Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin on osoitettu, että muuttunut microRNA-9 (miR-9) ilmentyminen on osallisena etenemistä mahasyövän. Kuitenkin tarkka roolit ja taustalla mekanismeja miR-9 leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän vielä tuntematon. Tässä tutkimuksessa miR-9 havaittiin olevan alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin 1 (Ets1) mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa. Bioinformatiikan analyysi paljasti oletetun miR-9 sitoutumiskohdat 3′-alueet (3′-UTR), sykliini D1 ja Ets1 mRNA. Ektooppinen ilmentyminen tai knockdovvn miR-9 johti vasteena muuttunut ilmentyminen sykliini D1, Ets1 ja niiden loppupään tavoitteensa fosforyloitu retinoblastooma ja matriksimetalloproteinaasi 9 viljellyissä mahasyövässä solulinjoissa SGC-7901 ja AGS. Vuonna lusiferaasireportterisysteemillä, miR-9 kohdistettu suoraan 3′-UTR sykliini D1 ja Ets1, ja nämä vaikutukset poistettiin mutatoimalla miR-9 sitoutumiskohtia. Yli-ilmentyminen miR-9 tukahdutetaan leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden SGC-7901 ja AGS solujen

in vitro

ja

in vivo

. Palauttaminen miR-9-välitteisen alas-säätely sykliini D1 ja Ets1 lyhytaikaisella transfektiolla, pelastettiin syöpäsoluja laskun proliferaatiossa, muuttoliike ja hyökkäystä. Lisäksi anti-miR-9 estäjä edisti proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota mahalaukun syövän solujen, kun taas kaatamalla sykliini D1 tai Ets1 osittain phenocopied vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen. Nämä tiedot osoittavat, että miR-9: n ekspressiota vähentävän sykliini D1 ja Ets1 kautta sitoutumiskohdat niiden 3′-UTR: n, estäen siten proliferaatiota, invaasio ja metastaasi mahasyövän.

Citation: Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 estää leviämisen, ja metastaasit mahasyövän Cells kautta Targeting sykliini D1 ja Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 29 joulukuu 2012; Julkaistu: 31 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana National Natural Science Foundation of China (nro 30600278, No. 30772359, No. 81071997, No. 81072073, nro 81272779), Program New Century Excellent Talents in University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation varten Palautetut Overseas Kiinan Scholars (2008-889), ja perustutkimus rahastoja Keski yliopistot (2012QN224). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Huolimatta paraneminen kirurgisten ja multimodaalinen hoito, ennuste edennyt mahasyöpä edelleen heikko johtuen toistumisen, invaasio ja metastaasi, jossa on 5-vuoden pysyvyys alle 30% [1]. Parempi tuntemus mekanismeista syövän etenemiseen taataan löytää uusia paradigmoja diagnosointiin ja hoitoon mahasyövän [2]. MikroRNA (miRNA), äskettäin tunnistettu luokka pienten ja hyvin säilyneitä ei-koodaavan RNA: ita, voivat osallistua transkription jälkeisen geenin ilmentymisen säätelyyn osittaisella täydentävien sitoutumisen kanssa 3’alueet (3′-UTR) ja kohde-mRNA, johtaen translaation tukahduttaminen tai mRNA: n hajoamisen [3]. Kehittyvät näyttöä siitä, että miRNA osallistuvat biologisiin prosesseihin liittyvät apoptoosin lisääntymistä, erilaistumista, invaasio ja metastaasi, vaikka vapauttaminen on ratkaisevan tärkeää syövän taudin alkamisen ja etenemisen [3]. Se on tällä hetkellä kiireellisesti tutkia roolit miRNA ja niiden kohdegeenien kasvaimen etenemisen kokeellisissa malleissa.

