Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Invasion ja etäpesäkkeiden ovat merkittävä syy haimasyövän kuolema ja tunnistaminen molekyylejä, jotka ovat nimenomaan käytetään kasvainten invaasio on suuri merkitys. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli valaista rooli GEP100 haiman syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden ja vastaavan molekyylimekanismin.

Methods

Stable solulinjoissa GEP100 tippuu alas perustettiin transfektoimalla GEP100 shRNA vektorin PaTu8988 soluihin ja valitaan puromysiini. qRT-PCR ja Western blot suoritettiin havaitsemiseksi geenin ilmentymisen. Matrigel-invaasiomääritys käytettiin havaitsemaan syöpäsoluinvaasiota

in vitro

. Maksan etäpesäkkeiden

in vivo

määritettiin pernan injektiona näyttämän solulinjojen seuraa perna resektio. Immunofluoresenssi tutkimuksessa käytettiin havaitsemaan solunsisäinen sijainti E-kadheriinin.

Tulokset

Huomasimme, että ilmentymisen taso GEP100 proteiinin läheisesti invasiivisen kyvyn paneelin 6 eri ihmisten haimasyövän solulinjoissa. Down-regulation GEP100 vuonna PaTu8988 soluissa merkittävästi vähentynyt invasiivisen aktiivisuuden Matrigel invaasiomääritys, vaikuttamatta muuttoliike, invaasio ja elinkelpoisuus. Inhiboitu invasiivisen aktiivisuuden pelastettiin yli-ilmentyminen GEP100 cDNA.

In vivo

tutkimus osoitti, että maksan etäpesäke oli merkittävästi vähentynyt PaTu8988 solujen GEP100 vakaasti tippuu alas. Lisäksi epiteelin kaltainen elimellisen muutoksen, matkien mesenkymaaliset epiteeli- siirtyminen (MET) indusoitiin GEP100 alassäätöä. Ilmaisua E-kadheriinin proteiini lisääntyi 2-3 taittuu mukana sen uudelleenjako solu-solu-kontaktien, kun taas mitään ilmeistä muutoksia havaittiin E-kadheriinin mRNA. Yllättäen mRNA Slug korotettiin GEP100 knock-down.

Johtopäätös

Nämä havainnot antanut merkittävää näyttöä siitä, että GEP100 on merkittävä rooli haimasyövän hyökkäyksen kautta ekspressiota sääteleviä E-kadheriinin ja prosessi MET, mikä osoittaa, että sen mahdollisuus tulla potentiaalinen terapeuttinen kohde vastaan ​​haimasyöpä.

Citation: Xie Cg, Wei Sm, Chen Jm, Xu Xf, Cai Jt, Chen Qy, et al. (2012) Down-asetus GEP100 aiheuttaa lisäys E-kadheriinin tasot ja estää Haimasyöpä Cell Invasion. PLoS ONE 7 (5): e37854. doi: 10,1371 /journal.pone.0037854

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 tammikuu 2012; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 25, 2012

Copyright: © 2012 Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nro Y2080372; URL: https://www.zjnsf.gov.cn/1/xm/lx.aspx) National Natural Science Foundation of China (nro 81101839; URL: http: //159.226 .244.22 /portaali /proj_search.asp) ja Qianjiang Talent Kanavataulukko päässä Science and Technology Department of Zhejiang Province (nro 2009R10057; URL: https://www.zjsts.cn/index/index.jspx). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1]. Viimeaikaiset tiedot arvioitu, että 43140 uutta tapausta diagnosoitiin, noin 36800 liittyviä kuolemantapauksia vuonna 2010 [2]. Haimasyöpä on usein diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa paikallisten invaasiota ja kauko etäpesäkkeitä, joten kirurginen resektio vaikeaa ja vähemmän tehokkaita [3]. Näin ollen valtava määrä työtä on tehty yrittää estää invasiivisen toiminnan karsinoomasoluja. Kehittämiseksi terapeuttisten, se on suuri merkitys tunnistaa molekyylejä, jotka ovat erityisesti käytetään kasvainten invaasio [4], [5], [6].

