmat). Näimme mitään korrelaatiota perustason telomeraasiaktiivisuus ja vasteen solulinjat GRN163L, mitattuna niiden IC

50 (kuvio S1B).

A) annos-vaste-käyrä telomeraasi inhibition GRN163L . HPAF soluja käsiteltiin kolmena kappaleena kasvavilla pitoisuuksilla GRN163L (50 nM 4 uM). Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttäen TRAP määritystä. Näytteet käsiteltiin ilman lääkettä oli asetettu 100%. B) IC

50 jokaisen rivin inhiboimiseksi telomerase by GRN163L. Annos-vastekäyrät tehtiin kuten paneelissa A. Epälineaariset käyräsovituksesta sallittu laskettaessa IC

50 jokaiselle riville. Tulokset ilmaistaan ​​IC

50 (keskellä bar) ja sen 95%: intervalli luottamusta (reunustavien baaria).

Jatkuvasta GRN163L Exposure leviämisen estämistä ja Cellular Lifespan

Kaksi haimasyövän solulinjoissa valittiin tutkimaan vaikutuksia pitkäaikaisen altistumisen GRN163L: CAPAN1 ja CD18. Verrattavissa suurin osa linjat tutkituista, CAPAN1 ja CD18 molemmilla oli suhteellisen lyhyt telomeres (2-3 kb) ja matalan tason telomeraasin toimintaa (0,5-1% HeLa-solujen). centrifugation.

doi:10.1371/journal.pone.0085155.s005

(TIF)

Acknowledgments

GRN163L