Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yleisin sisäelinten maligniteetti Länsi miehillä ja merkittävä syy syöpäkuolemista . Lisääntynyt aktivointi AKT ja NFkB kulkureittiä on tunnistettu kriittisiksi vaiheet eturauhassyövän taudin alkamisen ja etenemisen. GGAP2 (GTP-sitovaa ja GTPaasia aktivoiva proteiini 2) on multidomain proteiini, joka sisältää N-terminaalisen Ras homologiadomeeni (GTPaasi), jonka jälkeen PH domeeni, C-terminaalinen GAP domeeni ja ankyriiniproteiinista toista verkkotunnusta. GGAP2 voi suoraan aktivoida signaloinnin kautta sekä AKT ja NFkB reitit ja toimii solmu ylikuulumisen välillä reittejä. Lisääntynyt GGAP2 ilme on läsnä kolme neljäsosaa eturauhasen syöpiä. Mutaatiot GGAP2 on raportoitu solulinjoja muiden pahanlaatuisten kasvainten. Siksi analysoitiin 84 eturauhassyöpäkudoksille ja 43 hyvänlaatuinen eturauhasen kudosten somaattisten mutaatioiden GGAP2 suoralla sekvensoinnilla yksittäisten kloonien peräisin GAP ja GTPaasi domeenit normaalin ja kasvainkudoksen. Yleisesti ottaen puolet syövistä sisälsi mutantti GAP domain klooneja ja 20% syövistä, 30% tai enemmän klooneja mutantti GAP domain. Yllättäen mutaatiot olivat heterogeenisiä ja nonclonal, joissa on useita eri mutaatioita on läsnä monissa kasvaimissa. Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin analyysin GTPaasi verkkotunnuksen. Mutantti GGAP2 proteiinit oli merkittävästi korkeammat transkriptionaalista aktiivisuutta käyttämällä AP-1 reagoiva toimittaja konstrukteja verrattuna villityypin proteiinia. Lisäksi läsnäolo Näiden mutaatioiden liittyi aggressiivista kliinistä käyttäytymistä. Läsnäolo korkean taajuuden nonclonal mutaatioita yhden geenin on uusi ja edustaa uutta tila geneettinen muutos, joka voi edistää syövän etenemiseen. Analyysi mutaatioiden syöpä on käytetty ennustamaan lopputuloksen ja ohjata terapeuttinen kohde tunnistus, mutta tällainen analyysi on keskittynyt klonaalinen mutaatioita. Tutkimuksemme osoittavat, että joissain tapauksissa korkean taajuuden nonclonal mutaatiot voivat on arvioitava samoin.

Citation: Cai Y, Wang J, Ren C, Ittmann M (2012) usein heterogeeninen Missense mutaatiot GGAP2 in Eturauhassyöpä : vaikutukset tuumoribiologiassa, klonaalisuuden ja Mutation Analysis. PLoS ONE 7 (2): e32708. doi: 10,1371 /journal.pone.0032708

