Krooninen sairaus

tiivistelmä

päätavoitteena nykyisen työn oli tutkia mahdollista vaikutusta asetoniuute on

Ficus religosa

lehtiä (FAE) useita apoptoosin signalointi ihmisen rintasyövän soluja. FAE hoitoon merkittävästi indusoi annoksesta ja ajasta riippuva, ​​peruuttamaton inhibitio rintasyöpäsolujen kasvua, joilla on kohtalainen myrkyllisyys normaaleille rintojen epiteelisoluihin. Tämä havainto validoitiin käyttäen sulforodamiini B määritystä. Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla osoitti solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa ja induktio sub-G0 huippu. FAE aiheuttama kromatiinin kondensaatio ja näytetään kasvu apoptoottisen väestön anneksiini V-FITC /PI (Fluoreseiini-isotiosyanaatti /propidiumjodidianalyysi) kaksinkertainen värjäys. FAE stimuloi mitokondrion kalvon potentiaalia useita rintasyöpäsolulinjoissa verrattuna normaaliin diploidisoluissa. Ymmärtää rooli Bax vuonna FAE aiheuttaman apoptoosin, käytimme herkkiä soluja pohjainen alusta MCF-7-solut ilmentävät Bax-EGFP. Bax mitokondrioihin oli mukana Mitokondrioiden kalvon potentiaalia ja merkitty korkeus LEHDase aktiivisuuden (kaspaasi 9). Tämän mukaisesti tiedot, FAE aiheuttama n vapautumisen osoituksena suhteen muutos FRET Caspase anturi ilmentävät MCF-7 solulinja ja lohkaisu näkyvä Kaspaasit ja PARP. Mielenkiintoista, FAE kiihtyi solukuoleman mitokondrio riippuvaisella tavalla jatkuvassa elävien solujen kuvantamiseen tila ilmaisee sen mahdollista valolle herkistävää vaikutusta. Solunsisäinen sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) by FAE ollut keskeinen rooli välittämisessä apoptoottisen solukuoleman ja valolle toimintaa. FAE aiheuttama annoksesta ja ajasta riippuva esto syöpäsolun kasvua, joka liittyi Bax translokaatio ja mitokondrioita välittämän apoptoosin kanssa kaspaasi 9 riippuvainen Caspase Cascade. FAE myös hallussaan voimakas valolle vaikutus tasyöpäsolulinja joka välittyvät nopeasti mitokondrion transmembraanisen mahdollinen menetys ja osittainen Caspase aktivointi liittyy sukupolvi solunsisäisten ROS.

Citation: Haneef J, MP, Thankayyan R SK, Sithul H, Sreeharshan S (2012) Bax translokaatio välittämä Mitokondrioiden Apoptoosi ja kaspaasi Riippuvainen valolle herkistävä vaikutus

temppeliviikuna

syöpäsoluihin. PLoS ONE 7 (7): e40055. doi: 10,1371 /journal.pone.0040055

Editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 marraskuu 2011; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2012 Julkaistu: 06 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Haneef et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia University Grants komissio (UGC) ja neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR), Intian hallitus, kuten Senior Research Yhteisöt Dr. Haneef ja Dr. Parvathy M mukainen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasviperäisiä kasveja ja kasviperäisiä lääkkeitä on käytetty laajalti perinteisessä kulttuureissa ympäri maailmaa ja ovat kasvattaneet suosiotaan modernissa yhteiskunnassa luonnollisina vaihtoehtoina tuottaa uusia potentiaalisia terapeuttisia yhdisteitä tautien torjuntaa [1]. Terveysvaikutukset edistävät vaikutukset kasvin ainesosien ja uutteita ollaan yhä tutkitaan ja niiden kulutus on kasvussa [2]. Monia yrttejä on arvioitu kliinisissä tutkimuksissa ja tutkii parhaillaan phytochemically ymmärtämään tuumorisidistä vastaisia ​​toimia eri syöpiä. Valitettavasti suurin osa tutkimuksista tehtiin yksittäisiä molekyylejä, joiden havaittiin olevan vähemmän tehokasta kuin kemopreventiivisten aineina verrattuna phytochemical cocktaileja, jotka voivat aiheuttaa niiden aktiivisuutta synergia [3].

