Krooninen sairaus

tiivistelmä

arvioiminen

HER2

geenin monistaminen on olennainen osa terapeuttista päätöksenteon levinneen tai metastaattisen mahasyöpä. Yksinkertainen menetelmä on sovellettavissa pieniin formaliinikiinnitetyt, parafinoidut biopsianäytteistä on toivottavaa, koska lisänä tai korvikkeena nykyisin käytössä HER2 immunohistokemia ja in situ hybridisaatio protokollia. Tässä tutkimuksessa kehitimme mikrofluidistista-pohjainen digitaalinen PCR-menetelmän määrittämiseksi

HER2

ja kromosomi 17 sentromeerin (CEP17) kopioida numeroita ja arvioimalla kasvaimen pitoisuussuhde (TCR).

HER2 Twitter /CEP17 suhde määritetään kolme muuttujaa-TCR ja ehdoton kopio numerot

HER2

ja CEP17-tutkimalla kasvainsoluja; vain suhde kaksi jälkimmäistä voidaan saada digitaalisen PCR: llä käyttäen koko näytettä ilman puhdistamiseksi kasvainsolujen. TCR määritettiin puoliautomaattinen kuva-analyysi. Olemme kehittäneet Tumor Content kaavio, joka on tasossa suorakulmakoordinaatit koostuu

HER2

/CEP17 digitaalisen PCR tiedot ja TCR että rajataan monistettu, ei-monistettiin, ja moniselitteisiä alueilla. Soveltamalla tätä menetelmää, 44 kliinisen mahasyövän koepalojen luokiteltiin monistettiin (n = 13), ei-monistetaan (n = 25), tai epäselvät (n = 6). Vertailun vuoksi 11 näytteet olivat positiivisia, 11 olivat negatiivisia, ja 22 oli equivocally immunohistokemiallisesti. Siten meidän uusi menetelmä vähensi moniselitteisiä näytteiden 22-6, jolloin vältetään tarve vahvistuksen fluoresenssi- tai dual-anturi in situ 30%: ssa tapauksista. Kasvain sisältö taulukkoon-avusteinen digitaalinen PCR-analyysi voidaan soveltaa myös useita sivustoja kirurgisesti resekoituun kudoksissa. Nämä tulokset osoittavat, että tämä analyysi on käyttökelpoinen vaihtoehto HER2 immunohistokemia syöpien, jotka voivat toimia perustana automaattiseen arviointiin

HER2

tila.

Citation: Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-avusteinen

HER2 /

CEP17 Digital PCR-analyysi mahasyövän biopsianäytteistä. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430

Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

vastaanotettu: 07 marraskuu 2015; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2016; Julkaistu: 27 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ tehtiin osana biopankin Japanin Project (https://www.src.riken.jp/english/project/person/), joka tukee opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (https://www.mext.go.jp/english/), Japani virasto lääketieteelliseen tutkimukseen ja kehitykseen (http: //www.amed.go .jp /fi /), ja avustukset-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (KAKENHI) päässä Japanin Society for Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja kolmas johtava syöpään liittyvän kuoleman kaikkialla maailmassa [1]. Advanced tapauksissa ilman operatiivista väliintuloa on huono ennuste ja edellyttävät monitieteisiä hoitomuodot. HER2 on 185 kDa: n transmembraaninen glykoproteiini, joka on jäsen, epidermaalisen kasvutekijän reseptori perheen ja toimii tyrosiinikinaasireseptorin [2, 3]. Normaaleissa soluissa, HER2-proteiini toimii signaalin muuntimen aikana solujen lisääntymistä tai erilaistumista [4]; kuitenkin on onkogeenisiä ominaisuuksia, kun yliekspressoidaan. Tämä johtuu yleensä

HER2

geenimonistuksen, joka on raportoitu useita erilaisia ​​pahanlaatuinen kasvain [5] mukaan lukien rintasyövän [6, 7], sylkirauhasten adenokarsinooma [8], virtsarakon syöpä [9] , ja mahasyövän [10]. HER2-yliekspressoivassa syöpien osuus 8% -31% kaikista tapauksista [11-15]. Vuonna Trastutsumabi mahasyövän tutkimuksessa trastutsumabi (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi) -a humanisoitu anti-HER2 monoklonaalinen vasta-kasvatti eloonjäämisaste HER2-positiivinen mahalaukun syövistä, kun sitä annetaan yhdessä kemoterapian [16], ja oli myös hyväksytty hoitoon rintasyövistä [17, 18]. Arvioiminen HER2 tila on siis olennainen osa mahalaukun syövän hoidossa.

