Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus world– tärkein kuolinsyy peräisin peräsuolen syöpä on maksan etäpesäkkeiden, joita voidaan hoitaa yksittäisiä maksan perfuusio (IHP) . Etsiminen kaikkein kliinisesti merkittäviä lähestymistapoja hoitoon peräsuolen etäpesäkkeitä isoloituna maksan perfuusion (IHP), kehitimme soveltamisessa oksaliplatiinin samanaikaisesti hypertermian ja humanisoitu kuoleman reseptori 4 (DR4) vasta-mapatumumab (Kartta), ja tutki molekyylitason mekanismeja tämän multimodaalisuus hoito ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa CX-1 ja HCT116 sekä ihmisen paksusuolen syövän kantasoluja Tu-12, Tu-21 ja Tu-22. Osoitimme täällä, tässä tutkimuksessa, että synergistinen vaikutus multimodaalisuutta hoidon aiheuttaman apoptoosin oli kaspaasi riippuvainen ja aktivoidaan kuoleman signalointi kautta sekä ulkoista apoptoottisen reitin ja sisäisen reaktiotien. Death signalointi aktivoitiin c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) signalointi, joka johti Bcl-x L fosforylaatio seriinillä 62, vähentämällä anti-apoptoottista aktiivisuutta Bcl-xL, mikä osaltaan luontainen polku. Vaimennussäätely solun FLICE estävän proteiinin pitkä isoformin (c-FLIP

L) ulkoisessa hyytymistiessä toteutettiin läpi ubikinaa- at lysiinitähteeksi (K) 195 ja inhibition. Yliekspressio c-FLIP

L mutantti (K195R) ja Bcl-xL mutantti (S62A) kumosi kokonaan synergiavaikutuksesta. Onnistumista Tutkimuksen tukee soveltamista multimodaalisuutta strategian potilaille, joilla on peräsuolen maksametastaaseja jotka eivät reagoi standardiin kemosädehoito että pääasiassa kohdistettu mitokondrioiden apoptoottisen reitin.

Citation: Song X, Kim SY, Lee YJ ( 2013) Evidence for Two Vaadittavat synergistinen Apoptoosin indusointi Mapatumumab ja Oksaliplatiini yhdistelmähoidossa hypertermia Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (8): e73654. doi: 10,1371 /journal.pone.0073654

Editor: Raffaele Calogero, University of Torino, Italia

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2013; Julkaistu: 27 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat seuraavat avustuksen: NCI apuraharahastoon (CA140554). Tämä projekti käytti UPCI Core Facility ja tuettiin osittain palkinnon P30CA047904. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä, joka aiheuttaa noin 10% syöpäkuolemista Yhdysvalloissa, on kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden maailmassa; kuolema johtuu usein hallitsematon etäpesäkkeitä. Valitettavasti vain 10-15% alkuperäisestä peräsuolen maksametastaaseista katsotaan kokoisen [1,2]. Leikkaushoitoon tapauksissa maksan etäpesäkkeitä voidaan hoitaa yksittäisiä maksan perfuusio (IHP), johon liittyy menetelmään täydellisen verisuonten eristäminen maksan jotta multimodaalisuus hoitoon maksakasvainten [3-6].

Mapatumumab (Kartta) on täysin ihmisperäinen IgG1 agonistista monoklonaalinen vasta-aine, joka yksinomaan suunnattu ja aktivoi kuoleman reseptori 4 (DR4) korkea spesifisyys ja affiniteetti [7-9]. Lyhyesti, Kartta sitoutuu solun pinnan DR4: n ja laukaisee ulkoista apoptoottisen reitin, pääasiassa aktivointi pro-apoptoottisten initiaattoria kaspaasi-8. Kuitenkin vaiheen II kokeissa ilmeni vähän tai ei lainkaan kliinisiä aktiivisuutta yhden aineen Mapa potilailla, joilla on edennyt tulenkestävä peräsuolen syöpä tai ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10,11]. Useita mahdollisia molekyylitason mekanismeja on ehdotettu, mukaan lukien mutaation /vikoja syöttämällä reseptoreihin, kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin, capsases, proapoptoottiset proteiineja tai yliekspressio anti-apoptoottisten molekyylien [12-14]. Näin ollen on olemassa jatkuva ja merkittävä tarve kehittää sovelletaan strategioita lisätä Kartta tehoa.