guaniininukleotidiä-vaihto-proteiinin 100, GEP100 ( kutsutaan myös BRAG2) tunnistettiin yhdeksi guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEF), joka ensisijaisesti kiihtyi guanosiini 5- [γ-tio] trifosfaatti (GTPyS) sitoo Arf6 ja vastaa sen aktivaation jälkeen [7]. On raportoitu, että GEP100 oli mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien solun pinnan reseptorin ilmentymisen, solu-solu-fuusion, adheesion, fagosytoosia, apoptoosin ja angiogeneesin [8] – [15]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että GEP100 ollut tärkeä rooli syövän leviämisen. GEP100 yhdistää kasvutekijän reseptorin signalointi Arf6 aktivointi aiheuttaa rintasyöpä ja keuhkosyöpä hyökkäys [16], [17]. Tällä hetkellä toiminta GEP100 muissa syövissä, mukaan lukien haimasyöpä, on edelleen tuntematon.

prosessia kutsutaan epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) esiintyy usein aikana karsinooma etenemisen. Tämän prosessin aikana epiteelisolujen selviytymään fyysisistä rajoitukset niille solunsisäinen risteyksissä ja saada mesenkymaalisten fenotyyppi ja parannettu liikkuvuus [18]. E-kadheriinin on transmembraaniproteiini paikallistaa vyöliitos on basolateraaliseen pinnan ja sillä on tärkeä rooli epiteelin morfologian ylläpitoa. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen ja /tai toiminta on hyvin tunnustettu markkeri EMT ja edistää haimasyövän solujen etenemisen ja invaasio, jotka liittyvät huonoon ennusteeseen haimasyövän [19] – [23]. Tähän mennessä vaikutus GEP100 EMT on harvoin tutkittu.

Siksi tässä tutkimuksessa selvitimme funktio GEP100 prosesseissa haimasyövän soluinvaasiota, etäpesäkkeitä ja EMT. Analysoimme GEP100 sen erilaisissa solulinjoissa ja totesi, että GEP100 ilmentymistaso oli läheistä sukua soluun invasiivisia kykyjä. Matrigel invaasiomääritys

in vitro

ja maksan etäpesäke kokeilu

in vivo

molemmat paljasti, että alas-säätely GEP100 esti hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden merkittävästi. Ilmaisu E-kadheriinin oli up-säännellään GEP100 knock-down. Meidän havainnot auttavat edelleen paljastamatta molekyylitason mekanismeja käytetään haimasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden prosesseja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja vasta-

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa BxPC- 3, CFPAC-1, SW1990, AsPC-1, Panc-1 ja PaTu8988 olivat kaikki saatu Kiinan tiedeakatemia Cell Bank (Shanghai, Kiina) ja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ilman antibiootteja 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Ensisijainen vasta-aineiden Arf6, vimentiinin, β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineita GEP100 ja E-kadheriinin C36 olivat Sigmalta ja BD Biosciences vastaavasti. Kaikki sekundäärisiä vasta-aineita olivat Boster Technology (Wuhan, Kiina).

Plasmidit ja transfektio

pEGFP-GEP100 plasmidilla, joka koodaa koko pituudeltaan GEP100 cDNA: n ja pSuper-retro-puro-GEP100 koodaavan plasmidin GEP100 shRNA oli ystävällinen lahjoja professori Sabe Hisataka (Hokkaido University, Japani). Sillä shRNA-välitteisen GEP100 tukahduttaminen, 8 x 10

5 PaTu8988 solut transfektoitiin 3 ug psuper-retro-puro-GEP100 tai koodaava plasmidi merkityksetön sekvenssin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 48 tunnin ajan. Transfektoidut solut valittiin 1 ug /ml puromysiiniä (Invitrogen) ja altaat valittujen solut altistettiin

vuonna Virto

kokeet mukaan lukien invaasio, haavan paranemista, tarttuvuus ja elinkelpoisuuden määritykset. Sillä stabiilien solulinjojen, transfektoidut solut valittiin 1 ug /ml puromysiiniä ja altaat valitut solut laimennettiin sarjoittain valinta väliaineessa. Noin 20 kloonia eristettiin ja testattiin Western blot. Klooni näyttää mahdollisimman suurta tukahduttaminen käytettiin

in vivo

kokeita.

Viability, Adhesion, haavan paraneminen ja matrigeelin Invasion Analyysit

Solun elinkykyisyyksiä mitattiin MTT kolorimetristä määritystä kit (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

adheesiomääritystä 35 mm viljelyastia päällystettiin 10 ug /ml kollageeni I (Sigma-Aldrich) ja sitten 1 x 10

5-solut ympättiin. 1 tuntia myöhemmin, astia pestiin PBS: llä varovasti 3 kertaa. Solujen lukumäärä kiinnitetty lautasen laskettiin.

haavan määrityksessä, 1 x 10

6 solua ympättiin 35 mm: n viljelymaljalla, ja annettiin muodostaa yksikerroksinen. Haava tehtiin raaputtamalla yksikerroksista 100 ul: n pipetin kärki. Soluja viljeltiin, kunnes haava oli peittynyt.