Jos potilaalla on leikattavissa syöpien, HER2 tila olisi tutkittava pienellä biopsianäytteestä. Kuten kuvattu uusimmat suositukset HER2 testaus rintasyövän American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American patologi (CAP), immunohistokemia (IHC) ja /tai in situ -hybridisaatio (ISH) ovat standardin arviointimenetelmiä HER2 tila [19], mutta kummallakin on omat rajoituksensa. Esimerkiksi tehokkuutta HER2-IHC vaikuttavat useat tekijät, kuten formaliini fiksaatioprosessi, ja pisteytysjärjestelmä ei ole aina toistettavia erityisesti moniselitteisiä tapauksissa jolle ISH suositellaan [19-25]. Vuonna kirkas field

HER2

dual-anturi ISH (

HER2

-DISH),

HER2

ja kromosomi 17 sentromeerin (CEP17) kopioi numeroita voidaan havaita signaaleja alla valoa mikroskooppi koko alueen näytteen. Kuitenkin, vaikka tämä menetelmä on ylivoimainen herkkyys, se on kallista ja suhteellisen aikaa vievää.

Tässä tutkimuksessa käytimme mikrofluidistiikka-pohjainen digitaalinen PCR-tekniikalla (Biomark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] määrittää

HER2 Twitter /CEP17 kopiomäärä suhde. Digitaalisessa PCR-DNA: jaetaan 770 kappaletta nanoliter reaktiokammioita, odotetun pitoisuuden 0-1 molekyylin per kammio. Kaksivärisenä kohde- ja viite geenit ovat samanaikaisesti PCR-monistettiin ja niiden kopio luvut on laskettu laskemalla kammiot positiivisia signaaleja. Tämä erittäin yksinkertaista menetelmää pystytty vertailemaan

HER2

ja CEP17 kopio numeroita käyttäen erilaisia ​​alukesarjoilla. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli vahvistaa toteutettavuus digitaalisen PCR teknologian analysointia mahasyövän biopsianäytteistä. Kuitenkin yksi ongelma tässä lähestymistavassa on se, että kudos sisältää tavallisesti ei-syöpä stroomasolujen, jotka häiritsevät molekyyli- analyysejä. Voit voittaa tämän ongelman, kehitimme kaksiulotteinen sirontakuvaajan kutsutaan Kasvaimen sisältö (TC) kaavio, joka jakaa dataa monistettu, vahvistamattoman, ja moniselitteisiä luokat. Tavoitteena oli kehittää automatisoitu keinon arvioida

HER2

tila, jossa on TC kaavio-avusteisen

HER2 Twitter /CEP17 digitaalinen PCR-analyysi toimii ensimmäisessä vaiheessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi Tokion yliopiston Institutional eettisen komitean. Kliiniset näytteet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kerättiin alla Tokion yliopiston Institutional suuntaviivat tutkimus ihmisen kudoksissa.

Kliininen mahasyövässä biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä

Yhteensä 44 mahasyövän biopsianäytteistä 32 potilasta käsitellään rutiini formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) oli saatavilla analyysiä varten. Kaikki saatiin biopsianäytteet endoskooppisesti laitoksella Endoscopy ja Endoskooppinen Surgery. Neljä kirurgisista näytteistä, jotka oli resekoitu kirurgisesti laitoksella ruuansulatuskanavan leikkauksen, analysoitiin myös. Nämä näytteet fiksoitiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Kaikki tapaukset diagnosoitiin laitoksella patologian Tokion yliopiston sairaalan. Leikattiin paksuuteen 4 um käyttäen tavanomaisia ​​histologisia tekniikoita; Näiden kerättiin objektilaseille ja käytetään hematoksyliini- eosiinilla (HE) värjäys, HER2-IHC, ja

HER2

-DISH.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin on FFPE kudokseen käyttäen Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) kanssa 4D5 anti-HER2-vasta-aine. Värjäys intensiteetti ja kalvo immunoreaktiivisuus kuvioita arvioitiin käyttäen Dako pisteytysjärjestelmää mukaan ASCO /CAP suuntaviivat [19]. Ei solukalvojen värjäytyminen pisteytettiin 0; himmeä tai tuskin havaittava /keskeneräinen solukalvojen värjäytyminen pisteytettiin 1+; epätäydellisiä ja /tai heikko /kohtalainen kehän kalvon värjäytyminen pisteytettiin 2+; ja täysin ja erittäin kehän kalvon värjäytyminen pisteytettiin 3+.

HER2-

lautasen värjäystä ja arviointia

HER2

-DISH suoritettiin FFPE kudos käyttämällä HER2 DNA lautasen kit (Roche Diagnostics) mukaan valmistajan ohjeiden ja näytteet arvioitiin valomikroskoopilla.

