Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Androgeenien vajaushoidon (ADT) on ensilinjan hoitona metastaattinen eturauhassyöpä (PCA). Kuitenkin jatkuva ilmentymistä ja toimintaa androgeenireseptorin (AR) geeni edistää etenemistä kastraation resistenttien eturauhasen syöpiä (CRPC). Lisäksi kasvaimet voivat mukauttaa PI3K /AKT selviytymisreittiin paeta ADT. Co-kohdistaminen AR ja PI3K /AKT signalointia on ehdotettu olevan tehokkaampi terapeuttinen keino CRPC potilaille. Monet kliiniset tutkimukset ovat käynnissä testata onko PI3K /AKT-inhibiittorit ovat hyödyllisiä PCa potilaille. Kuitenkin, ovatko nämä inhibiittorit mitään vaikutuksia ilmentymiä täyspitkän AR (AR-FL) ja sen silmukointivariantti (AR-V7) on edelleen epäselvä.

Methods

neljä ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, LNCaP95, VCAP ja 22Rv1) eri geneettiset taustat hoidettiin viiden PI3K /AKT estäjät (LY294002, Wortmanniini, BKM120, Akti ja AZD5363) ja tai AKT siRNA. AR: n ja AR-V7-proteiinin ja mRNA-tasot mitattiin immunoblottauksella ja reaaliaikaista PCR-määrityksissä. AR-geenin transkription aloitus-, vaihtoehtoiset Silmukointi ja AR mRNA: n hajoamisen hinnat määritettiin myös.

Tulokset

PI3K /AKT-estäjät oli useita vaikutuksia AR proteiinin ilmaisuja ensisijaisesti korjauksilla AR-geenin transkription aloitus- ja silmukointi. Nämä vaikutukset säilyivät ennallaan läsnä RNA hiljentäminen AKT geenien.

Johtopäätös

PI3K /AKT-inhibiittorit ovat off-tavoite vaikutuksia AR-geenin ilmentyminen eturauhassyövässä soluja, jotka on lueta nämä inhibiittorit PCA potilailla, erityisesti potilaita ADT hoitoa.

Citation: Liu L, Dong X (2014) Complex vaikutukset PI3K /AKT inhibiittorit ja androgeenireseptorin Gene Expression eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (10): e108780. doi: 10,1371 /journal.pone.0108780

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 03 syyskuu 2014; Julkaistu: 31 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Liu, Dong. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ sai toiminta-avustusta Kanadan Institutes of Health Research (MOP-137007) ja Rising Star palkinnon Eturauhassyöpä Kanada (RS2013- 58) Xuesenin Dong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Androgeenien vajaushoidon (ADT) on tavallinen hoito metastasoituneen eturauhassyövän (PCA). Kuitenkin eteneminen kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC) tapahtuu suurin osa potilaista [1]. CRPC kasvaimia yllä ilmaus AR ja säännelty geenejä, mikä osoittaa, että AR signalointi toiminta jatkuu [2] – [5]. Useita mekanismeja on ehdotettu poikkeavalle AR uudelleenaktivointimaksu post ADT lukien: i) AR-geenin monistaminen ja saada-of-function mutaatioiden [4], [6] – [9]; ii) muutokset ilmentymistä ja toimintaa keskeisten AR yhteistyössä sääntelyviranomaisten [10] – [12]; ja iii) tärkeintä, sukupolvi ligandisitoutumisdomeeni katkaistu AR silmukointivarianteista (AR-Vs) [13] – [16], että konstitutiivisesti aktivoi AR signalointi. Näistä variantteja, AR-V7 (kutsutaan myös AR3) on runsaimmin ilmaistaan ​​AR-V PCA [13], [14], [17]. AR-V7 proteiinin tasot ovat merkittävästi koholla CRPC kasvaimia ja tiiviisti lyhyempi elossaololuku [13], [14], [18]. Nämä havainnot korostavat, että estämällä AR-geenin ilmentymistä ja toimintaa on edelleen tärkeä terapia.

Lisäksi fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) signalointi on usein aktivoidaan PCA ja on ollut osoitetaan tärkeitä rooleja varten CRPC etenemisen ja vastus hoidon aiheuttamaa solukuolemaa [19], [20]. Geneettiset muutokset komponenttien PI3K /AKT /mTOR-reitin esiintyi 42% ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja 100% etäispesäkekasval- [19]. Vielä tärkeämpää on, vastavuoroinen palaute aktivointi AR ja PI3K /AKT reittejä oli osoittanut, joka sallii syöpäsolut sopeutua joko koulutusjakson hengissä, kun toinen on farmakologisesti estyy [21], [22]. Nämä havainnot antavat perustelut että yhteistyö kohteena sekä reittejä voidaan saavuttaa parempia tuloksia varten CRPC potilaille.