Farmakologiset tutkimukset suoritetaan tuoreen kasvi materiaalit

F.religiosa

tarjoavat käytännöllisen tukea lukuisista perinteisiin käyttötapoihin. Sen kuori, hedelmiä, lehtiä, satunnaista juuret, lateksi ja siemeniä lääkkeellisesti käytetään eri muodoissa, joskus yhdessä muiden yrttien [4]. Phytochemical tutkimus suoritettiin

F.religiosa

oli johtanut eristämiseen kasvisterolien, aminohappoja, furanokumariinit, flavonoidit, fenoliset komponentit, hiilivedyt, alifaattiset alkoholit, haihtuvia komponentteja sekä muutamia muita luokkia sekundäärimetaboliitteja, tanniinit, steroidit , alkaloidit ja β-sitosteryl-d-glukosidi, K-vitamiini, n-oktakosanolia, metyyli oleanolate, lanosteroli, stigmasteroli, lupen-3-oni [5], [6]. Singh

et al

[7] ehdotti yksityiskohtaisen tutkimuksen sen mahdollisten syöpää, sydän-, neuro tulehduksellinen, neuropsykiatriset, oksidatiivisen stressin liittyvät häiriöt ja parasiitti-infektiot. Useimmat farmakologiset tutkimukset, joiden tavoitteena on validoida sen perinteisiin käyttötarkoituksiin haavan parantamiseen [8], [9], anti-bakteeri [10], kouristuksia [11], anti-diabeetikoilla [12], antioksidantti [13] , anti-inflammatoriset [14], asetyylikoliiniesteraasi estävä aktiivisuus [15] ja ahdistuneisuutta aktiivisuus [16]. Metanolipitoiset ote

F.religiosa

lehtiä kiinnostavuus vahva hermoja suojaava vaikutus vastaan ​​aiheuttamaa tulehdusta välittäjäaineiden, kuten typpioksidin ja sytokiinien LPS (Lipopolysaccharide) stimuloidut microglia kautta MAPK (Mitogeenillä aktivoitu proteiinikinaasi) reitin [17] .

Ficus lajia

osoitettiin olevan anti proliferatiivista aktiivisuutta kasvainsolulinjoissa ja sen eri osat ovat osoittaneet apoptoottisia vaikutuksia, mikä tarjoaa alustavan farmakologinen tuki niiden käyttöä syöpälääkkeen [18] . Till mennessä ei ole kirjallisuudessa ja kokeellista näyttöä on käytettävissä todisteet syövän ja apoptoottista vaikutusta

F.religiosa

lehtiuutteita useita rintasyövän soluissa. Tämä sai meidät tutkimaan mahdollinen mekanismi sen apoptoosin edistää aktiivisuutta ja tunnistaa muita biologista aktiivisuutta, jos sellainen on.

Solusykli on prosessi, joka toimii keskeisenä hallita kasvua ja lisääntymistä solun. Häiriöitä solusyklin prosessi aiheuttaa epätasapaino soluproliferaation ja solukuoleman, myöhemmin johtaa syövän kehittymisen. Näin ollen solusyklin voisi toimia kohteena syövän vastaisina aineina pysäyttämiseksi hallitsemattoman kasvainsolujen proliferaation ja aloittaa niiden apoptoosin [19]. Apoptoottisen prosessin (tai ohjelmoitu solukuolema) on tärkeä mekanismi vastauksena sytotoksinen hoito ja sen induktio on erittäin toivottavaa

toimintatapa

varten syöpälääke [20]. Yksi haasteista syövän hoidossa on, että pahanlaatuisia soluja on kyky kiertää apoptoosin, mikä on suurin syy tehottomuudesta mitään sytostaatin tappaa tällaisia ​​soluja. Esillä oleva tutkimus osoittaa vaikutusta asetonin uutteen