HER2

signaaleja esiintyi mustia pisteitä tai klustereiden ja CEP17 signaaleja esiintyi punaisina pisteinä. Kaksikymmentä ei-päällekkäistä syöpä ytimiä pisteytettiin

HER2

ja CEP17 signaaleja ja

HER2

geenin monistaminen luokiteltiin suositellut ASCO /CAP suuntaviivat [19]; positiivinen, [

HER

2 /CEP17 suhde ≥ 2,0] ja /tai [keskimäärin

HER

2 kopiomäärä ≥ 6,0 signaaleja /solu]; epäselvä, [

HER

2 /CEP17 suhde 2.0] ja [keskimäärin

HER

2 kopiomäärä ≥ 4,0 ja 6.0 signaaleja /solu]; negatiivinen, [

HER

2 /CEP17 suhde 2.0] ja [keskimäärin

HER

2 kopiomäärä 4.0 signaaleja /solu].

valmistaminen DNA FFPE kliinisestä materiaalista

Voit purkaa DNA koepalanäytteistä, 10 leikesarjojen leikattu paksuus on 10 um pantiin lasipinnan HER2 -IHC ja

HER2

-DISH. Kasvaimen sisältö vahvistettiin ennen ja jälkeen otsikointikäskyt värjäämällä viereisen diat HE. Koska yksi parafiiniblokkiin sisältää tavallisesti useita paloja biopsianäytteen, yksittäiset näytteet eristettiin käyttäen lasileikkuri. DNA: n uuttamiseksi kirurgiset resektoitiin näytteistä, 5 leikesarjojen kunkin edustavan kudoksesta-lohko leikattiin paksuuteen 10 pm, joka sijoitettiin levy valmistettu polytetrafluorieteenistä (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japani). Kalvo on kemiallinen kestävyys ksyleeni-pohjainen deparaffinization, ja on helppo leikata paloiksi. Tutkimuksessa eri osat olivat ClipArt pois arkkien mukaan HER2 profiili. Lasi tai PTFE kappaletta koottiin 2,0 ml putkeen, ja DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).

HER2

kopiomäärä arviointi digitaalisen PCR

Primer sarjaa vahvistamiseksi

HER2

ja CEP17 on esitetty taulukossa 1. Kukin aluke suunniteltiin siten, että saadut PCR-tuotteet olivat riittävän lyhyt (59 ja 65 bp) poistamiseksi vaikutusta DNA: n fragmentoituminen on FFPE prosessissa. Digitaalinen PCR suoritettiin käyttäen EP1 järjestelmä, jossa 48,770 digitaalisen array integroitu fluidiseen piiriin (Fluidigm). Jokainen siru sisälsi 48 paneelit, jotka jaettu edelleen 770 reaktio kammioihin. Positiivisten fluoresoivien signaalien kussakin paneelissa on käytetty määrittämään eri DNA-sekvenssejä. Protokolla on kuvattu muualla [26]. Lyhyesti, 4-il Reaktioseokset valmistettiin kutakin määritystä, joka sisälsi 1 x TaqMan geeniekspression master mix, 1 x HER2-FAM ja chr17cent-VIC Taqman, ja 1 x näyte lastaus reagenssia (Fluidigm). Reaktioseos jakautuu tasaisesti osaksi 770 reaktio kammiot ja digitaalisen array oli lämpö- kierrättää koskevasta EP1 System FC1 cycler. Kaksi kohdealueella oli itsenäisesti monistettiin ja 6-karboksifluoreseiinia ja VIC väriaine signaaleja kammioissa kirjattiin lopussa kunkin PCR-sykliä. Lukumäärä 6-karboksifluoreseiini-positiivinen (HER2) ja VIC-positiivinen (CEP17) kammiot kussakin paneelissa laskettiin ja

HER2 Twitter /CEP17 kopioluku laskettiin [27].

Arviointi kasvaimen sisällön suhteen (TCR) B

Koko slide kuva HE osiin, jotka olivat juuri ennen leikesarjojen DNA: n eristämiseksi, skannattiin käyttäen NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japani). Tiedot tuotiin Definiens Tissue Studio 2.0 (https://www.tissuestudio.com) määritystä varten TCR. Valittu alue kirurgisista näytteistä skannattiin käyttäen BZ-710 mikroskooppi (Keyence, Osaka, Japani). Tiedot tuotiin Hybrid Cell Count ohjelmisto (BZ-H3C, Keyence). Tiedot että yksityiskohtainen solujen määrä tuotujen kuvien ja erottaa syöpä- ei-syöpäsolujen perustuu tuman koko on luotu automaattisesti

Kokeet kehittämiseksi TC kaavioita

Solulinjat.

ohjaus kokeita, H522 keuhkosyöpä ja SK-BR-3 rintasyövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-viruksella transformoituja lymfoblastoidisolulinjassa (LCL) saatiin Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-soluja ja LCL viljeltiin Roswell Park Memorial Institute 1640 -alustaa (Nacalai Tesque, Kioto, Japani), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniliuosta ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japani), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. DNA uutettiin käyttämällä QIAquick DNA Mini Kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, ja LCL Aikasolujen valmisteltiin

HER2

-DISH arviointiin.

