Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että poikkeava aktivaatio Hedgehog (Hh) signalointia Gli transkriptiotekijät on ominaista erilaisten aggressiivisen ihmisen karsinoomien kuten munasarjasyöpä. Siksi kemoterapia-aineita, jotka estävät aktivoituminen Gli transkriptiotekijöiden ovat nousseet lupaavia uusia terapeuttisia lääkkeitä munasarjasyöpä.

Tulokset

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että aktivointi Hh-signaloinnin edistetään solumigraatiota ja invaasio, kun taas saarto Hh-signaloinnin kanssa GANT61 tukahdutetaan solumigraatiota ja hyökkäyksen munasarjasyöpäsoluja. Hoidon jälkeen GANT61, cDNA microarray analyysit paljastivat muutoksia monien geenien kuten integriini β4 alayksikön (ITGB4), polttoväli adheesiokinaasi (FAK), jne. Lisäksi ITGB4 ilmentyminen up-säännellään Sonic Hedgehog (Shh) ligandi ja alassäädetty Hh signalointi estäjä. SHH välittämä munasarjojen solumigraation ja invaasiota esti neutraloivia vasta-aineita ITGB4. Lisäksi fosforylaatiot FAK korotettiin Shh ja laski Hh signalointi estäjä. Inhibitio Gli1 ilmaisun käyttämällä siRNA jäljitteli vaikutuksia GANT61 hoidon tukemiseen spesifisyyden GANT61. Lisätutkimukset osoittivat, että aktivaatio FAK vaadittiin Shh välittämiä solun muuttoliikettä ja invaasiota. Lopulta huomasimme, että alas-säätely Gli vähensi ilmaus ITGB4 ja fosforyloidun FAK, jolloin tuumorin kasvun

in vivo

.

Johtopäätökset

hh-signalointireitin indusoi solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen kautta ITGB4 aktivaatio FAK munasarjasyövän. Tulosten perusteella näyttää, että heikentyessä ylikuulumisen välillä fosforyloidun FAK ja ITGB4 johtuen alas-säätely Gli perheen transkriptiotekijöiden voisi olla keskeinen rooli estämään munasarjasyöpä etenemisen.

Citation: Chen Q, Xu R, Zeng C, Lu Q, Huang D, Shi C, et al. (2014) Down-asetus Gli transkriptiotekijä Johtaa esto Migration ja Invasion of munasarjasyöpäsoluja kautta integriini β4 välittämän FAK Signaling. PLoS ONE 9 (2): e88386. doi: 10,1371 /journal.pone.0088386

Editor: Frédéric André, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu 16. lokakuuta 2013 Hyväksytty: 06 tammikuu 2014; Julkaistu: 12 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta China National Basic Research Program (2010CB535001), National Natural Science Foundation of China (81060095, 31171359), Specialized Research Fund tohtorikoulutuskeskukseen of Higher Education (2010360111007) ja NIH (P30 CA054174 ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yksi kaikkein vaarallisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti. Koska epäspesifisiä oireita, useimmat munasarjasyöpä tapauksia esiintyy pitkälle tauti ja liittyy korkea kuolleisuus [1]. Pitkälle edennyttä munasarjasyöpää syövän, kasvaimen solut ovat erittäin invasiivinen ja sen jälkeen syövän etäpesäkkeitä johtaa kuolemaan [2]. Vapautettu solumigraation ja invaasio myötävaikuttaa metastaattisen kyvyn kasvainsolujen ja molekyylitason mekanismi, joka säätelee etäpesäke vielä tunneta laajalti. Siksi on tärkeää tunnistaa molekyylitasolla välittäjäaineita, jotka antavat metastaattinen potentiaali munasarjasyöpäsoluja ja lopulta käyttää näitä molekyylejä biomarkkereina ennustamaan munasarjasyövän riski etenemisen [3].