Hyperthermia, hoitoon käytetään usein eristetty maksan perfuusio (IHP), maksimoi kasvaimen vahinkoa samalla kun säilytetään ympäröivän normaalin kudoksen [5, 6,15]. Oksaliplatiini, yleisesti käytetty kemoterapeuttinen aine paksusuolen syöpä, uskotaan laukaista solukuolema pääasiassa indusoimalla platina-DNA-additiotuote [3,16-18]. Olemme aikaisemmin kehittäneet multimodaalisuutta hoitoon käytetään oksaliplatiini esikäsittely yhdistettynä Kartta ja hypertermian hoitoon ihmisen paksusuolen syövän [19]. Kuitenkin IHP tuottaa suuria annoksia kemoterapiaa tai biologinen hoito alueellisesti vaatii standardin operatiivinen tekniikka, jatkuva intraoperatiiviseen vuotaa seuranta ja ulkoinen veno- veno ohituskierto [20]. Näin oksaliplatiinia esikäsittely ei ole saavutettavissa menettely IHP klinikoilla, ja kaikki osat multimodaalisuutta menettelyn tarvitse suorittaa samanaikaisesti.

Tässä tutkimuksessa tutkimme terapeuttista potentiaalia kliinisesti merkittäviä multimodaalisuutta hoitoaikataulun oksaliplatiini ja hypertermia yhdistettynä Kartta ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa ja paksusuolen syövän kantasoluja. Me raportoimme tässä, että multimodaalisuus hoito voi herkistää ihmisen paksusuolen syövän soluja Kartta aiheuttaman apoptoosin useiden molekyylitason toimintamekanismit kautta sekä luontaisen apoptoottisen reitin ja ulkoinen tie.

Materiaalit ja menetelmät

soluviljelmissä

Human kolorektaalisyöpää CX-1-soluja, jotka oli saatu Dr. JM Jessup (National Institutes of Health) [21], viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (Gibco BRL), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (HyClone). Ihmisen kolorektaalisen HCT116 solulinjat toimitti ystävällisesti Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins University) viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Gibco-BRL), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia [22]. Ihmisen paksusuolen syövän kantasoluja, Tu-22, TU-12- ja Tu-21 [23], määritettiin Dr. E. Lagasse (University of Pittsburgh) ja viljeltiin DMEM /F12-väliaineessa (Gibco BRL), joka sisälsi 0,5% naudan sikiön seerumia (HyClone), ja 1% insuliinia, transferriiniä, ja seleeni (ITS, Fisher Scientific). Kaikki soluja pidettiin 37 ° C kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

reagenssit ja vasta

Oksaliplatiini, MG132, sykloheksimi- (CHX) ja proteaasiestäjäseostabletit saatiin Sigma Chemical Co. Mapatumumab (Kartta) oli Human Genome Sciences (Rockville, MD, USA). JNK-estäjä (SP6001125) ja G418 olivat Calbiochemistä. Anti-Flag, anti-kaspaasi 8, anti-kaspaasi 9, anti-kaspaasi 3, antiubikitiinivasta-, anti-PARP, anti-fosforyloitu JNK /JNK ja anti-Bcl-x L-vasta olivat Cell Signaling. Anti-p-Bcl-x (S62) vasta-aine oli Chemiconilta /Millipore. Anti-FLIP-vasta-aine (NF6) oli Enzo Life Sciences. Anti-aktiini-vasta-aine oli Santa Cruz.

Hoito

Solut altistettiin lämmönnousua (42

° C) läsnä ollessa /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin 1 h, ja sitten inkuboidaan 37 ° C

° C: ssa 3 h tai 23 h. Sillä hypertermia, solut suljettiin parafilmillä ja asetettiin kiertovesihaudetta (Thomas Scientific), jota pidettiin 0,02

° C halutun lämpötilan.

Transient transfektion ja vakaa transfektio

ohimenevän transfektion jälkeen solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ja käsiteltiin 48 h transfektion jälkeen. Stabiilia transfektiota solut stabiilisti yli-ilmentävät HA-Bcl-xL: n villityypin (WT) tai mutantti-tyyppejä valmistettiin transfektoimalla CX-1-solujen HA-Bcl-x L-WT, HA-Bcl-x L-S62A (Ser62Ala), ja HA-Bcl-x L-S62D (Ser62Asp) ja pidettiin 500 ug /ml G418: aa. CX-1-Bcl-x L S62A-solut transfektoitiin Plenti-Flag-FLIP

L ja stabiileja klooneja valitaan blastisidiini (10 ug /ml). Altaat 3 klooneja käytettiin kokeessa.