Stepwise sekoittumisen LCL.

Genominen DNA H522 ja SK -BR-3-soluihin ja LCL säädettiin pitoisuuteen 50 ng /ul. H522 ja LCL genomista DNA: ta sekoitettiin kahdeksassa vaiheissa seuraavassa Tilavuussuhteet: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8, ja 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 ja LCL genomista DNA: ta sekoitettiin neljässä vaiheessa seuraavassa Tilavuussuhteet: 8: 2, 6: 4, 4: 6, ja 2: 8 (SK-BR-3: LCL).

Tilastolliset analyysit

Chi-squared testejä sovellettiin verrata määrä välillä

HER2

-DISH ja digitaalisen PCR H522 ja SK-BR-3-soluissa ja LCL. Erot katsottiin olevan merkittäviä, jos

p

0.05.

Tulokset

kehittäminen TC kaavion digitaalista PCR datan

HER2 Twitter /CEP17 suhde määritettiin perustuen kolme muuttujaa: TCR ja absoluuttinen kopio määrä

HER2

ja CEP17. Vain suhteellisen suhteet kaksi jälkimmäistä voidaan saada digitaalisen PCR: llä käyttäen tuumorinäytesylinterin eristämättä yksittäisiä soluja.

HER2

/CEP17 suhde, joka on saatu digitaalisten PCR [

r

] ilmaistiin seuraavasti, joka perustuu oletukseen, että geenin kopion määrä syöpäsolujen ovat homogeenisia ja ei-syöpäsolujen ovat geneettisesti vakaa diploidi kromosomeja (kuvio 1A ja 1B) 🙁 1) missä [

r

] on suhde

HER2

jotta CEP17 saatu digitaalinen PCR (0

r

); [

x

] on TCR (0 ≤

x

≤ 1); [

] on CEP17 kopioluvun yhdessä syöpäsolun (0 ≤

); ja [

B

] on

HER2

kopiomäärä yhdessä syöpäsolun (0 ≤

B

). Tästä eteenpäin, kaksiulotteinen scatterplot edustaa Eq (1) kutsutaan TC kaavio.

(A) matemaattinen esitys korrelaatio

HER2 Twitter /CEP17 suhdeluvut saatu digitaalinen PCR [

r

] ja TCR [

x

] (ylempi). Kun [

B Twitter /

= 2], [

r

] edustaa oikealla puolella yhtälön (merkitty nuolella), ja oikean- käsi jäsen yhtälö osoittaa monotoninen kasvu. Kaavamainen malli on esitetty [

= 2] ja [

B

= 4] (alhaalla oikealla). (B) TC kaavio osoittaa Eq (1). Suhde voidaan piirtää niin suoraviivaisesti (punainen) edustaa [

r

=

x

+ 1], joka on kynnys välillä negatiivinen ja moniselitteisiä alueilla. Koska arvo [

] ylittää 2,0, linjat yhä kupera ja käyrä ylöspäin mukaan tätä yhtälöä. Lines yhtyvät koordinaatit (0,1) ja (1,2). Kliinisissä näytteissä, [

] rajoittui arvoon välillä 2 ja 8. rajaavat suora punainen viiva [

r

=

x

+ 1] (

= 2) ja violetti linja kaartuu ylöspäin [

r

= (7

x

+ 1) /(3

x

+ 1 )] (

= 8) nimettiin epäselvä alue, ja alueen yllä violetti linja nimettiin positiivinen alue.

Tässä tutkimuksessa, [

x

] määritettiin HE-värjätään yksilöitä käyttämällä kuva-analyysi ohjelmistoja, kuten Tissue Studio kuva-analyysi-ohjelmisto kudosnäytteistä ja Hybrid Cell Count ohjelmisto kirurgisista näytteistä, vastaavasti; ja [

r

] ja [

x

] määritettiin mittauksista.

