Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska eturauhassyöpä etenee kastraatio-resistenttejä, on kasvu signaalitransduktioaktiivisuus. Useimmat kastraatio kestävä eturauhasen kasvaimia jatkossakin ilmaista androgeenireseptorin (AR) sekä androgen-reagoiva geeneistä huolimatta puuttuvat lähes kiertävän androgeenien näillä potilailla. AR säätelee paitsi sen samaa alkuperää steroidi hormoni, mutta myös vuorovaikutusta tähdistö yhteistyön sääntelyä ja signalointimolekyylien. Siten kohonnut signalointi toimintaa, joka tapahtuu eteneminen kastraatio vastus voi vaikuttaa eturauhasen syöpäsolun kasvua joko AR tai riippumattomia AR. Jotta voidaan tunnistaa signalointireittejä, jotka säätelevät eturauhasen syöpäsolujen kasvua, seuloimme paneeli shRNAs kohdistaminen 673 ihmisen kinaasien vastaan ​​LNCaP eturauhasen syöpäsoluja kasvatetaan läsnä ja poissa ollessa hormoni. Näyttö tunnistettu useita shRNA klooneja vastaan ​​tunnettuja ja uusia geenikohteet jotka säätelevät eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Perustuen suuruus vaikutusta kasvuun, me valinnut kuusi kinaasien jatkotutkimuksiin: MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, ja PSKH1. Pudotus näiden kinaasien laski solujen kasvua sekä androgeeniriippuvaisissa ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpäsoluja. Nämä kinaasit oli erilaisia ​​vaikutuksia pohjapinta tai androgeenin indusoiman transkription aktiivisuutta AR kohdegeenien. MAP3K11 Knockdown johdonmukaisimmin muuttunut transkription AR kohdegeenien, mikä viittaa siihen, että MAP3K11 vaikuttaa sen kasvua estävä vaikutus moduloimalla AR transkription ohjelma. Yhdenmukainen MAP3K11 vaikuttavat AR, knockdovvn MAP3K11 esti AR Ser 650 fosforylaation, mikä edelleen tukee stressi kinaasi sääntelyn AR fosforylaation. Tämä tutkimus osoittaa, sovellettavuutta lentiviruksen perustuvien shRNA johtamiseen fenotyyppisen näytöt ja tunnistaa MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, ja PSKH1 säätelijöinä eturauhasen syöpäsolun kasvua. Perusteellinen arviointi näistä kinaasin tavoitteet tietä kehittää tehokkaampia hoitoja kastraatio kestävä eturauhassyöpä.

Citation: Whitworth H, Bhadel S, Ivey M, Conaway M, Spencer A, Hernan R, et al. (2012) tunnistaminen kinaasien Regulating Eturauhassyöpä Cell Growth käyttäminen RNAi Fenotyyppiset Screen. PLoS ONE 7 (6): e38950. doi: 10,1371 /journal.pone.0038950

Editor: Jindan Yu, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 tammikuu 2012; Hyväksytty: 15 toukokuu 2012; Julkaistu: 27 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Whitworth et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institute of Health Grant R01 CA124706 PO ja Paul Mellon Urologiset Cancer Institute, University of Virginia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Andrea Spencer, Ronald Hernan, ja Heather Holemon oli työssä Sigma-Aldrich Biotechnology aikana RNAi näyttö. Sigma-Aldrich myy MISSION kirjastoa, jota käytettiin tässä tutkimuksessa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

androgeenireseptorin (AR) on kriittinen säätelijä eturauhassyövän etenemistä ja se on yhä selvempää, että AR säätelee paitsi sen samaa alkuperää steroidi hormoni, mutta myös vuorovaikutusta tähdistö yhteistyön sääntelyä ja molekyylejä [1] – [3]. Potilaille, joilla esiintyy levitetään eturauhasen syöpä, kasvain on tyypillisesti riippuvainen androgeenireseptorin kasvua ja näin ollen, aluksi reagoi kirurgiseen ja /tai farmakologisen ehtyminen kiertävän androgeenien [4]. Kuitenkin terapeuttinen menestys on väliaikainen. Syöpä lähes poikkeuksetta toistuu ja etenee metastaattinen ja tappava sairaus. Laaja rajat puhua välillä signalointireittien, kuten androgeeni- ja peptidi signalointireitteihin, useita geneettisiä mutaatioita, ja geneettinen plastisuus syövän, kaikki osaltaan luontainen ja kehittynyt resistenssi androgeeniablaatio [5].