MTS [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H- tetratsolium, MTS] määritykset

MTS tutkimuksia tehtiin käyttäen Promega CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega). CX-1-soluja kasvatettiin kudoksessa kulttuuritulkkien päällystetty 96-kuoppalevyille ja käsitelty, kuten on kuvattu tulokset. Soluja käsiteltiin sitten MTS /fenatsiinimetosulfaatti liuoksella 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi 490 nm: ssä määritettiin käyttäen entsyymi-immunologinen määritys levylukijalla.

anneksiini V: n sitoutumisen

Soluja kuumennettiin puuttuessa tai läsnä Kartta ja kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin serum- elatusaineella ja suspendoitiin sitomispuskuriin (anneksiini V-FITC: Värjäys Kit, PharMingen). Tämä solususpensio värjättiin hiiren anti-ihmis-anneksiini V-vasta-aineen ja PI ja välittömästi analysoitiin virtaussytometrialla.

Quantitative käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi

Kokonais-RNA uutetaan ja puhdistetaan viljellyistä soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin määrittämällä absorbanssi 260 nm: ssä. Kaksi ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä, tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Inc.) tilavuudessa 20 ui. Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen Applied Biosystems kartoitettujen TaqMan määritykset (20X Primer Probe mix), joka vastaa CASP8 ja FADD-like apoptoosin säätimen (CFLAR; määritys ID Hs00153439_m1) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH; määritys ID Hs02758991_g1 ). Kaikki reaktiot suoritettiin 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR System standardimenetelmien mukaisesti.

Immunosaostaminen

Lyhyesti, soluja lyysattiin CHAPS lyysipuskuria kanssa proteaasiestäjäseostabletit (Calbiochem). 0,5-1 mg lysaattia inkuboitiin 1,5 ug anti-Flag /ubikitiinipromoottori vasta-ainetta tai kaniinin IgG: tä (Santa Cruz) 4

° C: ssa yön yli, minkä jälkeen lisättiin proteiini A-agaroosi-helmiä (Santa Cruz) ja kierto huoneen lämpötilassa 2 h, mitä seurasi immunoblot-analyysillä.

immunoblot-analyysi

Solut lyysattiin Laemmli-hajotuspuskuria, ja keitettiin 10 min. Proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA), erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvolle. Nitroselluloosakalvolle blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS-Tween-20 (0,1% v /v) 1 h ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Piparjuuriperoksidaasi konjugoitu anti-kani tai anti-hiiri-lgG: tä käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Immunoreaktiivinen proteiini visualisoitiin kemiluminesenssi-protokollan (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Tiheydet nauhat analysoitiin käyttäen Gel-Pro sovellus Media Cybernetics. Osa Länsi blotit samassa levyjä ei valmisteta samasta pyyhkii ja riisuttiin ja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta normalisoimaan erojen Proteiinilisäyksen tasapuolisen Proteiinilisäyksen.

[

35S ] metioniini sisällyttäminen analyysi

Soluja käsiteltiin alustalla, joka sisälsi 4 pCi [

35S] -L-metioniinia ja altistettiin hypertermia (42

° C) läsnä ollessa /poissa ollessa oksaliplatiinin (10 ug /ml) 1 tunnin ajan, ja sitten inkuboitiin 37 ° C

° C: ssa 3 h. Solut solubilisoitiin 1 ml: aan 0,25 N NaOH: a ja täysin hajotettiin pipetoimalla varovasti. [

35S] metioniinin inkorporaatio analysoitiin Wallac 1409 Liquid Scintillation Counter (PerkinElmer, MA, USA). [

35S] -L-metioniinin tasot laskettiin normalisoimalla [

35S] -L-metioniini cpm korjattuna epäspesifisen taustan, että kokonaisproteiinin tasossa.

sivusto- mutageneesillä

Lys 106 Arg (K106R) ja K195R mutaatioita plasmidi pCR3.V64-Met-Flag-FLIP

L, joka oli lahja Dr. Jurg Tschopp (University of Lausanne), vietiin c-FLIP

L-geeniä käyttäen täysin toisiaan mutageenisiä alukkeita (QuickChange mutageneesillä Kitin Agilent Technologies). Seuraavat mutagenoidulla oligonukleotidejä käytettiin: sense 5′-GAGATTGGTGAGGATTTGGATAGATCTG-ATGTGTCCTCATTAAT-3 ’ja antisense 5′-ATTAATGAGGACACATCAGATCTAT-CCAAATCCTCACCAATCTC-3′ ja K106R-mutantti, sense-5’-CAAGCAGCAATCCA-AAAGAGTCTCAGGGATCCTTCAAAT-3 ’ja antisense 5’-ATTTGAAGGATCCCTGAG-ACTCTTTTGGATTGCTGCTTG -3 ’varten K195R mutantti. Mutantit vahvistettiin sekvenssianalyysillä.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Graphpad InStat 3 ohjelmisto (GraphPad Software). Data näytetään vertailu kahden ryhmän välillä arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Vertailut joukossa enemmän kuin kaksi ryhmää tehtiin käyttäen ANOVA asianmukaiset post hoc testaus. Tilastollinen merkitys on merkitty tähdellä (*, p 0,05 ja **, p 0,01).