Eq (1) edusti graafisesti TC kaavio, jossa [

r

] ja [

x

] kuten pysty- ja vaaka-akseleilla, vastaavasti (kuvio 1 B). Suhde [

B Twitter /

] oli viitearvon määrittämiseksi

HER2

geenimonistuman. Itse varsinainen kopioluku CEP17 [

] ja

HER2

[

B

] ei voitu määrittää tekemättä

HER2

-DISH. Kuitenkin käytännön arviointi

HER2

ja CEP17 kopioi numerot lautasen havaittu, että [

] vaihteli 2,0-6,0 (40 ja 117 CEP17 signaalien joukossa 20 syöpäsoluja S1 ja S2 taulukot) ja koskaan ylittänyt 8,0 kliinisissä mahasyövässä näytteitä. Kokemuksemme mukaan 164 peräkkäisen tapauksista mahasyövän (Ushiku T

et al

. Julkaisematon data), CEP17 kopiomäärä on 1,0-5,7, mediaani 2,5, ja monosomia, määritellään [

1.5], on melko harvinaista vain kahdessa tapauksessa (1,2%). Siten erilaisia ​​[

] asetettiin [2 ≤

≤ 8] kanssa turvamarginaali.

määritelty

HER2

vahvistus-negatiivinen [

B Twitter /

2] tai [

B

2

]. [

Bx

+ 2 (1 –

x

)] sen jälkeen ilmaistaan ​​seuraavasti: (2) B-

Molemmin puolin yhtälön (2) on jaettu [

Ax

+ 2 (1 –

x

)] 🙁 3) B

yhdistäminen kanssa yhtälöiden (1) ja (3), jolloin saatiin seuraavasti: (4) (5)

Eq (5) oli edellytys vastaa [

B Twitter /

2]. Oikea sivuosa yhtälön (5) osoitti monotoninen kasvu mukaan muuttujan [

] (2 ≤

≤ 8); sisällyttäminen [

= 2], mikä oli pienin arvo [

], osaksi Eq (5) antoi seuraavat: (6) B

Siksi kun Eq (6) oli tyytyväinen,

HER2

vahvistus-negatiivinen edellytys [

B Twitter /

2] päti mitään arvoa [

] (2 ≤

≤ 8).

Toisaalta, määritelmä

HER2

vahvistus-positiivisia oli [

B Twitter /

≥ 2] tai [

B

≥2

]. Tässä tapauksessa, [

Bx

+ 2 (1 –

x

)] oli ilmaistaan ​​seuraavasti: (7) B-

yhtälön (7) on käsitelty samalla tavalla kuten yhtälöitä (2) – (5) ja ilmaistiin seuraavasti: (8) B

Eq (8) oli edellytys vastaa [

B Twitter /

≥ 2]; oikea sivuosa yhtälön osoitti monotoninen kasvu. Sisällyttäminen [

= 8], joka oli maksimiarvo [

], osaksi Eq (8) saatiin seuraavasti: (9) B

Niinpä kun Eq (9) oli tyytyväinen,

HER2

vahvistus-positiivisten kunnossa [

B Twitter /

≥ 2] päti mitään arvoa [

] (2 ≤

≤ 8).

Kun yhtälöiden (6) ja (9) piirrettiin TC kaavion aluetta viivan yläpuolella kaartuu ylöspäin [

r

= (7

x

+ 1) /(3

x

+ 1)] (

= 8) nimettiin positiivinen alue, ja alapuolella suoran linjan [

r

=

x

+ 1] (

= 2) oli negatiivinen alueella. Alue, jota rajaavat viivat [

r

=

x

+ 1] ja [

r

= (7

x

+ 1) /(3

x

+ 1)] oli määräämättömäksi vyöhyke riippuen arvosta [

], joka nimettiin epäselvä alue ja määritellään seuraavasti (kuvio 1 B) 🙁 10)

[

x

] on 0 (joissa ei ole syöpäsoluja), kaikki rivit lähentyneet koordinaateissa (0,1), joka perustuu oletukseen, että ei-syöpäsolujen ovat genomisesti stabiileja. Kun [

x

] oli 1,0 (joka koostuu vain syöpäsoluja), linjojen läpi koordinaatit (1,2) riippumatta arvot [

] ja [

B

].

vertailu digitaalisen PCR ja

HER2

-DISH viljellyissä soluissa

validoitu teoreettinen Eq (1) ja TC kaavioon portaittain seos järjestelmä solulinjojen. EQ (1) saatiin käyttäen todellisia mitattuja arvoja [

] ja [

B

] saadaan

HER2

-DISH solulinjoissa, tai käyttämällä laskettua [

B ’

] alkaen [

] ja mitattiin [

r

].

suhteellinen kopio numerot

HER2

ja CEP17 (

HER2 Twitter /CEP17) in LCL ja H522 ja SK-BR-3cells arvioitiin

HER2

-DISH käyttäen FFPE Aikasolujen ja digitaalisilla PCR (taulukko 2).

