Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hiiret on käytetty malleina syövän yli vuosisadan, joka tarjoaa merkittäviä edistysaskeleita ymmärrystämme tämän monitahoisen perheen sairauksia. Erityisesti potilaalle tehdä -tuumoriksenografti hiiri malleja ovat nousemassa mieluummin syöpätutkimuksen lisääntyneen kliinistä merkitystä yli ihonalainen hiiri mallia. Nykyisessä tutkimuksessa olemme kehittäneet potilaalle tehdä haimasyövän ksenograftimalleja hiirissä minimaalisesti invasiivinen menetelmä, ultraääni ohjattu injektio (USGI) verrattavissa erittäin invasiivisia kirurgisia potilaalle tehdä injektion (SOI) menetelmät. Tämä optimoitu menetelmä esti injektio komplikaatioita, kuten rekyylin solujen kautta injektion kanavan tai vuoto solujen ulos haima vatsaonteloon. Kasvaimen kasvua seurattiin in vivo ja kvantifioidaan kaikukuvaukseen viikoittain, kasvaimia havaittiin myös in vivo fluoresenssikuvantamisella käyttäen kasvaimen kohdennetun molekyylikoettimena. Keskimääräinen kasvaimen volyymit varten USGI ja SOI malleissa 2 viikon kuluttua kasvaimen kasvu oli 205 mm

3 ja 178 mm

3 vastaavasti. By USGI ihmisen haimasyövän solulinjoissa, ihmisen potilaalle tehdä haimasyövän -ksenografteja perustettiin. Perustuen ultraääni kuvantamisessa potilaalle tehdä ihmisen haimasyövän ksenografti- ottaa oli 100% sekä ihmisen haimasyövän solulinjoissa käytetty, MiaPaca-2 ja Su86.86, jolloin keskimääräinen kasvaimen tilavuuteen 28 mm

3ja 30 mm

3 . Olemme osoittaneet, että tämä USGI menetelmä on toteutettavissa, toistettavissa, facile, vähän invasiivisia ja parantunut verrattuna erittäin invasiivinen SOI käytetty menetelmä potilaalle tehdä haiman -tuumoriksenografti malleja sopii molekyylikuvantaminen.

Citation: Huynh AS, Abrahams DF , Torres MS, Baldwin MK, Gillies RJ, Morse DL (2011) Luodaan Orthotopic Human Haimasyöpä ksenograftimallia käyttäminen Ultraääni Opastettu Injection Solujen. PLoS ONE 6 (5): e20330. doi: 10,1371 /journal.pone.0020330

Editor: Maria G. Castro, University of California, Los Angeles, ja Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 maaliskuu , 2011; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 27, 2011

Copyright: © 2011 Huynh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant Support : NIH /NCI R01-CA123547 (https://www.nih.gov/, https://www.cancer.gov/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hiiret on käytetty malleina syövän yli vuosisadan, joka tarjoaa merkittäviä edistysaskeleita ymmärrystämme tämän monitahoisen perheen sairauksia. Tällä hetkellä neljä pääaluetta syövän tutkimusta, joka käyttää hiirtä mallit: perusbiologian ja fysiologia, kokeellinen hoitomuotoja, ehkäiseminen ja genetiikan alttius ja riskejä. Nämä mallit ovat osoittautuneet hyödyllisiksi validointi geenien toiminnan, kuvaamista uusien syövän geenien ja kasvaimen biomarkkereiden saada käsityksen molekyyli- ja solutason mekanismeista kasvain aloittamista ja monivaiheinen prosesseja tumorigeneesin, ja tarjoamalla parempia kliinisiä malleja, joissa testataan uusia terapeuttisia strategioita [1]. Erityisesti, -tuumoriksenografti hiiren malleissa käytetään yleisesti prekliinisissä tutkimuksissa. Ihmisen kasvaimen ksenograftimalleissa luodaan injektoimalla ihmisen kasvainsolujen kasvanut viljelmä hiiren tai transplantaatiota ihmisen kasvaimen massan hiireen. Ksenograftikudoksista voidaan helposti hyväksyvät immuniteetti on heikentynyt hiirissä, kuten kateenkorvattomia nude-hiirten tai vakavasti vaarantua immuunivajavuustila (SCID) hiiriä [2]. On olemassa useita keskeisiä etuja käyttämällä ihmisen tuumoriksenografteja: niissä on monimutkaisia ​​geneettisiä ja epigeneettiset poikkeavuuksia, joita esiintyy ihmisen kasvaimen väestön voidaan käyttää apuna kehitettäessä yksilöllisiä molekyyli hoitomenetelmät; ja voidaan istuttaa ortotooppisesti toistamaan elimeen ympäristö, jossa kasvain kasvaa, niin että vaikutus kasvaimen sen mikroympäristölle voidaan mukauttaa [3].