Tulokset

multimodaalisuus hoitoon oksaliplatiini /Kartta /lämmönnousua aktivoi sekä sisäiseen ja ulkoiseen reittejä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa

tässä tutkimuksessa olemme yrittäneet kehittää kliinisesti merkittävää multimodaalisuutta hoito ja peräsuolen metastaattinen sairaus, joka voidaan hoitaa IHP. Käytetyt solulinjat ovat: paksu- ja metastaattinen HCT116 ja CX-1-soluissa, ja ihmisen paksusuolen syövän kantasoluja, Tu-12, Tu-21 ja Tu-22, jotka perustettiin tohtori E. Lagasse (University of Pittsburgh) maksasta metastasoituneen paksusuolen syöpäpotilaiden ja viljellyt sisällä kohdat 10-30. [23] Syövän kantasoluja (CSC) pystyvät itse uusia, ovat tuumorigeenisiä, ja kykenevät tuottamaan heterogeenisen suvusta syövän solut, jotka käsittävät kasvaimen. CSC ei pitäisi vain olla sidoksissa kasvaimen aloittamista ja kasvua, mutta on todennäköisesti vastuussa etäpesäke sekä [24,25]. Tutkia vaikutusta multimodaalisuutta hoitoon oksaliplatiinin /Kartta /hypertermia-indusoidun sytotoksisuuden, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Kuten kuviossa 1A ja 1B, synergistinen vaikutus havaittiin oksaliplatiini /Kartta /lämmönnousua verrattuna muihin kertahoitona tai bi-hoitoa molemmissa solulinjoissa (P 0,01). Kuvio 1C osoittaa selvästi, että synergistinen induktio apoptoottisen kuoleman aikana tapahtui oksaliplatiinihoidon /Mapa /lämmönnousua. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin ihmisen paksusuolen syövän kantasoluja Tu-12, Tu-21 ja Tu-22 (kuvio 1 F). Nämä synergistiset vaikutukset johtuivat kasvuun kaspaasien aktivaatio (kuvio 1 D). Kuviossa 1D on esitetty, että 100 ng /ml Kartta johti pieneen määrään kaspaasi 8 ja 3 aktivointi ja siten PARP pilkkominen (tunnusmerkki ominaisuus apoptoosin). Mielenkiintoista, hypertermia edistänyt kaspaasi 8, kun taas oksaliplatiini edistänyt kaspaasi 9 aktivointi. Lisäksi synergistinen vaikutus multimodaalisuutta hoito esti Z-IETD-FMK (kaspaasi 8-estäjä), Z-LEHD-FMK (kaspaasi 9 estäjä), ja Z-DEVD-FMK (kaspaasi 3 estäjä) molemmissa solulinjoissa ( kuvio 1E), mikä osoittaa, että molemmat reitit on ollut tärkeä rooli synergistinen vaikutus multimodaalisuutta hoidon.

(A, B) CX-1 ja HCT116-soluja altistettiin normothermic tai hypertermistä (42 ° C) olosuhteissa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin ja inkuboidaan sitten 23 tuntia 37 ° C: n läsnä ollessa /poissa ollessa Mapa ja oksaliplatiinin. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS-määrityksellä. Virhepalkit edustavat SD kolminkertaisista kokeista. Tähdellä ** tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (P 0,01). (C) CX-1-soluja altistettiin hypertermia (42 ° C) 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin ja sitten inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin. Käsittelyn jälkeen solut värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -Annexin V ja propidiumjodidilla (PI). Apoptoosi havaittiin virtaussytometrianalyysissä määrityksessä. (D) hoidon jälkeen, lohkaisu kaspaasin 8, kaspaasi 9, kaspaasi 3: n tai PARP havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä paljon proteiineja ladataan kuhunkin kaistaan. (E) CX-1 ja HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 20 uM Z-IETD-FMK (kaspaasi 8-estäjä), Z-LEHD-FMK (kaspaasi-9-estäjä), ja Z-DEVD-FMK (kaspaasi 3: n estäjä) ja μmin seurasi oksaliplatiini /Kartta /hypertermian ja lohkaisu PARP havaittiin immunoblottauksella. (F) Ihmisen paksusuolen syövän kantasoluja, Tu-12, Tu-21 ja Tu-22, altistettiin normothermic tai hypertermistä (42 ° C) olosuhteissa 1 tunnin ajan, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiiniannoksella ilmoitetun pitoisuuden ja inkuboidaan 23 tuntia 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin. PARP havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

