Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Hydroksyloitunut johdannaiset kolesterolin, kuten oksisterolit, tärkeä rooli rasva-aineenvaihduntaan. Erityisesti, 25-hydroksikolesteroli- (25HC) on liitetty erilaisia ​​metabolisia tapahtumia, mukaan lukien kolesterolin homeostaasiin ja ateroskleroosi. 25HC on havaittavissa ihmisen plasman nauttimisen jälkeen aterian runsaasti oksisterolit ja jälkeen ravinnon kolesterolin haaste. Lisäksi tasot oksisterolit, mukaan lukien 25HC, on todettu olevan koholla hyperkolesterolemian seerumissa.

Menetelmät /Principal Ensimmäisen

Tässä osoitamme, että estrogeenireseptori (ER) α sovittelee geenien ilmentymisen muutoksia ja kasvua indusoimia 25HC rinta- ja munasarjasyövän soluja. Lisäksi 25HC esittelee ERa riippuva kyky kuin 17β-estradioli (E2) estää säätely ylöspäin HIF-1α ja sidekudoksen kasvutekijä mukaan hypoksinen olosuhteet cardiomyocytes ja rotan sydämen valmisteet ja estää hypoksian indusoiman apoptoosin.

Johtopäätökset /merkitys

estrogeeni toiminta kohdistama 25HC voidaan pitää ylimääräisenä tekijänä mukana etenemistä rinta- ja munasarjasyövän kasvaimia. Lisäksi estrogeenin kaltaista aktiivisuutta 25HC saavuteta sydän-järjestelmä voi olla rooli vastaan ​​hypoksinen ympäristöissä.

Citation: Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone T, Cerra MC, Picard D, et al. (2011) kolesterolia Metabolinen 25-hydroksikolesteroli- Aktivoi estrogeenireseptorin α-välitteistä signalointia syöpäsoluissa ja Cardiomyocytes. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10,1371 /journal.pone.0016631

Editor: Vincent LAUDET, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 07 syyskuu 2010; Hyväksytty: 27 joulukuu 2010; Julkaistu: 31 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Lappano et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, hanke n. 8925/2009) (https://www.airc.it/) ja Ministero dell’Università e Ricerca SCIENTIFICA e Tecnologica (MIUR) (http: //www.istruzione.it/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

estrogeenireseptori (ER) α ja β kuuluvat tumareseptorisuperperheen ligandi-indusoituvan transkriptiotekijöiden [1]. Sitoutuminen on 17β-estradioli (E2) ja Keskeisten indusoi reseptorin homodimerisoitumisessa ja vuorovaikutus tietyn estrogeenin reagoiva elementit (eres) sijaitsevat säätelyalueita kohdegeenien [2]. Kaksi erillistä aktivaatiodomeeneista välittää ER-riippuvaisen transkription aktiivisuus: aktivointitoiminto (AF) -1 sijaitsee aminopäässä ja hormoniriippuvan AF-2 sijaitsee ligandia sitova alue (LBD) [3]. Ligandien ER indusoi muodostumista AF-2 hydrofobinen tasku, joka säätelee rekrytointia kofaktoreita ja tärkeintä -reseptorin farmakologia [4] – [5].

Edelliset tulokset saatiin sekä soluviljelmissä ja eläinmalleissa ovat osoittaneet, että ERa keskeinen rooli vaikutukset välittyvät estrogeenin maitorauhasen kehitykseen ja rintasyövän eteneminen [6] – [7]. Lisäksi estrogeeni on osoitettu estävän verisuonten toimintahäiriö ja vammojen ER-riippuvaisella tavalla [8] – [10], vähentää sydänlihassolujen hypertrofiaan [11] ja pienentää infarktin koon ja lihassolujen apoptoosin eläinmalleissa koronaarispasmipotilailla purennan [12] . Monipuolinen mekanismit ovat mukana suojaavan vaikutuksen aiheuttaman E2 sydänlihassolujen. Oksidatiivisen stressin ja seuraavissa sukupolvissa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ajatellaan laukaisevan sydänlihassolujen apoptoosin [13], kun taas kyky E2-aktivoitua ER torjua nämä redox välituotteiden on hyvin todennäköistä avaintekijä yleistä sydäntä. Solun vaste lasketaan happea ympäristön implicates hypoksian indusoituva-factor-1 (HIF-1), joka säätelee geenien ilmentymistä, kuten Soluvälitilan proteiini nimeltään Connective Tissue Growth Factor (CTGF), joka kuuluu CCN perheen kasvua säätävät (