F.religiosa

lehdet annoksesta ja ajasta riippuva kasvun inhibitio useiden rintasyövän solulinjoissa, jotka oli liitetty Bax translokaatio ja mitokondrioita välitteistä apoptoosia kanssa kaspaasi 9 riippuvaisen reitin. Vaikka FAE indusoi merkittäviä Caspase aktivaation niin entsymaattisessa määrityksessä sekä elävien solujen Caspase anturikenno malleja, jatkuva altistuminen käsiteltyjen solujen paljasti odottamattoman valolle herkistävää aktiivisuutta. Tämä tutkimus on tärkeää, koska se on ensimmäinen raportti antaa näyttöä siitä, että biologisesti käytettävissä ainesosat

F.religiosa

lehtiuutetta kohdistavat valolle ja apoptoosia indusoiva kyky tuottamalla solunsisäisten ROS.

tulokset

Phytochemical Analysis

juuri valmistettu raakatuoteasetonissa uute

Ficus

lehdet (FAE) oli laadullisesti testattiin läsnäolo alkaloidit, flavonoidit, fenolit, saponiinit ja tanniinit ( Taulukko 1) standardimenetelmiä käyttäen analyysin [21]. Alumiini kloridi kolorimetrinen menetelmä käytettiin flavonoideja arvio [22]. Flavonoidi sisältö uutteen suhteen quercetin vastaava oli 79 ± 4 mg /g kuivaa FAE jauhetta. Yhteenlaskettu fenolit arvioineet Folin Ciocalteu menetelmällä [23] suhteen galliinihappoa vastaava oli 110 ± 2,18 mg /g uutetta jauheena.

FAE Inhibioitu leviämisen Breast Cancer Cell Lines

anti-proliferatiivista vaikutusta FAE kasvuun nisän epiteelisolujen, MCF-10A, MCF-7, MDAMB231, T47D ja SKBr3 solut alun perin määritettiin MTT: tä (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritys ja sytotoksisuus trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla FAE (20-320 ug /ml) 24, 48 ja 72 tuntia. FAE inhiboivat rintasyövän solujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). IC

50-arvo kullekin solulinjojen määritetään MTT tiedot ovat – 363,6 ug /ml (nisäepiteelisoluissa), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) ja 75,47 ug /ml (SKBr3). Kahden ei-tuumorigeenisiä rintarauhasen epiteelisolujen, FAE esti kohtalaisesti sytotoksisuutta kuin syöpäsoluja. Proteiini pohjainen sulforodamiini B määritys suoritettiin myös, että perustellun MTT tulokset (kuvio 1 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, FAE osoitti suurta selektiivisyyttä syöpäsoluja kuin normaalit solut. Lisäksi, mikroskooppinen havainnointi solumorfologiaan paljasti, että FAE indusoi havaittavaa morfologian muutoksia, mukaan lukien kupliminen kalvon ja kutistumisen solujen lisäksi väheneminen solutiheyden ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 1 E), joka oli yhdenmukainen trypaanisinivärin syrjäytymisen data ( Kuvio 1C). Olemme suorittaneet klonogeeniset solujen selviytymistä määrityksessä arvioimaan vaikutusta FAE kolonioiden muodostumista. FAE hoito vähensi pesäkkeiden määrä annoksesta riippuvaisella tavalla MCF-7-soluissa (kuvio 1 D).

(A) MCF-7-solujen proliferaatiota arvioitiin MTT assay- Soluja käsiteltiin 20, 40 , 80, 160 ja 320 ug /ml FAE 48 tuntia. IC

50-arvo kullekin solulinjojen määritetään MTT tietoja on- 363,6 ug /ml (nisän epiteelisolut), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) ja 75,47 ug /ml (SKBr3). (B) Sytotoksisuus määritettiin käyttäen proteiinin, joka perustuu elinkelpoisuustesti sulforodamiini B-määritys (C) Solujen elinkelpoisuus trypaanisinivärin syrjäytymisen määritystä MCF-7-soluja käsiteltiin IC