Ihmisen mahalaukun syöpä, useita miRNA on raportoitu olevan poikkeavasti yli-ilmentynyt tai alas-säädellä aikana etenemisen mahasyöpä, mukaan lukien miR-21 [4], miR-15b [5], miR-16 [5], ja miR-101 [6]. Nämä miRNA pelata onkogeenisia tai kasvain heikentävän rooleja solukasvun säätelyssä, muuttoliikettä ja invaasiota tukahduttaa niiden kohdegeenien. Esimerkiksi onkogeenisiä miR-21 on poikkeavasti yliekspressoitu mahasyövässä, ja parantaa leviämisen ja invasiivisuus mahalaukun syöpäsolujen kohdistamalla palautuminen aiheuttavia kysteiinirikkaan proteiinin Kazal motiiveja [4]. Samaan aikaan miR-15b ja miR-16 ovat alassäädetty mahasyövän ja edistävät monilääkeaineresistenssin mahalaukun syöpäsolujen modulaatio apoptoosin kautta kohdistaminen B-solu leukemia /lymfooma 2 [5]. miR-101 on alassäädetty mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa, kun taas ektooppinen ilmentyminen miR-101 merkittävästi estää proliferaatiota, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen kohdentamalla tehostajana zeste homologin 2, sytokromi c oksidaasi alayksikkö II, ja myelooinen cell leukemia sarja 1 [6]. Siksi on ollut keskittyä tutkimaan edelleen ilmentymistä ja toimintaa miRNA kasvaimen biologiaan mahasyövän.

MicroRNA-9 (miR-9) on ensimmäinen tunnistettu yksi tärkeimmistä sääntelyviranomaisten kehittämisen , fysiologia ja patologia hermoston useissa organismeihin, kuten

Drosophila

, seeprakala, ja nisäkkäät [7] – [9]. Sarja myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että muuttunut miR-9: n ilmentyminen liittyy kehittymistä ja etenemistä syöpien [10] – [14]. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että miR-9 on merkittävästi alassäädetty mahasyövän, mikä sen potentiaali roolit kasvainprogression [15] – [18]. On myös osoitettu, että miR-9 voi moduloida leviämisen mahasyövän solujen kautta kohdistettu caudal tyypin homeobox 2 (CDX2) [19] ja NF-kappa B (NF-KB) [16]. Kuitenkin tarkka toiminta ja taustalla olevien mekanismien miR-9 etenemisessä mahasyövän vielä aihetta lisätutkimuksia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, ensimmäistä kertaa, että miR-9 suoraan tavoitteet sykliini D1 ja v-ETS erytroblastoosin virus E26 onkogeeni homologin 1 (Ets1), ja tukahduttaa leviämisen, invaasio ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen

vuonna vitro

ja

in vivo

.

tulokset

miR-9 oli alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksiin ja solulinjoja

tutkimiseksi miR-9 ilmentymistä mahasyövän, mahasyövän kudosten ja viereisen ei-neoplastisia limakalvon kerättiin 86 ensisijainen tapauksissa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) paljasti, että miR-9 alassäädetty mahasyövän kudoksissa kuin viereisillä epäneoplastisis- limakalvon (

P

= 0,001, Fig. 1A). MIR-9 ilmentyminen oli merkitsevästi alhaisempi mahasyövän tapauksissa syvempi mahalaukun seinämän invaasio (

P

0,001), imusolmuke etäpesäke (

P

0,001), kaukainen etäpesäke (

P

= 0,022), ja kehittyneet TNM (

P

= 0,01) (taulukko S1). Sen sijaan korkeampi sykliini D1 ja Ets1 transkriptipitoisuuksissa havaittu mahasyövässä kudoksissa (

P

0,0001 ja

P

0,0001 vastaavasti Fig. 1B ja Fig. 1 C). Oli käänteinen korrelaatio miR-9 ilmaisun ja sykliini D1 transkriptipitoisuuksissa mahasyövän kudoksissa (

P

0,001, Fig. 1 D). Lisäksi käänteinen korrelaatio miR-9 ilmaisun ja Ets1 transkriptipitoisuuksissa havaittiin myös näissä syövän kudoksissa (

P

0,001, Fig. 1 E). Ala miR-9 ilmaisun ja korkeamman transkriptipitoisuuksissa sykliini D1 ja Ets1 havaittiin mahasyövässä solulinjoissa kuin normaaleissa mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa [20] (Fig. 1 F). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin tarkkailla ilmaus sykliini D1 ja Ets1 näissä syövän yksilöt (Fig. S1). Nuclear sykliini D1 havaittiin 26/86 (30,2%) tapauksista, kun taas ydin- ja sytoplasman värjäytymistä Ets1 havaittiin 58/86 (67,4%) tapauksista (taulukko S1). Immunoreaktiivisuus sykliini D1 ja Ets1 oli merkitsevästi korkeampi mahasyövän tapauksissa syvempi mahalaukun seinämän invaasio (

P

0,001 ja

P

= 0,001), imusolmuke etäpesäke (

P

0,001 ja

P

0,001), kaukainen etäpesäke (

P

0,001 ja

P

0,001), ja kehittyneet TNM (

P

0,001 ja

P

= 0,004) (taulukko S1). Ala miR-9 ilmentymistä havaittiin mahasyövän kudoksissa suuremmilla immuunivärjäystä sykliini D1 (

P

0,0001, Fig. 1G) tai Ets1 (

P

0,0001, Fig. 1H ). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 alassäädetty ja korreloi käänteisesti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa.