Hedgehog (Hh) signalointi aloitetaan ligandin sitoutumisen nimittäin Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) tai Desert Hedgehog (Dhh) reseptoriinsa, Patched (Ptch) joka siten, vähentää estäviä vaikutuksia Ptch on Smoothenedin (Smo) [4]. Smo Sitten lokalisoitu ensisijainen cilium, organelle niillä on keskeinen rooli Hh signalointi [5] todisteet Smo aktivaatio intrasellulaarisen kaskadin cilium joka johtaa tumaansiirtymiseen of Gli2, joka on Gli perhe transkriptiotekijä [6]. Puolestaan ​​siirtämisellä Gli2 indusoi transkriptiota Hh kohdegeenien kuten Gli1, olennainen osa Hh-signaloinnin [6], [7]. Kyky Näiden Gli transkriptiotekijöiden päälle geenien tumaan voi todellakin edistää solujen lisääntymistä, solujen selviytymisen, stemness, ja solujen kohtalon määrittämiseen erilaisissa elimissä [8], [9]. Vielä tärkeämpää on, Hh-ajettu syöpien syntyä erilaisia ​​mutaatioita, jotka vaikuttavat eri komponenttien, mukaan lukien key transkription efektorit Gli proteiinit [10] – [12]. Konstitutiivisesti, Hh-Gli signalointi on hyperaktiivinen in tyvisolusyöpien medulloblastoomien ja syövät ruokatorven, koska mutaatio Patched tai Smoothenedin [13]. Lisäksi, kun läsnä on vapautettu Hh-Gli signalointi akselin havaittiin ihosyövän ja eturauhasen karsinoomien [14], [15]. Lisäksi useat raportit osoittavat, että Hh-signalointi on osallisena etäpesäkkeet munasarjojen [16], eturauhasen [17], mahan [18], ruokatorven [19] ja haiman [20], [21] karsinoomat. Yhdessä nämä havainnot tarkoita, että säätelemätön Hh signalointi korreloi vakavuudesta liittyvän kasvaimen sekä auttaa säilyttämään metastaattisen käyttäytymistä. Kuitenkin rooli Hh signaloinnin invaasiota ja etäpesäkkeiden munasarjasyövän edelleen huonosti määritelty. Lisäksi, mekanismeja, joilla Hh-signalointi edistää kasvaimen invaasion ja metastaasin on vielä selvitetty.

On olemassa monia merkkejä siitä, että Hh-signalointireitin on olennaista syöpäsolujen kasvua. Tästä syystä, inhibitio Hh-signaloinnin uusia terapeuttisia aineita on yritetty useita ihmisen syövissä, [22] – [24]. Blockade Hh-signaloinnin GDC-0449 [24], [25], syklopamiini [24], IPI-926 [23], tai Smo shRNA [26] estivät solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, ja tukahdutti kasvaimen muodostumisen. Kuitenkin useita kasvaimia, on osoitettu olevan tulenkestävä suoriin vaikutuksiin farmakologisen Hh esto Smo antagonistien johtuvat luonnollisesta tai hankittu mutaatioita Smo [27], [28] tai monistamiseen alavirtavaikuttajainhibiittorit Gli2 [29]. Nämä havainnot korostavat tarvetta tunnistaa paremmin hoitotavoitteet, joka tehokkaasti estää Hh-signalointireitin. GANT61 (Gli-antagonisti 61) tunnistettiin solusta-pohjainen näyttö inhibiittoreita Gli-välitteistä transkriptiota [29]. Äskettäin GANT61 on tunnistettu voimakas Hh-signalointireitin estäjä hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä [22], [24].

Tässä tutkimuksessa käytimme GANT61, pieni molekyyli estäjä sekä Gli1 ja Gli2 [29 ], tunnistamaan ainutlaatuinen alavirtaan tavoitteita

GLI

geenejä, jotka toimivat nimenomaan solumigraatiota ja hyökkäyksen munasarjasyöpä. Tuloksemme on saatu ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3- soluja, mikä osoittaa suurta invasiivisia käytös [30], tukea Hh signalointi edistää syöpäsoluinvaasiota kautta integriini β4 (ITGB4) -välitteisen aktivaation fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) on munasarjasyöpä. Itse kasvava näyttöä siitä, että ITGB4 on keskeinen rooli liittyvät toiminnot syöpä etenemiseen [31] – [33]. Mielenkiintoista, FAK on yhdistetty integriini-signalointireitteihin kautta vuorovaikutusta integriini liittyneet proteiinit, kuten paksilliini ja Talin [34] – [37], jossa tuloksena vaikutuksia solujen vaeltamiseen [37], [38]. Lisäksi hiiren ksenograftimalleissa ihmisen munasarjasyövän, estämällä Hh-signalointireitin voi edistää laajaa solukuolemaa ja vähentää tuumorin kasvua

in vivo

. Tulosten perusteella näyttää, että heikentyessä ylikuulumisen välillä fosforyloidun FAK ja ITGB4 johtuen alas-säätely Gli perheen transkriptiotekijöiden voisi olla keskeinen rooli eston munasarjasyöpä etenemisen.

