Krooninen sairaus

tiivistelmä

p53 kasvain vaimennin toiminto voi vaarantua monissa kasvaimia solun antagonisti HDM2 ja ihmisen papilloomaviruksen onkogeeni E6 jotka aiheuttavat p53 hajoamista. Palauttaminen p53 toiminta on vahva terapeuttista potentiaalia. Tässä olemme määritelleet TSC-22 uutena p53: n kanssa vuorovaikutuksessa proteiinin ja osoittaa sen uusia toimia positiivisena säätelijänä p53. Huomasimme, että TSC-22 taso oli merkittävästi säädellä vähentävästi kohdunkaulan syövän kudoksissa. Lisäksi yli-ilmentyminen TSC-22 oli riittävä estämään solujen lisääntymistä, edistää solujen apoptoosin kohdunkaulan syövän solujen ja tukahduttaa kasvua ksenograftikasvaimissa hiirillä. Expression of myös TSC-22 tehosti proteiinin taso p53 suojaamalla sitä poly-ubikitinaation. Kun sidottu motiivin aminohappojen 100 ja 200 p53, TSC-22 inhiboi HDM2- ja E6-välitteinen p53 poly-ubikinaation ja hajoamista. Näin ollen, ektooppinen yli-ilmentyminen TSC-22 aktivoinut p53, minkä jälkeen lisääntynyt ilmentyminen p21

Waf1 /CIP1 ja PUMA ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat. Mielenkiintoista on, että TSC-22 ei vaikuttanut vuorovaikutusta p53: n ja HDM2. Knock-down of TSC-22 Sirna selvästi parannettu poly-ubikitinaa- p53, joka johtaa hajoamista p53. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TSC-22 toimii tuumorisuppressorina turvaamalla p53 poly-ubikinaa- välittämän-hajoamisen.

Citation: Yoon CH, Rho SB, Kim ST, Kho S, Park J, Jang IS, et al. (2012) ratkaiseva rooli TSC-22 estäminen proteasomaalisten hajoaminen p53 kohdunkaulan syövän. PLoS ONE 7 (8): e42006. doi: 10,1371 /journal.pone.0042006

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 29 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 01 elokuu 2012

Copyright: © Yoon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus perustui pääasiassa Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (20110026217) ja osittain avustaa Koreassa Basic Science Institute NAP avustus (T3278B) ja sisäisen avustusta Koreassa National Institute of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, dicision julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

TGF-

β

stimuloidaan kloonin 22 (TSC-22) oli ensimmäinen tunnistettu TGF-

β

indusoitavissa geenin hiiren osteoblastisolujen. TSC-22-ilmennys indusoituu eri solulinjoissa TGF-

β

, forboliesteriä, seerumin, ja progestiinia ja säätelee positiivisesti TGF

β

signalointi [1], [2 ]. TSC-22 sisältää leusiinivetoketjun: n kaltainen motiivi, mutta se ei ole DNA: ta sitova motiivi N-pään alueen. TSC-22 voi homodimerize ja heterodimerisoitua TSC-22 homologinen geeni-1 (THG-1), ja on transkription repressoriaktiivisuutta [3].

Jotkut tutkijat ovat tunnistaneet fysiologiset roolit TSC-22 kehitykselliset käsitellä asiaa. TSC-22 vaaditaan gastrulaation alkupuolella alkionkehityksen in

Xenopus laevis

[4] ja munasolujen muodostumisen eri vaiheisiin on

Drosophila

[5]. Se on ollut myös, että TSC-22 indusoi erytroidisten solujen ja Sydämen myofibroblastin erilaistumisen kautta aktivoimalla transkriptionaalista aktiivisuutta Smad3 ja Smad4, ja antagonisoi Smad7 vastauksena TGF-

β

: sta riippuvaisen signaloinnin [6], [ ,,,0],7].

Lisäksi useat tutkimukset ovat keskittyneet tuumorin suppression toimintoja TSC22. TSC22 uskotaan olevan voimakas tuumorisuppressori syljen syöpäsoluissa [8], [9], ihmisen mahasyöpä soluihin [10], maksan karsinooma [11], ihmisen astrocytic kasvaimissa [12], ja suuri rakeinen lymfosyytti leukemia [13]. Yksityiskohtaiset mekanismit tuumorisuppressorigeenin funktio TSC22 on raportoitu yhdessä hypoteesia, että TSC-22 tukahduttaa ekspressiota anti-apoptoottiset geenit

Gadd45b

ja

Lzts2

[11], negatiivisesti säätelee Ras /Raf signalointi [14] ja mukana TGF-b välittämä mahakarsinoo- solukuoleman caspase3 riippuvaisella tavalla [10]. Toisaalta, TSC22-välitteinen apoptoottista aktiivisuutta inhiboi vuorovaikutusta TSC-22 ja fortillin, jonka jälkeen johtava TSC-22 epävakautta [15].