On olemassa useita estäjiä kohdistaminen eri avaintekijät PI3K /AKT-reitin kuten PI3K, AKT ja mTOR. Kuitenkin, PI3K-estäjien, kuten LY294002 on myös osoitettu sitoutuvan ja estää muita kinaaseja, jotka eivät kuulu PI3K /AKT signaloinnin [23], [24]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että kun mTOR inhiboi joitakin AKT-inhibiittoreita, se voi laukaista palautteen avulla johtaa uudelleen aktivointi AKT tai mitogeeniaktivoidun proteiinit [25], [26]. Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että yli tukahduttamaan AKT loppupään -efektiboksejamme off-tavoite vaikutukset AKT estäjien voisi tuottaa syvällisiä vaikutuksia syöpäsoluihin. Kysymys jää vastattava onko PI3K /AKT estäjät voivat muuttaa ilmentymiä täyspitkän AR (AR-FL) ja AR-V7 PCA soluissa, mikä saattaa torjua tehokkuutta ADT.

Tässä tutkimuksen neljä PC solulinjoja käsiteltiin viisi PI3K /AKT estäjiä. Mittasimme sekä AR-mRNA ja proteiini tasoilla ja määritettiin AR-geenin transkription aloitusta, Silmukointi ja AR mRNA: n hajoamisen hinnat. Me raportoitu oli olemassa monimutkainen vaikutukset PI3K /AKT-inhibiittorit AR geeniekspressiota jotka ovat riippumattomia sen AKT knockdown. Nämä off-tavoite vaikutuksia AR geeniekspression otettava huomioon sovellettaessa PI3K /AKT-inhibiittorit PCA potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Eturauhassyöpäsolulinjat, PI3K /AKT-inhibiittorit ja siRNA transfektio

LNCaP, Vcap ja 22Rv1 ihmisen eturauhassyövän solulinjaa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP-soluja 42-50 kohtia. LNCaP95 solulinja saatiin tohtori Plymate (University of Washington) ja ilmoitettiin aiemmissa tutkimuksissa [14], [27], [28]. Se on johdettu LNCaP solusta, ja se on saatu vastus androgen ehtyminen olosuhteissa. Sekä LNCaP ja LNCaP95 ilmaista mutantti AR (T877A), joka voi aktivoida AR jonka laaja steroideja tai steroideja analogeja. He myös ilmaista mutantin fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) geenin, joka konstitutiivisesti aktivoi AKT. VCAP ilmentävät villityyppistä AR ja PTEN. Mutta heillä AR-geenin monistamisen seurauksena korkeampi AR-FL ja AR-V7 ilmaisuja. 22Rv1 ilmentävät villityyppistä PTEN, mutta on geeni uudelleenjärjestelyn AR-geenin tuloksena korkea AR-V7 ilme. Yhdessä nämä neljä PCa solulinjoista edustavat monenlaisia ​​geneettisiä muutoksia Eturauhassyövän soluja. LY294002 ja Wortmanniini ostettiin Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). NVP-BKM120 ja AZD5363 olivat Selleck Chemicals (Houston, TX). Akti (CAT # 124005) oli EMD Millipore (Billerica, MA). Ohjaus ja AKT siRNA (CAT #: J-003000, J-003001 ja J-003002 varten AKT 1-3 isoformit vastaavasti) olivat Dharmacon (Ottawa, Ontario). SiRNA: t transfektoitiin PCa-soluista käyttämällä siLentFect Lipid Reagent Bio-Rad (Mississauga, ON) mukaisesti valmistajan protokollan.

immunoblottauksella määrityksissä

Protein lysaatit kerättiin lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% SDS), jota oli täydennetty proteaasi- ja fosfa- inhibiittorit Roche (Laval, QC) kuten on kuvattu [29]. Proteiinikonsentraatio määritettiin kummankin näytteen käyttäen BCA-kitti Pierce (Rockford, IL) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiini Näytteet erotettiin SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin polyvinyylifluoridista (PVDF), ja blotattiin mainituilla vasta-aineilla. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja yhdet edustavan blottien näytettiin. Vasta-aine on listattu taulukossa S1.

Reaaliaikainen PCR

Reaaliaikainen PCR määritykset suoritettiin kuten on kuvattu [30], [31]. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Purelink RNA Mini Kit Invitrogen (Burlington, ON) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen Applied Biosystems7900HT 5 ng cDNA, 1 uM kumpaakin alukeparia ja SYBR Green PCR Master Mix Roche (Laval, QC). Kaikkien reaaliaikainen PCR määritykset suoritettiin käyttäen kolmea teknistä rinnakkaisnäytteiden ja kolme itsenäistä cDNA synteesejä. Primer on listattu taulukossa S1.