Cyr61

, CTGF ja

marraskuu

) [14]. Tasot CTGF ovat säädelty haavan paranemisen aikana [15], tulehdus [16], sidekudossairauksien [17], kasvaimen kasvu [18] – [19] ja angiogeneesissä [18], [20]. Kertyvät näyttöä on myös ehdottanut, että CTGF kiinnostavuus on ratkaiseva merkitys sydän- fibrotic prosesseissa, mikä osoittaa sitä mahdollisena biomarkkeri ja mahdollinen ehdokas terapeuttisen intervention [21].

oksisterolit on hydroksyloitu johdannaisia ​​kolesterolin että pelata tärkeitä tehtäviä rasva-aineenvaihdunnan [22]. 25-hydroksikolesteroli- (25HC), joka on syntetisoitu kolesteroli tietyn hydroksylaasin [23], toimii estäjä kolesterolin biosynteesin eri solutyypeissä [24]. 25HC havaittiin rotan plasmassa nauttimisen jälkeen aterian runsaasti oksisterolit ja jälkeen ravinnon kolesterolin haaste [25]. Samoin, tasot oksisterolit, mukaan lukien 25HC, oli suurempi hyperkolesterolemian seerumissa verrattuna löytyy normocholesterolemic seerumissa [26]. Seuraavaksi hiiret puutteellinen oksisteroleja-catabolizing entsyymi oksisteroleja 7α-hydroksylaasin (Cyp7b) osoitti kohonneita pitoisuuksia sekä 25HC ja 27HC, mikä viittaa säätelyroolia aikaansaama Cyp7b on hydroksipaklitakseli kolesterolin johdannaisten [27].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että 25HC saa aikaan estrogeenisiä vaikutuksia aktivoimalla ERa-välitteisen signaloinnin joko rinta- ja munasarjasyövän solujen tai sydänlihassolujen. Saadut tulokset vahvistettiin, ainakin osittain, eristetyssä ja perfusoitiin rotan sydämiä.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

17β-estradioli (E2), 25-hydroksikolesteroli- (25HC), kobolttikloridia (CoCl

2), PD98059 (PD), SB202190 (SB) ja aktinomysiini D ostettiin Sigma-Aldrich, Inc., Milan, Italia. Kokeet suoritettiin käyttämällä 25HC Sigma-Aldrich, Inc., Milano (Italia) varmistettiin 25HC ostettiin Research Plus, Inc, Barnegat, NJ. ICI 182780 (ICI) saatiin Tocris Chemicals. Kaikki yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), lukuun ottamatta E2 ja PD, joka liuotettiin etanoliin.

Cell Culture

Rintasyöpä MCF7 ja ihmisen alkion munuaisen HEK293-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jossa fenolipunaista täydennetty 10% FBS: ää. Rinta- SKBR3- ja munasarjojen BG-1 syöpäsolujen pidettiin RPMI1640 ja DMEM, vastaavasti, ilman fenolipunaista, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Hiiren sydänlihassolujen kaltainen solulinja HL-1 luovutti ystävällisesti Dr. William C. Claycomb (Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA). HL-1-soluja viljeltiin mukaisesti julkaistun protokollan [28] ja Claycomb väliaineessa (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia), 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä, 0,1 mM noradrenaliinin (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia) ja 2 mM

l

-glutamine (Invitrogen, Milano, Italia). Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2. Sillä hypoksinen stimulaatio HL-1-soluja käsiteltiin CoCl

2 tai viljeltyjen alhainen happipitoisuus jännitteitä (2% O

2) on HeraCell inkubaattorissa (ThermoScientific-Heraeus, Milano, Italia). Kaikkia solulinjoja voidaan käsitellä immunoblot ja RT-PCR-kokeet siirtynyt alustaa ilman seerumia ja fenolipunaista 24 tuntia ennen käsittelyä.