HER2

signaaleja esiintyi erillisinä pisteitä ytimille

HER2

-DISH (kuvio 2A ja 2B);

HER2

kopiomäärä yksittäisissä soluissa oli lähes kaksi LCL ja neljä H522-soluissa. Sen sijaan, SK-BR-3-soluissa osoitti ryhmitelty

HER2

signaaleja, jotka oli vaikea erottaa yksilöllisesti (kuvio 2C); heidän määränsä mielivaltaisesti asetettu maksimiarvot 7, 14, ja 21 mukaan klusterin kokoa. Täten, alempi

HER2

/CEP17 suhde saatiin

HER2

-DISH kuin digitaalisen PCR.

(A-C) micrographs

HER2

-DISH LCL, H522, ja SK-BR-3 FFPE Aikasolujen.

HER2

signaalit näkyvät mustina pisteinä tai klustereiden ja CEP17 signaalit esitetään punaisina pisteinä.

HER2

ja CEP17 kopioida numeroita mitattuna

HER2

-DISH ja digitaaliset PCR on esitetty taulukossa 2. (EN) LCL oli genomisesti vakaa kaksi paria signaaleja, jotka vastaavat

HER2

ja CEP17, matkien ei-syöpä strooman tai tulehdussolujen. (B) In H522-soluissa, sekä

HER2

ja CEP17 signaaleja esiintynyt pisteitä ja yksittäiset signaalit olivat havaittavissa. (C) In SK-BR-3-soluissa,

HER2

signaalit muodostetaan klustereita ja tarkat mitat olivat vaikeita. CEP17 signaaleja vaihdellut 3 ja 7, joiden keskiarvo oli 83/20 = 4,15. (D, E) genominen DNA H522 ja SK-BR-3-soluja sekoitettiin LCL genomin vaiheittain ja analysoitiin digitaalisen PCR: llä. Vaaka-akseli esittää suhdetta H522 tai SK-BR-3 LCL, joka vastaa TCR-[

x

] kliinisissä tapauksissa; pystyakseli edustaa suhdetta HER2 on CEP17 digitaalisen PCR [

r

]. [

] ja [

B

] määritettiin

HER2

-DISH (taulukko 1). (D) In ​​H522, [

= 2,05] ja [

B

= 4,25], jolloin saatiin [

r

= (4,25

x

+ 2 (1 –

x

)) /(2,05

x

+ 2 (1 –

x

))] (kiinteä harmaa viiva). Piirretyt tiedot olivat arvioida teoreettisen linjan. (E) In SK-BR-3-soluissa, [

= 4,15], mutta

HER2

kopiomäärä [

B

] oli vaikea määrittää johtuen klusterin muodostumiseen .

HER2

kopiomäärä [

B ’

] ennustettiin [

B’

= 5,69 x 4,15 = 23,61] perustuu digitaaliseen PCR data [

r

] ja CEP17 kopioluvun [

]. Yhtälö [

r

= (23.61

x

+ 2 (1 –

x

)) /(4,15

x

+ 2 (1 –

x

))] edustaa kiinteä harmaa viiva. Piirretyt tiedot olivat arvioida teoreettisen linjan.

H522 ja SK-BR-3 solujen genomista DNA: ta sekoitettiin kuin LCL vaiheittain ja seokset analysoitiin digitaalisen PCR. Vuonna H522-soluissa,

HER2

[

B

] ja CEP17 [

] kopioida numeroita laskettiin

HER2

-DISH seuraavasti: [

= 41/20 = 2,05] ja [

B

= 85/20 = 4,25]. Kun arvot [

] ja [

B

] levitettiin Eq (1), tietoja voidaan kuvata viittaamalla linjan [

r

= ( 4.25

x

+ 2 (1 –

x

)) /(2,05

x

+ 2 (1 –

x

))] (Kuva 2D ). Kun kyseessä on SK-BR-3-soluissa, CEP17 kopiomäärä [

] oli [

= 83/20 = 4,15]; kuitenkin, kuten edellä on kuvattu,

HER2

signaalit kerättiin ryhmäksi, joka laski arvioitu kopioluku. Siksi soveltamalla [

= 4,15], [

r

= 5,69], ja [

x

= 1.0] Yhtälön (1), arvioitu

HER2

kopiomäärä [

B ’

] oletettiin olevan [

B’

= 5,69 x 4,15 = 23,61]. Näin ollen [

= 4,15] ja [

B ’