Editor: Sharon A. Glynn, National University of Ireland Galway, Irlanti

vastaanotettu: 01 joulukuu 2011; Hyväksytty: 31 tammikuu 2012; Julkaistu: 28 helmikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: tuki MI oli mahdollista kautta puolustusministeriön Eturauhassyöpä Tutkimusohjelma (W81XWH-07-1-0023; http: //cdmrp .army.mil), National Cancer Institute, että Dan L. Duncan Cancer Center (P30CA125123, www.nih.gov) ja käyttämällä tiloja Michael E. DeBakey veteraaniviraston Medical Center (www.houston .va.gov). Tuki YC oli mahdollista kautta puolustusministeriön Eturauhassyöpä Tutkimusohjelma (W81 WH-07-01-0220, https://cdmrp.army.mil). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erilaisia ​​geneettisiä ja epigeneettisten muutoksia on kuvattu eturauhassyövän. Useat tutkimukset ovat osoittaneet johdonmukaisesti geenien kopioluvun muutoksia kuten menetys 8p ja 13q14 ja voitto 8q24 kliinisesti lokalisoitu ja kehittyneen eturauhasen syöpiä [1], [2]. Epigeneettiset muutokset kuten metyloinnin ovat myös yleisiä eturauhassyövässä. Sitä vastoin useimmat tutkimukset ovat tähän mennessä osoittaneet vain harvoin klonaalinen pistemutaatioiden kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä [2], [3]. Enemmän edenneen eturauhassyövän syöpiä, klonaalinen pistemutaatioita tuumorisuppressorigeeneille kuten PTEN [4] ja p53 [3] ovat yleisempiä, toisin kuin matalien taajuuksien mutaation näiden geenien paikallisen syövän [5], [6], mutta eivät vieläkään ole yhteisiä verrattuna useimpiin syöpäsairauksia. Aktivointi klonaalinen mutaatiot onkogeenien, kuten RAS, eivät ole yleisiä eturauhasen syövän Yhdysvalloissa [3], toisin kuin useammin mutaation havaittu muissa yleisissä ihmisen syövissä, kuten paksusuolen ja keuhkosyöpä. Klonaalisia androgeenireseptorin mutaatiot nähdään kastraatiotason kestävä eturauhassyövän ja näyttävät valitaan mekanismina, jolla eturauhassyövän solut voivat selviytyä alhainen androgeenien ympäristöön [3]. Näin ollen käytettävissä olevat tiedot osoittavat, että klonaalinen pistemutaatioita, erityisesti onkogeenien, ovat harvinaisia ​​kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä.

GGAP2 (tunnetaan myös Pike-A) on G-proteiini, jolla on vahva GTPaasi-aktiivisuus, kuten odotettua sen RAS homologiadomeeni. Se sisältää myös GAP verkkotunnuksen voi aktivoida GTPaasi toiminnan kautta joko molekyylin sisäinen tai molekyylien välinen vuorovaikutus. GGAP2 sitoutuu aktivoitu AKT ja voimakkaasti parantaa sen toimintaa ja tämä vuorovaikutus edistetään GTP sitovia [7]. Olemme osoittaneet, että aktivoitu AKT voi sitoa ja fosforyloida GGAP2 seriinin 629, joka lisää GTP: n sitoutumista, jonka GGAP2 ja AKT aktivointi [8]. Fosforyloituu GGAP2 voi myös sitoa p50-alayksikköä NFkB ja parantaa NFkB transkriptioaktiviteettia. Aktivoitunut fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi /AKT ja NFkB reitit ovat molemmat todettu kriittinen reittejä syövän aloittamista ja etenemistä erilaisissa ihmisen maligniteettien, mukaan lukien eturauhassyöpä. Olemme osoittaneet merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen GGAP2 useimmissa ihmisen eturauhasen syöpien [8]. Kun GGAP2 ilmaistaan ​​eturauhassyövän soluissa se parantaa leviämisen, painopiste muodostumista in vitro ja syövän etenemiseen in vivo. Siten lisääntynyt GGAP2 lauseke, joka on läsnä kolme neljäsosaa ihmisen eturauhasen syöpiä, voi aktivoida kaksi kriittistä väyliä, jotka on yhdistetty eturauhassyövän taudin alkamisen ja etenemisen ja voi parantaa syövän etenemiseen in vivo.

Hu et al ovat määritelleet mutanttimuodot GGAP2 on sarkooma, neuroblastooma ja glioblastoomasolulinjoissa [9]. In vitro tutkimukset osoittavat nämä mutanttimuotoihin ovat parantaneet GTPaasina aktiivisuus ja voimakkaammin aktivoida AKT kuin villityypin GGAP2. Yhdenmukainen näiden huomautuksissa GGAP2 mutanttien kasvun edistämiseksi glioblastoomasolua ja transformaatio NIH3T3-solut [10]. Siksi pyrittiin selvittämään mutaatiot GGAP2 ihmisen eturauhassyöpänäytteissä. Olemme löytäneet korkeita taajuuksia missense GGAP2 mutaatioita kliinisesti paikallisesti ihmisen eturauhasen syöpä. Yllättäen mutaatiot ovat heterogeenisiä ja nonclonal, joissa on useita eri mutaatioita on läsnä monissa kasvaimissa. Läsnäolo Näiden mutaatioiden liittyi aggressiivista kliinistä käyttäytymistä ja lisääntynyt AP-1 transkriptionaalista aktiivisuutta. Siten GGAP2 on yleisimmin mutatoitunut onkogeeni ihmisen eturauhassyöpä tasalla, mutta mutaatiot ovat heterogeenisiä sijaan klonaalinen, mikä merkitty klonaalinen heterogeenisyys kliinisesti paikallisesti ihmisen eturauhasen syöpiä. Läsnäolo korkean taajuuden nonclonal mutaatioita yhden geenin on uusi ja edustaa uutta tila geneettinen muutos, joka voi edistää syövän etenemiseen.