(A) Totaali-RNA valmistettiin potilaiden syöpä näytteet ja

TSC-22

mRNA taso arvioitiin sitten reaaliaikaisen RT-PCR. cx; sarjanumero potilaan kudosnäytteistä. (B)

HeLa

ja

CaSki

solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua solut infektoitiin Ad-

TSC-22

tai Ad-

LacZ

. Ilmoitettuina ajankohtina solujen lukumäärät määritettiin MTT-määrityksellä analysoida solujen lisääntymisen hinnat. (C)

HeLa

infektoidut solut Ad

TSC22

tai Ad

LacZ

viljeltiin varten ilmoitettu ajat, ja sitten solut värjättiin propidiumjodidilla (PI ). Sub-G1 solupopulaatio (kuollut solu) ja solusyklin profiili PI-värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen. (D) DNA: n fragmentoituminen analyysi suoritettiin eristämällä kromosomaalinen DNA 1 x 10

6 määrä

HeLa

ja

CaSki

infektoidut solut Ad

TSC22

tai Ad-

lacZ

72 tuntia (vasemmalla). 3 päivän infektio Ad-

TSC-22,

p53, Puma, p21, E6 ja TSC22 ilmaisun analysoitiin Western hybridisaatiolla (oikealla).

p53 on hyvin tunnettu tuumorisuppressorigeenin, joka toimii aktivoimalla transkription kohdennettuja geenejä, kuten p21, PUMA, PKR ja BAX [16] – [18]. p53 toimintoja ohjaa translaation jälkeiset modifikaatiot, kuten fosforylaation, asetylaatio, ja ubikitinaatio. On hyvin selvää, että p53 tasot ovat tiukasti säännelty MDM2-välitteisen ubikinaa- kautta automaattisen sääntely takaisinkytkentäsilmukka [19], [20]. Toisinaan sääntely p53 ilmentyminen korreloi kasvaimen kehittymisen kautta infektio ihmisen papilloomavirus ilmentävät E6, joka johtaa ubikitiinistä välitteisen p53 hajoaminen [21], [22]. Vaikka sääntelyn p53 on tutkittu useiden eri reittien liittyvät tuumorigeneesiprosessin monet kysymykset jäävät noin kasvain esto mekanismi p53-reitin.

Koska taustalla oleva mekanismi verkosto tuumorisuppressorigeeneille ei vielä ole nimenomaisesti selvitetty, teimme cDNA microarray analyysi geeniekspressioprofiili syöpäkudoksessa löytää uusia kasvaimeen liittyviä geenejä. Huomasimme, että TSC-22 ilmentyminen väheni huomattavasti kohdunkaulan syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Myöhemmin selvitimme uusia toimia TSC-22 aikana tuumorigeneesin. Siksi suoritettiin hiivan kahden hybridin määrityksessä näytön uusia TSC-22-sitovia proteiineja. Tämän, p53 identifioitiin TSC-22-sitova proteiini. Olemme myös havainneet, että TSC-22 voi tehostaa toimintaa p53 kautta estämällä HDM2 ja E6-välitteinen ubikinaa- suoraan sitoutumalla p53. Toisaalta, TSC-22 yli-ilmentyminen stabiloitu p53-proteiinin taso, joka johtaa lisääntyneeseen solukuolemaan, ja soluproliferaation inhibointi. Lopuksi, kasvaimen kasvu oli voimakkaasti vähennetty ilmaus TSC-22 ksenografti kasvain malli. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TSC-22 on keskeinen rooli tuumorin kasvua sääntelyn p53 ubikinaation.

(A) TSC-22 ja p53 cDNA konstruktit transformoitiin osaksi EGY48 hiivasoluissa testi proteiini-proteiini-vuorovaikutusta hiivan kahden hybridin järjestelmä. Transformantit analysoitiin niiden kyky kasvaa elatusaineessa, josta puuttuu leusiini (vasemmalla) ja β-galaktosidaasi-ilmentyminen (oikealla). (B)

HeLa

soluja ja

CaSki-

solut infektoitiin Ad-

TSC-22

varten ilmoitettu kertaa. Proteiinitasot analysoitiin Western blot kanssa DO-1-vasta-ainetta vastaan, p53, anti-TSC-22-vasta-aineen, ja anti-β-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. (C)

HeLa

solut transfektoitiin 1 ug: Flag-TSC-22 ekspressiovektoriin. 24 h transfektion jälkeen, p53, Puma, p21, ja TSC22 ilmentyminen analysoitiin Western-blottauksella ja semikvantitatiivinen RT-PCR-proteiinin ja kokonais-RNA saadaan kustakin solulinjasta. (D)