Matrigel invaasiomääritys suoritettiin käyttäen transwell päällystetty 25 ug Matrigelillä (Sigma). 1 x 10

5-solut RPMI-1640 1% fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS) ympättiin ylempi hyvin. Kuten kemoattraktantti, RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää lisättiin alempaan osastoon. Kun oli inkuboitu 24 tunnin ajan, solut kiinnitettiin metanolissa 15 minuutin ajan ja värjättiin 1% kristallivioletilla (Sangon, Kiina) 10 min. Solut yläpinnalle suodattimen pyyhittiin pois pumpulitupolla, ja solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat ulos alapinnan kalvojen laskettiin 10 satunnaisesti valittua kentät.

RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista Trizol (Invitrogen) ja käänteistranskriptoidaan M-MLV-käänteistranskriptaasia (Promega) käyttäen oligo-dT-alukkeita 42 ° C: ssa 60 min. cDNA alistettiin sitten 35 sykliä PCR-monistusta. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: GEP100, forward-aluketta (5′-GCCTTTAGCAACGATGTCATC-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-CACATGGTCCTCATTGGTCTT-3′); Arf6, forward-aluketta (5’-ATGGGGAAGGTGCTATCCAAAATC-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-GCAGTCCACTACGAAGATGAGACC-3′); E-kadheriinin, forward-aluketta (5’-TCCCATCAGCTGCCCAGAAA-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-TGACTCCTGTGTTCCTGTTA-3′); Vimentiinin, forward-aluketta (5’-GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-TCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT-3′); Slug, forward-aluketta (5’-AGATGCATATTCGGACCCAC-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-CCTCATGTTTGTGCAGGAGA-3′); Kierre, forward-aluketta (5’-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′); ZEB1, forward-aluketta (5’-AGCAGTGAAAGAGAAGGGAATGC-3 ’), ja reverse-aluketta (5′-GGTCCTCTTCAGGTGCCTCAG-3′); Snail, forward-aluketta (5’-TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG-3 ’), ja reverse-alukkeen (5′-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3’). Käytetyt alukkeet β-aktiini hankittiin Sangon, Kiina.

Western blot -analyysi

Solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1% Na-deoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 20 ug /ml leupeptiiniä, 20 ug /ml Aprotini, 3 ug /ml Pepstatin A), ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen BCA kit (Keygen, Kiina). Yhteensä proteiinit fraktioitiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Membraanit blokattiin 5% BSA TBST-puskurissa, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä ja sitten inkuboitiin ilmoitetuilla primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita inkuboitiin huoneen lämpötilassa (RT) 1 tunnin ajan, ja havaittiin käyttäen tehostettua chemiluminesence tunnistusjärjestelmä (Amersham Pharmacia Biotech).

Immunofluoresenssi Study

Transfektoituja PaTu8988 Solut pestiin lämpimällä PBS: llä kerran ja heti kiinnitetään kylmällä metanolilla -20 ° C: ssa 6 min. Näytteen annettiin kuivua huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan ja blokattiin 2% BSA: lla PBS: ssa 30 min. Endogeeninen E-kadheriinin todettiin anti-E-kadheriinin monoklonaalinen vasta-aine 1 tunnin ajan RT: ssä. 5 pesun jälkeen 0,5%: lla BSA-PBS: llä, joka on FITC-leimatun anti-hiiri-vasta-ainetta (Boster, Kiina) lisättiin ja inkuboitiin 30 minuutin ajan RT: ssä. Sitten solut pestiin PBS: llä 5 kertaa uudelleen, sitten asennetaan 50% glyserolia PBS: ssä ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla.