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että polypeptidi kasvutekijän signaalintransduktioreitteihin voi stimuloida AR aktivointia, mikä viittaa siihen, että kasvu kasvutekijän ja reseptorin ilmentymisen voitaisiin kausaaliseksi eturauhassyövässä etenemiseen kastraatio vastarintaa. Kasvutekijän stimulaatio on raportoitu tehdä AR-reagoivat promoottorit, jotka ovat yliherkkiä androgeenin [6] – [14], ja pakotetaan ilmentyminen HER2 /neu androgeeni-riippuvaisten syöpäsolujen on osoitettu ajaa kastraatio kestävä kasvu [15] , [16]. Lisäksi EGFR /HER2 signalointi voi estää eturauhasen syöpäsolujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

[17], [18] sekä AR transkriptioaktiviteettia, proteiinin stabiilisuuteen, DNA: ta sitovan , ja Ser 81 fosforylaatio [19]. Kyky signa- vaikuttaa Jälleenkytkentätoiminto voi olla merkittävä rooli kehityksen ja etenemisen eturauhassyöpä, jossa kasvua signaalitransduktioaktiivisuus on liittynyt hankintaan kastraation-resistenttejä. Tämä viittaa siihen, että hoitostrategioita kohdistaminen kinaasireaktiosarjojen voi voittaa korvaavia signalointi mekanismeja, jotka rajoittavat tehokkuutta androgeeniablaatio.

Jotta voitaisiin tunnistaa signalointireittien jotka säätelevät eturauhasen syöpäsolujen kasvua, me seulotaan paneeli shRNAs että tavoite ihmisen kinome vastaan ​​LNCaP eturauhasen syöpäsoluja kasvatetaan läsnä ja poissa ollessa androgen. Etsimme kinaasien, joilla oli yleistä kasvua vaikutuksia ja kinaasien jotka kompensoivat androgeeniablaatio. Näyttö tunnistettu useita shRNA kloonit vastaan ​​geenikohteet jotka säätelevät sekä androgeenireseptorin herkkyyttä ja solujen kasvua. Raportoimme tässä tuloksista meidän näytön ja yksityiskohtainen arviointi osajoukko kinaasien tunnistettu säätelijöinä eturauhasen syöpäsolun kasvua.

Tulokset

Ennen seulonta paneeli shRNAs että tavoite ihmisen kinome vastaan ​​LNCaP eturauhasen syöpäsoluja, teimme huolellinen optimointi parametrit, mukaan lukien solun kasvun edellytykset, infektion monikerralla, puromysiiniselektion, androgen hoitoon, ja solujen elinkelpoisuus mittaukset (tuloksia ei ole esitetty). Havaitsimme shRNA-klooneja, jotka laskivat ja lisääntynyt LNCaP solujen kasvua sekä läsnä ollessa ja poissa ollessa androgeenireseptorin (kuvio 1). Näyttö käytti MISSION® kirjaston kolme-viisi shRNAs kullekin 673 kinaasi tavoitteita; kolme riippumatonta biologinen rinnakkaista tehtiin eri päivinä. Sen jälkeen Knockdown, muutoksiin LNCaP solujen aineenvaihduntaan määritettiin käyttäen alamarBlue korvikkeena solujen lisääntymisen. Useita shRNA kloonit vastaan ​​geenikohteet vaikuttavat solujen kasvuun tunnistettiin.

LNCaP-solut transdusoitiin kolmena rinnakkaisena kolme-viisi shRNAs kohdistettu 673 ihmisen kinaasien. Solujen kasvu mitattiin alamarBlue 7. päivänä piirretty on solujen kasvua suhteessa pLKO tyhjän vektorin ohjaus vastauksena kuhunkin shRNA läsnä ja poissa ollessa hormonin (0,05 nM R1881). Punainen ja vihreä viivat rajata katkaista pistettä hallinnassa pLKO, NTC, media yksin, ja AR shRNA. Punainen viiva osoittaa kasvun hidastumisen ja vihreän linjan kasvua.

Ei ollut eroa kasvun verrattaessa pLKO tyhjän vektorin ei-kohde ohjaus (NTC) (n = 82, tuloksia ei ole esitetty) . Androgeenien käsiteltyjä soluja kasvoi 3,2 kertaa suurempi kuin ajoneuvon käsiteltyjä soluja (n = 82). AR pudotus käyttäen shRNA käytettiin positiivisena kontrollina näytön, kasvun estämisessä yli 60% kasvatettujen solujen läsnä ollessa androgeenireseptorin (n = 41, tuloksia ei ole esitetty), mutta joilla on minimaalinen vaikutus LNCaP-soluja kasvatettiin ilman androgeenireseptorin (n = 41, tuloksia ei ole esitetty). Läsnäollessa androgen, me sai shRNAs jotka estivät kasvun vähintään 75%, mikä on vähemmän kuin top 1% of shRNAs kasvun estämiseen, koska shRNAs kohdistaminen kinaasien että positiivisesti säätelevät LNCaP solujen kasvua. Koska androgen, me sai shRNAs jotka estivät kasvun 50% tai enemmän, mikä on vähemmän kuin top 2%: shRNAs kasvun estämiseen, koska shRNAs kohdistaminen kinaasien että positiivisesti säätelevät LNCaP solujen kasvua. Käyttämällä näitä kriteereitä, shRNA knockdovvn 46 kinaasien estivät solujen kasvua. Mielenkiintoista on, että hyvin harvat shRNAs osoittivat vaikutuksen, joka oli riippuvainen läsnä tai poissa androgen. Useimmat shRNAs inhiboi kasvun molemmissa olosuhteissa, vaikka suuruus inhibition vaihtelivat, mikä osoittaa, että tämä näyttö ei paljastanut kinaaseja, jotka erityisesti säädellä androgeenin indusoiman LNCaP solujen kasvua. Ribosomaalisen proteiinin S6-kinaasi (RPS6KA3), joka on ollut mukana säätelyssä AR aktiivisuuden ja eturauhasen syöpäsolujen kasvua [20] – [24], todettiin tässä näytössä, joka tukee RNAi seulontaan tunnistaa kinaasien säätelevä eturauhasen syöpäsolun kasvua. Havaitsimme myös 34 kinaasien edustaa top 1%, jonka knockdown lisääntynyt LNCaP solujen kasvua (kuvio 1).