Tulokset

Mutaatio analyysi GAP verkkotunnuksen GGAP2

Voit selvittää GGAP2 on mutatoitunut eturauhassyövän me keskitymme aluksi GAP verkkotunnuksen, koska tämä alue on tärkeä negatiivinen säätelijä GGAP2 toimintaa. Analysoimme cDNA 15 syöpiä ja 9 hyvänlaatuista eturauhasen kudoksia eturauhasen yksilöitä. GAP-domeeni monistettiin ja yksittäiset kloonit eristettiin ja sekvensoitiin. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Kahdentoista viisitoista syöpätapauksista oli ainakin yksi klooni GGAP2 missense- ja /tai lopettaa mutaatioita, kun taas vain 2 9 hyvänlaatuinen tapauksissa ollut tällaisia ​​mutaatioita. Hyvänlaatuinen tapauksissa oli vain yksi mutanttikloonin kukin taas jopa 42 prosenttia kloonien syöpätapauksista mutatoitiin. Kaiken kaikkiaan 38 206 kloonia syöpäsoluissa oli mutantti vs. 2 137 hyvänlaatuinen. Tämä ero oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (p 0,001, chi neliö). Poissulkemiseksi artefakti johtuen käänteistranskriptiolle tai mahdollisuus, että mutantti selostukset voidaan transkriboida ensisijaisesti tai noussut vakautta me suoraan analysoineet GAP domainista perimän DNA 46 syövistä ja 22 hyvänlaatuinen kudoksiin. Kuten taulukossa 1 on esitetty, 20 46 syöpäkudoksissa sisältää vähintään yhtä mutantti-klooni ja 12 46 syövän kudosten yli 30% klooneista sisälsi missense- tai pysäyttää mutaatioita. Vain yksi mutantti klooni tunnistettiin hyvänlaatuinen kudoksista. Kaiken kaikkiaan 52 334 kloonia syöpäsoluissa oli mutantti vs. 1 167 alkaen hyvänlaatuinen kudoksista (p 0,001, chi neliö). Yhdistämällä cDNA ja genomi-analyysi, 32 61 syöpätapauksista sisälsi klooneja GAP mutaatioista ja 14 tapauksessa 30% tai enemmän kloonit olivat mutantti.

Yllättäen huomasimme, että aminohapot, joiden mutaatiot olivat erittäin heterogeenisiä . Ei ollut toistuvia missensemutaatioita mukana enemmän kuin kaksi kasvaimia. Kudoksissa useita mutanttiklooneissa oli vain kaksi tapausta, jossa on kaksi identtistä mutanttiklooneissa. Oli vaihtelu jakautumisesta missensemutaatioita alueiden kanssa aminohappojen 640-660 ja 700-710, joilla on suhteellisen useammin mutaatioita taas mutaatiot olivat harvinaisia ​​aminohapoista 540-570, mutta ei ollut tilastollisesti merkitsevä ”hot spot”. Useissa klooneja löydettiin 2 mutaatiot samasta kloonista. Tämä on samanlainen havainto Hu et al [9], joka löytyy useita mutaatioita useita mutantti GGAP2 eristettyjä cDNA: ita sarkooma ja glioblastoomasolulinjoissa. Lisäksi useita missensemutaatioita, havaitsimme 3 lopettaa mutaatioita, kaikki karboksiterminaalinen osa GAP verkkotunnuksen (aa 703-709), joka sijaitsee kohti karboksipäähän GGAP2 proteiinin ja johtaisi katkaistun proteiinin. Huomattavaa on, että Hu et al [9] löysi katkaisu aminohapossa 756 GGAP2 cDNA CRL-2098 luusarkoomasoluissa.