= 23.61] whilethe vertailulinja oli [

r

= (23.61

x

+ 2 (1 –

x

)) /(4,15

x

+ 2 (1 –

x

))] (Kuva 2E). Piirretty digitaalinen PCR tietoja SK-BR-3-solujen sekoitetaan LCL noudatettiin tätä linjaa sijaan [

r

= (19.50

x

+ 2 (1 –

x

)) /(4,15

x

+ 2 (1 –

x

))], joka perustui

HER2

-DISH tietoja, joiden [

B

= 19,50]. Nämä tulokset osoittavat pätevyyden TC kaavio-ie, että sillä on riittävästi quantitativity digitaalisen PCR erottamaan HER2-monistettu vahvistamattoman soluissa.

Concordance välillä TC kaavion digitaalista PCR ja HER2-IHC /- lautasen kliinisissä biopsianäytteissä

Mahasyöpää kudosnäytteistä (n = 44) 32 potilasta analysoitiin digitaalisen PCR.

HER2

tilan kunkin näytteen määritettiin HER2-IHC ja -DISH (kuvio 3A-3C). Arvioidut arvot olivat yhdenmukaisia ​​manuaalinen laskee tehnyt patologi (KM). TC nopeus määritettiin kuvien erottamalla ytimiä syöpä niiltä ei-syöpäsolujen (kuvio 3D).

(A-C) edustaja tapaukset näytetään HE värjäystä, HER2-IHC, ja

HER2

-DISH. (A) asia # 37: HER2-IHC pisteet = 0,

HER2

-DISH suhde = 1,09. (B) Tapaus # 6: HER2-IHC pisteet = 2+,

HER2

-DISH suhde = 2,83. (C) asia # 25: HER2-IHC pisteet = 3+,

HER2

-DISH suhde = 6,56. (D) TC laskettiin suhteen perusteella ydinten laskee koko tumallisten ja syöpäsolut, jotka olivat puoliautomaattisesti erottaa tuma koon kanssa syöpäsolujen osoittavat laajentuneen ytimet-avulla Tissue Studio kuva-analyysi-ohjelmisto.

Digital PCR tiedot ja TCR tapauskohtaisesti piirrettiin TC kaavion (kuvio 4) mukaan lukien tiedot

HER2

-DISH-positiivinen (punainen), -equivocal (violetti) ja – negatiivinen (sininen), sekä HER2-IHC-positiivinen (vinoneliöt), -equivocal (kolmiot), ja -negatiivinen (cross-merkit) näytteitä. Kliinis tietoja edustavista ja kaikista tapauksista on esitetty taulukossa 3 ja S1 Taulukko vastaavasti. Ei ollut

HER2

-DISH-positiivisia tapauksia viivan alapuolella [

r

=

x

+ 1]; kuitenkin yksi

HER2

-DISH-negatiivinen (# 32), kaksi moniselitteinen (# 8 ja # 15), ja kolme positiivista (# 1, # 41 ja # 44) tapauksessa havaittiin moniselitteisiä alueella . Lisäksi oli

HER2

-DISH-negatiivinen tapauksessa positiivisen alueen (# 33). Kolme tapausta (# 25, # 26 ja # 42) osoitti selvästi korkea digitaalinen PCR-arvot (28,25, 19,99 ja 24,00, vastaavasti). Vuonna

HER2

-DISH, nämä tapaukset osoittivat ryhmittyneet

HER2

signaalit (kuvio 3C), jotka olivat vaikea mitata, kuten SK-BR-3-soluissa. Eq (1) Myös ilmaistaan ​​seuraavasti: (11) B

Jokainen tapaus arvioitiin HER2-IHC ja digitaalinen PCR, ja sitten validoitu

HER2

-DISH (taulukko 3 ja S1 Taulukko ). Tulokset piirretään TC-kaavio. Havainnot HER2-IHC symboleilla seuraavasti; 3+ (positiivinen) kuin vinoneliöt; 2+ (epäselvä) kolmioina; 0 ~ 1 + (negatiivinen) rajat merkki. Tulokset

HER2

-DISH ovat kuvattu värejä seuraavasti; positiivinen, punainen; epäselvä, violetti; negatiivinen, sininen. Useita tapauksia otettu samasta potilaasta (Pt) on korostettu. Pystyakselilla 0,5 2,5 oli lineaarisesti tilattu ja ylempi alue oli logaritmisesti tilattu. Ei ollut positiivista tapausta (punainen vinoneliöt) kieltävä alueella, mikä osoittaa, että digitaalinen PCR voidaan seuloa negatiivisia tapauksia korkea spesifisyys. Toisaalta, tapaukset piirretty moniselitteisiä alueella eivät aina positiivinen, määritettynä CEP17 kopiomäärä. Kolme tapausta (# 25, # 26 ja # 42) osoitti selvästi huippupisteet ja klusterointi kuvio

HER2

-DISH (kuvio 3C).