In vivo

Metastasis Pitoisuus

maksan etäpesäkkeiden määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24], [25] muutoksin. Lyhyesti, Balb /c nude-hiirten (5-6 viikkoa) jaettiin 3 ryhmään 12 kullekin: kontrolliryhmään vastaanottaa PaTu8988 solut, ryntäily saaneen ryhmän soluja tippuu alas kanssa sramble shRNA ja koeryhmä sai solut jossa GEP100 vakaasti tippuu alas. Hiiret nukutettiin kloraalihydraatilla. Vatsaontelon valotettiin ja 5 x 10

6 esitetty solua 0,1 ml: ssa PBS: ää ruiskutettiin pernakudokseen läpi 27 gaugen neulan. Pistoskohdan puristettiin hieman suolaliuoksella puuvilla 5 min, jota seuraa ligaatio vasemman puoleista valtimon ja pernan valtimo. Sitten pernan resektoitiin. 4 viikkoa myöhemmin, maksa poistettiin kirurgisesti ja kiinnitettiin 10% formaliinilla yön yli. Maksa leikattiin 2 mm viipaleiksi ja 5 kohdissa noin samassa asennossa jokaisen maksan arvioitiin mikroskoopilla. Protokollat ​​käytetään kaikkien eläinkokeiden tässä tutkimuksessa oli hyväksynyt Animal tutkimuskomitea Zhejiangin yliopistossa.

Tilastollinen analyysi

Kokeet ja määritykset suoritettiin vähintään kolme kertaa. Tilastollinen merkittävyys oletettiin jos

P

≤0.05 T-testi.

Tulokset

korrelaatio GEP100 Expression ja Haimasyöpä Cell Invasive Kyky

invasiivisia kyky paneelin 6 eri ihmisen haimasyövän solulinjoissa tutkittiin Matrigel invaasiomääritys kuten on esitetty kuviossa. 1A. Solulinjoja tässä ryhmässä olivat peräisin sekä primaarista (BxPC3, Panc-1, ja SW1990) ja metastaattinen (AsPC-1, CFPAC-1, ja Patu8988) sivustoilta [26], [27]. Nämä solulinjat osoittivat jatkumon eri invasiivisia kykyjä. AsPc-1 ja PaTu8988 solut osoittivat korkeinta invasiivisia kykyjä, jonka jälkeen SW1990, CFPAC-1 ja Panc-1-soluissa. BxPC-3 solu oli heikoin. Ilmentymisen taso GEP100 proteiinin korreloi läheisesti kanssa invasiivisen kyvyn tämän paneelin solulinjoja, jossa AsPc-1 ja PaTu8988 solujen Voimakkaimmin ilmaisua, jonka jälkeen SW1990, CFPAC-1 ja Panc-1-soluissa, kun taas tuskin havaitaan että BxPC-3 solulinja. Mitään selvää suhdetta ilmentymisen Arf6 proteiinia ja invasiivisen kyvyn havaittiin. Olemme myös päättäneet ilmaisun tasot proteiinien liittyy epiteelin (E-kadheriinin) tai mesenkymaaliset (vimentiinista) fenotyyppi. E-kadheriinin ilmentyminen voidaan helposti havaita alhaisen invasiivisia solulinjoissa, mutta vain hyvin heikko ilmentyminen havaittiin erittäin invasiivisia solulinjat. Vimentiinista ilmentyi erittäin invasiivisia solulinja (Fig. 1 B).

(A) Invasiivinen kyvyt paneelin 6 haimasyövän solulinjoissa analysoitiin Matrigel invaasiomääritys 24 tuntia. AsPc-1 ja PaTu8988 osoittivat korkeaa invasiivisia kykyjä. (B) Western blot analyysi ilmentymisen GEP100, Arf6, E-kadheriinin ja vimentiinin proteiinin eri solulinjoissa. AsPc-1 ja PaTu8988 osoitti vahvin ilmentyminen GEP100 proteiinin, jonka jälkeen SW1990, CFPAC-1, Panc-1 ja BxPC-3, joka osoittaa läheinen suhde GEP100 ekspressiotaso ja solujen invasiivisia kyky. Mitään selvää suhdetta ilmaus Arf6 proteiinin ja invasiivisen kyvyn havaittiin. E-kadheriinin ilmentyminen voidaan helposti havaita alhaisen invasiivisia solulinjoissa, mutta vain hyvin heikko ilmentyminen havaittiin erittäin invasiivisia solulinjat. Vimentiinista ilmentyi erittäin invasiivisia solulinjat. (C) RT-PCR-analyysi ekspression GEP100, Arf6, E-kadheriinin ja vimentiinin mRNA. Ekspression GEP100 mRNA voitiin havaita kaikissa kuudessa solulinjoissa ja mitään ilmeistä korrelaatiota invasiivisen kyvyn havaittiin. Tämä oli sama asia Arf6 ja vimentiinista mRNA. E-kadheriinin mRNA osoittivat tiiviissä yhteistyössä invasiivisen kyvyn eri solulinjoissa. β-aktiinin mRNA: ta käytettiin kontrollina.

ilmentyminen GEP100 mRNA voitiin havaita kaikissa 6 solulinjojen ja mitään ilmeistä korrelaatiota invasiivisen kyvyn havaittiin. Tämä oli sama Arf6 ja vimentiinista mRNA. E-kadheriinin mRNA-tasolla osoitti tiiviissä invasiivisen kyvyn eri solulinjan (Fig. 1 C).