50 FAE 24, 48 ja 72 tuntia. Esitetyt tiedot edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) FAE estää pesäkkeiden muodostumisen rintasyövän soluissa. MCF-7-solut ympättiin kuudella kuoppalevyille 500 solua /kuoppa fenolipunaista DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. 12 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FAE. Elatusaineen FAE vaihdettiin jälkeen 4 päivän välein. Sen jälkeen, kun 14 päivää inkuboinnin, pesäkkeet värjättiin 0,3% kristalliviolettia, liuos 2 min, pestiin PBS: llä, kuivattiin ilmassa ja laskettiin. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (E) kasvun inhibointi sekä morfologisia muutoksia MCF-7-soluja käsiteltiin IC

50-arvo FAE 24, 48 ja 72 tuntia, verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Solut valokuvattiin Leica DMIL käänteismikroskooppi (200 x).

FAE aiheutti lievää solusyklin pysähtymiseen ja Sub-Go induktio

Solun luelinkykymäärityksillä vahvisti kykyä FAE estää MCF-7-solujen kasvua. Solusyklin analyysillä käyttäen virtaussytometrialla suoritettiin sen määrittämiseksi, onko FAE inhiboivan vaikutuksen MCF-7-solujen kasvu oli seurausta apoptoosin induktion tai solukierron pysähtymisen tai samanaikaisesti aktivoinnin näiden kahden tilan välillä. Edustava histogrammi yhdessä suljettu data annetaan (kuviot 2 A ja B). Tulokset paljastivat, että FAE hoitoa 100 ug /ml 24, 48 ja 72 tuntia aiheutti annokseen ja ajasta riippuva nousu solujen prosenttiosuus Saharan G

0 vaihe, joka oli mukana vastaava prosenttiosuuden pienentäminen solujen S ja G

2 /M vaiheessa. 24 h altistuksen, ei ollut merkittävää muutosta solusyklin vaiheessa jakelun. Hoito FAE 48 ja 72 tuntia lisäsi solupopulaation G

1 vaihe 60,4% ja 58,3% vastaavasti verrattuna ohjata 56,6% (kuviot 2 A ja B). Kaikki nämä löydökset osoittivat, että FAE aiheuttama lievä G

1 vaiheen pysähtymisen ja induktio sub-Go väestöstä. Kaikki arvot saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittäviä eroja kontrollista arvo merkitty * (p 0,05), ** (p 0,01) tai *** (p 0,001).

MCF-7-soluja viljeltiin FAE 100 ug /ml arvoa 24, 48 ja 72 tuntia ja solukierron vaihejakauma määritettiin PI värjäys ja analysoitiin BD Diva ohjelmistoa (A). Prosenttiosuus solusyklivaiheista on esitetty histogrammissa (B).

FAE aiheuttama kromatiinin kondensaatio ja apoptoosi

Hoechst 33342 värjäys MCF-7-solut, joita käsiteltiin FAE IC

50 24, 36 ja 48 tunnin osoitti myös ulkonäkö ominaisuuden apoptoottisia muutoksia, kuten tiivistymistä ydinvoiman chromatin (kuvio 3A). FAE indusoiman apoptoosin vahvistettiin edelleen anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäystä. Solu muutokset mukana prosessissa apoptoosin mukana menetys fosfolipidin epäsymmetria. Alkaessa apoptoosin, fosfatidyyliseriinin, joka yleensä löytyy sisäkerroksen plasmamembraanin, tulee kulkeutua ulkopuolelle. Anneksiini V-FITC voi sitoutua alttiina fosfatidyyliseriini pinnalla solukalvon [24]. Anneksiini-V-positiivisten /PI-negatiivisista soluista pidettiin aikaisin apoptoottisia, anneksiini V: positiivinen ja PI positiiviset solut olivat myöhässä apoptoottisia tai nekroottisen. Ei ollut merkittävää kasvua aikaisin tai myöhään apoptoottiset solupopulaation 24 h hoidon FAE (kuvio 3B). Kuitenkin sen jälkeen 36 h hoidon, prosenttiosuus alussa apoptoottisten solujen kasvoi 16,85% verrattuna ohjata 3,15%. 48 tunnin kuluttua hoidon jälkeen koko apoptoottinen väestöstä kasvoi jopa 53,4% (41,4% varhainen apoptoottisia ja 12% myöhään apoptoottisia, p 0,05, kuvio 3C).