annosvasteet oksaliplatiinin ja hypertermia on Mapa indusoiman apoptoosin

Havaitsimme, että koska annokset Kartta ja oksaliplatiinin lisääntynyt, kaspaasi 8/9 /3 aktivointi ja PARP pilkkominen parannettiin, mikä osoittaa, että synergistinen vaikutus multimodaalisuutta hoidon indusoiman apoptoosin oli annoksesta riippuvainen (kuvio 2A). Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että sekä ulkoisen ja sisäisen apoptoottisia reittejä olivat mukana synergistinen vaikutus multimodaalisuutta hoitoa. Vastaavia tietoja saatiin HCT116-soluissa (kuvio 2B).

(A) CX-1 ja (B) HCT116-soluja altistettiin hypertermia (42 ° C) 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin. Käsittelyn jälkeen, lohkaisu kaspaasin 8, kaspaasi 9, kaspaasi 3: n tai PARP havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä paljon proteiineja ladataan kuhunkin kaistaan. (C) CX-1-soluja altistettiin hypertermia (42 ° C) 1 h, kun läsnä /poissa ollessa 100 ng /ml Kartta ja 10 ug /ml oksaliplatiinin ja sitten inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa, kun läsnä /puuttuminen Mapa ja oksaliplatiinin. Käsittelyn jälkeen solut immunoblotattiin anti-fosfo-JNK /JNK, anti-fosfo-Bcl-xL /Bcl-xL: n ja anti-FLIP-vasta-aineita. (D) CX-1-soluja altistettiin hypertermia (42 ° C) 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta (100 ng /ml-1000 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml-100 ng /ml) ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin. Hoidon jälkeen fosfori-JNK /JNK, fosfori-Bcl-xL /Bcl-x L ja FLIP

L havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä paljon proteiineja ladataan kuhunkin kaistaan. (E) HCT116-soluja altistettiin hypertermia (42 ° C) 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta (10 ng /ml-100 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml-100 ng /ml), ja sitten inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin. Hoidon jälkeen fosfori-JNK /JNK, fosfori-Bcl-xL /Bcl-x L ja FLIP

L havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä paljon proteiineja ladattu kuhunkin kaistaan.

Multimodaalisuus hoidon aiheuttaman JNK aktivointi, Bcl-fosforylaation ja vähentäminen c-FLIP

L tasolla

edelleen ymmärtää mekanismeja miten ulkoisen ja sisäisen reittejä olivat mukana multimodaalisuus hoidossa aiheuttaman apoptoosin, tutkimme Bcl-xL sekä c-FLIP. Kuvio 2C esittää, että ei ollut mitään muutosta määrä Bcl-x L-proteiinia, mutta Bcl-xL: n kasvanut dramaattisesti, mukana JNK fosforylaation. Lisäksi taso c-FLIP

L vähenivät huomattavasti multimodaalisuus hoidon CX-1-soluissa. Kuvio 2D osoittaa, että JNK aktivoitiin ja Bcl-x L fosforyloitiin seriini 62 annoksesta riippuvalla tavalla CX-1-soluissa. Mielenkiintoista, taso c-FLIP

L laski jyrkästi, kun oksaliplatiini yhdistettiin lämmönnousua. Samankaltaisia ​​tuloksia saatiin HCT116-soluissa (kuvio 2E).

kinetiikka multimodaalisuutta hoidon CX-1 ja HCT116-solut

Havaitsimme, että vaikutus multimodaalisuutta hoito lisäsi ajan edennyt CX-1 (kuvio 3A) ja HCT116-soluja (kuvio 3B). JNK aktivointi saavutetaan maksimi 4 tunnin kuluttua ensimmäisen hoidon ja vähitellen väheni multimodaalisuutta hoidon. Tiedot immunoblottaus ja kuvantamisen geeli analyysit osoittavat, että Bcl-fosforylaation saavutti huippunsa noin 12 tuntia käsittelyn jälkeen osoittaa, että JNK aktivaatio oli varhainen tapahtuma ja saattaa säädellä Bcl-xL fosforylaatiota. CX-1-solujen taso c-FLIP

L dramaattisesti vähentynyt 4 tunnin kuluttua hoito oksaliplatiini yhdistettynä hypertermia, kun taas HT116 soluissa, se saavutti vähintään 24 tuntia käsittelyn jälkeen.