Koska tämä yllättävä heterogeenisuus pidimme sitä mahdollisuutta, että tämä voi edustaa PCR väärinliittymistä artefakti. Kuitenkin löysimme vain 3 hiljaiset mutaatiot keskuudessa 540 kloonien syöpään kudoksista (vs. 90 missense- tai seis) kun taas hyvänlaatuista kudoksissa löysimme 2 hiljaiset mutaatiot keskuudessa 304 kloonia (vs. 3 missensemutaatioita). Osuus missense ja pysäyttää verrattuna hiljainen mutaatio oli paljon suurempi syöpäkudoksessa kuin hyvänlaatuinen kudosten ja ero oli tilastollisesti merkitsevä (p = 0,02, Fisherin eksakti testi). Tämä on ristiriidassa satunnainen väärinliittymistä. Tutkimaan edelleen Tässä vaiheessa meidän systemaattisesti määritelty seurauksia siirtymisen mutaatioita aminohapposekvenssin kaikkien nukleotidien GAP domain. Olemme vain tutkitaan siirtymiä, koska 82%: n havaittu mutaatioiden olivat siirtymävaiheessa mutaatioita (tuloksia ei ole esitetty). Systemaattinen siirtyminen mutaatio kunkin nukleotidin GAP verkkotunnuksen antaisi 273 missensemutaatio, 15 pysäkki mutaatioita ja 162 hiljaisia ​​mutaatioita. Ero osuudet missense ja lopettaa versus hiljaiset mutaatiot havaitsimme (90 ja 3) vertasi ennustettu jakautuminen (288 ja 167) oli tilastollisesti erittäin merkitsevä (p 0,001, chi sq). Lopuksi harkitsi mahdollisuutta, että syöpä kudoksiin oli vauhdittunut mutaation kohdistaminen ensimmäisen ja toisen emäkset kunkin kodonin tuloksena satunnaisessa missensemutaatio kaikissa geenit. Siksi tutkittiin 5 syöpä ja 5 hyvänlaatuinen kudosten mutaatiot β-aktiini. Emme löytäneet mutaatiot 32 kloonia syöpäkudoksessa ja 36 kloonia hyvänlaatuinen kudoksista. Osuus missense ja lopettaa kloonien GGAP2 oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin β-aktiini (p = 0,02, chi sq). Näin havaitut heterogeeninen mutaatiot GAP alalla GGAP2 ovat todellakin aito.

Mutaatio analyysi GTPaasi verkkotunnuksen GGAP2

GTPaasina domain on myös keskeinen säätelijä GGAP2 toimintaa. Siksi tutkittiin cDNA 23 syövistä ja 12 hyvänlaatuinen kudosten GTPaasi mutaatioista. Tulokset olivat hyvin samanlaisia ​​kuin GAP domain (taulukko 2). Viisitoista 23 syöpien sisälsi missensemutaatioita vs. 1 12 hyvänlaatuinen kudoksiin. Neljässä syöpätapausta, 40% tai enemmän klooneja oli mutantti, kun taas vain yksi mutantti kloonin havaittiin hyvänlaatuinen kudoksessa. Kaiken kaikkiaan 28 188 kloonia syöpäkudokset mutatoitiin vs. 1 88 hyvänlaatuista kudoksessa (p 0,001, chi sq). Yleisen mallin mutaatioiden syöpäkudoksessa oli samanlainen kuin GAP verkkotunnuksen, että mutaatiot olivat hyvin heterogeeninen, molemmat yhden syövän kudoksen välillä syöpäkudoksissa. Löysimme yksi kahden mutanttikloonin, samanlainen GAP verkkotunnus. Huomattavaa on, että ei stop-mutaatioita havaittiin. Koska aminopään sijainti GTPaasi domain, mitään luukun mutaatioita lähes varmasti saadaan aktiivinen proteiini, koska se ei ole PH domain. Löysimme vain 2 hiljaiset mutaatiot, yksi syöpä ja yksi hyvänlaatuinen kudoksesta. Yhdeksässä kudoksissa 35 analysoitiin (26%) havaitsimme useita klooneja, jotka sisältävät aiemmin kuvatun hiljainen polymorfismi (Rs17852479) on L246, joka ei johda aminohapon muutokseen. Tämä polymorfismi esiintyy noin 28% ihmisistä aiemmin tutkituissa populaatioissa, samanlainen kuin meidän havainto. Yhteenveto mutaation analyysi GGAP2 on esitetty taulukossa 3.