transfektoinneilla, Lusiferaasimäärityksiä ja geenien hiljentäminen kokeita

Plasmidit ja Luciferase määrityksiä aiemmin kuvattu [29] – [32]. Erityisesti, käytimme ekspressiovektoreita, jotka koodaavat täyspitkän ERa ja ER muotoa koodaavan 485 aa proteiinia [29] – [32]. Solut siirrettiin 10-cm astioita, ylläpidetään seerumittomassa väliaineessa 24 tunnin ajan ja sitten transfektoidaan vielä 24 tuntia ennen hoitoja Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Milano, Italia) ja asianmukaiset kontrollivektoreihin. SureSilencing ™ shRNA plasmidit hiiren HIF-1α ja negatiivisilla kontrolli plasmidit (shRNA) hankittiin Superarray Bioscience Corporation (Frederick, MD, USA) ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti suositusten (Cat. KM03799P). Lyhyesti, solut maljattiin 10-cm: n maljoille, ja sitten transfektoitiin seerumivapaassa väliaineessa 24 tuntia ennen käsittelyä, jossa on seosta, joka sisältää 15 pl /levy Fugene6 Reagenssi ja 5 ug /malja ohjaus shRNA tai shRNA HIF-1α (shHIF-1α) plasmidi. Sillä HIF-1α hiljentäminen, valmistaja tarjoaa 4 erillistä lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) valmiiksi suunniteltu sekvenssit samaa geeniä, pakattu 4 erillisessä plasmidissa runkoverkkoihin (numeroitu 1-4). Meidän kokeissa yksi riippumaton shRNA plasmidin sekvenssi (n.3) oli riittävä hiljentää HIF-1α-geenin ilmentymistä. Ohjaus shRNA on salattu keinotekoinen sekvenssi, joka ei vastaa mitään ihmisen, hiiren tai rotan geenin.

ERa-sitoutumismääritykset

kyky 25HC kilpailla [3H] E2: n kanssa sitoutumisesta ERa arvioitiin joko MCF7-soluissa tai käyttämällä HEK293-solulysaateista läsnä tai poissa ollessa kaksi pikomoolia puhdistettua rekombinanttista ihmisen ERa-proteiini hankittiin PanVera, Invitrogen Srl Milano, Italia. MCF7-solut riisuttu tahansa estrogeeni pitämällä niitä Alustassa ilman seerumia 2 vuorokautta, minkä jälkeen soluja inkuboitiin 1 nM [2,4,6,7-3H] E2 (89 Ci /mmol; Ge Healthcare, Milano, Italia) ja kasvavia pitoisuuksia leimattuja E2 tai 25HC 2 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa /5% CO2: ta. Poistamisen jälkeen väliaineen, solut pestiin jääkylmällä PBS /0,1% metyyliselluloosaa kahdesti, talteen kaapimalla ja sentrifugoimalla, ja hajotettiin 100% etanolilla, 500 ui per 60 mm malja, 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa [33]. Radioaktiivisuus uutteet mitattiin nestetuikelaskennalla. Sitoutumismääritys suoritettiin myös käyttäen HEK293 kokosolulysaateista. Solut riisuttu tahansa estrogeeni pitämällä niitä Alustassa ilman seerumia 2 päivää, ja sen jälkeen hajotettiin 500 ui RIPA-puskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40; 0,5 mM EDTA) läsnäollessa a proteaasi-inhibiittorien seos, joka sisälsi 1,7 mg /ml aprotiniinia, 1 mg /ml leupeptiiniä, 200 mmol /litra fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 200 mmol /litra sodiumorthovanadate ja 100 mmol /litra natriumfluoridi. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Bradford-reagenssia mukaan valmistajan suositusten (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia). Yhtä suuret määrät koko proteiini-uutetta inkuboitiin puuttuessa tai läsnä kaksi pikomoolia rekombinantti ERa: n ja inkuboitiin 1 nM [3H] E2: n ja kasvavien pitoisuuksien leimaamatonta E2 tai 25HC 2 h 4 ° C: ssa. Sitoutuneet ja vapaat radioligandit erotettiin Sephadex G-25 PD-10 saraketta. Määrä reseptoriin sitoutuneen [3H] E2 määritettiin nestetuikelaskennalla.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) ja Re-ChIP määrityksissä