Tulokset

Down-regulation Gli ilmaisun heikentää munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava aktivaatio Hh signalointi osallisena erilaisissa aggressiivista ihmisen karsinoomien [10], [12], [16]. Tässä tutkimuksessa, ensin tarkasteltiin vaikutuksia GANT61, erityinen estäjä Gli1 ja Gli2 [29], [39], on Hh-signalointireitin mittaamalla ilmaus Hh reseptorien (Ptch ja Smo) sekä -efektiboksejamme (Gli1 ja Gli2 ). GANT61 esti ilmentymistä transkriptiotekijä Gli1 ja Gli2 (kuviot 1A ja B). Vastaavasti, GANT61 esti ilmentymisen Ptch, joka on alavirrassa oleva kohde Gli [40]. Lisäksi, käytimme immunofluoresenssitekniikkaa tutkia vaikutuksia GANT61 ilmentymistä koskevat Gli. Immunofluoresenssilla kuva osoitti GANT61 esti ilmentymisen Gli2 (kuviot 1C ja D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että GANT61 voi estää Hh-signalointireitin.

(A) Altistuminen GANT61 (30 uM; 48 h) vähentää ilmentymistä sekä Gli1 ja Gli2 proteiinin, määritettiin Western blot. GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus. (B) ilmentäminen Sekä Gli1 ja Gli2 mRNA vähentynyt hoidon jälkeen GANT61 (30 pM; 48 h), määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. (C, D) GANT61 estää ilmentymistä Gli2 munasarjan syöpäsolujen. ES2 ja SKOV3-soluja käsiteltiin ohjattu ajoneuvo (DMSO) tai GANT61 (20 uM) 48 tunnin ajan. Sen jälkeen solut värjättiin Gli2 ja visualisoida -konfokaalimikroskoopilla. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (E, F) Blockade Hh-signaloinnin estää munasarjasyövän solujen vaeltamiseen. Konfluentteja ES2 yksisolukerrokset haavoittuneen kanssa pipetin kärjen ja käsiteltiin sitten N-Shh ehdollisen alusta plus ohjaus ajoneuvon (0,2% DMSO) tai GANT61. Solumigraation leikausalueen seurattiin mikroskoopilla. Prosenttiosuus kokonaisalasta solut arvioitiin sitten käyttäen NIH Image ohjelmaa. (G, H) Blockade Hh-signaloinnin estää munasarjasyöpäsolu hyökkäystä. SKOV3- soluja (1 x 10

5 solua /kuoppa) lisättiin ylempään kammioon. Kasvualustaa, joka sisälsi N-Shh (0,5 ug /ml) yksinään tai yhdessä GANT61 (20 uM), ohjaus ajoneuvon (0,2% DMSO) lisättiin alempaan kammioon. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut, jotka tunkeutuivat alapinta insertin värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin mikroskopialla. Edustaja kuvia kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Mittakaava, 200 um. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kokeita suoritettiin kolme kertaa. **,

P

0,01, verrattuna kontrolliryhmiin.

Seuraavaksi testasimme vaikutuksia Hh signaloinnin motiliteettia ihmisen munasarjan syöpäsolujen käyttämällä

vuonna vitro

arpeutumisprosessit määrityksessä. Kaksi ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ES2 ja SKOV3 käsiteltiin ehdollisen elatusainetta, joka sisälsi N-Shh (0,5 ug /ml) ja kontrolli välineellä. Olemme havainneet, että N-Shh merkittävästi parannettu ES2 ja SKOV3 solumigraatio (tietoja ei esitetty). Vahvista osuus Hh-signaloinnin ja motiliteettia munasarjasyöpä, solut käsiteltiin inhibiittorin Hh-signalointireitin. Ylimääräinen inkuboimalla N-Shh-käsitellyt solut kasvavilla pitoisuuksilla GANT61 päinvastaiseksi stimuloivaa vaikutusta N-Shh on soluvaelluksen ES2 soluissa, verrattuna soluihin, käsiteltiin N-Shh plus ohjaus ajoneuvon (kuviot 1E ja F), viittaa siihen, että GANT61 esti ES2 solujen vaeltamiseen. Lisäksi vaikutus Hh-signaloinnin on invasiivinen kyky munasarjasyöpäsoluja mitattiin käyttämällä Matrigel invaasiomääritys. Kyky munasarjasyöpäsoluja hyökätä matrigeelin oli merkittävästi parannettu käsittelemällä Shh (kuviot 1G ja H). Sitä vastoin Shh aiheuttama invaasiokyvyssä SKOV3- solujen väheni lähes 64% soluissa, jotka käsiteltiin myös GANT61 (kuviot 1G ja H), mikä viittaa siihen, että Hh signalointi on keskeinen rooli motiliteettia munasarjasyöpäsoluja.