GAP mutaatioista lisääminen AP-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden

Olemme osoittaneet, että NFKB voi lisätä ilmentymistä FOS eturauhassyöpäsoluissa ja siten AP-1-aktiivisuutta [11]. Testata, onko GGAP2 ja mutantti GGAP2 vaikuttanut AP-1 transkription käytimme kohdennetulla mutageneesillä insinööri GGAP2 ekspressiorakenteita, jotka sisältävät 9 eri missensemutaatioita. Nämä mutantti- konstruktit tai villityypin tai tyhjän vektorin kontrollit kotransfektoitiin AP-1 reportteri rakentaa 293T-soluihin ja normalisoitu lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Kuten kuviossa 1 on esitetty, villityypin GGAP2 hieman lisää AP-1 jentymisen. Useita mutanttiklooneissa osoittautunut huomattavan parannuksen AP-1: n promoottori transkription transfektoiduissa soluissa mutantti verrattuna villityypin GGAP2 (Fig. 1).

Asteriskit osoittavat tilastollisesti merkittävää kasvua verrattuna villityypin (WT) GGAP2 ANOVA (p 0,05). Mean +/- SEM. Mutaatio ja määrä transfektioista näkyvät.

Association of GAP mutaatioista kliinisiä ja patologisia parametrit aggressiivinen tauti

Voit selvittää, onko läsnäolon missense- tai lopettaa mutaatioita GAP domain liittyivät aggressiivinen tauti tarkastelimme suhteessa tällaisten mutanttiklooneissa eturauhassyövissä eri kliinisiä ja patologisia liittyviä parametreja aggressiivinen tauti (kuva 2). Varhainen PSA uusiutumisen jälkeen eturauhasen liittyy kuoleman tautia [12]. Syövät aikaisin PSA toistumisen oli 49 mutaatioista 172 analysoidusta kloonista, kun taas tapauksissa ilman aikaisin PSA toistumisen oli vain 34 mutaatiota 234 klooneja. Tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,001, chi sq). Tämän mukaisesti, löysimme myös merkittävästi lisääntynyt osuudet GAP mutaatioiden tapauksissa lantion imusolmuke etäpesäke (p = 0,027, chi m²), rakkularauhanen invaasio (p = 0,027, chi m²), ekstrakapsulaarinen laajennus (p = 0,015, chi m² ) ja korkeammat Gleason (Gleason 5/6 Versus 7-10, p = 0,002, chi sq). Nämä havainnot tukevat vahvasti käsitystä, että GAP domain mutaatiot GGAP2 voi edistää eturauhassyövän etenemistä.

osa klooneista, jotka sisältävät missense- tai lopettaa mutaatioiden tapauksissa kunkin osoitti kliinisiä tai patologisia parametri näkyy. Kaikki erot patologinen ja kliininen muuttujat olivat tilastollisesti merkitseviä. Erityisesti: varhaisen PSA toistumisen ( 2 vuotta leikkauksen jälkeen) versus tai myöhään toistumisen (p 0,001, chi m²); ekstrakapsulaarinen laajennus (ECE) versus ECE (p = 0,015, chi m²); rakkularauhanen invaasio (SVI) versus SVI (p = 0,027, chi m²); lantion imusolmuke etäpesäke (LN) versus etäpesäke (p = 0,027, chi m²); Gleason 5/6 vs. 7-10 (p = 0,002, chi sq).

Keskustelu

Clonal mutaatioita kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä ovat harvinaisia ​​ja yleensä liity tuumorisuppressorigeeneille (tarkistetaan in [3]). Mutaatiot onkogeenien kuten RAS ovat harvinaisia ​​Yhdysvalloissa miesten eturauhassyövän vaikka RAS mutaatioita on tunnistettu yleisemmin eturauhasen syöpiä peräisin Japani miehet [3]. Olemme tunnistaneet usein mutaatiot GGAP2 in paikallinen eturauhassyöpä. Kaiken puoli syöpien sisältää vähintään yhtä mutantti-GAP domeenin klooni ja 20% syövistä, 30% tai enemmän klooneja mutantti GAP verkkotunnuksen. Yllättäen vaikka oli 10 erilaista toistuvaa mutaatiot näissä vain toistui 2-3 kertaa, yleinen GAP mutaatioista olivat heterogeenisiä ja nonclonal. Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin analyysin GTPaasi verkkotunnuksen. Monirivisille näyttöä väittävät, että nämä toteamusta eivät ole artefakti lukien: harvinaisuus mutaation hyvänlaatuinen eturauhasen kudosten ylivoima missensemutaatioita syövän kudoksissa; vähäisyys hiljaiset mutaatiot syövän kudoksissa ja puuttuminen mutaatiot β-aktiini.