Teoreettisesti arvioidun [

B Twitter /

] laskettiin soveltamalla mitattuna [

r

] ja [

x

] ja mitattiin [

], joka määritettiin laskee CEP17 signaalit saadaan

HER2

-DISH 20 syöpäsoluissa (taulukko 3 ja S1 taulukko). [

B ’

] saatiin myös mittaamalla [

r

] ja [

] ja [

x

= 1], kuten on kuvattu SK-BR-3-soluissa.

Useita tapauksia arvioitiin kahdeksan potilasta (kuvio 4 ja S1 taulukko). Kaikki tapaukset, kunkin potilaan osoitti samat tulokset lautasen ja digitaalisen PCR paitsi Potilaan 24 (Pt-24); yksi viidestä tapauksesta (# 29) oli positiivinen ja kaksi (# 30 ja # 31) olivat negatiivisia molemmat mittaukset. Kaksi tapausta negatiivisia lautasen myönnettiin positiivinen (# 33) ja moniselitteisiä (# 32) alueilla TC kaavion (taulukko 3 ja S1 taulukko).

Kaikkiaan 22 HER2-IHC tapauksissa oli pistemäärä 2+ (taulukko 4), joka käsittää kolme positiivista, 15 negatiivinen, ja neljä moniselitteinen tapauksissa perustuu TC kaavio digitaalisen PCR. Positiiviset ja negatiiviset tulokset olivat täysin yhtäpitävät niiden kanssa

HER2

-DISH. Neljästä epäselviä tapauksia IHC pisteet 2+, yksi (# 1) oli positiivinen ja muut (# 8, # 32 ja # 41) olivat negatiivisia, määritettynä

HER2

-DISH. Arvioitu [

B Twitter /

] arvo oli vastaavasti ≥ 2,0 tapauksessa # 1 ja 2.0 jälkimmäisessä kolmessa, paitsi tapauksessa # 41, arvioitu [

B Twitter /

] joista oli 2,12.

arviointi kasvaimensisäisenä HER2 heterogeenisyys vuonna kirurgisista näytteistä

kasvaimensisäisenä HER2 heterogeenisuus arvioitiin yhdistämällä HER2-IHC /-DISH ja digitaalinen PCR (kuvio 5, S1 Kuva ja S2 taulukko). Case_1, 2, ja 4 osoitti selvästi kasvaimensisäisenä heterogeenisuus koostuu HER2-IHC-positiivinen ja -negatiivinen vaurioista klusterin, kun taas Case_3 yleensä osoitti epäselvä HER2-IHC ilme kuvio. Tärkeää on, että HER2-positiiviset vauriot olivat pääsee mahalaukun in Case_1 (# 1-2, # 1-3), Case_2 (# 2-1, # 2-2), ja Case_4 (# 4-4).

(A) Neljä kirurginen resektoitiin tapausta arvioitiin kussakin edustavaa osaa yhdistelmä HE värjäys, HER2-IHC, ja -DISH. Jokainen tapaus on merkitty väreillä; Case_1, tummanvihreä; Case_2, meren sininen; Case_3, tummanpunainen; Case_4, tumma lila. Korkea suurennos näkymät HE värjäys, HER2-IHC, ja

HER2

-DISH esitetään S1 kuvassa. Alueet on valittu DNA: n eristämiseksi ovat rajattujen yhtenäisellä mustalla viivalla. Case_1, _2, ja _4 osoittavat heterogeenisuus HER2 tila. HER2-yli-ilmentymän alueita HER2-IHC yleensä vastasi

HER2

vahvistus alueilla, joilla aihekokonaisuuksien tai useita

HER2

signaaleja

HER2

-DISH. Region # 2-2 sisältää komponentteja osoittaa sekä HER2-IHC 3+ ja 0-1. Case_3 koostuu suhteellisen homogeenisen komponenttien osoittavat HER2-IHC 2+ (epäselvä) kuvio. (B) Digitaalinen PCR Tulokset piirretään TC-kaavio samalla tavalla kuin kuviossa 4. Jokainen tontti on merkitty näytteen nimi ja [

r

] arvon värin kunkin tapauksen. Pystyakselilla 0,5 2,2 oli lineaarisesti tilattu ja ylempi alue oli logaritmisesti tilattu.

Kaikki HER2-IHC /-DISH-positiivisten tapausten piirrettiin positiiviseen alueella.