(A) Nuclear muutokset liittyvät MCF-7 soluja käsiteltiin IC

50 arvo FAE jälkeen Hoechst 33342 värjäyksen alle Eclipse E-600 fluoresenssimikroskooppia (400 x). Solujen lukumäärä voidaan havaita karakteristisia apoptoottinen morfologia säteilevät kirkasta fluoresenssi kasvoi ajasta riippuvalla tavalla. (B) FACS-analyysi kautta anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen käytettiin tarkkailla apoptoosin. Solut oikeanpuoleiseen alanurkkaan osoittaa anneksiini positiivinen /PI negatiivinen, varhainen apoptoottisia soluja. Solut ylemmässä oikeassa neljänneksessä osoittaa anneksiini positiivinen /PI positiivinen, myöhään apoptoottiset tai nekroottisia soluja. (C) solujen prosenttiosuus läpi aikaisen ja myöhäisen apoptoosin verrattuna vastaaviin valvonta hoidon FAE 48 tuntia, IC

50 arvoa. Kukin arvo edustaa keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä ero kontrollista arvon merkitty * (p 0,05).

FAE stimuloidun translokaatio Bax-GFP mitokondrioissa ja mitokondrion Transmembraaniaktivaattori potentiaalia Time riippuvaisesti

Bax on vahva multi-domain proapoptoottisten proteiini, joka asuu sytoplasmassa inaktiivisina monomeerin terveissä soluissa. Kun apoptoottiset ärsykkeille, Bax läpi konformationaaliset aktivointi johtaa sen mitokondrioihin. Useat tutkimukset aiemmin sekaantunut rooli Bax ja sen konformationaalinen aktivoinnista alussa tapahtumia, jotka edistävät vapautumista Sytokromi C mitokondrioita ja myöhemmin Caspase aktivoinnin lääkkeen aiheuttama luontainen apoptoosin signalointi [25]. Olemme palveluksessa herkkiä soluja pohjainen, MCF-7-solut ilmentävät Bax-EGFP (Enhanced vihreä fluoresoiva proteiini) ja Mito DsRed havaita Bax mitokondrioihin vuonna FAE solukuolema. Jotta pisteet aktiivisuutta useita elävien solujen, Pathway Bio lämpökamera käytettiin 2 x 2 montages kuvatulla [26]. Edustaja kuva MCF-7 Bax EGFP-solujen käsittelyn jälkeen 100 ug /ml FAE on esitetty kuviossa 4A. Kuten kuviossa 4B, jo 3 h lääkehoidon lähes 33,3% soluista osoitti rakeisen mitokondrioiden kuvio käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Ennen FAE hoidon Bax-EGFP osoittivat diffuusin soluliman kuvio osoittaa niiden monomeerinen tila. Myöhemmissä tuntia, suurin osa soluista osoitti rakeisen kuvio massiivinen suuri Bax oligomeerejä mitokondrioissa (kuvio 4B). Korkea suurennos kuvan Bax aggregaatit mitokondrioissa on myös esitetty kuviossa 4B. Olemme havainneet varhaisessa lisääntynyt Bax translokaatiota in Bax yli-ilmentäviä soluja, jotka oli yhdenmukainen aiemman raportin että yli-ilmentyminen Bax herkistynyt solujen kuolemaan, koska sen luontainen pro-apoptoottista aktiivisuutta [27]. Tulos selvästi toteen, että varhainen Bax aktivaation ollut ratkaiseva rooli FAE aiheuttamaa apoptoosia signalointi. Hiljentäminen Bax käyttäen siRNA vähentää kromatiinin kondensaatio FAE käsitellyissä soluissa verrattuna salattu sekvenssin transfektoiduissa soluissa (kuviot 4 ii ja iii). Lisäksi meillä oli käytössä vielä kolme rintasyövän solulinjoissa, MDAMB 231, SKBr3, T47D ja kaksi normaalia diploidisoluissa profiiliin apoptoottinen aktiivisuus FAE. Visualisoida mitokondrion kalvon potentiaalia ja kromatiinin kondensaatio samanaikaisesti, solujen käsittelyn jälkeen 100 ug /ml FAE 36 tuntia värjättiin mitokondrion kalvon potentiaalia spesifisen väriaineen TMRM ja ydin- Hoechst 33342, kuten on kuvattu [28]. Kuten on esitetty kuviossa 5A, suurin osa käsitellyn rintasyövän solut osoittivat laskua TMRM intensiteetti osoittaa, että mitokondrion kalvon potentiaali oli kadonnut, että hyvin korreloi kondensoidun kromatiinin. Mielenkiintoista molemmat ihmisen endoteelisolujen sekä ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen osoittivat vähemmän TMRM intensiteetti tappio ja vähemmän kromatiinin tiivistyminen kuin syöpäsoluja. Tulokset viittasivat siihen, että FAE solukuolema useimmissa rintasyövän solujen mitokondrion kalvon potentiaalia ja kromatiinin kondensaatiota. Normaali lisääntyvät diploidisoluissa olivat suhteellisen resistenttejä apoptoottisen solukuoleman aiheuttama FAE. Kuitenkin ne myös osoittivat eron TMRM fluoresenssi verrattuna käsittelemättömiin soluihin, mikä osoittaa, että mitokondrion kalvon läpäisevyys on muuttunut.