HeLa

solut ilmensivät stabiilisti shRNA spesifinen TSC-22 ja ei-kohdistuksen ohjaus shRNA analysoitiin määrittämään proteiinin ja mRNA ekspressiotasot p53 ja Puma. (E) Lusiferaasiaktiivisuutta on p53RE (vastaava elementti) -indusoituun promoottori arvioitiin kanssa transfektoimalla ilmoitetun määrän Flag-TSC-22 plasmidin

HeLa

soluja (ylempi paneeli). Aktiivisuutta p53RE-promoottori arvioitiin

sh-con

ja

sh-TSC-22

ilmentävien

HeLa

soluja (alempi kuva) mukaan Lusiferaasimäärityksiä. (F) Yksi ug Flag-TSC-22 tai Flag-mock transfektoitiin

p53

+ /+ tai

p53

– /-

HCT116

soluja. 48 h transfektion jälkeen solulysaatit analysoitiin Western-blottauksella, jossa mainituilla vasta-aineilla. (G) Stability p53-proteiinin arvioitiin

HeLa

infektoitujen solujen Ad-

TSC-22

tai Ad-

LacZ

. 24 h infektion jälkeen soluja käsiteltiin sykloheksimidi (50 ug /ml) osoitettujen ajanjaksojen ajan. Solulysaatit analysoitiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1), jossa β-aktiini latauskontrollina.

Tulokset

TSC22 kasvaimen kasvu estyy

jotta analysoitava kulloinenkin geeniekspressioprofiili kohdunkaulan syöpään, teimme cDNA mikrosiruanalyysi kanssa valmistettua cDNA potilaiden kohdunkaulan syöpä kudoksiin. Mielenkiintoista on, että meidän microarray tiedot osoittivat, että

TSC-22

geenin ilmentyminen oli huomattavasti vähentynyt kaikissa syövän näytteissä (tuloksia ei ole esitetty). Sitten suoritettiin reaaliaikainen PCR (RT-PCR) analyysi vahvistaa microarray tuloksia. Kuten kuviossa 1A on esitetty,

TSC-22

mRNA: n ilmentymisen tasot potilaiden syövän kudokset olivat vähentyneet huomattavasti verrattuna normaalissa kudoksessa.

Nämä tulokset johtivat kysymyksiä. Ensimmäinen kysymys koski sitä, onko TSC-22 voi tukahduttaa kasvainsoluproliferaation vai ei. Siksi meidän tartunnan

HeLa

(HPV-18) ja

CaSki-

(HPV-16) solujen adenoviruksella ilmentävät

TSC-22

tai

LacZ

(infektioiden hallintaan). Kuten kuviossa 1B on esitetty, leviämisen suhteet sekä soluja vähensi infektion Ad

TSC-22

. Olemme ensi tutkinut, TSC-22 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin

HeLa

soluja. Huomasimme, että G0 /G1 väestö dramaattisesti lisääntynyt Ad-

TSC-22-

tartunnan soluja verrattuna, että Ad

LacZ-

tartunnan saaneiden solujen 48 tunnin kuluttua tartunnasta. Lisäksi useimmat Ad-

TSC-22-

infektoiduissa soluissa tehtiin apoptoosin myöhäisessä vaiheessa (kuvio 1 C). Seuraavaksi me arvioitiin kromosomi-DNA pirstoutuminen tarkkailla TSC-22 aiheuttama apoptoosin

HeLa

ja

CaSki

soluja. Kuten kuviossa 1D, kromosomi DNA Ad-

TSC-22

infektoiduista

HeLa

ja

CaSki-

solut osoittivat erittäin korkeaa pirstoutuminen. Lisäksi p21 (solusyklin estäjä) ja PUMA (apoptoosin indusoija) ilmentymistasot merkittävästi parannettu Ad

TSC-22

tartunnan

HeLa

ja

CaSki-

solu (kuvio 1D oikea paneeli). Nämä vaikutukset olivat merkittävämpiä kroonisesti HPV18-tartunnan

HeLa

solu. p53 ja TSC22 tasolla HeLa solut tuskin havaitsimme vertailla (d) CaSki- soluihin (kuvio 1 D oikea paneeli). Me spekuloida, että niiden eri ilmenemismuotoja johtuvat eri serotyypin HPV. Nämä tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen TSC-22 indusoi korkeita solukuoleman. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että TSC-22: lla on keskeinen rooli kohdunkaulan kasvainsolun kasvua ja kuolema.

ektooppisesti ilmaistu TSC-22 on vuorovaikutuksessa ektooppisesti ilmaistu p53

H1299

soluja. Kaksi ug Flag-TSC-22 ekspressiovektori transfektoitiin yhdessä Flag-p53-ekspressiovektoriin (A) tai ei-leimatun p53: n ekspressiovektoriin (B)