Kaksi päätyyppiä ihmisen ksenograftin hiiren malleja käytetään syöpätutkimukseen heterotooppinen ja potilaalle tehdä määritellään sijainnin implantoidun ksenograftin. Sillä heterotooppi- ihonalainen malleissa ksenograftissa istutetaan välillä dermis ja taustalla lihakset ja tyypillisesti sijaitsee kylkeen, takana tai käpälään hiiren. Yli 30 vuoden ajan, ihonalaista ksenograftimallia on ollut laajimmin käytetty prekliinisen hiirimallissa syöpätutkimukseen, koska se on nopea, halpa, helppo toistettavissa, ja on pidetty riittävän prekliinisissä testata syöpälääkkeet. Ihonalainen mallissa on myös etuja tarjota visuaalisen vahvistuksen, että hiiret käytettiin kokeeseen on kasvaimia ennen hoitoa; ja tarjoaa keinoja arvioida kasvaimen vaste tai kasvua ajan, verrattuna ontelonsisäisesti malleihin, joissa eläinten eloonjääminen on ainoa mitta vasteen [4]. Kuitenkin suuria haittoja prekliinisissä käytön ihonalainen ksenograftimalleja on tullut esiin. On johdonmukaisesti havaittu, että lääke hoito, jotka ovat hoitavia hiiren ihonalainen ksenograftimalleissa useinkaan ole merkittävää vaikutusta ihmisen sairauksien. Ensisijainen syy tämä epäonnistuminen voi johtua havainto, että ihonalainen microenvironment ei ole merkitystä, että elimen sivuston ensisijaisen tai etäpesäkkeitä. Lisäksi, ihonalainen kasvain mallit harvoin muodostaa etäpesäkkeitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että heterotooppi- kasvainmuodoista jotka eivät edusta sopivia paikkoja ihmisen kasvaimista eivät ennusta, kun käytetään testaamaan vastauksia syöpälääkkeet [5].

puutteiden korjaamiseksi ihonalaisen malleja, potilaalle tehdä tuumoriksenografteja yhä tutkitaan lisätä kliinistä merkitystä. Tässä mallissa -tuumoriksenografti on joko implantoidaan tai injektoidaan vastaavaa elintä, joista syöpä on peräisin, tai jos etäpesäkkeitä todettu potilailla. Edut potilaalle tehdä malleissa käyttää asianomaisia ​​sivuston kasvaimeen isäntä vuorovaikutusten syntyminen sairaudelle relevantit etäpesäkkeitä, Opiskelukykyä paikkakohtaisia ​​riippuvuus hoidon elinspesifisellä geenien ilmentymisen ja että kliiniset skenaariot voidaan monistaa, esim. kirurginen poisto primaarikasvaimen tai adjuvanttihoitoon okkulttisen etäpesäkkeiden [5]. Suurimmat haitat ovat, että potilaalle tehdä -tuumoriksenografti sukupolvi on työvoimavaltaista, teknisesti haastavaa, kallista, vaatii pidemmän parantavaa ja toipumisaika ja että seuranta kasvaimen tilavuuden vaatii suhteellisen vähäisemmästä kuvantamismenetelmiä käyttöön verrattuna calipers [5]. Kuitenkin potilaalle tehdä kasvain malleja ovat nousemassa mieluummin syöpätutkimuksen johtuu lisääntyneestä kliinistä merkitystä.

On olemassa voimakas tarve kehittää parempia malleja prekliininen tutkimus haimasyövän. On arvioitu, että 43140 ihmistä (21370 miestä ja 21770 naista) diagnosoidaan syöpä haima vuonna 2010, ja että 36800 miehet ja naiset kuolee tähän sairauteen [6]. Ennuste on huono, joilla on vähemmän kuin 5% eloonjääneitä viiden vuoden kuluttua diagnoosista, ja täydellinen remissio on harvinainen. Ei tehokas varhainen havaitseminen on kehitetty menetelmiä ja edistystä kehittämisessä hoitoa ja terapiaa on pysähtynyt. Gemsitabiini on ollut tavanomaisen kemoterapian yli vuosikymmenen. Kuitenkin hyötyä yhden aineen Gemsitabiinihoidon pitkälle ja metastasoituneen haimasyövän on pieni [7]. Käyttö potilaalle tehdä ksenograftimalleja prekliiniseen haimasyövän tutkimus voi kehittämiseksi hoitojen ja diagnostisten kuvantamismodaliteetit tätä tautia vastaan.