Nuclear run-pitoisuusrajaan

Nuclear jälkikäynti määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [32] pienin muutoksin. LNCaP ja LNCaP95 soluja käsiteltiin 18 tunnin ajan ajoneuvon, LY294002, AZD5363 tai siRNA vastaan ​​AKT1-3 isoformeja. Täysin 6 x 10

6 solut pestiin kylmällä PBS: llä, kerättiin ja lyysattiin jäillä 0,5% Nonidet P-40 hajotuspuskuria [10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2: a] ja sentrifugoitiin 500 x g: ssä 10 min. Supernatantit poistettiin ja tumat inkuboitiin reaktiopuskurissa [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCI2, 0,3 mM KCI], joka sisälsi 2,5 mM NTP sekä biotiini-16-UTP sekoitus Roche (Laval, QC) 45 min 30 ° C: ssa. Biotinylated orastava RNA-transkriptien saostettiin streptavidiinihelmillä Gold Biotechnology (St. Louis, MO) ja pestiin natriumsitraattisuolaan puskuri plus 15% formaldehydiä. Saostunut RNA eluoitiin streptavidiinilla helmiä ja käyttää malleina reaaliaikaista PCR-analyysejä, joissa alukkeiden monistetaan mRNA yhteensä AR tai 18S rRNA (18rS), kuten on kuvattu taulukossa S1. Tulokset esitettiin graafisesti keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä toistoa kunkin koeolosuhteissa.

Silmukointi määritys AR-geenin

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Purelink RNA Mini Kit Invitrogen (Burlington, ON ). Reaaliaikainen PCR suoritettiin mitata AR-geenin Silmukointi. Suhteellinen AR-FL ja AR-V7 silmukoinnin tehokkuutta määritettiin normalisointi sisäinen PCR-tuotteen sisällä AR eksonit 2 ja 3. Primer tiedot taulukossa S1. Kaikkien reaaliaikainen PCR määritykset suoritettiin käyttäen kolmea teknistä rinnakkaisnäytteiden ja kolme itsenäistä cDNA synteesejä.

Tilastot

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Voit selvittää eroja koeryhmään, yksisuuntainen ANOVA seuraa opiskelija

t

-testi tehtiin käyttämällä GraphPad Prism (versio 4) kanssa merkitsevyystaso asetettu P 0,05 *, P 0,01 kuten ** ja P 0,001 kuin ***.

tulokset

vaikutukset PI3K /AKT-inhibiittorit AR proteiinin pitoisuudet PCa soluissa

LY294002 on vahva kilpailukykyinen estäjä että PI3K ja estää PI3K päässä fosforyloivaan ja aktivoimalla alavirtaan efektoreita AKT [33]. Wortmanniini on kovalenttinen inhibiittori PI3K että peruuttamattomasti estää AKT-fosforylaation [34]. LY294002 tukahdutettu AR-FL proteiinin tasot LNCaP (Fig. 1A), estämällä sekä AR-FL ja AR-V7 proteiinin tasot LNCaP95 soluissa (Kuva. 1 B). Sekä LNCaP ja LNCaP95 solut ovat PTEN puutteellisia soluja, jossa AKT on konstitutiivisesti aktiivinen sen fosforylaatio muodossa (p-AKT). Sekä LY294002 ja Wortmanniini esti voimakkaasti p-AKT tasot molemmissa solulinjoissa. Densitometria analyysejä proteiinin ilmentymiä AR-FL, AR-V7 ja p-AKT mitattiin (Fig. 1 C). Mielenkiintoista, sekä LY294002 ja Wortmanniini tukahdutti AR-FL ja AR-V7 proteiini ilmaisuja VCAP soluissa (kuvio. 2A). Kuitenkin LY294002 lisääntynyt AR-FL, mutta laski AR-V7 proteiinin tasot 22Rv1 soluissa (Kuva. 2B). Wortmanniini estämällä sekä AR-FL ja AR-V7 proteiini ilmaisuja VCAP ja 22Rv1 soluja. Densitometria analyysejä proteiinin ilmentymiä AR-FL ja AR-V7 analysoitiin (Fig. 2C). Koska Vcap ja 22Rv1 solut ovat PTEN riittävästi soluja, joissa p-AKT on erittäin n matalia /havaitsemattomia tasoja, ellei sen ylävirtaan tyrosiinikinaasin reseptorit aktivoituvat, vaikutukset LY294002 AR-proteiinin ilmentymistä Vcap ja 22Rv1 soluja ei todennäköisesti liittyy AKT aktivointi . BKM120 on yleiseurooppalainen PI3K estäjä, mutta ei mTOR [35]. BKM120 tehokkaasti tukahdutettu p-AKT tasoilla sekä LNCaP ja LNCaP95 soluja. Kuitenkin BKM120 ollut vaikutuksia AR-FL ja AR-V7 proteiinin tasoa kaikissa neljässä PCa solulinjoissa (Fig. 1-2). Akti on kilpailukykyinen fosfatidyyli eetteri analoginen että telakat osaksi pleckstrin homolgy (PH) verkkotunnus AKT estää AKT translokaation PI3K solukalvolle näin estää AKT-fosforylaation ja aktivaation [36]. Akti eivät osoittaneet ehkäisevästä vaikutuksia AR-FL: n tai AR-V7-proteiinin tasot (Fig. 1-2). AZD5363 on ATP-kompetitiivinen inhibiittori AKT [37], [38]. Se lisäsi sekä AR-FL ja AR-V7 proteiinin tasot ja indusoi p-AKT tasot LNCaP ja LNCaP95 soluja (Fig. 1). Kuitenkin, se laski AR-FL ja AR-V7-proteiinin tasot PTEN riittävän Vcap ja 22Rv1 solut (Fig. 2).