valinnut kuusi estävä kinaasien lisätutkimuksia perustuu suuruuteen vaikutus shRNA Knockdown: mitogeeniaktivoidut proteiini kinaasikinaasikinaasina 11 (MAP3K11), diasyyliglyserolin kinaasi delta (DGKD), suoliston solujen kinaasi (ICK), sitruuna rho vuorovaikutuksessa kinaasi (CIT), galactokinase2 (GALK2), ja proteiini seriini kinaasi H1 (PSKH1). Eräs näistä arvelee, että jos kinaasit, jotka vähentävät kasvua, kun pudotti ovat syy eturauhassyövän etenemisen, niin aktiivisuus näiden kinaasien tulisi kasvaa syövän etenemisessä. Välivaiheena tutkimaan aktivoinnin tilan kinaasien, tutkimme kinaasi viesti tasoilla Oncomine tietokantaan. Huomasimme, että vähintään kaksi riippumatonta tutkimusta mRNA tasot kuusi kinaasien lisääntynyt joko ensisijainen eturauhassyöpä verrataan normaaliin eturauhasen tai metastaattinen eturauhassyöpä verrataan ensisijainen sairaus tai normaalissa eturauhasessa (kuvio S1).

Me validoitu kasvun vaikutus ja knockdown meidän kuuden valitun kinaasien avulla CyQuant pitoisuus, joka mittaa DNA sisältö korvikkeena solujen määrä, ja käyttää tätä tekniikkaa myös laajentaa analyysin kastraatio vastustuskykyisten solulinjassa, C4-2B. Solut transdusoitiin lentiviraalinen hiukkasia ilmaistaan ​​kaksi shRNAs spesifisiä kullekin kinaasia kohteisiin tai pLKO tyhjän vektorin ohjaus läsnäollessa (0,05 nM R1881) tai poissa androgen. Kuten havaitaan kuviossa 2, kasvu oli vähentynyt molemmissa solulinjoissa vasteena kuhunkin shRNA. Yleensä kinaasin pudotus esti kasvun läsnä ja poissa ollessa androgen. Lisäksi kinaasi pudotus vaikutti kasvuun vastaavasti sekä androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja kastraatio kestävä C4-2B solulinjassa.

suhteellinen vaikutus kahden riippumattoman shRNAs kohden kinaasi solujen kasvuun LNCaP (A) ja C4- 2B (B-solut). CyQuant Pitoisuus mitataan DNA sisältöä korvikkeena solujen määrä 7 päivää shRNA transduktion. Koe tehtiin läsnä ollessa ja puuttuessa hormonin (0,05 nM R1881), n ​​= 3-7 riippuen kinaasin. Solujen kasvu verrattuna käsittelemättömiin pLKO ohjaus ja arvoista otettiin keskiarvo poikki biologinen rinnakkaista. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. * Merkitsee tilastollista merkitsevyyttä.

qPCR käytettiin määrittämään kinaasin pudotus, jonka shRNA LNCaP ja C4-2B-soluja (kuvio 3). Hormoni lisättiin eri pitoisuuksina (ajoneuvon, 0,05, 0,5, ja 1 nM R1881), ja RNA eristettiin 2 ja 24 tunnin kuluttua hormonihoidon. Nämä hormoni hoidot olivat samoja kuin ne, joita käytetään vaikutuksen arvioimiseksi kinaasin pudotus on AR transkriptioaktiviteettia, joka on kuvattu alla ja esitetty taulukossa 1. Kukin kinaasin pudotettiin molemmissa solulinjoissa kahdella eri shRNAs ja verrattuna pLKO tyhjä vektorisäätö. Emme havainneet vaikutusta hormonin annoksen tehokkuutta kinaasin taintumisen (kuva S2); Näin data kuvassa 3 ovat qPCR tulosten keskiarvo poikki biologisten rinnakkaisnäytteiden ja hormonien kunkin shRNA tai pLKO valvonta 24 tunnin kuluttua hormonin stimulaatio. ShRNA virukset saavat aikaan yli 50% pudotus kohde kinaasin mRNA: ta verrattuna pLKO, useimmat knockdowns yli 70% sekä ajankohtina ja molemmissa solulinjoissa. Pääosin sama havainnot tehtiin kinaasien pudotus seuraavat 2 tuntia hormonin stimulaatio (tuloksia ei ole esitetty).