inhibitio Hh-signaloinnin muuttaa geeni-ilmentymisen profiilit munasarjasyöpäsoluja

roolin tutkimiseksi Hh-signalointireitin käynnistymiseen ja etenemiseen munasarjasyövän, mittasimme geeniekspressiotasot vasteena inhibitioon Hh signalointia munasarjasyöpäsoluja käyttäen cDNA Mikrosirutekniikan. SKOV3- soluja käsiteltiin joko 20 uM GANT61 tai DMSO: a vehikkelikontrollina 60 tuntia. Sitten, vertasimme geeni-ilmentymisen profiilit GANT61 käsiteltyjen SKOV3- soluja ja DMSO-käsiteltyjen solujen Illumina® Sentrix® BeadChip taulukot. Ilmentymisen 18401 ihmisen geenien profiloitu kontrollisoluissa vehikkeliä ja käsitellyissä soluissa GANT61. Geenit, joilla on

DiffScore

alle -20 tai yli 20 (eli

P

-arvo 0,01) pidettiin differentiaalisesti ilmentyvien geenien (DEGS) aiheuttama GANT61 ajoneuvon suhteen valvontaa. Niistä 412 DEGS ainutlaatuinen SKOV3 (20 uM GANT61 60 h), 208 geenit (50,5%) oli säädelty ja 204 geenit (49,5%) oli alassäädetty (kuvio 2A). Ja lähes kaikki

DEGS

(392/412) osoitti huomattavan ilme muutos jälkeen GANT61-hoidon (kertainen muutos 2,0). Geenit merkittäviä muutoksia ilme seuraavissa GANT61 hoito luokiteltiin eri ryhmiin perustuu hyvin dokumentoitu ja vakiintuneilla biologisilla tai patologinen toiminto (kuvio 2B). Nämä DEGS vastauksena hoitoa GANT61 pääasiassa kuuluvat seuraaviin ryhmiin: fokaalisen adheesion, MAPK signalointi, solusykliä, p53 signalointi, soluväliaineen (ECM) -reseptorin vuorovaikutus, Wnt signalointia, ErbB- signalointi, Toll-like-reseptori signalointi, NOD- kuten reseptorin signalointi ja sytokiinireseptorin vuorovaikutusta. DEGS toimivat polttoväli tarttuvuutta GANT61 käsiteltyjä soluja esitetään lämpöä kartta (kuvio 2C). Tämän kartan, huomasimme, että 19 geenit merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti, joista seitsemän up-geenien ja 12 alas geenien verrattuna ohjata SKOV3- soluihin. Mielenkiintoista, jotkut DEGS havaittu fokaalisen adheesion kuten LAMC2, ITGA5, LAMA3, ITGB4, COL1A1, THBS1 ja COL5A1 löydettiin myös joukossa DEGS ECM-reseptorin vuorovaikutus. Nämä havainnot viittaavat siihen, että fokaalisen adheesion ja ECM-reseptorin vuorovaikutus cross-talk in SKOV3- soluissa hoidon jälkeen GANT61, ja ilmaisu muutos ”fokaalisen adheesion” -aiheiset geenit on tärkeä rooli vasteena GANT61-hoitoa.

(A) tunnistaminen erilaisesti ilmaisi geenien (DEGS) in GANT61 saaneilla SKOV3- soluissa. Soluja käsiteltiin GANT61 (20 uM) tai DMSO: ta 60 tunnin ajan, ja kokonais-RNA uutettiin kuten kappaleessa Menetelmät kuvatulla tavalla. Muutokset geeni-ilmentymisen määritettiin cDNA microarray-geeni profilointi käyttäen Illumina Human HT ilmaisu BeadChip V4 (Illumina Inc., San Diego, CA). Differential lausekkeet DEGS näkyvät. (B) Top 11 kanoninen signalointireitteihin vaikuttaa estämällä Gli1 /Gli2 toiminto SKOV3- soluissa. Top 11 kanoninen signalointireittejä, määräytyy IPA, jotka olivat merkitsevästi säädelty tai alas-säädellä GANT61 käsittely SKOV3- soluissa, on esitetty. 412 DEGS kartoitettiin IPA-määriteltyjen verkon. Merkittävä

P

-arvot, jotka määrittävät todennäköisyys, että assosiaatiota geenien aineisto ja kanonisen polku on sattuman laskettiin Fisherin testiä, ja ilmaistaan ​​-log (

P

-arvo). (C) Lämpö kartta DEGS polttopisteessä tarttuvuus signaali väylän GANT61 saaneilla SKOV3- soluissa. Lämpö kartta osoittaa, että 17 geenit merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti, joista seitsemän up-geenien ja 12 alas geenien, että GANT61 saaneilla verrattuna ohjata SKOV3- soluihin. (D) Valittu DEGS cDNA array geeniekspressioprofilointi analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä. SKOV3- soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai GANT61 varten ilmoitettu ajat, uutettiin kokonais-RNA for real-time PCR Menetelmät kuvatulla tavalla käyttäen alukesarjoja taulukossa 1. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kolmen määrityksen, ja GAPDH käytettiin normalisoida suhteessa mRNA-tasot.