MCF7-soluja kasvatettiin 10-cm: n maljoille 70 -80% konfluenssiin, siirrettiin seerumivapaassa väliaineessa 24 h ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 10 nM E2 tai 1 uM 25HC 1 tunti. Sen jälkeen solut olivat silloitettu 1% formaldehydiä ja sonikoitiin. Supernatantit immunocleared kanssa sonikoitua lohen DNA /proteiini A-agaroosi (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) ja immunosaostettiin anti-ERa-vasta-aineen tai ei IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italia). Pelletit pestiin, eluoitiin puskurissa, joka koostui 1% SDS: ää ja 0,1 mol /l NaHCO3, ja pilkottiin proteinaasi K: DNA saatiin fenoli /kloroformi-uutolla ja saostetaan etanolilla. A4 ui jokaista näytettä käytettiin templaattina monistamiseen ERE sisältävä alue sijaitsee pS2 promoottori reaaliaikaisella PCR (Applied Biosystems, Milano, Italia). Käytetyt alukkeet olivat 5′-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 ’(pS2 eteenpäin) ja 5′-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3’ (pS2 käänteinen). Data normalisoitiin tuloon varten immunosaostus. Re-ChIP kokeissa kompleksit eluoitiin inkuboimalla 30 min Re-IP-puskurissa (0,5 mM ditiotreitolia, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, 150 mM NaCl) ja alistettiin siru menettelyä käyttäen anti-SRC-1, SRC-3 ja CBP-vasta-aineiden (kaikki ostettu Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italia).

Käänteinen transkriptio ja reaaliaikaisen PCR

Geenien ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen PCR kuten aikaisemmin on kuvattu [32]. PS2, PR, katepsiini D, sykliini A, sykliini-D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 ja ribosomaalisen proteiinin 18S, jota käytettiin kontrollina geenin saamiseksi normalisoidut arvot, alukkeet olivat: 5 ’-GCCCCCCGTGAAAGAC-3′ (pS2 eteenpäin) ja 5’-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3 ’(pS2 reverse); 5’-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 ’(PR eteenpäin) ja 5′-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3′ (PR käänteinen); 5’-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 ’(Katepsiini D eteenpäin) ja 5′-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3′ (katepsiini D käänteinen); 5’-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 ’(sykliini eteenpäin) ja 5′-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3′ (sykliini reverse); 5’-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 ’(sykliini D1 eteenpäin) ja 5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′ (sykliini D1 käänteinen); 5’-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 ’(HIF-1a eteenpäin) ja 5′-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3′ (HIF-1α käänteinen); 5’-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 ’(CTGF eteenpäin) ja 5′-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3′ (CTGF reverse); 5’-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 ’(FAS eteenpäin) ja 5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′ (FAS käänteinen); 5’-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 ’(SERPINF1 eteenpäin) ja 5′-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3′ (SERPINF1 käänteinen); 5’-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 ’(HSPA1L eteenpäin) ja 5’AGCAATCACACCTGCATCCTT-3′ (HSPA1L reverse); 5’-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 ’(SELENBP1 eteenpäin) ja 5′-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3′ (SELENBP1 käänteinen), ja 5’-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 ’(18S eteenpäin) ja 5′-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3’ (18S taaksepäin), vastaavasti .

immunoblottauksella

Solulysaatit ja immunoblottaus määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Vasta-aineet ERa (F-10), sykliini D1 (M-20), CTGF (L-20), fosforyloitu ERK1 /2 (E-4) ja ERK2: n (C-14), β-aktiini (C-2) ja β-tubuliinia (H-235-2) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (DBA, Milano, Italia). ER ja HIF-1α ostettiin R saada positiivinen kontrolli, dioja käsiteltiin 1 ug DNAasi I /ml 10 minuutin ajan huoneenlämmössä ennen altistumista fluoreseiini dUTP ja TdT-.

eristetty ja perfusoitiin sydämen valmisteita

Kaikki koemenettelyn hyväksyttiin käsittelevä komitea eläinten käyttöä on Farmakodynamiikkaa biologian osasto yliopistossa Calabrian (hyväksyntä ID 110 /2000A). Menettelyt seurasi tutkimuksessa olivat mukaisesti Euroopan yhteisön normeja hoidosta ja koe-eläinten käyttöä ja

Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals

julkaiseman Yhdysvaltain National Institutes of Health (NIH julkaisu nro 85-23, tarkistettu 1996). Aikuinen mies (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Italia) nukutettiin i.p. injektio etyylikarbamaatin (2 g /kg kehon painoa). Jälkeen sydämet irrotettiin ja yhdistetty Langendorffin laitteeseen perfuusion Krebs-Henseleit-liuoksella (KHS), joka koostuu (mM) NaCl 113, KCI 4,7, NaHCO3 25, MgSO 4 1,2, CaCl2 1,8, KH2PO4 1,2, glukoosi 11, mannitoli 1,1, Na-pyruvaatti 5 ja kaasutettiin 95% O