A, B ja C, reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että verrattuna viereisiin ei-neoplastisten limakalvon (n = 86), down-regulation miR-9 ja suurempi transkriptitasot sykliini D1 ja Ets1 havaittiin mahalaukun syövän kudoksissa (n = 86). D ja E, siellä oli käänteinen korrelaatio miR-9 ilmaisun ja transkriptipitoisuuksissa sykliini D1 tai Ets1 mahasyövän kudoksissa. F, alempi miR-9 ilmaisun ja korkeammat sykliini D1 ja Ets1 transkriptipitoisuuksissa havaittiin mahasyövässä solulinjoissa (MKN-74, SGC-7901 ja AGS), verrattaessa normaaleissa mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa. G ja H, alempi miR-9 ilmentymistä havaittiin mahasyövän kudoksissa suuremmilla immuunivärjäystä sykliini D1 tai Ets1. Symbolit (* ja #) osoittavat merkittävää vähenemistä ja merkittävän kasvun välillä GES-1, vastaavasti.

miR-9 alassäädetty ilmaus sykliini D1 ja Ets1 läpi transkription jälkeisen tukahduttaminen

Tutkiakseen olettamusta, että miR-9 voi vaikuttaa ilmaus sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän, laskennallinen ennuste tehtiin miRNA tietokantoja. Mahdolliset sitoutumiskohdat Mir-9 korkea täydentävät, havaittiin emäkset 2974-2995 sykliini D1 3′-UTR ja 2648-2670 on Ets1 3′-UTR (Fig. 2A). Tutkia suorien vaikutusten miR-9 ilmaisun sykliini D1 ja Ets1 mahalaukun syöpäsoluissa, suoritimme Mirna yli-ilmentyminen kokeiluja. Vakaa transfektointi miR-9 esiaste osaksi SGC-7901 ja AGS solut johti kasvua miR-9 tasoa (Kuva. S2). Western blot, RT-PCR ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että yli-ilmentyminen miR-9 johti vähentyneeseen proteiinin ja transkription tasoa sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän soluja kuin ne, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) ( Fig. 2B, kuva 2C, ja kuva 2D). Lisäksi tasot fosforyloitua retinoblastoomaa (pRB, alavirtavaikuttajainhibiittorit sykliini D1) [21] ja matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9, joka on alavirtaan geenin Ets1) [22] määrä väheni miR-9 yli-ilmentävien syöpäsolujen (Fig. 2B, Fig. 2C, ja Fig. 2D). Tutkia edelleen ehkäisevän roolin miR-9 ilmaisemisessa sykliini D1 ja Ets1, suoritimme MIR-9 Knockdown kokeita transfektoimalla anti-miR-9 tai negatiivinen kontrolli (anti-NC) estäjät osaksi GES-1, SGC -7901 ja AGS soluja. Transfektio anti-miR-9-inhibiittori ilmeisesti väheni endogeeninen miR-9 ilmentymistä (Fig. S3A), ja upregulated proteiinin tasot sykliini D1, pRB, Ets1 ja MMP-9 kuin transfektoitiin anti-NC (Fig. 2E ja Kuva. S4A). Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat parannettua transkriptitasot sykliini D1, Ets1 ja MMP-9: n viljellyissä soluissa, jotka on transfektoitu anti-miR-9-inhibiittori, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu anti-NC (Fig. 2F ja kuvio. S4b). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että miR-9 inhiboituu huomattavasti ilmaus sykliini D1 ja Ets1 läpi transkription jälkeisen tukahduttaminen.