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta kehittää potilaalle tehdä ihmisen haimasyövän ksenograftimalleja ultraäänellä ohjattua injektio (USGI) kasvainsolujen. Orthotopic -tuumoriksenografti hiirimalleja haimasyövän on vakiintunut monta vuotta. Nämä mallit vaativat erittäin invasiivisia kirurgisia potilaalle tehdä istutusta (SOI) kasvainsolujen tai paloina haimaan. Tämä menettely voi aiheuttaa merkittäviä trauma, vaativat leikkauksen jälkeinen toipumisaika, ja voi aiheuttaa haitallisia tapahtumia, kuten infektio, verenvuoto, kasvain tarttuvuus muihin elimiin, ja muut vaikutukset kirurgisesta stressi, esim. haavan paranemista.

Viimeaikaiset edistysaskeleet ovat sallineet kehittämiseen kuvaohjatut menetelmiä ortotooppisten injektion solujen tai kudoksen sisäelimiin, mahdollisesti poistaen tarpeen erittäin invasiivisia kirurgisia menettelyjä. Erityisesti invasiivisia reaaliaikaista ultraääni ohjattu injektio (USGI) tuumorisolujen voidaan suorittaa luoda ortotooppisten ksenograftimalleissa. USGI kasvainten solujen on tullut hyväksytty tapa kehittää potilaalle tehdä maksasyövän malleja. Esimerkiksi monilääkeresistentti mallia onnistunut nude-hiirissä kautta potilaalle tehdä kiinnittymisestä monilääkeresistenteiksi ihmisen HCC-soluissa ohjannut ultraääni [8]. Olemme onnistuneesti kehittäneet uuden ortotooppisten ksenograftimallia imusolmukkeen etäpesäke, jossa tarkka määrä kasvainsoluja ruiskutettiin kainalon imusolmukkeisiin ultraäänellä kuva ohjausta [9].

syngeenisiä ortotooppisten hiiren haimasyöpä hiirimallissa oli kehittämä injektio hiiren haiman adenokarsinooma soluja, Pan02, tai lähellä haima C57BL /6-hiiriin käyttäen SonoCT ultraääniohjauksessa [10]. Ultraääni ohjattu menetelmä tehtiin suotuisa verrattuna ihonalaisen malli tutkinnan vaikutuksesta immunoterapia kasvaimen kasvuun [10]. Kuitenkin kasvaimet johtuvat tämän tutkimuksen näytti levitetään laajalti koko vatsaontelon eikä eristää pelkästään haima, ja se ei ollut selvää, oliko tämä seurausta etäpesäke, tai mahdollisesti soluja vapautuu ympäröivään alueeseen menettelyn aikana.

nykyinen tutkimus on ensimmäinen ilmoittaa potilaalle tehdä injektion ihmisen haimasyövän soluja suoraan haimaan immuunialtisteisia hiirten ultraäänellä-kuva ohjausta. Olemme täysin tunnettu kasvain ottaa hinnat suhteessa kirurgisen mallia ja ovat vahvistaneet histologia että kasvaimia alun perin eristettiin haima seurasi myöhemmin etäpesäkkeiden vatsaonteloon myöhemmin viikkoa. Lisäksi olemme osoittaneet, että kohdennettu molekyylikuvantaminen aine voidaan erityisesti toimittaa verisuoniston läpi saatuun kasvaimia haimassa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki menettelyt olivat noudattaen opas hoito ja käyttö laboratorion Animal Resources (1996), National Research Council, ja hyväksytty Institutional Animal Care ja käyttö komitea, University of South Florida hyväksyttyyn protokollan R3715. Immuunipuutteiset hiiret sijaitsevat puhtaan laitos Erityisehdoin jotka sisältävät HEPA suodatettu ilmanvaihto häkkikanaloissa, autoklavoidaan vuodevaatteet, autoklavoidaan kotelo, autoklavoidaan vesi, säteilytettyä ruokaa ja erityinen häkki muuttuvat menettelyjä. Hiiret käsitellään aseptisesti lukien päällään käsineet, takit ja kengän peittämiseen.