(A) LNCaP ja (B) LNCaP95 soluja käsiteltiin kasvavia annoksia PI3K /AKT-inhibiittoreita LY294002 (0, 25, 50 uM), Wortmanniini (0, 0,5 ja 1 uM), BKM120 (0, 0,5 ja 1 uM), Akti (0, 5 ja 10 uM) tai AZD5363 (0, 2,5 ja 5 uM ) 18 tuntia. Proteiini lysaatit immunoblotattiin AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfori-AKT (Ser473) ja β-Actin aineita. (C) Tulokset toistettiin vähintään kolmen erillisen kokeen. Densitometria-analyysi Proteiinivyöhykkeet mitattiin Image J ohjelmisto ja piirrettiin keskiarvona + SEM. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Studentin t-testi suoritettiin * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

(A) VCAP ja (B ) 22Rv1 soluja käsiteltiin kasvavia annoksia PI3K /AKT-inhibiittoreita LY294002 (0, 25, 50 uM), Wortmanniini (0, 0,5 ja 1 uM), BKM120 (0, 0,5 ja 1 uM), Akti (0, 5 ja 10 uM) tai AZD5363 (0, 2,5 ja 5 uM) 18 tuntia. Proteiini lysaatit immunoblotattiin AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, fosfori-AKT (Ser473) ja β-Actin aineita. (C) Tulokset toistettiin vähintään kolmen erillisen kokeen. Densitometria-analyysi Proteiinivyöhykkeet mitattiin Image J ohjelmisto ja piirrettiin keskiarvona + SEM. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Studentin t-testi suoritettiin * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

vaikutukset PI3K /AKT-inhibiittorit AR-mRNA-tasot PCA-soluissa

AR-mRNA-tasot mitattiin myös PCa solulinjojen hoitoja PI3K /AKT-inhibiittoreita. Muutoksia AR-FL ja AR-V7-mRNA-tasoja (Fig. 3) olivat yhdenmukaisia ​​mitä havaittiin AR proteiinin tasot on esitetty kuviossa 1 ja 2 LY294002 ja Wortmanniini laski sekä AR-FL ja AV-7-mRNA: n tasot kaikki PCa solulinjoja paitsi että LY294002 lisääntynyt AR-FL mRNA tasot 22Rv1 soluissa. BKM120 ja Akti ollut merkittäviä vaikutuksia AR mRNA. AZD5363 lisääntynyt AR-FL ja AR-V7 mRNA tasot LNCaP ja LNCaP95 soluja, mutta vähentäneet mRNA tasot VCAP ja 22Rv1 solujen tilastollista merkittävyyttä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PI3K /AKT-inhibiittorit vaikuttavat AR-geenin ilmentymistä pääasiassa mRNA-tasolla.

LNCaP, LNCaP95, Vcap ja 22Rv1 soluja käsiteltiin kasvavia annoksia PI3K /AKT-inhibiittoreita LY294002 (0, 25, 50 uM) , Wortmanin (0, 0,5 ja 1 uM), BKM120 (0, 0,5 ja 1 uM), Akti (0, 5 ja 10 uM) tai AZD5363 (0, 2,5 ja 5 uM) 18 tuntia. AR-FL (A) ja AR-V7 (B) mRNA: n ekspression tasojen suhteen 18rS määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset olivat kolmesta itsenäisestä RNA uuttoa kolmena reaaliaikainen PCR-määrityksiä kullekin RNA-näytettä. Tiedot piirrettiin keskiarvona + SEM. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Studentin t-testi suoritettiin * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