Kinase transkriptipitoisuuksissa LNCaP (A) ja C4-2B (B) soluissa Knockdown kahden itsenäisen shRNAs per kinaasi . Transkriptipitoisuuksissa mitattiin qPCR päivänä 4 seuraavat transduktion ja 2 tunnin kuluttua R1881 hormonihoidon (ajoneuvo, 0,05, 0,5, ja 1 nM). Transkriptin tasot verrattuna käsittelemättömiin pLKO ohjaus ja normalisoitiin housekeeping-geeni, PSMB6. Arvot laskettiin keskiarvo yli hormonien ja biologisten rinnakkaista. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. * Merkitsee tilastollista merkittävyyttä.

Ei ollut joitakin ero knockdovvn kinaasin mRNA shRNA, mikä saattaa selittää ero knockdovvn kasvua. Esimerkiksi LNCaP-soluissa, CIT shRNA-2 sai aikaan suuremman kasvun inhibitiota kuin CIT shRNA-1, joka yhtäläisyyksiä vaikutus kinaasin mRNA pudotus, jossa CIT shRNA-2 vähentää CIT-mRNA-tasoja enemmän kuin CIT shRNA-1. Kuitenkin yhteneväisyyksiä kasvun hidastumisen ja mRNA knockdown eivät ole ilmeisiä kaikille kinaasien kohdennettuja.

Sen määrittämiseksi, jos kasvun esto indusoi kinaasin Knockdown oli spesifinen eturauhasen syöpäsoluja, mittasimme kasvua LHS ja MCF10A solut vasteena shRNA kohdistaminen seitsemän kinaasien (kuvio 4). LHS solut ovat ei-tuumorigeenisiä ikuisti ihmisen eturauhasen epiteelisolujen tuottamat ektooppinen ilmaus SV40 suuri, pieni T-antigeenin ja ihmisen telomeraasin [25]. MCF10A on ei-tuumorigeeninen, spontaanisti kuolemattomaksi rintaepiteelin solulinja [26]. LNCaP-soluja toimi kontrollina, rinnakkaiset kokeet osoittavat inhibition LNCaP solujen kasvua ja kinaasin ekspressiota (tietoja ei esitetä). Yleensä shRNA kohdistuu kinaasien oli vain vähäinen vaikutus LHS ja MCF10A solujen kasvua, mikä viittaa siihen, selektiivisyyttä syöpäsolujen (kuvio 4). Knockdown kinaasin viestin LHS ja MCF10A soluja oli vaihteleva (tuloksia ei ole esitetty). Vuonna LHS soluissa, MAP3K11 oli tosiasiallisesti pudotettiin (75 90% esto) ja PSKH1 (50%: n esto); mutta Knockdown oli tehoton muiden kinaasien. Vuonna MCF10A soluissa, CIT estyi (80%) ja PSKH1, DGKD, ja GALK2 olivat kukin inhiboi noin 50%. Kyvyttömyys estää kinaasin ekspressiota samassa määrin kuin LNCaP, C4-2B, (kuvio 3) ja CWR22Rv1 soluja (tietoja ei esitetty), monimutkaistaa tulkinnassa merkitystä näiden kinaasien normaalien solujen kasvua ja selviytymistä. Kuitenkin kaikki kuusi kinaasit pudotettiin ainakin yhdessä normaalia testatuista solulinjoista. Niinpä nämä tulokset ovat yhdenmukaisia, että on selektiivisyys kohdentamalla kinaasien syöpäsoluissa yli normaalit solut.

suhteellinen vaikutus kahden riippumattoman shRNAs kohden kinaasi solujen kasvua LHS (A) ja MCF10A (B-solut) . CyQuant Pitoisuus mitataan DNA sisältöä korvikkeena solujen määrä 7 päivää shRNA transduktion. n = 2 LHS solujen ja n = 3 MCF10A soluja. Solujen kasvua verrattiin pLKO ohjaus ja arvoista otettiin keskiarvo poikki biologinen rinnakkaista. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon.