Vaikka sekä yli-ilmentymisen ja nonclonal mutaatiota GGAP2 ovat yleisiä eturauhasen syövän välinen suhde näiden kahden muutoksiin on epäselvä. Molemmat voivat mahdollisesti aktivoida siganaling toimintaa GGAP2 eturauhassyövässä, vaikka yksityiskohtaisia ​​tutkimuksia tarvittaisiin erottamaan, ovatko nämä toimet ovat samat eri spesifisiä mutaatioita. Joissakin tapauksissa yli-ilmentyminen voi mahdollisesti parantaa biologista aktiivisuutta, joka liittyy mutaatio, vaikka on myös mahdollista, että mutaatio voi kompensoida puutetta yli-ilmentymisen. Tarkemmat tutkimukset GGAP2 ilmaisun, nonclonal mutaatio ja merkkiaineita reitin aktivaation paljon kasvaimia tarvitaan ymmärtämään niiden vaikutusta erillisiä muutoksia eturauhassyövän.

kasvaimensisäisenä geneettinen heterogeenisyys joihin pistemutaatioita geenien kuten p53 tai K-RAS eri alueilla yhden makroskooppisten kasvainten on havaittu syöpien, kuten paksusuolen syöpä [13] ja gliooma [14]. On syytä huomata, että meidän tapauksissa kaikki kasvaimet edustavat yksinkertaista 6 mm kasvaimen keskittyy ja siten myös syövät olivat kaikki yhdestä kasvain keskittyä ja on siten heterogeenisyys havaitsimme eroaa tällä maantieteellisellä geneettinen heterogeenisyys. Meidän tapauksessamme, havaitun heterogeenisuus kuvastaa heterogeenisuus solutasolla yksittäisessä kasvain painopiste.

Onko mutaatiot havaitsimme merkittävää? Missensemutaatio taajuus havaittu GAP toimialueen syövän kudoksissa oli 370 × 10

-6 per emäsparin sekvensoitiin sekä GTPaasi toimialueen 298 x 10

-6 per kp. Bielas et ai [15] ovat osoittaneet, että taajuus satunnainen mutaatio syöpäkudoksiin on noin 2,1 x 10

-6 per bp useiden syöpätyyppien. Niinpä meidän havaittu taajuus missensemutaatio in GGAP2 on 100 kertaa suurempi kuin tausta nopeus mutaatio, voimakkaasti mikä valikoivaa kasvua etu mutanttiklooneissa. Olemme myös havainneet merkittävää yhdistyksen välillä taajuuden mutaation GAP toimialueen ja kliiniset ja patologiset liittyviä parametreja aggressiivinen tauti, joka osoittaa ne ovat kliinisesti merkittäviä. On huomattava, että 20%: ssa tutkituista tapauksista, että yli 30% klooneista syövän oli mutantti GAP verkkotunnuksen. Ottaen huomioon, että kudokset analysoitiin olivat noin 80% syövän keskimäärin vähintään 75% syöpäsolujen sisältäisi mutantti alleeli (olettaen yksi mutaatio solua kohti) tällaisissa tapauksissa. Tämä on pienin luku, koska se ei sisällä GTPaasina mutaatioista ja mahdolliset mutaatiot muilla alueilla GGAP2, joka on raportoitu [9]. Siten havaittiin korkean taajuuden heterogeeninen mutaatiot voisivat edistää suoraan paikallisille kasvaimen kasvua monissa tapauksissa. Lisäksi, tehokkain mutaatiot voivat edistää etäpesäkkeiden erityisten solujen klooneja. On todisteita tukemaan käsitystä, että nonclonal p53 mutaatioita ensisijainen eturauhasen syöpiä voi aiheuttaa etäpesäkeleesioita [16]. Tiheä monipuolista nonclonal mutaatioiden GGAP2 voi tarjota lukuisia mahdollisia metastaattinen klooneja.