, järjestelmä mahdollisista sitoutumiskohtien Mir-9 3′-UTR sykliini D1 ja Ets1 paikantaminen emäksiä 2974-2995 ja 2648-2670, vastaavasti. B, vakaa transfektointi miR-9 esiaste johti vähentynyt proteiinipitoisuus tasoilla sykliini D1, Ets1 ja niiden loppupään tavoitteensa pRB ja MMP-9 mahasyövän SGC-7901 ja AGS soluja kuin ne, jotka oli transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale). C ja D, transkripti tasot sykliini D1, Ets1 ja MMP-9 määrä väheni miR-9 esiaste-transfektoiduissa SGC-7901 ja AGS soluja, verrattuna kuin mock soluissa. E, transfektio anti-miR-9-estäjä (100 nmol /l) johti lisääntyneeseen proteiinin tasot sykliini D1, Ets1 ja niiden loppupään tavoitteet pRB: n ja MMP-9 SGC-7901 ja AGS soluja kuin ne, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli estäjä ( anti-NC, 100 nmol /l). F, transkriptio tasot sykliini D1, Ets1, ja MMP-9 nostettiin SGC-7901 ja AGS-solut transfektoitiin anti-miR-9-estäjä (100 nmol /l), verrattuna niihin, jotka on transfektoitu anti-NC (100 nmol /l). Symbolit (* ja #) osoittavat merkittävää vähenemistä ja merkittävä kasvu valetrans- tai anti-NC, vastaavasti.

miR-9 suunnattu suoraan sykliini D1 ja Ets1 mahalaukun syöpäsoluissa

sen määrittämiseksi, miR-9 voi tukahduttaa ilmentymistä sykliini D1 ja Ets1 kohdistamalla sen sitoutumiskohdat 3′-UTR: n, PCR-tuotteet, jotka sisältävät ehjä kohdekohtaan tai mutaatio miR-9 siementen tunnistussekvenssit (Fig. 3A) insertoitiin lusiferaasi-reportterivektoria. Plasmidit transfektoitiin mahasyövän pysyvästi transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli -vektoriin (mock) tai miR-9 esiaste.

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitu kuin Firefly vähensi merkittävästi SGC-7901 ja AGS pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste (Fig. 3B), ja nämä vaikutukset poistettiin mutatoimalla otaksuttu miR-9 sitoutumiskohtien 3′-UTR sykliini D1 ja Ets1 (Fig. 3B). Lisäksi knockdovvn miR-9 anti-miR-9 estäjä lisäsi lusiferaasin toimintaa GES-1, SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 3C ja kuvio. S4C), kun taas mutaatio miR-9-tunnistuskohdan poistettava nämä vaikutukset (Fig. 3C ja kuvio. S4C). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 välittömästi ja nimenomaisesti vuorovaikutuksessa kohde sivustoja 3′-UTR sykliini D1 ja Ets1.

, järjestelmä ja järjestys ehjän miR-9 sitoutumiskohta (Wt) ja sen mutaatio (Mut) sisällä lusiferaasireportterisysteemillä vektorit. B, vakaa transfektointi miR-9 esiaste osaksi SGC-7901 ja AGS solujen alensivat lusiferaasiaktiivisuudet 3′-UTR toimittaja sykliini D1 ja Ets1 kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale), jotka poistavat mutaatio oletetun miR-9 sitoutumiskohtia. C, transfektio anti-miR-9-estäjä (100 nmol /L) tulee SGC-7901 ja AGS solujen lisääntynyt lusiferaasiaktiivisuudet kuin transfektoitiin anti-NC (100 nmol /l), kun taas mutaatio miR-9 tunnistuskohta poistetaan nämä vaikutukset. Symbolit (* ja #) osoittavat merkittävää vähenemistä ja merkittävä kasvu valetrans- tai anti-NC, vastaavasti.

miR-9 tukahdutti

in vitro

leviämisen mahasyövän soluja kohdistamalla sykliini D1

Koska edellä näyttö osoittaa, että miR-9 esti sykliini D1 ilmentyminen, ja yhdistämällä tosiasiat että sykliini D1: llä on kriittinen rooli solusyklin etenemisen ja leviämisen syöpäsolujen [21], Tutkimme lisäksi vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen ja kohdegeenin palauttaminen viljellyillä mahalaukun syöpäsoluja. Western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että transfektio sykliini D1, mutta ei Ets1, pelasti miR-9 aiheuttama säätely alaspäin sykliini D1 (Fig. 4A ja Fig. 4B). Pesäkkeitä muodostumista määrityksessä, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee kasvua SGC-7901 ja AGS solujen, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 4C). Virtaussytometria osoitti, että miR-9 yli-ilmentyminen indusoi solukierron pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 4D). Lisäksi transfektio sykliini D1, mutta ei Ets1, osaksi SGC-7901 ja AGS solujen palauttaa leviämisen inhibitio ja solusyklin pysähtymisen aiheuttamaa yli-ilmentyminen miR-9 (Fig. 4C ja Fig. 4D). Toisaalta, tutkimme vaikutuksia miR-9 Knockdown on GES-1, SGC-7901 ja AGS soluja. Johdanto anti-miR-9 estäjä näihin soluihin johti tehostetun kykyjä leviämisen (Fig. S3B) ja solusyklin etenemisen (kuvio. S3C). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 huomattavasti tukahdutetaan