(A) MCF-7-soluja, jotka ilmentävät Bax EGFP ja Mito DsRed ympättiin 96-kuoppaisille lasin pohjalle levy (BD, USA), joilla on alhainen tiheys ja 48 tunnin kuluttua, käsiteltiin FAE 100 ug /ml. Kuva on otettu käyttäen BD Pathway Bioimager 435 (Becton Dickinson, USA) 3, 18 ja 27 h asettamalla Montage (2 x 2) ja erityiset Macro avulla AttoVision ™ ohjelmistoa. Vihreä rakeinen yhteenlaskettu osoittaa translokaatio Bax on mitokondrioita, kuten on osoitettu nuolilla. Edustaja kuvia kerätään ilmoitettuina ajankohtina käytettiin analysointiin prosenttiosuuden positiivisten solujen kanssa Bax EGFP päälle mitokondrioita verrattuna koko alan. (B) Kaavio, joka esittää solujen prosenttiosuus, joille Bax kulkeutuessa mitokondriot, kun FAE hoitoon. (C) MCF-Bax-DS Punasolut käsiteltiin kuten edellä on esitetty. Bax-EGFP kertyminen mitokondriot on osoitettu korkea suurennus kuvia nuolilla. Suurennettu yhdistettiin kuva käsiteltyjen solujen on myös esitetty. (D) MCF-7-solut transfektoitiin ohjaus (scr) siRNA tai Bax siRNA. 48 tunnin kuluttua transfektion kokosolu-uute valmistettiin ja testattiin immunoblot varten Bax ja Actin. Sama solut värjättiin myös Hoechst 33342 jälkeen 48 h FAE hoidon visualisoida kromatiinin kondensaatio (vasen paneeli). Käyrä on kvantitatiivinen edustus solujen prosenttiosuus kondensoituneilla kromatiinin salattu-transfektoiduissa ja Bax-transfektoiduissa soluissa jälkeen FAE hoidon.