H1299

soluja viljeltiin 100 mm: n maljoille. 48 h transfektion jälkeen, solulysaatit immunosaostettiin anti-p53 (DO-1) (A) tai anti-Flag (B) monoklonaalinen vasta-aine. Immunosaostumat analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä HRP-konjugoitua anti-Flag (A) tai anti-p53 (FL393) (B) monoklonaalinen vasta-aine. (C-D) TSC-22 on vuorovaikutuksessa endogeenisten p53. Ektooppisesti ilmaisi TSC-22 on vuorovaikutuksessa endogeenisten p53 soluissa. HEK293-solut transfektoitiin 2 ug: Flag-TSC-22-plasmidin 48 tuntia. Solulysaatit immunosaostettiin anti-p53 (DO-1) monoklonaalinen vasta-aine, hiiren immunoglobuliini G (IgG) (C), tai anti-Flag (D) monoklonaalinen vasta-aine. Immunosaostumat analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä HRP-konjugoitua anti-Flag (C) tai anti-p53 (FL393) vasta-aine.

TSC-22 sitoutuu

p

53 on hiivan kaksi-hybridi-määritys

Kuten meidän tiedot, TSC-22, myötävaikuttaa inhibitio syöpäsolujen kasvua ja solujen kuolemaan. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien tutkimusten osoittavat, että TSC-22 on mahdollinen tuumorisuppressori [8] – [11], [13], [23] – [25]. Selventämiseksi mekanismeista tätä toimintoa, me seulotaan TSC-22-proteiiniin sitoutuvien proteiinien käyttäen hiivan kahden hybridin määrityksessä. Tätä kautta p53 identifioitiin TSC-22-sitovan proteiinin (kuvio 2A, vasen paneeli). Vuorovaikutus TSC-22 ja p53 siten osoittanut

in vitro

sekä solujen kasvu ja β-galaktosidaasi määritys (kuvio 2A, oikea paneeli).

määrittäminen vaikutukset TSC- 22

p

53

ymmärtää paremmin vaikutuksia TSC-22 p53,

HeLa

ja

CaSki-

solut infektoitiin Ad

TSC-22

tai

LacZ

kasvavien ajanjaksojen ajan. Mielenkiintoista, endogeeninen p53 tasot olivat huomattavasti transfektoimalla Ad-

TSC-22

ajassa mukaisesti (kuvio 2B). Tehostaminen p53 ilmentyminen oli merkittävämpi

HeLa

soluissa kuin

CaSki

soluja. Jotta tarkkailla lisälaite p53 kohdegeenin aktiivisuuden ilmentymistä TSC22, Flag-merkityn TSC-22 otettiin

HeLa

soluja. p53-proteiinin ja sen kohdegeenien, kuten p21 ja Puma, oli selvästi aiheuttama Flag-

TSC-22

ilmaisu (kuvio 2C). Kääntäen, koputtaa alas TSC-22

HeLa

solujen vähensi proteiinin tasot p53 ja PUMA (kuvio 2D). Kuitenkin taso p53 mRNA ei vaikuttanut knock-down ja yli-ilmentyminen TSC-22 (kuvio 2C ja 2D, alapaneeli).

Voit selvittää p53 toimintaa säätelee TSC-22 ilmentyminen in

HeLa

soluja, arvioimme

p53RE

(vastaava elementti) -indusoituun promoottorin aktiivisuus TSC-22 ilmentyminen ja knock-down of TSC-22

HeLa

soluja . Promoottori kätkeminen

p53RE

aktivoitiin TSC-22 ilmentyminen annoksesta riippuvalla tavalla. Toisaalta, promoottorin aktiivisuus väheni TSC-22 knock-down. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p53-välitteinen transkriptionaalista aktiivisuutta säätelee TSC-22 (kuvio 2E). Sen arvioimiseksi, pienenemistä PUMA ja p21 aiheuttavat suoraa sääntelyä p53 TSC-22, Flag-merkittyjen

TSC-22

plasmidi vietiin

HCT116 p53

+ /+

ja

p53

– /-

soluja. Tehostettu ekspressio PUMA havaittiin

p53

+ /+

mutta ei

p53

– /-

soluja (kuvio 2F). Tämä tulos viittaa siihen, että sääntely PUMA ja p21 by TSC22 riippuu p53. Tutkimaan edelleen parantamiseksi p53 TSC-22, arvioimme p53 vakautta Ad

TSC-22

tai Ad-

LacZ

tartunnan

HeLa

solujen jälkeen sykloheksimidikäsittelylle . Kuten kuviossa 2 on esitetty G, Ad-

TSC-22

suuresti parannettu, ja stabiloidaan endogeenisen p53 tasoilla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TSC-22 edistää tuumorisuppressori p53 lisäämällä stabiilisuutta p53-proteiinin.