in vitro

leviämisen ja solusyklin etenemisen mahalaukun syöpäsolujen johon pyritään sykliini D1.

A ja B, western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT -PCR osoitti, että transfektio sykliini D1, mutta ei Ets1, palautti alas-säätely sykliini D1 aiheuttama miR-9 yli-ilmentyminen mahasyövässä SGC-7901 ja AGS soluja, verrattaessa transfektoitu negatiivisen kontrollin vektori ( pilkata). C, in pesäkemuodostusta, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee kasvua SGC-7901 ja AGS soluja kuin mock soluja, jotka pelastettiin transfektoimalla sykliini D1, mutta ei Ets1. D, virtaussytometria osoitti, että miR-9 yli-ilmentyminen indusoi solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe SGC-7901 ja AGS soluissa kuin mock soluja, jotka pelastettiin transfektoimalla sykliini D1 , mutta ei Ets1. Symboli (*) todetaan merkittävä laskua mock.

miR-9 heikennetty

in vitro

muuttoliike ja invaasion mahasyövän solujen kohdistamalla Ets1

koska aiemmat tutkimukset osoittavat yhtä tärkeää roolia Ets1 vuonna hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen [23], [24], me tutki tarkemmin vaikutuksia miR-9 yli-ilmentyminen ja kohdegeenin palauttaminen maahanmuutto- ja hyökkäys mahasyövän SGC -7901 ja AGS soluja. Western blot ja reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR osoitti, että transfektion Ets1, mutta ei sykliini D1, pelastettiin MIR-9-indusoidun down-regulation of Ets1 (Fig. 5A ja kuvio. 5B). Vuonna siirtokuoppaan migraatiokokeessa, mahasyöpä pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste esitti heikentynyt muuttoliike kapasiteetti kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 5C). Vuonna Matrigel invaasiomääritys, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee invasiivisuus on SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 5D). Lisäksi transfektoimiseksi Ets1, mutta ei sykliini D1, osaksi SGC-7901 ja AGS solulinjat palautti miR-9-meditaed esto maahanmuutto- ja invaasion (Fig. 5C ja kuvio. 5D). Lisäksi tutkimme vaikutuksia miR-9 Knockdown on GES-1, SGC-7901 ja AGS soluja. Transfektio anti-miR-9 estäjä johti lisätä maastamuuttoa ja invaasion näiden solujen (Kuva. S3D ja Fig. S3E). Nämä tulokset osoittivat, että miR-9 huomattavasti heikennetty

in vitro

muuttoliike ja invaasion mahasyövän solujen johon pyritään Ets1.

A ja B, western blot ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR osoitti että transfektoimiseksi Ets1, mutta ei sykliini D1, palautti alas-säätely Ets1 aiheuttama miR-9 yli-ilmentyminen mahasyövässä SGC-7901 ja AGS soluja, verrattaessa transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale). C, on transwell migraatiokokeessa, mahalaukun syövän soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu miR-9 esiaste esitetty on heikentynyt maahanmuuton kapasiteettia kuin se, mock-solut, jotka pelastettiin transfektoimalla Ets1, mutta ei sykliini D1. D, vuonna Matrigel invaasiomääritys, miR-9 yli-ilmentyminen vaimenee hyökkäys ominaisuuksia SGC-7901 ja AGS soluja kuin mock soluja, jotka pelastettiin transfektoimalla Ets1, mutta ei sykliini D1. Symboli (*) todetaan merkittävä laskua mock.

miR-9 vaimennettu kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen

in vivo

Seuraava tutkittu tehoa miR-9 vastaan ​​kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