Koska AR on tärkeä säätelijä eturauhasen syöpäsolujen kasvua, halusimme selvittää, onko Kuuden valitun kinaasien saattaa vaikuttaa kasvua säätelevät AR transcriptome . Jotta voidaan tutkia vaikutus kinaasin pudotus on AR kohdegeenin transkription, qPCR käytettiin mittaamaan transkriptitasot kahden AR kohdegeenien, TMPRSS2 ja SGK, LNCaP ja C4-2B solut kaksi riippumatonta shRNAs käyttää inhiboimaan kinaasin ilmentymistä (taulukko 1) . Tutkimme transkriptio näiden geenien 2 ja 24 tuntia vaikutuksen arvioimiseksi kinaasin Knockdown on välittömästi varhaisen reagoinnin ja vakaan tilan tasot AR transkriptionaalisen aktiivisuuden. Tilastollinen analyysi osoittaa, että ei ollut mitään vaikutusta hormonin annoksen kykyyn kinaasin pudotus vaikuttaa AR transkriptioon; kinaasi pudotus muuttunut transkriptio samanarvoisesti tai ei ollut vaikutusta, kullakin androgen annoksella. Huolto androgen induktion pLKO havaittiin kaikissa analysoitiin kokeista. Esitetty taulukossa 1 ovat tilastollisesti merkittäviä muutoksia AR transkription TMPRSS2 ja SGK vastauksena kinaasi pudotus kahden riippumattoman shRNAs 2 ja 24 tuntia kolmella eri androgen annos hoitoja. Molemmat shRNAs täytyi muuttaa geenin transkriptio merkittävästi samaan suuntaan raportointia taulukossa.

Ei ollut johdonmukainen lasku AR transkriptioaktiviteettia vastauksena Knockdown kuudesta kinaasien kaikkialle sekä solulinjoissa, AR kohdegeenien tutkitut ja kaksi testattuina ajankohtina (taulukko 1). Knockdovvn MAP3K11 laski transkription TMPRSS2 LNCaP-soluissa 24 tuntia ja C4-2B solujen 2 tuntia lisäämisen jälkeen androgen. Kuitenkin MAP3K11 pudotus lisääntynyt transkriptio SGK in C4-2B soluissa 2 tuntia lisäämisen jälkeen tai hormonia. Knockdovvn DGKD vähentynyt transkriptio TMPRSS2 C4-2B soluissa sekä SGK LNCaP-soluissa 24 tuntia. Ei ollut mitään muutosta TMPRSS2 tai SGK transkriptio joko solulinja seurauksena knockdovvn ICK tai PSKH1. CIT Knockdown on erilainen vaikutus AR transkriptio. Mielenkiintoista on, että parhaiten yhteen vaikutusta AR transkriptio oli peräisin GALK2 pudotus, joka aiheutti lisääntymisen SGK 24 tunnin kuluttua hormonin Lisäksi molemmissa solulinjoissa ja 2 tuntia C4-2B soluissa. Kuitenkin tarkastellaan vain TMPRSS2 ja SGK edustajana AR-kohdegeenien voi luoda valinta bias; siksi, laajensimme analyysi AR geenien.

Analysoimme 14 lisägeenit, kuten AR-aktivoitu geenit PSA, FKBP51, ORM1, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, ja UGT2B ; AR-tukahdutettu geenejä DKK ja FST; ja kastraatio kestävä eturauhassyövän AR geenien CDC20, CDK1, ja UBE2C. Transkriptio LNCaP-soluissa MAP3K11 Knockdown tutkittiin 24 tunnin kuluttua androgen hoidon. Kuten odotettua, androgeenin indusoima tai tukahdutettu transkriptio kaikkien AR kohdegeenien pLKO ohjaus soluissa. Vaikutus MAP3K11 Knockdown on AR transkriptio on tavoite riippuvainen. Androgen stimuloimaa transkription TMPRSS2, SGK, ja ORM1 väheni vastauksena MAP3K11 pudotus (kuvio 5A). Käänteistä päti androgeenisäädellyn tukahdutettu geenejä DKK ja FST. MAP3K11 pudotus stimuloi geenin ilmentymisen ja vähentynyt määrä androgeenin indusoiman repression (kuvio 5B). PSA, FKBP51, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, ja UGT2B ei muuttunut vastauksena MAP3K11 pudotus. Sikäli kuin tämä osajoukko AR kohdegeenien edustaa AR transcriptome, nämä tiedot viittaavat siihen, että solujen kasvun inhibitio vasteena MAP3K11 kinaasi pudotus voi johtua asetuksen AR transkriptionaalisen aktiivisuuden osajoukossa AR-säädeltyjen geenien. AR selektiivisesti säätelee solusyklin geenien, kuten CDC20, CDK1, ja UBE2C edistää solujen kasvua [27]. Olemme havainneet, että MAP3K11 pudotus johti hieman, mutta tilastollisesti merkitsevä väheneminen transkription näistä M-vaiheen AR-geenien (kuvio 5C).