2-5% CO

2 (pH 7,4, 37 ° C). KHS annettiin tasaisella virtausnopeudella 12 ml /min. Mitata sydämen toimintaa, vedellä täytetty lateksi ilmapallo, yhdistetty BLPR mittari (WRI, Inc. USA), lisättiin läpi mitraaliläpän vasempaan kammioon sallimaan samatilavuuksisen supistukset ja ottaa jatkuvasti mekaanisen parametreja. Pallo oli vähitellen täynnä vettä, jolloin saadaan ensimmäinen vasemman kammion diastolinen paine 5-8 mmHg [35]. Kaikki sydämet perfusoitiin varten 15 min tasapainottumisen aikana. Kun tasapainotus ajan, sydämet (n = 3) satunnaistettiin johonkin seuraavista ryhmistä: ryhmä 1 (kontrolli): KH kaasutettiin 95% O

2-5% CO

2; Ryhmä 2: KH kaasutettiin 95% O

2-5% CO

2 plus 1 nM E2; Ryhmä 3: KH kaasutettiin 95% O

2-5% CO

2 plus 100 nM 25HC; Ryhmä 4: KH kaasutettiin 50% O

2-45% N

2-5% CO

2; Ryhmä 5: KH kaasutettiin 50% O

2-45% N

2-5% CO

2 plus 1 nM E2; Ryhmä 6: KH kaasutettiin 50% O

2-45% N

2-5% CO

2 plus 100 nmol 25HC.

Kaikki sydämet perfusoitiin 60 minuutin vaikutuksen tutkimiseksi kunkin yhdisteen ja eri happipitoisuus muutoksiin CTGF ja HIF-1α mRNA ilmaisun. Liuos, joka sisältää hoidot oli valmistettu juuri ennen kokeita. Vasemman kammion paine, syke ja Sepelvaltimovirtauksesta seurattiin koko perfuusion protokollaa. Lopussa on -perfuusioiden, kammiot leikattiin irti ja käsitellään välittömästi RNA uuttamalla.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen ANOVA seurasi Newman-Keuls ”sen määrittämiseksi erojen avulla. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

25HC aktivoi ERa syöpäsoluissa

Aloitimme arvioidaan, onko 25HC pystyy transaktivoimaan transfektoitiin ER reportterigeenin rintasyöpäsoluissa (MCF7), jotka ilmentävät ERa eikä ER arvioituna RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista on, että 25HC aktivoitu ERa annoksesta riippuvalla tavalla, vaikkakin pienempi teho kuin E2 (Fig. 1A). Me seuraavaksi arvioitava, ovatko 25HC voisi antagonisoida transkription aktivaation aiheuttama E2. MCF7-soluja käsiteltiin sitten samanaikaisesti kasvavien pitoisuuksien sekä 25HC ja E2, mutta transkription olivat samanlaiset kuin saatu käytetään E2 yksinään (Fig. 1A). Päinvastoin, lusiferaasin aktiivisuus indusoitiin 10 nM E2 tai 1 uM 25HC kumottiin käyttäen kasvavia annoksia ER-antagonistin ICI (Fig. 1 B), mikä viittaa siihen, että ERa välittää transkriptionaalista aktivaatiota altistettaessa kunkin yhdisteen. Antaa lisää tietoja, jotka koskevat kykyä 25HC aktivoida ERa: aan ja sen arvioimiseksi, onko ER voi myös vastata 25HC, me transfektoitiin lyhytaikaisesti ER-negatiivinen HEK293-solujen ER reportterigeenin yhdessä ekspressiovektorin, joka koodaa ERa tai ER. Huomattavaa on, että ainoastaan ​​ERa ilmaisu sallitaan 1 gM 25HC aiheuttavan lusiferaasiaktiivisuus, joka poisti 10 uM ICI (Fig. 1 C-D). Antaa lisää näyttöä kyky 25HC aktivoida ERa muttei ER, käännyimme täysin heterologinen järjestelmä. HEK293-soluissa, 1 uM 25HC aktivoitu kimeeristä proteiinia, joka koostuu DNA: ta sitovan domeenin (DBD) hiivan transkriptiotekijän Gal4: n ja LBD sekä ERa mutta ei ER (Fig. 1 E-F). Jälleen transaktivaatiota ERa poisti 10gM ICI (Kuva. 1 E-F). Vahvistavan edellä mainitut havainnot, me tutkittava 25HC voi indusoida ilmentymistä ER kohdegeenien SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, joita raportoitiin vastaamaan E2 hoitoon [36]. Käyttäen HEK293-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti, jossa on ER-ekspressioplasmidin, transkriptio näiden geenien stimuloitiin E2, mutta ei 25HC (Fig. S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että 25HC aktivoi ERa selektiivisellä tavalla ja osoittaa, että ERa-LBD on riittävä transkription vasteen.