Down-regulation of GEP100 pienensi Invasive Kyky haimasyöpäsoluissa

Sen arvioimiseksi, GEP100 edistää soluinvaasiota valitsimme erittäin invasiivisia PaTu8988 soluja ja alas-säännelty GEP100 lausekkeen shRNA. Yli 80%: n inhibition GEP100 proteiinisynteesin vahvistettiin Western blot kaksi kloonia (Fig. 2A). Klooni 1 # valittiin invaasiomääritys. Matrigel invaasiomääritys osoittivat, että GEP100 knock-down vähensi solujen läpäisemään matrigeelin noin 35% verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 2B). Re-ilmentyminen GEP100 palautti kykyä hyökkäyksen noin 60%. Vaeltavia aktiivisuus arvioitiin haavan paranemista määrityksessä ja haavan paranemista ajanjaksojen kolmesta esitettiin. GEP100 knock-down vain hieman esti muuttoliike (Fig. 2C), jossa ei ole tilastollista merkitystä. Toisaalta, GEP100 knock-down eivät estäneet soluadheesiota päälle kollageenia (Fig. 2D). Edellä mainituissa olosuhteissa, solujen elinkelpoisuutta ei vaikuttanut (kuvio. 2E).

(A) stabiili solulinja GEP100 tippuu alas saatiin transfektoimalla psuper-retro-puro-GEP100 osaksi PaTu8988 soluihin ja valitut 1,5 ug /ml puromysiiniä. Down-regulation GEP100 varmistettiin Western blot. β-aktiini käytettiin kontrollina. (B) Invasion testi osoitti, että GEP100 alassäätöä vähensi solujen lävistää Matrigel-pinnoitettu kalvo. Tiedot esitettiin ja graafisesti lasketut normalisoi- arvot, jotka on saatu käsittelemättömillä soluilla, kuten 100%. GEP100 knock-down vähensi solujen lävistää matrigeelin noin 35% verrattuna kontrolliryhmään. Re-ilmentyminen GEP100 vuonna shRNA käsitellyissä soluissa palautti kykyä hyökkäyksen noin 60%. (C, D, E) GEP100 alassäätöä ei ollut merkittävää vaikutusta solujen vaeltamiseen, invaasiota ja elinkelpoisuus. Ctrl, ohjaus.

Down-regulation of GEP100 Vähentynyt Maksa metastaasin haimasyöpäsoluissa Balb /c nude-hiirissä

Seuraavaksi tutkittiin, knock-alas GEP100 lohkojen maksan etäpesäke kasvainsolujen hiirissä. Me pistetään PaTu8988 tai PaTu8988 /sekoituskoodin shRNA tai PaTu8988 /GEP100 shRNA soluista Balb /c-nude-hiirissä. Kaksitoista hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin 4 viikon kuluttua injektion. Torjunta- ja ryntäily shRNA ruiskutetaan ryhmien maksassa tuli pieni ja karkea, valkaista alueilla nähty pinnalla. Sillä GEP100 shRNA ruiskutetaan ryhmä, pienet täplät olivat myös osoitteessa maksa pinnalla. Maksan etäpesäkkeiden osoittaa huonosti eriytetty solukasat varmistettiin mikroskooppisesti 9 10 hiirestä (90%) kontrolliryhmässä ja 10 12 hiirtä (83%) on sramble ryhmässä, kun taas vain 4 11 hiirtä (36%) havaittiin koeryhmässä (Fig. 3). Merkittävä estävä vaikutus maksan etäpesäke havaittiin (

P

≤0.05). Numerot etäpesäkenystyröiden laskettiin ja keskiarvo. Vertaamalla ohjaus- ja ryntäily ryhmät, GEP100 alassäätöä vähensi etäpesäkenystyröiden merkittävästi (

P

≤0.05).