(A) Kaaviokuva esittää cDNA rakentaa varten Flag-leimatun p53: n deleetiomutantit ja täyspitkä p53 , ja ilmaisee TSC22 sitova alue. (B)

H1299

-solut transfektoitiin ilmoitetuilla koodaavat plasmidit Flag-leimatun p53: n deleetiomutantit yhdessä Flag-TSC-22-plasmidi. Solulysaatit immunosaostettiin anti-p53-polyklonaalista vasta-ainetta FL393 (vasen) tai DO-1 monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen N-terminaalinen alue (oikealla), minkä jälkeen Western blottauksella käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Lysaatit (5%) oli myös ladattiin SDS-geelin Western blottaus käyttämällä anti-Flag-vasta-aineen (alareunassa kunkin paneelin). (C) Kaaviokuva, joka esittää cDNA-konstrukteja Flag-merkityn TSC-22 deleetiomutantit (vasen paneeli).

H1299

-solut transfektoitiin ilmoitetuilla plasmideilla, jotka koodaavat Flag-merkityn TSC22 deleetiomutantit yhdessä Flag-p53-plasmidi. Solulysaatit immunosaostettiin anti-p53-vasta-ainetta (FL393); co-immunosaostettiin TSC22 havaittiin Western-blottauksella käyttämällä HRP-konjugoitua anti-Flag-vasta-ainetta (oikealla, keskimmäinen ruutu). Lysaattia (5%) analysoitiin Western blottauksella käyttäen anti-Flag-vasta-aineen (oikealla, alapaneeli).

TSC-22 sitoutuu

p

53

in vivo

Voit selvittää TSC-22 on vuorovaikutuksessa p53 nisäkässoluissa, transfektoimme

H1299

ihmisen keuhkojen ei-pienisoluinen karsinooma solujen Flag-TSC22 ekspressioplasmidin ja ^ p53 ilmaus plasmidi, ja sitten toteutettiin samanaikainen immunosaostus ja Western blot määrityksissä. Olemme havainneet, että TSC-22 erityisesti co-immunosaostettiin p53 soluissa, jotka ilmentävät sekä Flag-TSC22 ja p53, mutta ei soluissa, jotka ilmentävät joko proteiinia yksinään (kuvio 3A). Toisaalta, p53 erityisesti yhteistyössä immunosaostettiin TSC-22 anti-Flag-vasta-ainetta (kuvio 3B), mikä viittaa vuorovaikutusta TSC-22 ja p53. Seuraavaksi yritimme vahvistaa endogeenisen vuorovaikutusta p53 ja TSC-22. Koska emme voi ostaa sopivan TSC-22-vasta-aineen käyttö on samanaikainen immunosaostus kokeilu, tämä vuorovaikutus varmistettiin vastavuoroinen samanaikainen immunosaostus endogeenisen p53 ja eksogeenisesti ilmaisi Flag-merkityn TSC-22 HEK293-soluissa, jotka ilmentävät korkeita p53 (kuviot 3C ja D). Tulokset viittaavat siihen, että TSC-22 suoraan vuorovaikutuksessa p53.

TSC-22 sitoutuu p53 alueella lukien aminohapot 100-200

määritellä tarkemmin alueen olennainen sitova TSC-22 p53, me syntyy useita p53 deleetiomutantit (kuvio 4A). Ekspressioplasmidit p53 ja TSC-22 transfektoitiin

H1299

soluja yhdessä tai yksin. Kuten kuvioissa 4A ja B, TSC-22 kykeni sitoutumaan p53 osittain useista häviämämutantteja lukien p53

1-300, p53

101-393, ja p53

1-200. Kuitenkin edelleen poistamalla osan sisäisen alueen DNA: ta sitovan domeenin, kuten p53

1-100, p53

201-393, p53

301-393 ja p53

201-300, poistetaan p53-TSC22 sitoutuminen (kuviot 4A ja B). Nämä tulokset osoittavat, että alueella, mukaan lukien aminohapot 100-200, joka on osa p53 DNA: ta sitova domeeni, tarvitaan sitova TSC-22. Sen jälkeen, tunnistaa p53 sitova alue TSC-22, Flag-merkityn katkaistun TSC-22-mutanttien, jotka kukin sisälsi α-heliksin ilmaistiin p53: n kanssa, kuten on esitetty kuviossa. 4C. Yhdessä immuunisaostuskokeissa käyttäen anti-p53-vasta-ainetta (DO-1), TSC-22

54-154 oli yhteistyössä immunosaostettiin p53, mutta TSC-22

1-110 ja TSC-22

54-110 ei. Nämä tiedot viittaavat siihen, että p53 sitoutuu aminohapot 110-154 ja TSC-22. Valitettavasti emme voineet edelleen vahvistaa yksityiskohtainen vuorovaikutus p53-TSC-22, koska TSC-22

110-154 ei ollut ilmaistu meidän kokeessa (kuvio 4C). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että TSC-22 ja p53 vuorovaikutuksessa erityisiä verkkotunnuksia kussakin proteiinia.