. Stabiili transfektio miR-9 esiaste osaksi SGC-7901 tai AGS solujen alensivat kasvu ja painon ihonalaisen ksenograftikasvaimissa kateenkorvattomissa nude-hiirissä, kun sitä verrataan niihin stabiilisti transfektoitu negatiivinen kontrolli vektorin (vale) (Fig. 6A ja kuvio. 6B ). Lisäksi ilmaisu sykliini D1, Ets1 ja loppupään MMP-9 väheni stabiili transfektio miR-9 esiaste (Fig. 6C). CD31-positiivinen keskiarvo suonitiheyttä vähentää kasvaimiin on muodostettu ruiskuttamalla syöpäsolujen stabiilisti transfektoitu miR-9 esiaste (Fig. 6D). Kokeellisessa etäpesäke tutkimukset, SGC-7901 tai AGS pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste perustettiin tilastollisesti vähemmän keuhkojen metastaattinen pesäkkeitä kuin mock ryhmä (Fig. 6E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-9 esti kasvua ja etäpesäkkeiden mahalaukun syövän solujen

in vivo

.

A ja B, injektio- ja SGC-7901 tai AGS pysyvästi transfektoitujen solujen miR-9 esiaste kateenkorvattomiin nude-hiiriin (n = 5), alensivat koko ja paino ihonalaisen ksenograftikasvaimissa kuin transfektoitu negatiivinen kontrolli -vektoriin (mock, n = 5). C, hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E) ja immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että stabiili transfektio miR-9 esiaste johti vähentyneeseen ekspressioon sykliini D1, Ets1, ja MMP-9 kasvaimiin. Mittaviivat: 100 pm. D CD31-positiivisten keskiarvo suonitiheyttä pieneni kasvaimiin muodostuu syöpäsolujen transfektoitiin stabiilisti miR-9 esiaste. Mittaviivat: 100 pm. E, kokeellisessa etäpesäkkeiden määrityksessä, syöpäsolut stabiilisti transfektoitu miR-9 esiaste perustettiin merkittävästi vähemmän metastaattisen keuhkosyövän pesäkkeet (nuolenpäät) kateenkorvattomissa nude-hiiriin (n = 6). Mittaviivat: 100 pm. Symboli (*) todetaan merkittävä laskua mock.

knockdovvn sykliini D1 ja Ets1 phenocopied miR-9 yli-ilmentyminen estoa proliferaatioon, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen

in vitro

Koska edellä esitetyt tulokset osoittivat negatiivisen säätelyn sykliini D1 ja Ets1 ilmentyminen miR-9, me arveltu, että pudotus sykliini D1 ja Ets1 voi käyttää samankaltaisia ​​vaikutuksia viljellyissä mahalaukun syöpäsoluja. Pieni häiritsevä RNA: t (siRNA: t), joiden tarkoituksena koodaavan alueen sykliini D1 ja Ets1, si-CCND1 ja si-Ets1, suunniteltiin ja transfektoitiin SGC-7901 ja AGS soluja. Transfektio si-CCND1 ja si-Ets1 johti vähentyneeseen ekspressioon sykliini D1, pRB, Ets1 ja MMP-9 mahasyövän soluissa, vastaavasti, verrattuna niihin, jotka on transfektoitu sekoituskoodin siRNA (si-Scb) (Fig. 7A, kuvio . 7D ja Fig. S5). Knockdown sykliini D1 tukahdutetaan lisääntymistä ja indusoi solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe SGC-7901 ja AGS-soluissa (kuvio. 7B ja kuvio. 7C). Lisäksi knockdovvn Ets1 in SGC-7901 ja AGS solujen alensivat valmiuksia muuttoliikkeen ja invaasion (Fig. 7E ja Fig. 7F). Nämä tulokset viittaavat siihen, knockdovvn sykliini D1 ja Ets1 phenocopied (hallussaan samanlainen fenotyyppejä sen) miR-9 yli-ilmentyminen uudiskasvun estämiseksi, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen

in vitro

.