(A) Transcript androgeenivaikutuksen-indusoidun AR-kohdegeenien, että muuttunut vastauksena MAP3K11 knockdown LNCaP-soluissa transdusoitiin kaksi itsenäistä shRNAs ja pLKO valvontaa. RNA eristettiin 24 tuntia lisäämisen jälkeen R1881 1 nM. Transkriptitasot mitattiin qPCR verrattuna pLKO ja normalisoitiin housekeeping-geeni, GUS. (B) Transcript androgeenivaikutuksen-tukahdutettu AR-kohdegeenien ja (C) transkriptin tasot AR-säänneltyjen M-vaiheen geenejä on kuvattu [27]. (B) ja (C) käsiteltiin kuten on kuvattu (A). Arvot laskettiin keskiarvo poikki biologinen rinnakkaisnäytteiden n = 3. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon. * Merkitsee tilastollista merkittävyyttä.

Aikaisemmin osoitimme, että stressi kinaasit voivat säädellä AR Ser 650 fosforylaatio [28]. Täten tutkimaan edelleen mekanismi MAP3K11 säätely eturauhasen syöpäsolun kasvua ja AR transkriptio, testasimme jos MAP3K11 Knockdown säädellä AR Ser 650 fosforylaatio koska MAP3K11 on ylävirran säätelijä JNK toimintaa. PMA indusoi AR Ser 650 fosforylaation LNCaP ja C4-2B solujen yli 3-kertaiseksi (kuvio 6). Näissä kokeissa sekä shRNAs vähentynyt MAP3K11 proteiinin ilmentymisen, jossa MAP3K11 shRNA-1 laskeva ilmentymisen suuremmassa määrin kuin MAP3K11 shRNA-2. Samanlaisia ​​muutoksia c-Jun-fosforylaation havaittu, mikä viittaa siihen, että MAP3K11 shRNAs esti PMA-stressille kinaasisignaloinnin. Näissä olosuhteissa, AR Ser 650 fosforylaation laski sekä LNCaP ja C4-2B soluja. Rinnakkainen laskua yhteensä AR havaittiin. Kvantitointi suhteellisen määrän Ser 650 fosforylaation kokonaismäärään AR vähensi fosfo-Ser 650 (kuvio 6 histogrammi), mikä viittaa siihen, stökiömetrinen muutos AR Ser 650: n fosforylaatiota vasteena MAPK3K11 pudotus. MAP3K11 shRNA-1 oli suurin vaikutus AR Ser 650 fosforylaatio, rinnalle vaikutus MAP3K11 proteiinin ilmentymiseen ja c-Jun fosforylaatiota. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aikaisemmissa tuloksia, jotka viittaavat siihen, että stressi kinaasisignaloinnin säätelee AR Ser 650 fosforylaatio [28] ja edelleen viittaavat siihen, että MAP3K11 Knockdown voidaan nostattamaan kasvun estäminen kautta keskeytymisen AR.

LNCaP ja C4-2B solut transdusoitiin kaksi itsenäistä shRNAs kohdistaminen MAP3K11 tai pLKO ohjaus. Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai PMA. Yhteensä AR immunosaostettiin ja blotattiin varten fosfo-S650 ja koko AR tasolla. Solulysaattia pyyhittäisiin täydellistä MAP3K11 yhteensä JNK, fosfo-JNK, ja tubuliinia. Piirretään on fosfo-S650 signaali normalisoidaan yhteensä AR, n = 3. Kvantifiointi suoritettiin Odyssey LICOR kuvantamisjärjestelmä. Virhepylväät edustavat keskivirhe keskiarvon.

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittaa soveltuvuutta lentiviruksen perustuvien shRNA johtamiseksi fenotyyppinen näytöt kohteiden tunnistamiseen mukana eturauhassyövän kasvua. Signalointireittien säätelevät eturauhasen syöpäsolun kasvua ja AR toiminta on keskeinen rooli siirryttäessä androgeeniriippuvaisen eturauhassyöpä on kastraatio-resistenttejä [29]. Jotta tiedettäisiin kinaasien näissä verkoissa, tutkimme kuinka RNAi knockdovvn kinaasien vaikuttaa LNCaP eturauhasen syöpäsolun kasvua. Me ennusti löytää sekä uudet ja tunnetut säätelijöinä kasvua. Näytön tunnistettu kinaasien aiemmin osoitettu säätelevän eturauhasen syöpäsolujen kasvua ja AR toimintaa, mukaan lukien ribosomin S6-kinaasi (RPS6KA3 tai EK) [30]. RSK on alavirtaan MAPK ja parantaa PSA transkriptio. Kemiallinen estyminen EK laski PSA ilmaisun ja eturauhasen syöpäsolujen kasvua [30]. RSK näyttää välittävän AR transkription aktivointi omilla kinaasia toimintaa sekä vuorovaikutus p300, AR yhteistyössä säädin HAT toimintaa. Tunnistaminen RSK meidän näyttö tukee hypomorphic geneettinen näytöt tunnistaa kinaasien säätelevä eturauhasen syöpäsolujen kasvua.