vaikutukset AKT Knockdown AR-geenin ilmaisu

tutkia tarkemmin, ovatko vaikutukset LY294002 ja AZD5363 päälle AR proteiinin ja mRNA-tasot välittyvät AKT teimme AKT pudotus joissa käytetään yhdistettyä siRNA kaikkia kolmea AKT1-3 isoformeja. Tehokkuutta AKT siRNA on osoitettu Western blottauksella (kuvio. 4A-B). Havaitsimme, että riippumatta läsnäolo AKT Knockdown, LY294002 voi silti merkittävästi vähentää AR-FL ja AR-V7 proteiinia (Fig. 4A) ja mRNA (Fig. 4C) tasot LNCaP, LNCaP95 ja VCAP soluja. LY294002 voimistunut AR-FL ilme, mutta laski AR-V7 ilmentymistä 22Rv1 soluissa. Lisäksi havaitsimme, että AZD5363 huomattavasti AR-FL ilmaisuja LNCaP ja LNCaP95 solujen ja laski AR-FL ja AR-V7 in Vcap ja 22Rv1 soluja, jotka vaikutukset pysyi muuttumattomana jopa, kun läsnä on tehokas AKT pudotus (Fig. 4B ja 4D). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että vaikutukset LY294002 ja AZD5363 AR ilmaisut olivat riippumattomia ja AKT ja sen loppupään efektoreja.

LNCaP, LNCaP95, VCAP ja 22Rv1 solut transfektoitiin kontrolli tai yhdistettyä siRNA varten AKT 1-3 isoformit 36 ​​tuntia. Sitten soluja käsiteltiin edelleen 50 uM LY294002 (A) tai 5 uM AZD5363 (B) vielä 18 tunnin ajan. Proteiini lysaatit immunoblotattiin AR (N-20), AR-V7, Pan-AKT, p-AKT (Ser473) ja β-Actin aineita. Tulokset toistettiin yli kolmen erillisen kokeen. Densitometria-analyysi Proteiinivyöhykkeet mitattiin Image J ohjelmisto ja piirrettiin keskiarvona + SEM. (C) AR-FL ja (D) AR-V7 mRNA: n ekspression tasojen suhteen 18rS määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset olivat kolmesta itsenäisestä RNA uuttoa kolmena reaaliaikainen PCR-määrityksissä kullakin RNA-näytettä ja piirretään keskiarvona + SEM. Studentin t-testit suoritettiin verrattiin välillä auton ja LY294002 /AZD5363 hoitojen * P 0,05; ** P 0,01 ja *** P 0,001.

LY294002 ja AZD5363 vaikuttaa AR-geenin transkription aloitusta, Silmukointi ja AR-mRNA vakautta

vaikutukset LY294002 ja AZD5363 on AR-mRNA-tasot voivat olla useilla mahdollisilla tasoilla kuten AR-geenin transkription aloitusta, pre-mRNA ja AR mRNA: n hajoamisen. Käyttämällä ydin- run-on määritys, mittasimme molemmat AR ja 18rS geenin transkription aloitusta hinnat läsnäollessa ajoneuvon tai PI3K /AKT estäjien (Kuva. 5A). 18rS geeni käytettiin sisäisenä kontrollina, koska sen mRNA-tasot eivät vaikuttaneet PI3K /AKT-inhibiittoreita. Osoitimme, että LY294002 estyy, kun taas AZD5363 parannettu AR-geenin transkription aloitus- hinnat suhteessa 18rS sekä LNCaP ja LNCaP95 soluja. Lisäksi kaatamalla AKT ei muuttanut AR-geenin transkriptio hinnat.

(A) LNCaP ja LNCaP95 soluja käsiteltiin ajoneuvon, 50 uM LY294002 tai 5 uM AZD5363 18 tuntia (vasemmalla). LNCaP ja LNCaP95 solut transfektoitiin myös ohjaus- tai AKT1-3 siRNA 48 tuntia (oikealla). Nuclear run-on määritykset suoritettiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät -kappaleessa. (B) LNCaP ja LNCaP95 solut transfektoitiin kontrolli tai yhdistettyä siRNA varten AKT 1-3 isoformeja 36 tuntia. Cell sitten käsiteltiin edelleen 50 gM LY294002 tai 5 uM AZD5363 vielä 18 tuntia. Silmukointi määritykset AR-FL ja AR-V7 mitattiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät -kappaleessa. (C) LNCaP ja LNCaP95 soluja esikäsiteltiin 2 uM aktinomysiini D: 2 tuntia. Soluja käsiteltiin sitten ajoneuvon, 50 uM LY294002 tai 5 uM AZD5363 0, 2, 4, 6, 8, ja 16 tuntia. AR-FL ja AR-V7 mRNA: n ekspression tasojen suhteen 18rS määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. (D) LNCaP ja LNCaP95 solut transfektoitiin kontrolli tai yhdistettyä siRNA varten AKT 1-3 isoformeja 36 tuntia. Cell esi-käsiteltiin 2 uM aktinomysiini D: ssa 2 tuntia ja sitten käsiteltiin vehikkelillä, 50 uM LY294002 tai 5 uM AZD5363 6 tuntia. AR-FL ja AR-V7 mRNA: n ekspression tasojen suhteen 18rS määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset olivat kolmesta itsenäisestä RNA uuttoa kolmena reaaliaikainen PCR-määrityksiä kullekin RNA-näytettä. Yksisuuntainen ANOVA seurasi Studentin t-testi suoritettiin * P 0,05, ** P 0,01 ja *** P 0,001.