(A) makroskooppinen havainnot resektoitua maksassa. Vakaa PaTu8988 soluja kuten oli splenicly ruiskutetaan seurasi perna resektio. 4 viikkoa myöhemmin, maksat poistettiin havainnointiin. Useimmat maksojen ohjauspaneelista ja ryntäily shRNA ryhmien tuli pieni ja karkea, jossa suuri vaalennettua alueita nähtävissä pinnalla. Sillä GEP100 shRNA ruiskutetaan ryhmä, vain pieniä näppylöitä havaittiin joitakin maksan pinnan. Etäpesäke vahvistettiin mikroskoopilla ja sivustoja etäpesäkkeiden oli nuolilla (hematoksyliinillä ja eosiinilla, x100). (B) Prosenttiosuudet maksan etäpesäke Balb /c nude-hiiret lueteltu. Tilastollisesti merkittävä ero saatiin välillä ohjaus ja koeryhmässä (

P

≤0.05). (C) keskimääräinen lukumäärä etäpesäkenystyröiden maksanvärisillä laskettiin ja piirretään. Lyhyesti, kun kiinnitys 10% formaliinilla yössä, maksa leikattiin 2 mm viipaleiksi ja 5 kohdissa noin samoissa paikoissa kussakin maksan arvioitiin mikroskoopilla. Tilastollisesti merkittävä ero saatiin välillä ohjaus ja koeryhmässä (

P

≤0.05). Ctrl, ohjaus.

E-kadheriinin ilmentyminen oli Up-säänneltyjen ja jaettu uudelleen solu-solu yhteyttä GEP100 alassäätöä

Lopuksi tutkimme mahdolliset mekanismit osallistuvat invaasio esto haiman syöpäsolujen GEP100 alassäätöä. Olemme havainneet, että down-regulation of GEP100 aiheutti morfologisen muutoksen PaTu8988 solujen mesenkymaaliset tyyppi epiteeli- kaltainen (Fig. 4A). Ja vastaavasti, ilmentymisen E-kadheriinin proteiini, joka on epiteelin markkeri, lisääntyi noin 3-kertainen verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 4B). Ilmaisua E-kadheriinin mRNA tutkittiin myös, mutta ei merkittäviä muutoksia voitu havaita (kuvio. 4C). Seuraavaksi määritettiin edelleen solunsisäistä sijaintia E-kadheriinin proteiinia. Immunofluoresenssikoe tutkimuksen mukaan GEP100 tippuu alas soluja, E-kadheriinin keskitettiin solu-solu kosketuksiin (Fig. 4D). Vaikka mitään merkittävää muutosta ei havaittu mRNA-tasolla E-kadheriinin, vielä tutkinut ilmaus useita tärkeimmät transkriptiotekijöiden E-kadheriinin. Mielenkiintoista, kasvua Slug havaittiin GEP100 tippuu alas soluissa, kun taas ei ollut muutosta Twist, ZEB1, Etana (Fig. 4C).

(A) mesenkymaalisten epiteeli- havaittu muutosta solut stabiilisti tippuu alas varten GEP100. Ylempi ja alempi paneeli osoittivat morfologiset esiintymisiä alhaisella solutiheys ja kun solut saavuttivat konfluenssin, vastaavasti. Vertaamalla ohjaus- ja ryntäily ryhmiä, solun koeryhmässä tuli epiteelin kaltainen ja liimalla. (B) Western blot osoitti, että ilmentymistaso E-kadheriinin proteiini lisääntyi noin 3-kertaisesti koe-ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. (C) RT-PCR-analyysi E-kadheriinin mRNA: ta ja sen transkription säätävät. Ilmaisu E-kadheriinin mRNA ei vaikuttanut GEP100 alassäätöä. Kasvua Slug mRNA havaittiin GEP100 tippuu alas soluissa, kun taas ei ollut muutosta Twist, ZEB1 ja Snail. (D) immunofluoresenssi E-kadheriinin. Vertaamalla ryntäily ryhmä, GEP100 alassäätöä jakaa E-kadheriinin soluun solukontaktien.

Keskustelu

Tämänhetkiset tulokset osoittivat ensimmäistä kertaa, että GEP100 näyttelee keskeinen asema haimasyövän soluinvaasiota. Down-regulation GEP100 estivät merkittävästi invasiivisen kyvyt haimasyöpäsoluissa mahdollisesti ylös-säätely ilmentymisen E-kadheriinin ja palauttaminen epiteelin fenotyypin. GEP100 voisi olla potentiaalinen molekyyli tavoite haimasyövän geeniterapiassa.