(A) TSC22 estää HDM2 välittämän p53 ubikitinaation.

H1299

-solut transfektoitiin ilmaistuilla plasmideilla. Transfektoidut solut käsiteltiin MG132 (20 uM) 5 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aine. Ubikitinoituja p53 havaittiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1). Ubikitinoitu p53 on merkitty Ub (n) -p53 (ylempi paneeli). Ilmentymisen yhteensä p53, HDM2, Flag-TSC-22 ja HA-Ub-proteiinit on esitetty alemmassa paneelit. (B) TSC-22 ei keskeytä vuorovaikutusta p53 ja HDM2.

H1299

solut transfektoitiin Flag-p53 sekä Flag-TSC-22 tai Flag-mock vektorin läsnä ollessa HDM2 ekspressiovektoriin. Solulysaatit immunosaostettiin anti-p53 (DO-1) vasta-aine, jota seurasi Western-blottauksella käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Lysaattia (5%) analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä osoitti vasta-aineita (alempi paneeli). (C) TSC-22 inhiboi E6-välitteisen p53 ubikitinaation.

H1299

-solut transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidien läsnä ollessa HA-Ub-ekspressiovektoriin. 48 h transfektion jälkeen, transfektoituja soluja käsiteltiin MG132 (20 uM) 5 tunnin ajan, ennen kuin ne on korjattu. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aine. Ubikitinoituja p53 havaittiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1). Ubikitinoitu p53 on merkitty Ub (n) -p53 (ylempi paneeli). Ilmentymisen yhteensä p53, Myc-E6, Flag-TSC-22, ja HA-Ub-proteiinit on esitetty alemmassa paneelit. (D) TSC-22 häiritsee ubikinaa- p53

HeLa

soluja.

HeLa

solut kotransfektoitiin Flag-TSC-22 tai Flag-mock vektorin ja HA-Ub ekspressiovektoriin. 48 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin 20 uM MG132: ssa 5 h ennen sadonkorjuuta. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aine. Ubikitinoituja p53 havaittiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1). (E) Stable TSC-22 knock-down tai ohjaus

HeLa

soluja käsiteltiin 20 uM MG132 5 h ennen sadonkorjuuta. Ubikitinaation p53 analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

TSC22 Estää HDM2 ja E6 -välitteisen p53 Poly-ubikitinaation

Sen määrittämiseksi, onko lisälaite p53: n vakautta TSC-22 on estämällä p53 ubikitinaatiosta

H1299

solut transfektoitiin HDM2, p53, ja TSC-22 ekspressioplasmideja, ja käsitelty proteasomaalisten estäjän MG132 6 h, jotta voidaan tehdä

in vivo

ubikinaa- määrityksiä . Kuten on esitetty kuviossa 5A, p53 oli hyvin ubikitinoituja ilmentymisen kanssa HDM2. Kuitenkin edelleen HDM2-välitteisen p53 ubikitinaation inhiboitui merkittävästi, että ne ilmentävät TSC-22 (kuvio 5A). Halusimme seuraavaksi onko inhibitio HDM2-välitteisen p53 ubikitinaation TSC-22 on aiheuttanut keskeytyksen vuorovaikutusta HDM2 ja p53. Siksi me käyttöön p53, HDM2, ja TSC22 ilmentämisplasmidit

H1299

soluja, kuten on esitetty kuviossa 5B. p53 sitten immunosaostettiin solu-uutteiden kanssa DO-1-vasta-aine. Kiinnostavaa kyllä, tämä koe osoitti, että p53 oli samanaikaisesti sidottu HDM2 ja TSC-22. Lisäksi p53-HDM2 vuorovaikutus ei ollut keskeytynyt ilmentyminen TSC-22. Nämä tiedot viittaavat siihen, että TSC-22 voi suojata p53 päässä HDM2-välitteisen ubikitinaation suoraan sitoutumalla p53 alueella erillään HDM2 sitoutumiskohdan.