CX -1 (A) ja HCT116 (B) solut altistettiin hypertermistä (42 ° C) olosuhteissa 1 tunnin ajan, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, kun läsnä /poissa ollessa Kartta ja oksaliplatiinin 3 h, 7 h, 11 h ja 23 h. Käsittelyn jälkeen, lohkaisu kaspaasin 8/9/3 ja PARP, fosfo-JNK /JNK, fosfo-Bcl-xL /Bcl-xL: n ja FLIP

L havaittiin immunoblottauksella. Aktiini käytettiin vahvistamaan sama määrä proteiineja.

vaatimus JNK aktivaation ja Bcl-x L fosforylaation multimodaalisuus hoidon indusoiman apoptoosin

JNK-inhibiittori SP6001125 osittain pelkistetty oksaliplatiini /kartta /hypertermia aiheuttaman PARP lohkaisu CX-1-soluissa, mikä osoittaa, että JNK-reitin oli ratkaiseva monikäyttöisyyttä hoidon indusoiman apoptoosin (kuvio 4A). Huomattavasti, SP6001125 erittäin puolestaan ​​laskenut Bcl-x L fosforylaatiota CX-1-soluissa, joka tarjoaa vahvaa näyttöä siitä, että multimodaalisuutta hoito aiheuttama Bcl-fosforylaation vaatii JNK aktivointia. Zhao et ai. kertoi, että JNK aktivaatio välittää c-FLIP downregulation [26]. Tätä mahdollisuutta tutkittiin kuviossa 4A. Havaitsimme, että ei palauttaminen c-FLIPL ilmeni hoidon aikana SP6001125. Tämä havainto oli yhdenmukainen muiden tutkijoiden raporteissa [27,28].

(A) Soluja esikäsiteltiin JNK -estäjä 25pM SP6001125 seurasi oksaliplatiini /Kartta /hypertermian ja immunoblotattu anti-PARP, anti-fosfo -Bcl-xL: n ja anti-Bcl-x L-vasta-ainetta. (B) transfektanttien kontrolli-plasmidi (pcDNA), villityypin Bcl-xL: n (Bcl-x L-WT), Ser62 /Ala fosfo-viallinen Bcl-xL: n mutantti (Bcl-x L-S62A), tai Ser62 /Asp fosfo-matkivat Bcl-x L-mutantin (Bcl-x L-S62D) käsiteltiin oksaliplatiinin /Kartta /hypertermia ja immunoblotattu anti-PARP tai anti-Bcl-x L-vasta-ainetta. Aktiini käytettiin vahvistamaan yhtä paljon proteiineja ladattu kuhunkin kaistaan.

vaikutuksen arvioimiseksi Bcl-x L fosforylaation Ser62 sen anti-apoptoottista aktiivisuutta, loimme CX-1 peräisin oleva solu linjat stabiilisti yli-ilmentävät villityyppistä Bcl-xL: n (Bcl-x L-WT), Ser62Ala fosfo-viallinen Bcl-xL: n mutantti (Bcl-x L-S62A), Ser62Asp fosfo-matkivat Bcl-xL: n mutantti (Bcl-x L-S62D), tai vastaava tyhjän vektorin (pcDNA). Kuten odotettua, yli-ilmentyminen Bcl-x L-WT esti oksaliplatiini /Kartta /lämmönnousua aiheuttama PARP pilkkominen. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen Bcl-x L-S62D parannettu PARP pilkkominen, kun taas Bcl-xL-S62A esti PARP pilkkominen (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että taso Bcl-xL: n ja sen fosforylaatio S62 on tärkeä rooli multimodaalisuus aiheuttaman apoptoosin.

Reduction in c-FLIP

L tasolla seuraavat hypertermia ja oksaliplatiinille CX-1 solut

c-FLIP on tärkeä estäjä ulkoista apoptoottisen reitin estämällä kaspaasin 8 aktivointia, ja havaitsimme, että taso c-FLIP

L aleni jälkeen lämmönnousua 42 ° C: ssa 1 h CX-1-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 5A. Kuitenkin c-FLIP

L palautui normaalille tasolle kuluttua 3 tunnin inkuboinnin 37 ° C, joka oli yhdenmukainen aiempien paperi [24]. Oksaliplatiini (10 ug /ml, 4h) yksinään ei alentaa C-FLIP

L. Mielenkiintoista, taso c-FLIP

L pidettiin entistä alhaisemmalle tasolle, kun lämmönnousua, oksaliplatiinin.