(A) MCF7-solut transfektoitiin ER lusiferaasireportterigeenillä yhdessä sisäisen transfektio ohjaus Renilla Luciferase ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla (logaritminen asteikko) E2 ja 25HC. Lisäksi, soluja käsiteltiin samanaikaisesti saman annoksen kutakin yhdistettä. Normalisoidut lusiferaasiaktiivisuus arvoja solujen vehikkeliä (-) asetettiin 1-kertainen induktio, joihin indusoimaa hoitoja laskettiin. (B) MCF7-solut, jotka on transfektoitu ER reportterigeenin käsiteltiin 10 nM E2 tai 1 uM 25HC yksinään ja yhdistelmänä konsentraation kasvaessa ER-antagonistin ICI, kuten on osoitettu. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (C-F) HEK293-solut transfektoitiin ER lusiferaasireportterigeeniin (EREluc) ja ERa: n (C) tai ER (D) ekspressioplasmideja, jossa Gal4 reportterigeenin GK1 ja Gal4-fuusioproteiinit, joka koodaa ligandia sitovan domeenin (LBD) ja ERa (GalERα) (E) tai ER (GalERβ) (F) ja käsiteltiin 10 nM E2 tai 1 uM 25HC yksin ja yhdessä 10 uM ER antagonisti ICI, kuten on osoitettu. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

perusteella saatujen tulosten transfektiokokeissa, kysyimme 25HC voisi käyttäytyä kuin ligandilla ja kilpailla E2 varten sitoutuminen ERa. Kokosolu-sitoutumismääritys, jossa MCF7-solujen 25HC syrjäytti radioleimatun E2 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A). Vastaavasti, kun yhdistelmä-DNA-ERa lisättiin HEK293-solulysaatti, joka itsessään ei sido E2, 25HC kilpaili tehokkaasti vastaan ​​merkkiaineen E2 (Fig. 2B-C). Tulokset näistä sitoutumismääritykset ovat sopusoinnussa ajatus, että 25HC sitoo ERa suoraan, mutta lisäksi kokeita on tarpeen vahvistaa toimintatavasta yksiselitteisesti.

Käyrät jäljellä sitoutumisen radioaktiivisen merkkiaineen läsnäollessa kasvavia pitoisuuksia leimaamatonta E2 ja 25HC MCF7-soluissa (A), HEK293-solulysaateista läsnä (B) tai ei ole rekombinantti-ERa-proteiinin (C). Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta näytteestä kolme erillistä koetta. Huomaa, että määrä merkkiaineen sitoutuneen puuttuessa kilpailijan mielivaltaisesti asetettu 100% ja että taustalla itseisarvot poikkeavat toisistaan ​​kolme paneelia.

25HC indusoi rekrytointia ERa PS2 promoottorisekvenssi MCF7-soluissa

perusteella edellä mainittujen havaintojen arvioimme onko 25HC voisi aiheuttaa rekrytointia ERa kohdennettuihin ERE sisältäviä DNA-alueen sisällä pS2 promoottorisekvenssin. Suorittaminen chromatin immunosaostus (chip) määritys MCF7-soluissa, 1h käsittely 1 uM 25HC aiheuttama rekrytointia ERa PS2 promoottori havaittuna käyttämällä 10 nM E2 (Fig. 3A). Lisäksi, tarkistaa, onko 25HC voi rekrytoida co-aktivaattorit, että pS2-promoottorin, suoritimme Re-ChIP määritys, jossa käytetään vasta-aineita vastaan, SRC-1 ja SRC-3, jotka kuuluvat steroidi reseptoriin koaktivaattori (SRC) perheet vastaan ​​CBP ( CREB: tä sitova proteiini) [37]. Kaikki co-aktivaattorit oli tehokkaasti rekrytoitiin PS2 promoottori altistamalla MCF7-solut 10 nM E2 kuitenkin 1 uM 25HC osoitti lievää tehoa (Fig. 3A). Siksi, E2 ja 25HC näyttää eri kyky rekrytoida yhteistyössä aktivaattorit, jotka edistävät agonistinen teho ligandien.