määrittämiseksi luotettavuutta cDNA microarray geeniekspressioprofilointi käsittelyn jälkeen SKOV3- solujen GANT61, real-time PCR käyttää määrittämään ilmentymisen muutosten valitun ryhmän kuuden DEGS tunnistettu cDNA mikrosiruja. Mukana olevien geenien ja syntetisoitujen alukkeet on esitetty taulukossa 1. Reaaliaikainen PCR suoritettiin cDNA, joka on luotu käyttämällä kokonais-RNA: ta riippumatta eristetty GANT61-käsiteltyjen SKOV3- solujen 0 h, 36 h ja 60 h. GAPDH käytettiin normalisoimaan kaikki reaaliaikainen PCR-datan (kuvio 2D). Muutokset määritettiin reaaliaikaisella PCR todettiin olevan sopusoinnussa mikrosiruanalyysi, mikä validointi sen merkitystä. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että Hh-signalointireitin voi olla keskeinen rooli liikkuvuutta ja invasiivisuus munasarjasyöpä soluja.

ITGB4 välittää Shh aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion munasarjasyöpäsoluja

Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että ITGB4-FAK signalointi voisi moduloida metastaattista potentiaalia munasarjasyövän solujen hajottaa tyvikalvon esteet ja edistetään soluliikkuvuus [41] – [43]. Sen määrittämiseksi, Shh stimuloiman solumigraation ja invaasion johtui kohonneet ITGB4 proteiinia, tutkimme ilmentymistason ITGB4 käyttäen Western blot analyysi ja reaaliaikainen PCR. ITGB4 ekspressio lisääntyi jälkeen N-Shh stimulaatio, jossa tasot 3 kertaa suurempi kuin käsittelemättömien solujen havaitaan 24 tunnin kuluttua (kuviot 3A, B ja C). Sen sijaan, ITGB4 ilmentyminen väheni merkittävästi, kun läsnä on GANT61 (kuviot 3D ja E). Sen määrittämiseksi, kumoamisen ITGB4 signalointi voi tukkia Shh stimuloimaa solujen liikkuvuutta ja invaasio, me estänyt ITGB4 signalointi käyttämällä anti-ITGB4 estävää vasta-ainetta. Kuten kuviossa 3F, stimuloivan vaikutukset N-Shh solun muuttoliikettä ja invaasiota olivat täysin poistettiin anti-ITGB4 estävää vasta-ainetta, mutta ei normaalilla IgG.

(A, B) stimulointi N-Shh up-regulation ITGB4 ilme. SKOV3- soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa N-Shh (0,5 ug /ml) 24 tunnin ajan. Western blotit suoritettiin sitten mainituilla vasta-aineilla. Proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin Image J ja normalisoitiin GAPDH. (C, D) inhibitio Gli1 alas-säätelee ITGB4 ilmentymistä. SKOV3- soluja käsiteltiin GANT61 tai DMSO: ssa 48 tunnin ajan. Western blot suoritettiin sen jälkeen mainituilla vasta-aineilla. Proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin Image J ja normalisoitiin GAPDH. (E, F) piirityksen ITGB4 estää solun invaasiota in SKOV3- soluissa. SKOV3- soluja kasvatettiin matalan seerumin (2% FBS) kasvualustaan ​​ympättiin yläkammiot. Alhaisen seerumia sisältävään kasvualustaan ​​N-Shh (0,5 ug /ml) yhdessä anti-ITGB4-vasta-ainetta (0,2 ug /ml) tai kontrolli-IgG lisättiin alempaan kammioon. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut, jotka tunkeutuivat alapinta insertin värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin mikroskopialla. (G) Gli1 miRNAi estää ilmentymisen ITGB4 on SKOV3- soluissa. SKOV3- soluja transfektoitiin ohimenevästi ajoneuvon (Lipofectamine yksin), ohjaus miRNAi ja Gli1 miRNAis (miR-Gli1-720 ja miR-Gli1-1863), vastaavasti. Western blot osoitti, että Gli1 miRNAi esti ilmentymisen ITGB4 geenejä. (H) hiljentäminen Gli1 ilmaisu heikentää Shh aiheuttama munasarjasyöpäsolu hyökkäystä. SKOV3- solut transfektoitiin Gli1 miRNAi tai ohjata miRNAi ssa 24 tunnin ajan, jota seuraa stimulointi N-Shh (0,5 ug /ml) tai kontrolliväliaine vielä 24 tunnin ajan. Soluinvaasiota mitattiin Menetelmät kuvatulla tavalla. (I, J) vaimentaminen ITGB4 ilmentyminen heikentää Shh-indusoidun munasarjasyöpäsolujen hyökkäystä. SKOV3- solut transfektoitiin ITGB4 miRNAi rakentaa (miR-ITGB4-2255 ja miR-ITGB4-4027) tai kontrolli-miRNAi ssa 24 tunnin ajan, jota seuraa stimulointi N-Shh (0,5 ug /ml) tai kontrolliväliaine vielä 24 tunnin ajan. Western blot osoitti, että ITGB4 miRNAis esti ilmentymisen ITGB4 geenin (I). Soluinvaasion mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät (J). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kokeita suoritettiin kolme kertaa. **,

P

0,01, verrattuna kontrolliryhmiin.