A, transfektointi si-CCND1 (100 nmol /l) tulee mahasyöpä SGC-7901 ja AGS solujen alensivat ilmaus sykliini D1 ja sen loppupään tavoite pRB kuin transfektoitu scramble siRNA (si-Scb, 100 nmol /l ). B, knockdown sykliini D1 tukahdutti leviämisen SGC-7901 ja AGS soluja kuin ne, jotka oli transfektoitu si-Scb. C, knockdown sykliini D1 aiheuttama solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe kuin transfektoitu si-Scb. D, transfektio si-Ets1 (100 nmol /l) mahalaukun syövän soluihin, johti vähentyneeseen ekspressioon Ets1 ja sen alavirran geenin MMP-9 kuin transfektoitu si-Scb (100 nmol /l). E, muuttoliike ominaisuuksia SGC-7901 ja AGS solut vähenivät transfektoimalla si-Ets1 kuin transfektoitu si-Scb. F, hyökkäys ominaisuuksia SGC-7901 ja AGS solut vähenivät transfektoimalla si-Ets1 kuin transfektoitu si-Scb. Symboli (*) todetaan merkittävä laskua si-Scb.

Keskustelu

On hyvin osoitettu, että miR-9 ilmaisun profiili syövän perustuu kudosjakaumasta. Vuonna ensisijainen aivokasvaimia, miR-9 on koholla ja toimii olennainen tekijä hermo karsinogeneesissä [10]. miR-9 on myös yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän [11], mikä viittaa siihen, sen kasvaimen promoottorin rooli kasvaimen kehittymisen ja etenemisen. Kuitenkin miR-9 säätyy alas useita ihmisen syövissä, mukaan lukien haimasyöpä [12], munasarjasyöpä [13] ja peräsuolen syövän [14], ja se liittyy pahanlaatuinen etenemisen rintasyövän [25] ja peräsuolen syöpä ( 14). Luo

et al.

Totesi alas-säätely miR-9 24 mahasyövässä yksilöt [15], joka vahvistettiin myöhemmin 9 [16], 72 [17], ja 13 [18] mahasyövän tapauksissa. Kuitenkin Inoue

et al.

Raportoitu säätelyä miR-9 5 mahalaukun syöpäpotilaiden reaaliaikainen PCR-pohjainen miRNA paneelit [26], ja tämä toinen havainto miR-9 mentymisprofiili voi johtua heterogeenisuus rajallinen yksilöitä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-9 on merkittävästi säädellä vähentävästi 86 ensisijainen mahasyövän yksilöitä kuin viereisen ei-neoplastisia kudoksia, mikä on sopusoinnussa aikaisempien havaintojen [15] – [18]. Mikä tärkeintä, me myös vahvistaa, että miR-9 ilmentyminen käänteisesti yhteydessä kliinisissä vaiheissa, invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Ihmisillä kypsä miR-9 koodaa kolme itsenäistä geenejä, miR-9-1, miR-9-2 ja miR-9-3, paikantaminen on kromosomeja 1, 5 ja 15, vastaavasti [27]. Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että alaspäin säädelty miR-9 ilmentyminen mahasyövän johtuu poikkeava hypermetylaatiota promoottorialueen miR-9 koodaavat geenit [17]. Vastaavasti, poikkeava hypermetylaatiota miR-9 perheen geenien on myös raportoitu joissakin primaareja kasvaimia, jossa imusolmuke etäpesäke, kuten paksusuolen syöpä, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja melanooma [14], [28]. Tärkeää on, että nykyinen tutkimus raportoi käänteinen korrelaatio miR-9 tasoa ja ilmaisu sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän kudoksissa, mikä tarkoittaa, että sykliini-D1 ja Ets1 voidaan säätelee negatiivisesti miR-9.

Toiminto ja kohdegeenien miR-9 ovat kasvainspesifisiä ja riippuvainen solujen yhteydessä. miR-9 pystyy tukahduttamaan E-kadheriinin ilmentymisen rintasyövässä [29], jolloin ydin- translokaatio β-kateniinin ja sen sitomiseksi transkriptiofaktoreiden T-solu tekijä /imukudoksen tehostajana tekijä 1, ja myöhemmin sääteli transkriptio geenit, jotka helpottavat solujen lisääntymisen ja angiogeneesin [29]. Pakko miR-9 ilmentyminen rintasyöpäsolulinjoissa myös johtaa merkittävään ilmentyminen muuttuu useiden geenien p53 liittyvät apoptoottisen reitin [30]. Suoran kohdistaminen NF-KB, ektooppinen ilmentyminen miR-9 estää

in vitro

ja

in vivo

kasvun munasarjasyöpäsoluja [31] ja kasvua ja etäpesäkkeiden melanooman [32] . Vuonna neuroblatoma, yli-ilmentyminen miR-9 estää invaasio, etäpesäke, ja angiogeneesin kasvainsolujen kohdistamalla matriksimetalloproteinaasi 14 [33]. Wan

et al.