Useimmissa tutkimuksissa mutaatioiden syöpä ovat oikeutetusti keskittyneet klonaalinen mutaatioita, koska se on helpompi nähdä näiden merkittävyyden mutaatioita. Heterogeeniset nonclonal mutaatioita ei havaita monia analyysimenetelmiä tai ei analysoidaan edelleen, koska on epäselvää, ovatko ne voivat olla PCR esineitä tai yksinkertaisesti matkustaja mutaatioita. Tuloksemme osoittavat, että joissain tapauksissa korkean taajuuden heterogeeninen nonclonal mutaatiot voivat esiintyä ja ne voivat olla kliinisesti merkittäviä. Vielä on määriteltävä, kuinka usein näin on muiden kasvaimeen ja onkogeeneihin. Joissakin tapauksissa ryhmät ovat analysoitiin ensisijainen eturauhasen syöpien läsnäolon mutaation avulla yksijuosteisen konformaatiopolymorfismi määrityksissä minkä jälkeen sekvensointi poikkeuksellisen siirtyvät bändejä ja todettu suhteellisen korkeat mutaatio joissain geenejä. Esimerkiksi käyttäen tätä lähestymistapaa, mutaatioiden plexin-B1 todettiin 46% ensisijainen eturauhasen syöpien [17], mutta se on vaikea määrittää täsmällistä prosenttiosuutta kasvainsoluja kasvain, joka mutaatio. Koska mutaatiot ovat usein riitä antamaan erillinen bändi yksijuosteinen konformaatiopolymorfismi- määrityksissä niiden on oltava varsin usein, vaikka ei klonaalinen. Tämä on päinvastoin kuin löydökset GGAP2, jossa mutaatiot ovat erittäin heterogeenisiä. Näin eriasteista nonclonal mutaatioita, korkeasti heterogeeninen oligoclonal voi esiintyä eturauhasen syöpä. Toisaalta, käyttäen samanlaista lähestymistapaa kuin meidän, Steinkamp et al [18] sekvensoitiin androgeenireseptorin mRNA: kastraatiotason kestävä eturauhassyövän etäpesäkkeiden. He löysivät korkea heterogeenisyys mutaatioiden monet mutaatiot ovat läsnä vain 5-10% klooneja. Tämä havainto on samanlainen kuin mitä me havaittu GGAP2. Androgeenireseptorin on keskeinen rooli eturauhassyövän synnyssä ja selviytymistä niin on voimakas selektiivinen painetta säilyttää mutaatioita, jotka johtavat toimintaan edessä antiandrogeeninen hoitoja. Olemme osoittaneet, että GGAP2 on usein yli-ilmentynyt eturauhassyövässä ja voi aktivoida kaksi keskeistä reittejä eturauhassyövän etenemisen eli NFKB ja AKT polkuja. Lisäksi se on suhteellisen suuri negatiivinen säätelydomaini jotka ovat alttiita häiriöille, jotka voivat tehdä paljon helpompi aktivoida kuin jotkut onkogeenien kuten RAS, jotka tarvitsevat erityistä pistemutaatiot. Muita analyysejä tarvitaan määrittämään missä määrin muita geenejä, mukaan lukien kasvaimen synnyssä ja muiden onkogeenien on korkea taajuus ei-klonaalisia missense- tai lopettaa mutaatioita.

Mahdollisuuksia suurtaajuus nonclonal mutaatio lisää toinen kerros monimutkaisuus monimutkaisia ​​mutaatiostatuksesta maisema yleisimmistä syövistä, joka on paljastunut laajamittaisista sekvensoimalla [19], [20], [21]. Huomattavaa on, että on osoitettu, että nonclonal mutaatiot K-RAS keuhkosyöpää sairastavilla tyrosiinikinaasiestäjiksi merkittävästi vaikuttaa säilymiseen [22]. Siten on tärkeää määrittää, missä määrin nonclonal mutaatioita esiintyy kaikkialla ja laajan geenien eturauhas- ja muiden syöpien ja ovatko ne vaikuttavat selviytymisen ja hoitovaste.