(A) Soluja altistettiin 37 ° C tai 42 ° C 1 h, kun läsnä /puuttuminen 10 ug /ml oksaliplatiinin ja sitten korjataan välittömästi tai 3 tuntia sen jälkeen, kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa. c-FLIP

L tutkittiin Western blot-analyysi. (B) Soluja altistettiin 37 ° C: ssa tai 42 ° C: ssa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa 10 ug /ml oksaliplatiinin ja sitten inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) suoritettiin mittaamiseksi suhteessa c-FLIP mRNA-tasolla. Pylväsdiagrammi esittää keskiarvot (+ SD) kolminkertaisista kokeista. (C) Soluja altistettiin 37 ° C: ssa tai 42 ° C: ssa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa 10 ug /ml oksaliplatiinin ja sitten inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Proteiini synteesi mitattiin [

35S] metioniinin. (D) Soluja käsiteltiin 30 ug /ml CHX tai altistunut hypertermia läsnä ollessa tai poissa ollessa CHX. Tasot c-FLIP

L ja latauskontrollina aktiini mitattiin Western blot-analyysi. (E) Soluja altistettiin hypertermian 30 tai 60 min läsnä ollessa /poissa ollessa MG132. Lysaattinäytteestä immunosaostettiin anti-ubikitiini-vasta-ainetta ja proteiini G-Sepharose. Ubikitinoituja FLIP havaittiin Western blot anti-FLIP-vasta-ainetta. (F) Solut transfektoitiin ohimenevästi 4 ug plasmidia, joka sisälsi vale, K106R (106 lysiinitähde on korvattu arginiini), K195R, tai villityypin (WT) c-FLIP

L. 48 tunnin kuluttua inkubaation, solut altistettiin hypertermian 42 ° C: ssa 1 h. Taso C-FLIP

L havaittiin anti-FLIP-aineella. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (G) Solut transfektoitiin ohimenevästi Flag-merkityn c-FLIP

L WT tai K195R plasmidia; 48 tuntia myöhemmin, solut altistettiin hypertermian 42 ° C: ssa 1 h. Tasot ubikitinoitu c-FLIP

L havaittiin IP anti-Flag-vasta sen jälkeen Western blot käyttäen anti-ubikitiinipromoottori vasta-aine. Läsnäolo transfektoidut c-FLIP

L lysaateissa varmistettiin Western blot. Aktiini esitetty sisäisenä standardina. (H) Solut transfektoitiin ohimenevästi c-FLIP

L WT, K106R, tai K195R plasmidi; 48 tuntia myöhemmin, solut kuumennettiin 42 ° C: ssa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta (100 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml), ja sitten inkuboitiin 37 ° C

° C: ssa 3 h. Lysaatit, jotka sisältävät yhtä suuret määrät proteiinia, immunoblotattiin anti-PARP ja anti-FLIP-vasta-ainetta. Aktiini esitetty sisäisenä standardina. (I) Solut transfektoitiin ohimenevästi c-FLIP

L WT, K106R, tai K195R plasmidi; 48 tuntia myöhemmin, solut kuumennettiin 42 ° C: ssa 1 h puuttuessa tai läsnä Kartta (100 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml), ja sitten inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS-määrityksellä. Virhepalkit edustavat SD kolminkertaisista kokeista. Tähdellä * tilastollisesti merkittävää eroa (P 0,05).

Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että mitään merkittävää inhibitiota c-FLIP ilmentymisen mRNA-tasolla oli ilmeistä, kun hypertermia, oksaliplatiini, tai yhdistelmä (kuvio 5B). Havaitsimme kuviossa 5C, että 25% proteiinisynteesiä estyi hypertermia, vaikkei ollut 46% inhibition in oksaliplatiini yhdistettynä lämmönnousua. Kuvio 5D osoittaa, että väheneminen c-FLIP

L tasolle 42 ° C: ssa 1 tunnin lämmityksen yksinään oli enemmän kuin 30 ug cyclohexmide joka estää proteiinisynteesiä 99% [28]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että proteiinisynteesin esto yksin ei ole merkittävä tekijä downregulation FLIP

L kuume. Merkillistä, c-FLIP

L erittyi aikana 3 h normothermic kunnossa, mikä osoittaa, että c-FLIP

L oli uudelleensyntetisoidun. Kuitenkin elpyminen viivästyi hypertermia- ja oksaliplatinan proteiinisynteesiä oli merkittävästi estyy.