(A) HDM2 ja Myc-E6 transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidit

H1299

soluja. Transfektoidut solut käsiteltiin MG132 (20 uM) 5 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aine. Ubikitinoituja p53 havaittiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1). Ubikitinoitu p53 on merkitty Ub (n) -p53 (ylempi paneeli). Ilmentymisen yhteensä p53, HDM2, Flag-TSC-22 ja HA-Ub-proteiinit on esitetty alemmassa paneelit. (B) Flag-merkityn villityypin (WT) tai mutantti-TSC22

1-110 oli ko-transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidit

H1299

soluja. Transfektoidut solut käsiteltiin MG132 (20 uM) 5 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta. Solulysaatit immunosaostettiin anti-HA-vasta-aine. Ubikitinoituja p53 havaittiin Western-blottauksella anti-p53-vasta-ainetta (DO-1). Ubikitinoitu p53 on merkitty Ub (n) -p53 (ylempi paneeli). Ilmentymisen yhteensä p53, HDM2, Flag-TSC-22 ja HA-Ub-proteiinit on esitetty alemmassa paneelit. (C) Nude hiiret inokuloitiin 1 x 10

6

HeLa

soluja ihon alle. Ihonalainen kasvaimia, jotka ovat peräisin

HeLa

soluja käsiteltiin adenovirusvektoreita kuten on osoitettu. Tuumoritilavuudet esitetään keskiarvona vähintään viidestä hiirtä per ryhmä (n = 10- 14 ryhmää kohti). Bars = SD. (D) vaikutus TSC-22 käsittely ilmentymistason p53 HeLa-soluista peräisin tuumorit leikattiin klo 27

päivänä jälkikäsittelyä määritettynä immunoblot-analyysillä. Edustava immunoblot kolmesta näytteestä kustakin ryhmästä.

vieressä pyrkivät osoittamaan, että TSC-22 voi suojata p53 E6-välitteinen ubikitinaation koska E6 ja HDM2 sitovien domeenien p53 päällekkäisyyttä. p53 on erittäin ubikitinoituja ilmentymisen kanssa E6

H1299

soluissa (kuvio 5C, kaista 3); kuitenkin edelleen ilmentyminen TSC-22 selvästi esti E6-välitteinen p53 ubikinaa- (kuvio 5C, kaista 4). Seuraavaksi me käyttää

HeLa

soluja, jotka konstitutiivisesti E6 tutkia TSC-22-välitteisen p53 vakaus fysiologisissa olosuhteissa. Ubikinaa- p53 oli kasvanut huomattavasti, kun MG132 hoidon soluissa. Sitä vastoin, tämä ubikitinaatio selvästi hävisivät yli-ilmentyminen TSC-22 (kuvio 5 D). p53 ubikinaa- pelastettiin ilmaus shRNA spesifinen TSC-22

HeLa

solujen puuttuessa MG132 (kuvio 5E, kaista 2). Kuitenkin ero tason p53 ubikinaa- ollut merkittävä välillä

sh-con

ja

sh-TSC-22

solujen läsnäollessa MG132. Olemme edelleen tutkia vaikutusta TSC-22 p53 ubikinaa- että ne ilmentävät sekä HDM2 ja E6. Kuten kuviossa 6A, taso p53 ubikinaa- oli dramaattisesti indusoitiin molempia HDM2 ja E6. Kuitenkin molemmat HDM2 ja E6-välitteinen p53 ubikitinaation on tiukasti keskeytyi TSC-22 ilmentyminen (kuvio 6A). Lisäksi testasimme, onko TSC-22-p53-vuorovaikutus on tärkeää estää p53 ubikitinaation. Kuten kuviossa 6B on esitetty, C-terminaalinen deleetio mutantti TSC-22

110, joka ei ole vuorovaikutuksessa p53: n kanssa (kuvio 4C), ei estänyt HDM2 ja E6-välitteinen p53 ubikitinaation (kuvio 6B). Tämä tulos paljastaa, että TSC-22 estävät p53 ubikinaa- kautta suoraa vuorovaikutusta. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että TSC-22 suoraan vuorovaikutuksessa p53 ja estää E6 ja /tai HDM2-medidated p53 ubikitinaatiosta seurasi stabilointi proteiini p53.

TSC-22 vaimentaa kasvaimen kasvua nude-hiirissä

seuraava ratkaistava, onko TSC-22 kasvaimen kasvu estyy

in vivo

. Eksponentiaalisesti kasvavat

HeLa

kohdunkaulan syövän soluja injektoitiin subkutaanisesti immuunijärjestelmän puutosta BALB /c-nude-hiirissä. Kun tuumorin tilavuus oli noin 100 mm

3, 1 x 10

9 pfu adenovirusta, joka ekspressoi TSC-22 tai

LacZ

injektoitiin kasvaimia. Kolmen peräkkäisen sisäisen kasvaimen injektiota adenoviruksen, eläimet (5-7 ryhmää kohti) seurattiin kasvaimen kasvua. Kasvaimen kasvu ja morfologia analysoitiin yli 30 päivää. Kuvio 6C osoittaa, että kasvain massa hiirillä ruiskutetaan Ad-TSC-22 oli huomattavasti vähäisempää kuin kasvaimia injektoitu Ad-

LacZ

tai jotka olivat käsittelemättömiä. Me tutkimme seuraavaksi vaikutuksen TSC-22 p53 vakauttamiseen kasvainkudoksissa korjattu ohjaus ja TSC-22 hoidetuissa hiirissä. TSC-22 transfektion havaittiin merkittävästi lisätä ilmentymistä p53-proteiinin tasoa (kuvio 6D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että TSC-22 voi olla voimakas tuumorisuppressoriproteiinia tässä eläinmallissa.