Cell Culture

MiaPaca-2-solut (ATCC CRL-1420), SU86.86 soluja (ATCC CRL- 1837), ja vanhempien HCT116-solut (ATCC CCL-247) ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA). HCT116 /δOR + koolonkarsinoomasoluissa olivat geneettisesti muunneltuja päässä vanhempien HCT116-solulinjaa erittäin yli-ilmentävät δ-opioidireseptorin [11]. Ilmaus δOR pinnalla HCT116 ja HCT116 /δOR + solut karakterisoitiin ennen injektiota käyttäen

in vitro

aikaerotteisella fluoresenssin sitoutumismääritys [12]. HCT116 /δOR +, ja MiaPaca-2-soluja viljeltiin DMEM /F12-(Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% normaalia vasikan seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä liuosta (Sigma, St. Louis, MO). SU86.86-soluja viljeltiin RPMI-elatusaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Atlanta Biologicals). Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta.

Kirurginen Orthotopic haimasyövän Vieraslajisiirteen Mouse Model

verrattuna USGI tekniikka, 5 naaras nu /nu-hiiret 6-8 viikkoa vanhoja (Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN), tehtiin vakiintunut kirurginen menetelmä ortotooppisten injektion solujen haima. Tätä menettelyä, hiiret nukutettiin isofluraani kaasu; vatsan ihon ja lihaksen oli viiltää aivan keskiviivan ja yläpuolella haimaa visualisoimiseksi haiman lohkoa; haima varovasti vedettynä ja sijoitettu mahdollistaa suoran injektion 20 ui bolus 1 x 10

6 HCT116 /δOR + solua /PBS: ään käyttämällä 1 cc ruisku 30 gaugen neula; perillemeno solujen haiman havaittiin alle suurennus käyttäen leikkely mikroskooppi; haima asetettiin takaisin sisälle vatsaonteloon; ja sekä lihasten ja ihon kerrokset suljetaan kirurgisella liimalla. Sen jälkeen toipuminen leikkauksesta, Hiiriä seurattiin ja punnittiin päivittäin.

kaikukuvaukseen

Visual Sonics Vevo 2100 Imaging Station käytettiin kaikkiin ultraäänikuvauksessa. Kuva yritysostoja tehtiin käyttämällä parannettuja vatsan mittapaketti B-moodi ja 3-D-tilan asetukset. Fysiologinen tila (EKG, hengitys, verenpaine ja kehon lämpötila) hiirten seurattiin jokaisen kuvan hankinta istunnossa. Hiiret kuvantaa ennen kasvaimen ksenografti luoda perustason kuvia ja sitten kuvattiin viikossa jopa 4 viikkoa ultraäänellä seurata kehitystä potilaalle tehdä haimasyövän ksenografteissa.

fluoresenssikuvantamisella

Hiiret joissa potilaalle tehdä haiman ksenografteissa ja HCT116 /δOR + solujen annettiin 4,5 nmol /kg kehon painoa DMT-Tic-Cy5 häntälaskimoinjektiona. DMT-Tic-Cy5 on suuri affiniteetti (3 nM Ki) peptidomimedic suunnattu koetin konjugoidaan fluoresoivaa ainetta (Cy5), joka käytettiin määrittämään sijainnin HCT116 /δOR + solujen

in vivo

ja

ex vivo

fluoresenssikuvantamisella [12]. Injektion jälkeen hiiret pidettiin erityisen pimeässä kammiossa ja valolta suojattuna altistumisesta niin paljon kuin mahdollista estää kuvan valkaisuun väriaine. Alfalfa-vapaa ruoka ja erityinen häkki vuodevaatteet käytettiin minimoimaan autofluoresenssi.

In vivo

ja

ex vivo

fluoresenssi kuvat hankittiin käyttäen Caliper Life Sciences Xenogen IVIS 200 Series Imaging System. 615-665 nm: n virityksellä ja 695-770 nm emissiosuodattimia käytettiin. Paikannusajat vaihtelivat 0 s 10 s pitää intensiteetti laskee alueella 15000 60000 estää kylläisyyttä. Ennen tietojen analysointi, instrumentti tausta vähennyksiä tehtiin. Living Image 3.2 ohjelmisto käytettiin piirtää kiinnostavat alueet (ROI) yli kasvaimet määrittää fluoresenssikeskiarvo signaalia (teho yksikköä). Tehokkuus yksiköt lasketaan normalisoimalla Fluoresenssiemission kuvia vaihtelut tapaus heräte valonjaon lavalla. Autofluorisaatiota tausta vähennettiin määrittämällä kasvaimen keskimääräinen fluoresenssi signaali ennen injektiota.

histologia Haiman ksenoqraftit

haimoissa Hiirten korjattu, silmämääräisesti, kiinnitettiin 10% formaliinilla puskuria, jalostetut , upotettu, tri-leikattiin, H 0,002 (kuva 5). Perustuen

in vivo

ultraääni- ja fluoresenssikuvantamisella, ottamista oli 100% molemmissa malleissa käytettäessä HCT116 /δOR + syöpäsoluja.