Useita tavoitteita tunnistettiin meidän RNAi näyttö viittaa siihen, että useita kinaasisignaloinnin reitit säätelevät eturauhasen syöpäsolun kasvua. Valitsimme kuusi kinaasien jatkotutkimuksiin, kuten MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, ja PSKH1. Pudotus kaikkien kuuden kinaasien todettiin vähentävän solujen kasvua sekä androgeeniriippuvaisissa ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpäsoluja. Sen määrittämiseksi, kasvua vaikutus välittyi läpi AR, me aluksi tarkasteltiin transkription kaksi hyvin tunnettu AR reagoiva geenejä, TMPRSS2 ja SGK. Emme havainneet johdonmukaista vaikutus poikki ajankohtina ja solulinjoissa testattiin AR transkriptio TMPRSS2 ja SGK kun kuusi kinaasit tippuu alas. Kuitenkin, kun lisäsimme analyysi 16 yhteensä AR-geenien vastauksena MAP3K11 pudotus, olemme havainneet, että osajoukko AR-kohdegeenien on muutettu. Tämä viittaa siihen, että MAP3K11 Knockdown voi moduloida AR transkriptionaalisen aktiivisuuden ja saattaa välittää sen kasvua vaikutukset läpi AR. Lisäksi nämä tiedot lisäävät näyttöä siitä, että AR voidaan säädellä promoottorin selektiivisesti, jotta se voi toimia integraattorina useiden solunulkoisen signaaleja. Meidän lab ja muut ovat ilmoittaneet tätä aikaisemmissa tutkimuksissa [31], [32]. Lisäksi kokeista, joissa muita AR-kohdegeenien on tarpeen täysin vaikutusten arvioimiseksi pudotus näiden kuuden kinaasien AR transkriptiota.

MAP3K11, jota kutsutaan myös Mixed Lineage Kinase (MLK3), on jäsen seriini /treoniini -kinaasiperheen että ensisijaisesti aktivoi MAPK8 /JNK-kinaasin ja toimii positiivisena säätelijänä JNK signaloinnin [33]. Lisäksi tämä kinaasi voi suoraan fosforyloida ja aktivoida IkappaB kinaasi ja on mukana transkription aktiivisuutta NF-kappaB Rho perheen GTPaaseja. MAP3K11 vaaditaan seerumin stimuloimaa solujen lisääntymistä sekä mitogeeni ja sytokiinien aktivointi p38, ERK, ja JNK1. MAP3K11 myös oma roolinsa mitogeenistimuloidut fosforylaation ja aktivaation BRAF, ilman fosforyloivaan BRAF suoraan. Näin ollen, MAP3K11 toimii solmun mitogeeni ja stressiä signalointireittejä. Olemme aiemmin osoittaneet, että aktivointi MAP kinaasireitin korreloi eturauhassyöpä etenemisen eri asetuksia ja todennut, että stressi kinaasisignaloinnin säätelee AR Ser 650 fosforylaatio [28], [34]. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että stressi kinaasisignaloinnin säätelee AR Ser 650 fosforylaatioon; knockdovvn MAP3K11 stoikiometrisesti laski PMA-indusoidun AR Ser 650 fosforylaatio. Modulaatio Ser 650 fosforylaation voidaan säännellä AR transkriptionaalista aktiivisuutta AR-kohdegeenien, että muutettiin kun MAP3K11 pudotus, mukaan lukien TMPRSS2, SGK, ORM1, DKK ja FST. Olemme myös havainneet, että kastraation kestävä eturauhassyövän AR säänneltyjen M-vaiheen geenien CDC20, CDK1, ja UBE2C [27], laskivat vasteena MAP3K11 pudotus, vaikka lasku transkriptio näiden geenien voi heijastaa kasvun esto laukaisee MAP3K11 knockdown eikä edustavat muuttunut AR transkriptionaalisen aktiivisuuden. Meidän näytön tunnistettiin myös muita stressiä kinaasien, mukaan lukien MAP3K7, MAP4K3, ja MAPKAPK5 (tietoja ei ole esitetty), mikä korostaa kriittistä luonnetta stressin kinaasisignaloinnin säätelyssä eturauhasen syöpäsolujen kasvua.