(A) E2 ja 25HC aiheuttaa rekrytointi ERa on ERE sivusto sijaitsee pS2 promoottori sekvenssin MCF7-soluissa. Soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan ajoneuvo, E2 (10 nM) tai 25HC (1 uM) ja toimitetaan kromatiinin immunosaostus menettelyä käyttäen anti-ERa tai epäspesifinen anti-IgG-vasta-aineita. Uudelleen-chip määrityksissä anti-SRC-1, SRC-3 ja CBP-vasta-aineita käytettiin. Monistetut sekvenssit arvioitiin real-time PCR. (B-C) arviointi mRNA: n ekspression pS2, progesteronireseptori (PR), katepsiini D, sykliini A ja sykliini D1 reaaliaikaisella PCR: MCF7 ja BG-1-soluissa. Soluja käsiteltiin 24 tuntia 10 nM E2: n ja 1 uM 25HC. Saadut tulokset kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena normalisoitiin 18S ilmaisun ja esitetty kertainen muutos RNA ilmentymisen verrattuna soluihin, vehikkeliä. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (•), (°), (▪), (□) (♦) osoittavat

p

0,05 solujen vastaanottamiseksi ajoneuvo (-) vs. hoidot.

25HC säätelee ilmentymistä ERa kohdegeenien MCF7 ja BG-1-soluissa

vieressä arvioitiin potentiaalia 25HC säätelemään hyvin tunnettuja ERa kohdegeenien, kuten pS2, PR, katepsiini D, sykliini A ja sykliini- D1 MCF7 rinta- ja BG-1 munasarjasyöpäsoluja. Määritettynä reaaliaikaisen RT-PCR, 24 h altistuksen 1 uM 25HC sääteli mRNA ilmaus kaikkien geenien tutki, samanlainen käsittely 10 nM E2 (Fig. 3B-C). Edelleen vahvistaa nämä havainnot, tutkimme kyky 25HC ilmentymisen moduloimiseksi ja ERa: n ja sykliini D1-proteiinin tasot MCF7 ja BG-1-kasvainsoluja. Tähän mennessä alas-säätely ERa estrogeenin on pidetty tunnusmerkki reseptorin aktivoitumisen [38], kun taas säätely ylöspäin sykliini D1 E2 on laajasti raportoitu [39]. Erityisesti 24 h altistuksen 1 uM 25HC alassäädetty ERa-proteiinin tasot (Fig. 4A-B). Päinvastoin, 24 h hoidon 1 uM 25HC sääteli sykliini D1-proteiinin ilmentymisen, joka kumottiin 10gM ICI (Fig. 4C-D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että 25HC pystyy säätelemään ERa kohdegeenien, kuten E2.

Immunoblotit of ERa (A, B), ja sykliini D1 (C, D) MCF7 ja BG-1-soluissa. Soluja käsiteltiin 24 tuntia vehikkelillä (-), 10 nM E2 tai 1 uM 25HC ja, kun läsnä on 10 uM ER-antagonistin ICI, kuten on osoitettu. β-aktiini toimii latauskontrollina. 25HC indusoi proliferatiiviset vaikutukset MCF7 ja BG-1-soluissa (E-H). -Soluja käsiteltiin 5 päivää kasvavien pitoisuuksien kanssa (logaritminen asteikko) E2: n ja 25HC ja laskettiin päivänä 6 (E, G). Soluja käsiteltiin 10 nM E2 tai 1 uM 25HC ja yhdessä 10 uM ER-antagonisti ICI ja laskettiin päivänä 6 (F, H). Solujen lisääntymistä vastaan ​​ajoneuvosta ajoneuvon asetettiin 100%, johon solukasvua aiheuttama hoitoja laskettiin. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (•), (°) osoittaa

p

0,05 solujen vastaanottamiseksi ajoneuvo (-) vs. hoidot.

25HC indusoi proliferatiivisia vaikutuksia MCF7 ja BG-1-solujen

Sitten yritimme arvioida biologinen vastine edellä mainitut vaikutukset kohdistaman 25HC. Kasvun määritykset suoritettiin MCF7 ja BG-1 syöpäsolujen osoitettu, että 25HC pystyy aiheuttamaan proliferatiiviset vaikutukset annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 4E ja 4G). Seuraavaksi kasvu vastauksia 10 nM E2 ja 1 gM 25HC luovuttiin 10gM ICI (Fig. 4F ja 4H), mikä viittaa siihen, että ERa välittää solujen lisääntymistä aiheuttama altistettaessa molemmat yhdisteet.