Sininen varjostettu alue esittää kasvaimen muodostetaan suorittamalla 3D kasvain tilavuuden mittaukset. A) ultraääni kuva USGI malli, B)

in vivo

fluoresenssikuva USGI malli, C)

ex vivo

fluoresenssikuva hiiren haima päässä USGI mallista, D) ultraääni kuva SOI malli, E)

in vivo

fluoresenssikuva SOI malli, ja F)

ex vivo

fluoresenssikuva hiiren haima päässä SOI mallista.

voit selvittää USGI voidaan käyttää ihmisen haimasyövän solulinjoissa, 5 hiirtä koki USGI 2 × 10

6 MiaPaca-2 solujen 20 ul bolus ja toinen 5 hiirtä koki USGI 2 x 10

6 SU86.86 soluja. 2 viikon kuluttua, kaikki hiirillä oli potilaalle tehdä haiman tuumoriksenografteja havaittu ultraäänitutkimuksella kuvantaminen ja silmämääräinen tarkastus (kuva 6). Kasvaimen tilavuudet (n = 5) piirrettiin ajan funktiona MiaPaca-2 ja Su86.86 ihmisen haiman kasvaimissa (kuvio 7) ja on esitetty taulukossa 1. Perustuen

in vivo

ultraääni kuvantamisessa potilaalle tehdä ksenografti ottaa oli 100%, kun käytettiin sekä ihmisen haimasyövän solulinjoissa, MiaPaca-2 ja Su86.86.

sininen varjostettu alue esittää kasvaimen muodostetaan suorittamalla 3D kasvaimen tilavuus mittauksia.

validointi Ex vivo fluoresenssikuvantamisella ja histologia

Heti

in vivo

fluoresenssi kuvantamisessa HCT116 /δOR + kasvain xeongraft kantavia hiiriä inhimillisesti lopetettiin, tutkitaan visuaalisesti läsnäolo kasvaimia muualla kehossa, ja tärkeimpien elinten (sydän, keuhkot, munuaiset, maksa, perna, haima, ruoansulatuskanavasta) poistetaan, ja

ex vivo

fluoresenssi kuva saadaan 24 tuntia annostelun jälkeen kohteena fluoresoiva koetin.

ex vivo

keskifluoresenssi (n = 5) hankittu haimasta Molempien mallien oli suhteellisen sama (kuva 5). Määritettynä

ex vivo

kuvantamiseen, koetin erityisiä fluoresenssi oli läsnä 100% hiiren haimasta (n = 5) molemmissa malleissa ja alhaisen fluoresenssin taso havaittiin munuaisissa (kuvio 8).

histologia, kasvaimia havaittiin 100%: lla haimoissa joka koki USGI tai SOI käyttämällä HCT116 /δOR + soluja. Kasvaimet havaittiin vasta 4 out of 5 (80%) haimoissa injektoitu MiaPaca-2 tai SU86.86 soluja, vaikka ottaa oli 100% perustuen Yhdysvaltojen kuvantamisen. Histologia Näistä haimasta vasta valmistettiin 3 kohdat, jotka olivat 50 pm toisistaan, joten on todennäköistä, että kasvaimia jäänyt leikattaessa. Kuvio 9 esittää edustavan H 0,002, näissä kudoksissa verrattuna USGI. Tämä johtuu mahdollisesti siitä, että lisääntynyt etäpesäkkeitä päässä ksenografteista syntyy SOI suhteessa USGI samanaikaisesti pisteen injektion jälkeen soluja (2 viikkoa). Perustuen keskimääräinen määrä maligniteetin suhteessa normaaliin haiman kudosta määritettynä patologi (taulukko 1), 2 menetelmiä tuotti lähes yhtä tyyppisiä pahanlaatuisia kasvaimia; keskiarvon ollessa 85% solun, 11% strooman ja 4% nekroottinen komponentteja. Näin ollen olemme osoittaneet, että potilaalle tehdä haimakasvaimesta ksenografti mukaan USGI on mahdollista ja verrattavissa saatujen tulosten SOI.

Koska alkuvaiheissa Tutkimuksessa käytettiin peräsuolen syövän solut, kaksi ihmisen haiman solulinjoissa, MiaPaca-2 ja