Vahvista roolin transkriptiotekijän Gli välittämisessä ITGB4 ilmaisun, transfektoimme SKOV3- soluja miRNAi konstrukteja kohdistettu Gli1 . Immunoblottianalyysi kuvassa 3G osoitti miR-Gli1-720 ja miR-Gli1-1863, mikä vähensi ilmentymistä Gli1 mukaan 5- ja 4-kertaiseksi, merkittävästi vähentynyt ITGB4 alayksikköä ilme. Seuraavaksi arvioimme vaikutuksia suoran vaiennettu Gli1 ilmentymisen solun käyttäytymistä. Kuten kuviossa 3H, merkittävä lasku soluinvaasiota havaittiin Gli1 miRNAi käsiteltyjä soluja arvioituna solun invaasiomääritys. Lopuksi pyrittiin määrittämään, onko ITGB4 myötävaikuttaa invasiivisen fenotyypin välittyy Hh signalointi. Näitä kokeita varten, käytimme erittäin invasiivinen munasarjasyöpäsoluja SKOV3 [30]. ITGB4 ekspressio tukahdutettiin käyttäen tiettyjä miRNAi konstruktioita ja Shh stimuloiman solujen invaasiota käsiteltyjen solujen kuin kohdistaminen (miR-ohjaus) tai käsittelemättömät solut verrattiin. Menetys ITGB4 ilmaisun (kuva 3I) vähensi Shh stimuloimaa solujen invaasio SKOV3- solujen -60% verrattuna käsittelemättömään tai ei-kohdistaminen (miR-kontrolli) miRNAi-transfektoiduissa soluissa (kuvio 3J), mikä viittaa siihen, että ITGB4 on tärkeää kasvainsolun invaasiota.

Shh edistää liikkuvuutta ja invasiivisuus munasarjasyövän solujen kautta ITGB4 aktivaatio FAK signaloinnin

Valaistaan ​​molekyylitason mekanismeista Shh stimuloimaa ITGB4 vasteen solun motiliteettia ja invaasio munasarjasyöpä soluja, arvioimme FAK-proteiinin ilmentymisen ja aktivointi ITGB4 onko ne vaikuttivat Hh signalointi. Kuten on esitetty kuviossa 4A, fosforylaatio FAK (Tyr397) havaittiin merkittävästi parantaa tuloksena N-Shh stimulaatiota. Kuitenkin, huolimatta läsnä N-Shh, käsittelemällä SKOV3- solut anti-ITGB4 estävää vasta-ainetta merkittävästi vähentynyt fosforylaatio FAK (Tyr397) (kuviot 4A ja B). Lisäksi stimuloimalla SKOV3- soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa N-Shh paljasti, että ilmaus ITGB4 ja fosforylaation FAK (Tyr397) kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi fosforylaatiota FAK (Tyr397) pelkistettiin soluissa, jotka oli cotreated kanssa GANT61 verrattuna soluihin, käsiteltiin N-Shh plus ohjaus ajoneuvon (kuviot 4C, D ja F). Reprobing vasta-aineella suunnattu yhteensä FAK ei havaittu merkittäviä muutoksia proteiinien ja mRNA-tasojen (kuviot 4C, D ja E), mikä viittaa siihen, että havaittu nousu ilmaisua ei esiinny seurauksena kasvu kokonaisvahingoista FAK proteiinia, joka on yhdenmukainen tulosten kanssa, että salpaus Hh-signaloinnin vähentää ilmentymistä ITGB4 (kuviot 3D ja G). Mielenkiintoista on, että kun Hh-signalointireitin on estetty GANT61 alennettu ilmentyminen paksilliinin, joka on alavirtaan FAK [44], ei havaittu (kuvio 4C ja D). Samoin esto Hh-signaloinnin johti häiriöitä solun tukirangan organisaation munasarjasyöpäsoluja (kuvio 4G). Nämä havainnot osoittavat, että Hh signalointi on kriittinen rooli induktioon FAK fosforylaation ja tukirankaproteiinin organisaatio.