Raportoitu, että yli-ilmentyminen miR-9 esti

in vitro

ja

in vivo

kasvun mahalaukun Adenokarsinoomasolulinja MGC803 kautta tukahduttaa NF-KB at transkription jälkeisellä tasolla [16]. Kuitenkin tuoreessa tutkimuksessa, Rotkrua

et al.

Osoitti, että miR-9 saattaa olla mukana mahasyövän kautta alaspäin säätäminen CDX2, ja knockdovvn miR-9 vähensivät

in vitro

leviämisen mahasyöpä MKN-45-soluissa [19], kun taas niiden tulokset tarvitsee edelleen vahvistettava miR-9 yli-ilmentyminen, kohdegeenin pelastus, ja

in vivo

tutkimuksissa. Lisäksi, tällä hetkellä on kiistelty siitä, CDX2 lähettää onkogeeninen tai kasvaimia estävä rooli mahasyövän [34], [35]. Lisäksi mahdolliset roolit miR-9 ja metastaasit mahasyövän ei ole selvitetty toistaiseksi. Siten toiminto ja kohdistu suoraa miR-9 mahasyövän optio lisätutkimuksia.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yli-ilmentyminen miR-9 heikennetty lisääntymistä, muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja, joka oli samanlainen kuin sykliini D1 tai Ets1 pudotus, mikä viittaa siihen, potentiaalinen sovellus miR-9 kuin tavoite terapeuttisten mahasyövän. Lisäksi tuloksemme vahvistivat, että miR-9 suunnattu suoraan sykliini D1 ja Ets1 mahasyövän soluihin 3′-UTR lusiferaasireportterilla määritys. Koska viimeaikaiset tiedot osoittavat, että tietyt miRNA voidaan vaihtoehtoisesti moduloida geeniekspressiota vuorovaikutuksessa promoottorit [36] – [38], mahdolliset roolit miR-9 säätelyssä transkription sykliini D1 ja Ets1 kautta vuorovaikutuksessa promoottorit ovat edelleen epäselviä ja ansaitsevat edelleen tutkimus. Sykliini D1 on esikasvaintekijän joka kuuluu perheeseen G

1 sykliinejä, ja sillä on tärkeä rooli solusyklin G

1 S siirtymisen sitomalla sen kumppanit sykliiniriippuvainen kinaasi 4 ja 6 fosfory- ja inaktivoida RB-proteiini [21]. Yli-ilmentyminen sykliini D1 on varhainen tapahtuma syövän syntymistä paksu-, ruokatorven ja sappirakon syöpää [39], ja on ennustetyövälineenä indikaattori liittyy huono hengissä ruokatorven, rinta, ja virtsan syövät [39]. Sykliini D1 yli-ilmentyminen ihmisen syövissä on selvitetty monin mekanismein, mukaan lukien genominen muutokset, transkription jälkeinen sääntely, ja translaation jälkeinen proteiinin stabiloimiseksi [39]. Äskettäin on osoitettu, että miR-16-1 tukahduttaa sykliini D1 ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla sitoutumisen kautta sen 3′-UTR Manttelisolulymfoomapotilailla [40]. Nykyisessä tutkimuksessa, meidän havainnot osoittivat, että miR-9 estoa solusyklin etenemistä ja solujen lisääntymistä pelastettiin palauttaminen sykliini D1 ilmentyminen mahasyövässä soluissa, mikä viittaa siihen, että tunnistaminen sykliini D1 kuin miR-9 kohdegeenin voi selittää, ainakin osittain, miksi yli-ilmentyminen miR-9 tukahdutti leviämisen mahalaukun syöpäsoluja.

Ets1, jäsen ETS perheen transkriptiotekijöiden, sitoutuu spesifisiin DNA-sekvensseihin, jotka sisältävät GGAA /T ydinmotiivin [22], ja osallistuu kasvaimen invaasion ja etäpesäkkeiden kautta transkription säätelyyn useiden geenien vastuussa soluväliaineen remodeling, muuttoliike, ja invaasio, kuten matriksimetalloproteinaasi ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori [22]. Tähän mennessä yhä useammat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet tärkeän roolin Ets1 kasvaimen kehittymistä ja etenemistä erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [23], [24].