Tässä tutkimuksessa ensimmäinen, olemme osoittaneet, että GEP100 ilmaistiin haiman syöpäsoluissa. GEP100 kuuluu KEHU perheen Arf GEF, joka koostuu kolmesta isoformien, BRAG1 /IQsec2, BRAG2 /IQsec1 /GEP100, ja BRAG2 /IQsec3 /synArfGEF [28]. Ilmaus BARG2 /GEP100 on kaikkialla [7]. Paneelissa 6 haimasyövän solulinjoissa käytimme, BxPC-3, SW1990 saatiin primaarikasvaimista ja Panc-1 oli peräisin invasiivisia intraduktaalisissa laajentamisesta primaarisen kasvaimen, kun taas muut 3 olivat kaikki peräisin metastaasien [26], [27]. AsPc-1 ja PaTu8988 voimakkaimmin ilmentymisen GEP100, jonka jälkeen SW1990, CFPAC-1 ja Panc-1, kun taas ensisijainen kasvain BxPC-3-solut osoittivat heikoin. Ilmentymisen GEP100 proteiinin liittyy läheisesti invasiivisia kyky kustakin solulinjasta, viittaa siihen, että GEP100 saattaa olla mukana haiman syöpäsoluinvaasiota.

lisäksi havainneet, että GEP100 down-regulation kanssa shRNA inhiboi merkittävästi Matrigel hyökkäys kyky PaTu8988 soluja, mutta sillä ei ollut vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen, migraation ja adheesion, mikä osoittaa, että GEP100 on erityisen vastaa invasiivisia solujen kykyä.

In vivo

kokeessa osoitti myös, että GEP100 knock-down estivät merkittävästi maksassa etäpesäke haimasyövän soluja Balb /c nude-hiirissä. Tämä tulos oli yhdenmukainen aiempien tietoja, jotka osoittavat rintasyöpäsoluissa GEP100 oli hyvin ilmaistu invasiivisia niitä ja että GEP100 alassäätöä esti solujen invaasiota ja keuhkometastaasitestissä [16], [17]. Nämä tulokset osoittivat, että GEP100 ei ole vain kohde rintasyövän, se voi olla yleinen mekanismi, jota muut syöpätyyppeihin.

Useita muita biologisia toimintoja GEP100 on raportoitu. HeLa-soluissa, GEP100 säädellään soluadheesion kautta ohjataan endosytoosin ja kierrätys integriinin β [9]. Vuonna maksakarsinooma HepG2, GEP100 suoraan vuorovaikutuksessa α-kateniinin ja ollut merkitystä aktiinisytoskeletonin remontin [10]. Vuonna myoblastit ja makrofagien, GEP100 oli mukana solu-solu-fuusiota [11]. On myös raportoitu osallistua säätelyssä nucleolar arkkitehtuurin ja fagosytoosin [12], [13]. Tässä tutkimuksessa emme noudata mitään merkittävää vaikutusta GEP100 solun tarttumista kollageenimatriksi tai muuttoliikkeen aktiivisuutta. Koska ei ole mitään raportti roolista GEP100 haiman syöpäsoluja, tämä voi johtua eron solutyypissä.

Toisin kuin edellisessä raportin läheinen suhde Arf6 ilmaisun ja rintasyöpä solujen invasiivisia kyky [29], meidän ei havainnut, että paneelissa haimasyövän solulinjoissa käytimme. Edellä mainittu biologinen toiminnot GEP100 on havaittu olevan riippuvainen aktivointi Arf6, mutta uskotaan, että GEP100 on monitoiminen proteiini, joka säätelee solun toimintoja on sekä Arf riippuvia ja riippumattaman tavalla. Esimerkiksi, GEP100 oli mukana apoptoottisen solukuoleman riippumatta Arf6 toimintaa [12]. Lisätutkimuksia kuten määritellä aktivoinnin tilasta Arf6 on tarpeen paljastaa rooli Arf6 prosessissa haimasyövän solujen invaasiota.