mittaamiseksi

bona fide

vaikutukset LY294002 ja AZD5363 päälle AR-FL ja AR-V7 silmukointi, mutta jättää niiden vaikutukset AR-geenin transkription aloitusta, suunnittelimme kolme sarjaa alukkeita mitata suhteellinen liitos hinnat AR-FL ja AR-V7 . Koska AR-V7 Silmukointi on toisensa poissulkevia Silmukointi prosessi eksonin 3b ja eksonin 4 AR pre-mRNA, yksi alukejoukko kattavat eksonin 3 ja 4 yhtymäkohdassa AR-geenin mittaamiseksi AR-FL mRNA-tasoja, yksi alukejoukko kattavat eksonin 3 ja 3b AR-V7 mRNA-tasoja ja toinen alukeyhdistelmän ovat eksonit 2 ja 3 täydellistä AR mRNA-tasoja. Osoitimme, että AR-FL Silmukointi ei vaikuttanut LY294002, AZD5363 tai AKT knockdown. Kuitenkin, LY294002 dramaattisesti inhiboitui, kun taas AZD5363 lisääntynyt AR-V7 silmukoinnin LNCaP95 soluissa (kuvio. 5B). Muutokset AR-V7 liittämiseen aiheuttama LY294002 tai AZD5363 ei ole muutettu läsnäollessa AKT knockdown.

AR-FL ja AR-V7 mRNA stabiiliuksia tutkittiin myös LNCaP ja LNCaP95 soluja esikäsiteltiin aktinomysiini D (Fig. 5C). LY294002 parannettu AR-FL ja AR-V7 mRNA hajoamista LNCaP95 soluissa 16 tunnissa. AZD5363 parannettu AR-FL ja tai AR-V7 mRNA: n hajoamisen sekä LNCaP ja LNCaP95 soluja. Kuitenkin vaikutukset LY294002 ja AZD5363 päälle AR-mRNA stabiiliuksia ei vaikuttanut AKT taintumisen (Fig. 5D). Koska koko mRNA tasot AR-FL ja AR-V7 LNCaP ja LNCaP95 solut kasvoivat AZD5363 (Fig. 3), nämä tulokset osoittivat, että vaikutukset AZD5363 on AR-geenin transkription aloitusta ja Silmukointi overweighed sen vaikutukset AR mRNA hajoamista.

LY294002 ja AZD5363 vaikuttaa AR-FL ja AR-V7 transkriptionaalisen aktiivisuuden

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, korjauksilla AR-FL ja AR-V7 proteiinin tasot LY294002 ja AZD5363 vaikuttaisi AR transkription toimintaa, mittasimme ilmaisuja kahden AR-FL geenien (PSA ja OPRK1) ja yksi AR-V7 säädellä geenin (UGT2b17). Sekä LNCaP ja VCAP soluja, AR-FL agonisti R1881 kannustanut PSA ilme, mitkä toimet hiljennettiin LY294002 (Fig. 6A-B). Sitä vastoin AZD5363 vahvisti R1881 vaikutus upregulating PSA ilmaisun LNCaP, mutta vähensi R1881 toimintaa VCAP soluissa. Nämä muutokset olivat yhdenmukaisia ​​vaikutuksille LY294002 ja AZD5363 päälle AR-FL proteiinin tasot näissä soluissa. Ilmentyminen OPRK1 geenin tukahdutettiin ligandin aktivoitu AR-FL [39]. Hoito LY294002 laski AR-FL inhibitiota on OPRK1 ilmentymisen sekä LNCaP-soluja (69% suppressio alennetaan 35%) ja Vcap soluja (94% suppressio alennetaan 42%). AZD5363 vahvisti AR-FL tukahduttamaan OPRK1 ilmentymisen LNCaP-soluja (69% suppressio nousi 79%), mutta alensi AR-FL estoa OPRK1 ilmentymisen Vcap soluissa (94% suppressio alennetaan 86%). Kuitenkin molemmat vaikutukset LY294002 ja AZD5363 PSA: ja OPRK1 ilmaisuja ei muuttanut merkittävästi AKT knockdown. Tutkia AR-V7 transkriptionaalisen aktiivisuuden, mittasimme ilmentymistä UGT2b17 on Vcap ja LNCaP95 soluja, joita oli käsitelty MDV3100 estää AR-FL aktiivisuutta. Sekä VCAP ja LNCaP95 solut ilmentävät sekä AR-FL ja AR-V7. Olemme aiemmin osoittaneet, että kun läsnä on AR-FL toiminnallinen salpauksen, säätely ilmentymisen UGT2b17 määritettiin AR-V7 [27]. LY294002 inhiboi UGT2b17 ilmentymistä sekä LNCaP95 ja Vcap solut (Fig. 6C-D). AZD5363 kannustanut UGT2b17 ilmentymistä LNCaP, mutta vähensi ilmaisunsa VCAP soluissa. Nämä muutokset UGT2b17 geenien ilmentyminen oli johdonmukaista AR-V7 proteiinin tasot alle LY294002 ja AZD5363 hoitoja. Nämä vaikutukset eivät muuta AKT knockdown.