Kuva 5E esittää, että ubikinaa- endogeenisen c-FLIP

L taas nostaa lämmönnousua hoitoja. Lisäksi proteasomin estäjä MG132 tukossa hajoamisen c-FLIP

L, joka osoittaa, että proteasomaalisten välittämän hajoamisen proteiinin jälkeen lämmönnousua.

Online-ohjelmisto UbPred, joka ennustaa proteiinia ubikitinaa- sivustoja, osoitti, että lysiini 106 ja 195 oli korkeimmat pisteet. Me korvattiin 106 ja 195 lysiiniä arginiinin ja testattu vakautta täyspitkän c-FLIP

L, jolla on saatu pistemutaatio. Kuten kuviossa 5F, että transfektio ryhmä, c-FLIP

L K106R oli helposti hajoavaa, kun niihin hypertermiaan kun K195R oli tehonnut hajoaminen kuume. Kuva 5G vahvistaa, että c-FLIP

L villityypin (WT) oli tehokkaasti ubikitinoitu muttei K195R mutantti, joka löydettiin lähes ilman ubikitinaation. Havaitsimme, että c-FLIP

L K195R ilmentävien solujen olivat resistenttejä multimodaalisuus hoidon aiheuttama apoptoottista solukuolemaa (kuvio 5H ja 5I). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ohimenevää kuumetta välittämää hajoaminen c-FLIP

L mukana ubikitinaa- of K195, ja K195R mutantti resistenssin vastaan ​​multimodaalisuus hoidon aiheuttama apoptoottista kuolemaa.

kumoaminen synergistisen vaikutuksen yliekspressio c-FLIP

L K195R ja Bcl-x L-S62A CX-1 ja HCT116-solut

Lopuksi vertasimme vaikutus multimodaalisuutta hoidon CX-1 ja HCT116-solut yli-ilmentynyt c-FLIP

L WT, Bcl-x L-S62A, Bcl-x L-S62A + c-FLIP

L WT (kuva 6A ja 6B) ja c-FLIP

L K195R, Bcl-x L-S62A, Bcl- xL-S62A + c-FLIP

L K195R (kuvio 6C ja 6D). Havaitsimme, että c-FLIP

L WT /K195R tai Bcl-x L-S62A osittain tukossa vaikutuksen multimodaalisuutta hoitoa. On huomioitava, että multimodaalisuutta hoito aiheuttaman apoptoosin lähes kokonaan estänyt yli-ilmentymisen sekä c-FLIP

LWT /K195R ja Bcl-x L-S62A (kuva 6A ja 6C), mikä osoittaa c-FLIP

L ja Bcl- xL olivat riippumattomia tekijöitä synergistisen vaikutuksen multimodaalisuutta hoitoa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin solunelinkykyisyysmääritys (kuvio 6B ja 6D). Tuloksemme viittaavat siihen, että (a) väheneminen c-FLIP

L tasolla ja (b) Bcl-fosforylaation Ser62 ovat vastuussa synergistinen apoptoosin induktioon kliinisesti relevanttien multimodaalisuus hoitoon.

( A) CX-1-soluissa stabiilisti yli-ilmennetään kanssa pcDNA, c-FLIP

L WT, Bcl-x L-S62A ja c-FLIP

L WT + Bcl-x L-S62A, ja kolme stabiilien kloonien yhdistettiin, ja solut kuumennettiin 42 ° C: ssa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta (10 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml), ja sitten inkuboitiin 37 ° C

° C: ssa 3 h. Pilkkominen PARP, ja taso C-FLIP

L ja Bcl-x L havaittiin Western blot -analyysillä. (B) Solujen elinkelpoisuus analysoitiin MTS määrityksessä 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Virhepalkit edustavat SD kolminkertaisista kokeista. Tähdellä ** tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (P 0,01). (C) HCT116-soluja transfektoitiin ohimenevästi yhtä suuri määrä plasmidia, joka sisälsi vale, c-FLIP

L K195R, Bcl-x L-S62A ja c-FLIP

L K195R + Bcl-x L-S62A. 48 tunnin kuluttua inkubaation solut kuumennettiin 42 ° C: ssa 1 h, kun läsnä /poissa ollessa Kartta (10 ng /ml) ja oksaliplatiinin (10 ug /ml), ja sitten inkuboitiin 37 ° C

° C: ssa 3 h.