Olemme löytäneet GEP100 knock-down aiheutti morfologisen muutoksen solujen mesenkymaalisten epiteelin fenotyyppi. Haimasyövän, siirtämällä niiden epiteelisolujen ominaisuuksia kohti mesenkymaalisten fenotyypin tehostaa solun motiliteettia ja pidetään edellytyksenä kasvaimen invaasio. E-kadheriinin on paras tunnettu molekulaarinen merkkiaine epiteelisoluissa ja paikallistaa vyöliitos. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen ja /tai toiminta on hyvin tunnustettu markkeri EMT ja edistää hyökkäys [18]. Siksi tarkasteltiin ilmentymisen E-kadheriinin proteiinia. GEP100 shRNAs hoito lisäsi E-kadheriinin ilmentymisen tason 2-3 kertaiseksi. Tämä on sopusoinnussa Hiroi n raportti, joka osoittaa, että HepG2 solussa, alas-säätely GEP100 lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin [10]. Lisäksi he myös osoittivat, että GEP100 vuorovaikutuksessa α-kateniinin.

E-kadheriinin ilmentymisen voitaisiin säädellä useita mekanismeja kuten promoottori metylaatio, transkription sääntelyä transkriptiotekijät kuten Snail, Slug, Twist, Zeb-1 , Sip1, ja asianmukainen solunsisäinen sijainti [30], [31]. Niistä transkriptiotekijät selvitimme, ilmentyminen patruunan lisäsivät down-regulation of GEP100, joka oli odottamatonta. Slug on jäsen Snail superperheen ja ensimmäinen tunnistettu kehityksen kriittisen proteiinin hermostopienasta muodostumiseen kananalkioiden [32]. Slug korreloi käänteisesti E-kadheriinin ilmentymisen ja on kriittinen EMT edistävää tekijä monissa kasvaintyypeissä [33], [34]. Tuore tutkimus osoitti, että Slug ilmentyminen ei aina liittynyt E-kadheriinin alassäätöä [35]. Se oli selvästi osoitettu, että Slug ekspressio lisääntyi haimasyövän verrattuna ympäröivään parenchyma. Kuitenkin 36 tapauksessa adenokarsinooma analysoitu mitään ilmeistä suhteen välillä havaittiin E-kadheriinin ja Slug ilmaisun [36]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että GEP100 alassäätöä aiheuttama lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen sekä lisääntynyt Slug ilme. Yksi tulkinta on, että E-kadheriinin proteiinin ekspressio ei riipu Slug tämän solutyypin todellakin mRNA E-kadheriinin ei ole muutettu. Vaikka ilmaus Slug liittyy monia kasvainten ennuste, ei ole vielä selvää, miten Slug itse säädellään. Tuloksemme osoittivat, että GEP100 saattaa olla mukana säätelyssä Slug ilmaisun.

Asianmukainen lokalisaatio E-kadheriinin on myös kriittinen sen toimivuus. Solun pintaan E-kadheriinin epiteelisoluissa osittain sisäistetään ja kierrätetään takaisin solukalvon läpi useita mekanismeja kuten clathrin riippuvaa, kaveoleja riippuva, ​​kalvolauttojen välittämä polkuja tai macropinocytosis [31]. Vuonna epiteelin risteykset, dynamiikkaa E-kadheriinin myös läheisesti sääntelee ARF proteiinit [37], [38]. Arf6 GTPaasina on ratkaiseva E-kadheriinin endosytoosin ja kierrätystä. On osoitettu, että ilmentyminen ei-aktiivisen Arf6T27N proteiini estää HGF-indusoitua sisäistämisen E-kadheriinin, kun taas ekspressio konstitutiivisen aktiivisen muodon Arf6Q67L aiheuttaa purkaminen vyöliitos [39]. HepG2-solut, GEP100 ehtyminen aiheuttama inaktivaatio Arf6 seuraa heikentynyt sisäistämisen E-kadheriinin ja sen kerääntyminen plasmam kalvo [10]. Jossa immunofluoresenssilla tutkimus, huomasimme, että GEP100 knock-down lisäsi kertymistä E-kadheriinin ja vyöliitos. Me spekuloida, että GEP100 sääteli ilmentymistä E-kadheriinin estämällä sen endosytoosin ja seuraava hajoaminen. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään tätä kysymystä.

Yhteenvetona tuloksemme esitetään kokeellista näyttöä siitä, että GEP100 ilmaisu korreloi invasiivisen kyvyn haimasyövän soluja ja voidaan pitää uutena kohteena kehittämiselle terapeuttisten estää haiman syöpäsoluinvaasiota.

Kiitokset

Kiitämme professori Sabe Hisataka varten ystävällisesti jakaa shRNA ja cDNA-konstruktit käytetään näissä tutkimuksissa.