(A) LNCaP ja (B) VCAP transfektoitiin kontrolli tai AKT1-3 siRNA 48 tuntia ja käsiteltiin ajoneuvon tai 1 nM R1881. Solut myös yhteistyössä vehikkeliä, 50 uM LY294002 tai 5 uM AZD5363 18 tuntia. Reaaliaikainen PCR-määrityksissä mitataan PSA ja OPRK1 mRNA-tasoja. (C) LNCaP95 ja (D) Vcap solut transfektoitiin ohjaus- tai AKT1-3 siRNA 48 tuntia ja käsiteltiin ajoneuvon, 50 uM LY294002 tai 5 uM AZD5363, kun läsnä on 5 uM MDV3100 18 tuntia. Reaaliaikainen PCR-määrityksissä mitataan UGT2b17 mRNA-tasoja. Tulokset olivat kolmesta itsenäisestä RNA uuttoa kolmena reaaliaikainen PCR-määrityksiä kullekin RNA-näytettä. Studentin t-testit suoritettiin verrattiin välillä auton ja LY294002 /AZD5363 hoitojen * P 0,05; ** P 0,01 ja *** P 0,001.

Keskustelu

Aberrant aktivoituminen PI3K /AKT-reitin kautta joko geneettisiä tai epigeneettiset mekanismit usein esiintyy kasvaimissa, tekee tämän reitin houkutteleva terapeuttinen kohde monenlaisia ​​syöpiä. Monet inhibiittorit ovat käytettävissä estää PI3K /AKT signalointi ja jotkut ovat alle aikaisin kliinisissä kokeissa. Kuitenkin heterogeenisyys eturauhasen syöpiä on erityinen ominaisuus, joka tekee vaikea ennakoida, onko estyminen PI3K /AKT signalointi hyötyisivät PCa potilaille. Lisäksi monia mahdollisia biologisia jälkivaikutuksia PI3K /AKT esto voi heikentää entisestään mahdollisia terapeuttisia voitto. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, onko PI3K /AKT-estäjät ole off-tavoite tehosteita AR geeniekspressiota paneelissa Eturauhassyövän solulinjoja edustavat eturauhaskasvainsoluissa kanssa laajan geneettisiä variaatioita. On tärkeää dokumentoida ilmentymisen profiili AR-FL ja AR silmukointivariantit mukaisesti hoitoja PI3K /AKT-inhibiittoreita, koska jatkuva AR ilmentymistä ja toimintaa on yksi kriittinen molekyylitason mekanismeja, joilla eturauhasen kasvaimia edetä CRPC. Me kertoi, että PI3K /AKT-estäjät oli monimutkainen vaikutuksia AR geeniekspressiota, jotka olivat riippumattomia ja AKT, mikä viittaa siihen, että nämä PI3K /AKT-estäjät voivat vaikuttaa signalointi kuin PI3K /AKT-reitin PCA soluissa vireillä heidän geneettiset taustat. Nämä off-tavoite vaikutukset varoitti potentiaalinen sovellus PI3K /AKT-estäjät tiettyjen, elleivät kaikki, PCa potilasryhmissä.