DGKD on entsyymi, joka fosforyloi diasyyliglyseroli (DAG) tuottamiseksi fosfatidihappoa (PA). DGK katalysoi fosforylaatiota DAG muuntamalla se PA, jolloin vaihtamalla yksi toisiolähettinä toisen ja aktivoimalla proteiinikinaasi C (PKC) [35]. On yhä enemmän näyttöä siitä, että DGKD on mukana säätelyssä DAG ja PA tasolla vastauksena erilaisia ​​kasvutekijöitä ja hormoneja [35]. DGKD ilmoitettiin vuorovaikutuksessa RACK1 on proteiini, joka meillä oli aiemmin osoittanut kuin AR vuorovaikutuksessa proteiini, joka säätelee AR fosforylaatiota ja transkriptioaktiviteettia [36], [37]. Siten DGKD saattaa edistää AR sääntelyn kautta RACK1. Kuitenkin knockdovvn DGKD ei ollut merkittävää vaikutusta AR transkriptioaktiivisuuden. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilman DGKD, EGFR signalointia vähennetään koska sekä ilmaisun ja kinaasitoiminta estyvät [38]. Tämä vaikutus on EGFR on seurausta lasku on deubiquitinase, USP-8, ja sen vuoksi lisääntynyt ubikitinaatio ja hajoamista EGFR [38]. Kasvutekijä signalointi on tunnettu säätelijä eturauhasen syöpäsolun kasvua [29]. Näin ollen on mahdollista, että kasvun vaikutus, joka vastaa DGKD pudotus on muuttumisen johdosta reseptorin tyrosiinikinaasin signaloinnin.

ICK on seriini /treoniini-kinaasi, joka sisältää kaksi fosforylaatiokohdan löytyy mitogeeni-aktivoivan proteiinin kinaasien, joiden toiminta säätelee solusyklin liittyvien kinaasi (CCRK) ja ihmisen proteiini fosfataasi 5 (PP5) [39]. ICK liittyy miehen sukusolujen liittyvän proteiinikinaasi (MAK). MAK on AR co-säädin, joka suoraan sitoo AR yhteistyössä immuunisaostuskokeissa ja parantaa AR-riippuvaista transkriptiota kinaasi riippuvaisella tavalla [40]. Esto MAK joko RNAi tai kinaasia kuollut muoto laski LNCaP solujen kasvua. Vaikutus MAK Knockdown kasvuun rinnasteinen havaintojemme kanssa ICK vaikka emme ole havainneet vaikutusta ICK on AR transkriptio viittaa vaihtoehtoista mekanismia kasvun säätelyssä. ICK voi fosforyloida Viikatteet, antiapoptoottista proteiinia ja voi siten säädellä solujen eloonjäänti [39], [41].

CIT on kaksi spesifisyyttä proteiinikinaasi, joka on oletettu RHO ja RAC efektori, joka voi olla rooli sytokineesiin [42]. CIT Knockdown voivat häiritä sytokineesiin ja siten solujen kasvua. GALK2 on N-asetyyligalaktosamiini (GalNAc) kinaasi, jolla on myös galaktokinaasin aktiivisuus korkeissa galaktoosi pitoisuuksina [43]. Säätelevä hiilihydraattien aineenvaihdunta on välttämätön solujen kasvulle ja GalNAc on kriittinen O-kytketty glykosylaatio ja vastaavat asetus solun signaloinnin [44]; GALK2 Knockdown voi häiritä näitä perustavaa laatua solun prosesseja. PSKH1 on tutkittu ilmiö kinaasi, joka voi olla silmukoinnin tekijä osaston liittyvän seriini kinaasin rooli intranukleaarinen kuin snRNP liitos tekijä kaupan ja pre-mRNA käsittely [45]. Puuttuminen on merkittävä vaikutus ei-tuumorigeenisiä LHS eturauhasen solujen ja MCF10A rintojen solut voivat johtua eroista suhteellista tehokkuutta knockdown ja /tai vaatimus näiden kinaasien näihin perustavaa laatua solun prosesseja. On todennäköistä, että vaatimus CIT, GALK2, ja PSKH1 vaihtelee riippuen kasvaimia valtio lähtien mRNA-tasoja näiden kinaasien kasvaa eturauhassyöpä etenee (kuva S1). Jatkotutkimuksia tarvitaan määrittää mekanismia kasvun säätelyssä näiden kinaasien eturauhassyövän.

Tässä tutkimuksessa seulotaan paneeli shRNAs kohdistaminen ihmisen kinome vastaan ​​LNCaP eturauhasen syöpäsoluja kasvatetaan läsnä ja poissa ollessa androgeenireseptorin tunnistaa signalointireittejä, jotka säätelevät eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Havaitsimme useita shRNA klooneja vastaan ​​kinaasit, jotka säätelevät sekä androgeeniriippuvaisen ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpäsolun kasvua. Tämä tutkimus osoittaa edelleen soveltuvuutta lentiviruksen perustuvan shRNA johtamiseksi fenotyyppinen näytöt kohteiden tunnistamiseen mukana erilaisia ​​biologisia prosesseja, ja vahvistetaan MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, ja PSKH1 säätelijöinä eturauhasen syöpäsolun kasvua.