(A, B) Hh signalointi aktivoi FAK kautta ITGB4. SKOV3- soluja käsiteltiin ITGB4 vasta-aineen tai kontrolli-lgG: n läsnä tai poissa ollessa N-Shh (0,5 ug /ml) 24 tunnin ajan. Expression ja fosforylaatiota FAK (Tyr397) varmistettiin Western blot. (C-E) salpaus Gli alas-säätelee fosforylaatio tasot FAK (Tyr397), mutta ei FAK proteiinin ilmentymisen. SKOV3- soluja käsiteltiin GANT61 tai DMSO: ssa 24 tunnin ajan. Sitten Western blot suoritettiin käyttäen mainituilla vasta-aineilla. N.S., ei ole merkitystä. (F, G) tukahduttaminen Gli lauseke vähentää fosforylaation FAK (Tyr397) ja solun tukirangan organisaatioon. SKOV3- soluja käsiteltiin GANT61 48 tuntia. Sen jälkeen solut värjättiin vasta-aineella fosforylaatiota FAK (Tyr397) ja visualisoitiin käyttämällä konfokaalimikroskoopilla (F). F-aktiini värjäys, soluja inkuboitiin Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, A12379) 20 minuutin ajan ja visualisoidaan konfokaalimikroskoopilla (G). (H) menetys Gli-FAK signalointi heikentää Shh aiheuttama munasarjasyöpäsolu hyökkäystä. SKOV3- solut transfektoitiin kontrolli miRNAi tai Gli1 miRNAi (miR-Gli1-720) 24 tunnin ajan, jota seuraa stimulointi N-Shh (0,5 ug /ml) yhdessä PF573228 (5 uM), spesifinen inhibiittori FAK, tai ohjaus ajoneuvon (DMSO) vielä 24 tunnin ajan. Soluinvaasion mitattiin invaasiomääritys Menetelmät kuvatulla tavalla. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kokeita suoritettiin kolme kertaa. **,

P

0,01, verrattuna kontrolliryhmiin. Mittakaava, 20 pm.

edelleen arvioimista roolin ITGB4-FAK signalointia Shh stimuloiman solumigraatiota ja invaasio, myös esti ja pudotti FAK in SKOV3- soluissa ja analysoitiin solujen liikkuvuutta ja invaasio. Tärkeää on, lisäkäsittelyä PF573228, spesifinen inhibiittori FAK [45], täysin päinvastainen liikkuvien ja invasiivisia vaikutuksia Hh-signaloinnin on SKOV3- soluissa (kuvio 4H). Lisäksi ohimenevä ilmentyminen FAK miRNAi vähensi kykyä N-Shh edistää maahanmuuttoa ja invaasion näiden solujen verrattuna käsiteltyjen solujen ohjattu miRNAi (tuloksia ei ole esitetty). Huomattavaa on, että vähentäminen FAK ilmaisun tietyn miRNAi -konstruktio käytetään tässä osoitettiin aiemmin [46]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että Hh signalointi säätelee muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja kautta ITGB4 aktivaatio FAK signalointi.

Blockade Hh-signaloinnin estää munasarjasyövän kasvua

in vivo

arvioida mahdollisten kasvua estäviä vaikutuksia GANT61

in vivo

, me myöhemmin istutettu SKOV3- solujen sc hiiriin. Hoidon GANT61 (25 mg /kg, kolme kertaa viikossa) vähensi merkittävästi kasvainten kasvua verrattuna liuotin ohjaus (kuvio 5A). Tämä heijastui myös lopullisten kasvaimen painot 15. päivänä, mikä oli merkitsevästi pienempi GANT61 hoidetussa ryhmässä (kuvio 5B). Tutkimme myös, onko Gli voisi olla alas-säädellä tätä hoitoa. Western blot -analyysit kasvainkudosnäytteet paljasti, että hoito GANT61 todellakin alassäädetty Gli1 ja Gli2 kudoksissa (kuvio 5C ja D). Lisäksi, intensiteetti sekä ITGB4 ja fosforylaation FAK (Tyr397) väheni merkittävästi kasvaimen osissa GANT61 ryhmässä verrattuna liuotin kontrolliryhmän (kuvio 5E ja F). Tämä tulos viittaa siihen, että down-regulation of Gli vähentää ilmentymistä ITGB4 ja fosforyloitu FAK, jolloin tuumorin kasvun inhibitioon

in vivo

.