Off-tavoite vaikutukset PI3K /AKT-estäjät oli hyvin dokumentoitu ja toistuvasti havaittu tässä tutkimuksessa. LY294002 ja Wortmanniini osoitettiin sitoutuvan monia muita kinaaseja, jotka eivät liity PI3K /AKT signalointi [23], [24]. Siksi ei ole yllättävää, että LY294002 ja Wortmanniini oli osoittanut hallitseva kielteisiä vaikutuksia AR geeniekspressiota jopa AKT pudotus kunnossa. Vaikka sekä BKM120 ja Aktin dramaattisesti tukahdutti AKT-fosforylaation ja aktivaation, he eivät osoittaneet mitään vaikutusta AR geeniekspressioiden kaikissa neljässä PCa solulinjoissa. Nämä tulokset sulkenut pois mahdollisuuden, että aktivointi AKT oli suoraan vastuussa muutoksista AR geeniekspressioiden. He palvelivat negatiivisina kontrolleina edelleen esittää off-tavoite vaikutukset LY294002, Wortmanniini ja AZD5363 päälle AR geeniekspressioiden. Mielenkiintoista, AZD5363 voi muuttaa AR-FL ja AR-V7 ilmaisuja vireillä kun geneettisen taustan Eturauhassyövän solulinjoissa. Kuitenkin useat todisteet kaikkialle osoitti off-tavoite vaikutukset AZD5363 AR geeniekspressiota. Ensinnäkin, vaikka LNCaP ja LNCaP95 solut ilmentävät mutantti PTEN ja konstitutiivisesti aktiivinen AKT, AZD5363 kasvatti sekä AR-FL ja AR-V7 ilmaisuja, vaikka endogeeninen AKT merkittävästi vähenevät RNA hiljentäminen (Fig. 4). Nämä tulokset osoittivat, että palaute aktivointi AKT mukaan AZD5363 ei edistänyt muutoksia AR ilmaisuja. Toinen, Vcap ja 22Rv1 solut ekspressoivat villityypin PTEN, jossa n matalia /havaitsemattomia tasoja p-AKT ilman aktivointia ylävirran tyrosiinikinaasin reseptorit (Fig. 1-2). Vaikutukset AZD5363 vähentämisessä AR-FL ja AR-V7 in VCAP ja 22Rv1 linjat siis eivät liity AKT aktivointia. Viimeisin, AZD5363 voi parantaa AR-geenin transkription aloituskohdasta (Fig. 5A), RNA: n silmukoinnin AR-V7 (kuvio. 5B), AR-FL ja AR-V7 mRNA: n hajoamisen riippumaton AKT pudotus (kuvio. 5C-D).

sekä AR ja PI3K /AKT signalointi oli osoitettu olevan tärkeä PCA soluja kehittää hoidon vastarintaa. Kehittäminen estäjien näihin signalointi tarjoaa uusia mahdollisuuksia PCa potilaille. Vastapainon näistä mahdollisuuksista on haaste Potilaansisäiset PCa solun heterogeenisyys [40]. Useita klooneja syöpäsolujen eri geneettistä taustaa toimia samanaikaisesti samalla potilaalla [41]. Siksi yksi PI3K /AKT-estäjällä voisi olla tehokas yksi populaatio syöpäsoluja, mutta mahdollisesti tarjota kasvua etuoikeus muille kautta kloonivalinnan prosessi. Co-kohdistaminen AR ja PI3K /AKT polkuja voi olla vielä haastavampaa. Vastavuoroinen aktivointi AR ja PI3K /AKT signalointi eturauhassyövissä saattaa vaikeuttaa tulosten PCa saavilla potilailla monimuotoiset hoitoja AR ja PI3K /AKT esto. Antiandrogeenit voi mahdollisesti heikentää tehokkuutta PI3K /AKT estäjiä. Päinvastoin, PI3K /AKT estäjät saattavat ehkäistä tehokkuutta antiandrogeenit. Uusimmat tutkimukset, PTEN hiiressä mallien osoitti lisäksi, että vaikka kastraatio herkkiä kasvaimia vastasi AR ja PI3K /AKT signaloinnin johdettu kastraatio vastustuskykyisten kasvainten läpikäyvät fenotyyppisiä plastisuus mikä lisää kasvaimensisäisenä heterogeenisuus ja menetys kasvaimen itsenäisyyden PI3K signalointi [42]. Aikaisemmat tutkimukset olivat osoittaneet, että kastraatio olosuhteissa indusoivat AR-geenin transkription ja Silmukointi AR-V7 [27]. Me osoitti lisäksi tässä, että inhibiittorit kuten AZD5363 voi lisätä AR-geenin transkription aloitusta ja AR-V7 Silmukointi. Co-hoito antiandrogeeni ja AZD5363 voisi mahdollisesti johtaa tehostetun AR-V7 ilmaisun ja edistää AR-V7 ajettu kasvaimia alaryhmässä Eturauhassyövän potilaista.

Yhteenvetona Meidän tutkimukset osoittivat PI3K /AKT-inhibiittorit ovat eri off-tavoite vaikutuksia AR geeniekspressioiden PCA solujen erilaisia ​​geneettisiä taustoja. Nämä tiedot tulee ottaa huomioon hoidettaessa PCa potilaita, joilla nämä inhibiittorit.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Tiedot vasta-aineiden ja alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0108780.s001

(DOCX)