Materiaalit ja menetelmät

ihmisen kudosnäytteet

Normal kehävyöhyke ja syöpä kudoksia kerättiin kirjallinen suostumus alkaen saavilla miehillä eturauhasen jonka Baylor College of Medicine Eturauhassyöpä Program kudospankki ja jäädytettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Potilaat olivat iältään 43-73-vuotiaita ja olivat pääasiassa valkoihoisia. Kaikissa tapauksissa leikkausta edeltävän kuvantaminen ja kliininen tutkimus paljasti kliinisesti paikallinen tauti. Patologinen lavastus eturauhasen yksilöitä ja lantion imusolmukkeiden osoitti noin 30% Vaihe 2 (T2N0); 50% Vaihe 3 (T3N0) ja 20% Vaihe 4 (Kaikki T, N1). Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen lahjoittaa kudoksiin tutkimus- ja näissä tutkimuksissa hyväksynyt Baylor College of Medicine Institutional Review Board. Hyvänlaatuinen kudokset varmistettiin olevan vapaa ja syövän kudoksissa, joka sisältää vähintään 70% karsinooma. RNA: t ja DNA: t uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24], [25]. PSA toistumisen määriteltiin seerumin PSA 0,2 ng /ml, jossa varhainen uusiutuminen on toistuminen 2 vuoden kuluessa leikkauksesta.

Mutaatio analyysi

N-pään GTPaasina domain ja C-terminaali GAP domeeni GGAP2 geenin monistettiin käyttäen PCR: ää ja kloonattiin PCR 2.1 TOPO-vektoriin käyttäen TOPO TA-kloonausvektoriin (Invitrogen). PCR suoritettiin käyttäen Platinum Taq (Invitrogen) minimoimiseksi väärinliittymistä. Käytetyt alukkeet kloonaukseen olivat sillä GTPaasina domain Forward: CCGCTCCATTCCTGAACTG; Reverse: GTTGCTGCTTGCGCAAG GAP domain: Forward: CACAGACAGCCAAAGCGA; Reverse: CCAAAAGCAGGAGAACGGTAG. DNA: t sekvensoitiin molempiin suuntiin ja kaikki emäsparimuutoksia kutsutaan koneen lukea sekvenssin vahvistettiin silmämääräinen tarkastelu sekvensointi jälkiä. Kloonit huonolaatuista sekvensoinnin jälkiä ei analysoitu. Ei uusia raportoitavia iturataa variantteja havaittiin.

mutageneesi

Yhden nukleotidin mutageneesi toteutettiin mukaan valmistajan protokollan (Stratagene). Lyhyesti, alukkeita, joilla on kohde-mutaatiot, käytettiin PCR: ssä tuottamaan GGAP2 ekspressiorakenteita, jotka sisältävät 9 eri missensemutaatioita. Käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa 4. Dpn1enzyme lisättiin PCR-tuotteita 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa sulavaa templaatti-DNA ennen muutosta. Kloonit sekvensoitiin tarkistaa mutaatioita.

Luciferase transkription toimittaja määrityksissä

Luciferase transkription reportteri-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11] käyttämällä 293T-soluihin. Molemmat AP-1 lusiferaasireportteri vektori ja PRL Renilla sivektorissa saatiin Stratagene (Cat # 219077 ja # E2810). PRL Renilla Luciferase Reporter Vektorit on tarkoitettu käytettäväksi sisäisenä kontrollina toimittajille yhdessä AP-1 cotransfect 293T-soluihin. Ohimenevä transfektio tehtiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppaisilla levyillä. Lusiferaasiaktiivisuudeksi määritettiin ja normalisoitiin Renilla lusiferaasisignaaliin jokaisesta näytteestä. Riippumattomat määritykset suoritettiin 3-9 kertaa.

Tilastollinen

varaaminen mutaatio ryhmien välisen Khin neliö tai Fisherin tarkkaa analyysi. Lusiferaasiaktiivisuus mutanttiklooneissa verrattiin käyttäen varianssin analyysiä (ANOVA). Kaikissa testeissä p 0,05 katsottiin merkitseväksi.

Kiitokset

apua Patricia Castro kiittävät.