SKOV3- soluja (2 x 10

7) istutettiin sc kylkeen BALB /c nu /nu-hiirissä. Tämän jälkeen hiiret saivat joko GANT61 (25 mg /kg s.c., kolme kertaa viikossa) tai liuotinta (maissiöljy: etanoli, 04:01). Hoito aloitettiin kaikissa ryhmissä (n = 8 kussakin ryhmässä), kun keskimääräinen tuumorin tilavuus oli saavuttanut 100 mm

3. (A) Käsittely GANT61 johtanut merkittävään kasvun estäminen Ksenosiirretyn ihmisen munasarjasyövän kasvaimia. n = 8; **,

P

0,01. (B) Koe lopetettiin päivänä 15, ja kasvaimet irrotettiin. Lopullinen kasvaimen painot GANT61 hoitoryhmässä (n = 8) oli merkittävästi pienempi verrattuna leikatun kasvaimia liuotin kontrolliryhmässä (n = 8). **,

P

0,01. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (C, D) Western blot analyysit Gli1 ja Gli2 kasvainkudoksissa. Hoito GANT61 vähentynyt ilmentyminen Gli1 ja Gli2. (E, F) immunohistokemiallinen kuva kasvainkudoksen osassa. Hoidon GANT61 vähentynyt ilmentyminen ITGB4 (E). Huomattava lasku fosforylaatioon FAK (Tyr397) myös tehokkaasti saavuttaa GANT61 hoito (F). Mittakaava, 20 pm.

Keskustelu

Vaikka kriittinen rooli Hh-signaloinnin kasvainten synnyssä on korostettu [47] – [50], molekyylitason mekanismeja, joilla Hh signalointi polku välittää etäpesäke ei ole hyvin ymmärretty. Täällä raportoimme että Hh-signalointireitin edistää munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi olemme havainneet, että aktivointi Hh-signalointireitin indusoi ITGB4 ilmentyminen ja aktivointi FAK. Lopuksi osoitimme, että häiriöt ITGB4-FAK signalointi johti tukahduttamiseen Hh-välitteisen solumigraation ja invaasiota. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että Hh-signalointireitin indusoi metastaattisen toiminnot munasarjasyövän kautta ITGB4 aktivaatio FAK.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Hh signalointi on rooli valvonnassa motiliteettia useiden solutyypit [51] – [53]. Häiriöitä Hh-signaloinnin syklopamiinilla on osoitettu estävän EMT ja vähentää etäpesäkkeiden haiman syöpäsoluissa [20]. Gli yli-ilmentyminen indusoi imusuonten etäpesäkkeitä, kun taas inhibitiota Hh-signaloinnin vähentää solujen kasvua ja liikkuvuus [19]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että siirtyminen ja invaasion munasarjasyöpäsoluja indusoitiin N-Shh stimulaatiota ja estänyt kumoamalla Hh signalointia GANT61 (kuvio 1). Mielenkiintoista on, olemme myös havainneet, että aktivointi Hh-signalointireitin munasarjasyövän indusoiman ITGB4 geenin transkriptiota (kuvio 3). Lisäksi saarto ITGB4 signaloinnin jota ITGB4-estävää vasta-ainetta tekee munasarjasyöpäsoluja vastetta Shh stimuloiman muuttoliike ja invaasio, mikä viittaa siihen, että ITGB4 moduloi Hh-signalointi munasarjasyövän muuttoliikettä ja invaasiota (kuva 3). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että epänormaali aktivaatio tämän signalointi voi edistää etäpesäkkeiden erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien munasarjasyöpä, ja että inhibitio Hh-signalointireitin voivat olla käyttökelpoisia ehkäistäessä etäpesäke. On mielenkiintoista huomata, että parantamiseksi ITGB4 geenin ilmentyminen indusoitiin N-Shh stimulaatio (kuvio 3). Näin ollen, Hh signalointi on arvioitava edelleen sen määrittämiseksi, jos se vaikuttaa aktiivisuuteen ITGB4 promoottorin kautta fyysisen vuorovaikutuksen Gli proteiinin ja tietyn alueen ITGB4 promoottorin.

koottua näyttöä siitä, että integriinien voi muuttaa cellular käyttäytymistä rekrytointi ja aktivointi signalointi proteiineja, kuten ei-reseptorityrosiinikinaaseissa myös FAK ja c-Src, jotka muodostavat kaksi kinaasikompleksi [54]. FAK-Src kompleksi sitoutuu ja voi fosforyloida erilaisia ​​adaptoriproteiineja kuten p130C ja paksilliini [55]. Aktivointi FAK sekä integriini ja kasvutekijöitä on keskeisessä asemassa erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen selviytymistä, proliferaatiota, kiinnitys, muuttoliike ja invaasio [56] – [58]. Yli-ilmentyminen FAK-proteiinin on raportoitu metastaattisessa ihmisen peräsuolen syöpä, rintasyöpä, eturauhassyöpä, ja munasarjasyövän solujen [59] – [62]. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health.