25HC jäljittelee vaikutukset E2 vastaan hypoksian indusoiman apoptoosin sydänlihassolujen

edelleen arvioimista estrogeenisiä ominaisuuksia 25HC, käännyimme täysin eri mallin järjestelmä, kuten HL-1 sydänlihassolujen [28], jotka ilmentävät ERa ja hyvin alhainen ER tasolla arvioituna RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). On raportoitu, että E2 suojaa soluja hypoksinen loukkaus eri solussa yhteyksissä [40] – [42]. Näin ollen meidän arvioida, onko E2 ja 25HC voisi suojata HL-1 sydänlihassolujen apoptoosin indusoiman tunnettu hypoksia-jäljittelevää ainetta CoCl

2 [43] – [44]. Määritetään DNA hajoamista TUNEL määrityksen, noin 70% HL-1-soluissa johti positiivisia TUNEL värjäystä altistumisen jälkeen CoCl

2 (Fig. 5 ja Fig. S2). Huomattavaa on, että prosenttiosuus apoptoottisten solujen väheni merkittävästi läsnä joko 10 nM E2 tai 1 uM 25HC (Fig. 5 ja Fig. S2). Suojavaikutus kohdistama molemmat yhdisteet kumottu käyttäen 10gM ICI, joka yksin ei aiheuttanut apoptoosia (Fig. 5 ja Fig. S2). Yhdessä tulokset näytetään osoittavat, että E2 ja 25HC voi suojata sydänlihassolujen peräisin hypoksian indusoiman apoptoosin ER-riippuvaisella tavalla.

Apoptoottiset muutoksia havaittiin käyttämällä TUNEL (vihreä) ja tumat värjättiin propidiumjodidilla ( PI, punainen), kuten on osoitettu. Edustaja valokuvia jälkeen 18 tunnin käsittelyyn kuljettimella, ja 100 uM CoCI2, 10 nM E2, 1 uM 25HC yksinään tai yhdistelmänä 100 uM CoCl2 10 nM E2: n läsnä ollessa tai poissa ollessa 10 uM ICI, 100 uM CoCl2 kanssa 1 uM 25HC läsnä tai poissa ollessa 10 uM ICI.

E2 ja 25HC estää hypoksian indusoima HIF-1α ja CTGF vuonna sydänlihassolujen

aiemmin on raportoitu, että HIF-1α välittää CTGF ilmaisun kannustanut hypoksia eri solussa yhteyksissä [ ,,,0],45] – [47]. Vaikka potentiaali sääntely HIF-1α E2 on ehdotettu tietyissä malleissa [48] – [49], estrogeenin kyky vaikuttaa hypoksian aiheuttaman CTGF ilmentymisen verenkiertoelimistön vielä tutkittava. Perusteella näiden havaintojen, me todeta, että HIF-1α ja CTGF ovat ajan säänneltyä sekä mRNA ja proteiini tasoilla ajasta riippuva tavalla 100gM CoCl

2 HL-1-solut (Fig. 6A, C) . Samanlaisia ​​vasteita havaittiin inkuboimalla HL-1-solujen läsnä ollessa alhainen happipitoisuus jännitteitä (2% O

2) (Fig. 6B, D). Seuraavaksi hypoksian indusoima HIF-1α ja CTGF poistettiin käyttäen inhibiittorin DNA-pohjustetaan RNA-synteesin aktinomysiini D (Fig. S3), viittaa siihen, että transkription mekanismit ovat vastuussa säätely ylöspäin sekä HIF-1α ja CTGF . Sitten totesimme, että vaiennettaisi HIF-1α kumoaa CTGF induktio havaittiin joko altistuessaan CoCl

2 tai hypoksinen olosuhteet (2% O

2) (Kuva. 6E-F), mikä osoittaa, että HIF-1α sovittelee ylös-säätely CTGF hypoksia HL-1-soluissa. Sen jälkeen kysyimme E2 ja 25HC saattaisi vaikuttaa HIF-1α ja CTGF ilme. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että joko 10 nM E2 tai 1 uM 25HC estävät säätely ylöspäin HIF-1α ja CTGF joko CoCl

2 tai alhainen happipitoisuus jännitteitä (2% O

2) sekä mRNA (kuva. S4) ja proteiini tasoilla (Fig. 7A-B).