Keskustelu

Meidän haku, liittyvien geenien tunnistamiseen kohdunkaulan syövän kehityksen, ilme kuvio tehdään noudattaen cDNA microarray kokeiluja ja RT-PCR osoitti, että

TSC-22

geeni johdonmukaisesti vähennetty tuumorikudoksissa (Fig. 1A). Useat aiemmat tutkimukset raportoitu, että TSC-22 on alassäädetty ihmisen sylkirauhasen kasvaimet [23], hiiren maksakasvaimien [11], ja ihmisen aivojen kasvaimia kuten astrocytomas [26]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että alas-säätely TSC-22 voi olla rooli syövän kehittymisen erilaisissa kudoksissa. Nämä aikaisemmat raportit eivät ratkaisseet ongelmaa TSC-22 vähennetään syöpäsoluissa. Järkevä selitys on, että TSC-22 voi estää syöpäsolun kehitystä. Tuloksemme osoittivat, että TSC-22 dramaattisesti inhiboivat soluproliferaatiota ja solukuolema, kun ilmaistaan ​​adenovirus ilmentämisjärjestelmä (kuviot 1C ja D). Samoin, parantamiseksi TSC-22: n ilmentyminen liittyy voimistunutta apoptoosia ihmisen mahakarsinooman soluihin [10].

Koska TSC-22 on transkription repressori [3], rooli TSC-22 kasvaimen suppression ovat ehdottaneet Mari

et al

. [11]. Kokeiluja käyttämällä TSC-22 siRNA, tämä ryhmä osoitti, että DNA-vaurioita-geenin, 45 β (Gadd45ß) ja oletettua tuumorisuppressorigeeni 2 (Lzts2) ovat otaksuttu tavoitteita TSC-22. Kuitenkin suhteita kautta nämä tavoitteet pelata keskeisiä rooleja kasvaimen tukahduttaminen TSC-22 ei suoraan paljastanut. Meidän yrittää löytää uusi funktio TSC-22 kasvaimen suppression, olemme määritelleet sitovan proteiinin hiivan kahden hybridin kokeessa. Tämä tutkimus osoitti, että TSC-22 suoraan sitoutuu p53 (kuvio 2A). Olemme lisäksi havaittu, että TSC-22 säädelty proteiini tasoilla p53 muuttamatta tasoja p53 mRNA. TSC-22 yli-ilmentyminen ja knock-down kokeet osoittivat, että TSC-22 helpottaa p53 transkription aktivaattori kohdegeenien, jotka voivat inhiboida kasvaimen kehittymisen (kuvio 2C-G). Nämä tulokset osoittivat, että lisääntynyt p53-proteiinin arvot liittyvät translaation jälkeiset sääntelyn TSC-22. TSC22-p53 vuorovaikutus arvioitiin

in vivo

määrityksissä, joissa p53 yhteistyössä immunosaostettiin TSC-22 (Kuva 3-4).

Yli-ilmentyminen TSC-22 selvästi esti ubikinaa- p53 HDM2, joka säätelee p53 liikevaihdon kautta E3 aktiivisuutta. Useat säätimiä, jotka vaikuttavat p53: n kautta modulaatio HDM2-p53 vuorovaikutus on tunnistettu, mukaan lukien p14Arf [27], [28], YY1 [29], gankyrin [30], L11 [31], Daxx [32], Numb [ ,,,0],33], ja Nucleostemin [34]. Näistä säätimet, Numb muistuttaa eniten TSC-22, koska Numb sitoutuu p53 ja HDM2, mikä estää ubikitinaation ja hajoaminen p53 [33].

Itse asiassa huomasimme kolmen komponentin kompleksin, joka sisältää kaikki kolme proteiinia: TSC-22, HDM2 ja p53. Näin ollen, TSC-22 ei kilpaile HDM2 sitoutumisesta p53. TSC-22 sitoutuu DNA: ta sitovan domeenin p53, joka on olennainen p53-toiminto. Siksi vielä ratkaistava, onko tämä vuorovaikutus on tarpeen aktivoida kohdegeenien p53 tumassa.

Mielenkiintoista, lisääntynyt solukuolema ja esto lisääntymisen TSC-22 ilmentyminen oli useammin havaittiin

420−1.75×A

550)]/(time×volume×A

600).

Co-immunoprecipitation

To