(EN) rintasyövän soluja, MDAMB231, T47D, SKBr3 ja normaalit solut, kuten ihmisen rintarauhasen epiteelisolut ja ihmisen endoteelisoluja käsittelyn jälkeen FAE 100 ug /ml 24 h, värjättiin 50 nM TMRM ja 0,5 ug /ml Hoechst 33342 15 minuuttia. Sitten solut kuvattiin loisteputken mikroskoopilla käyttäen DAPI ja rodamiinisuodatinta sarjojen 40 × tavoite. Kuvat otettiin kiinni kanssa Retiga Exi käyttämällä kameran NIS elementti ohjelmisto (Nikon). (B) Ac-LEHD-AFC pilkkominen (kaspaasi 9 aktiivisuus) (C) Ac-DEVD-AMC pilkkominen (kaspaasi 3/7 aktiivisuus). MCF-7-soluja käsiteltiin IC

50 arvo FAE 24, 36 ja 48 tuntia. Tulokset mitattiin fluorometrisesti. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta näytteestä. Merkittävä ero kontrollista arvon merkitty * (p 0,05), ** (p 0,01) tai *** (p 0,001). FAE-hoito johti ajasta riippuva nousu pilkkominen Ac-LEHD-AFC (asetyyli-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorimetyyli kumariini), mikä viittaa lisääntynyt aktiivisuus kaspaasi 9 (kuvio 5B). 24 h hoito, ei näkyvästi pilkkominen Ac-DEVD-AMC (substraatti Kaspaasit 3/7, asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metyylikumariini) havaittiin. Huomattavaa DEVDase aktiivisuutta esiintyi vain 36 h hoidon FAE. Scale palkki edustaa 50 mikrometriä.

FAE Triggerd kaspaasi 9

tarkastella osallistumisen Kaspaasit vuonna FAE aiheuttaman apoptoosin, toimintaan aloitteentekijä kaspaasi 9, kuten (LEHDase) ja efek- kaspaasi 7/3 kuten (DEVDase) toimintaa tutkittiin fluorometrisellä proteaasimäärityksessä. MCF-7-soluja käsiteltiin FAE IC

50-arvo 24, 36 ja 48 h ja kaspaasi aktiivisuudet määritettiin. FAE-hoito johti ajasta riippuva nousu pilkkominen Ac-LEHD-AFC (asetyyli-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorimetyyli kumariini), mikä viittaa lisääntynyt aktiivisuus kaspaasi 9 (kuvio 5B). 24 h hoito, ei näkyvästi pilkkominen Ac-DEVD-AMC (substraatti Kaspaasit 3/7, asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metyylikumariini) havaittiin. Huomattavaa DEVDase aktiivisuutta esiintyi vain 36 h hoidon FAE (kuvio 5C).

FAE aiheuttama n vapautumisen Live Cell Model kaspaasin aktivaatio

Ennen tulokset osoittivat, että FAE aiheuttaman apoptoosin ensisijaisesti mitokondrioita välittämä luontainen reitti, johon liittyy Bax välittämää mitokondrion läpäiseväksi seuraa kaspaasi 9 ja kaspaasi 3/7 aktivointi. Edelleen, perustelemaan roolia Kaspaasit vuonna FAE solukuolema, olemme käyttäneet FRET (fluoresenssiresonanssienergiansiirto), joka elävien solujen malliin kuten aiemmin on kuvattu [28] valvomaan aktivoitu Kaspaasit elävissä soluissa. Lyhyesti rintasyöpä joka ilmentää FRET koetin ECFP-DEVD-EYFP (Enhanced Cyan loisteputki Valkuainen- kaspaasi 3 pilkkominen sequence- Enhanced keltainen fluoresoiva proteiini) altistettiin FAE 100 ug /ml ja kuvantaa suhdetoimintatila. Kun Caspase aktivointi, FRET alkaen donorifluoroforin vastaanottajarakkuloihin menetettiin kasvaessa ECFP ja lasku EYFP fluoresenssin. Kuten on esitetty kuviossa 6A, käsittelemättömään kontrolliin solut osoittivat lisääntynyttä akseptorin fluoresenssin kuin luovuttajan fluoresenssi, joka näkyi lasku ECFP /EYFP suhde (0,04) kasvaneiden energian siirto välittämän vastaanottajan fluoresenssin. Kuitenkin käsitelty kuoppiin, useimmat solut osoittivat lisääntynyttä suhde 1,005 osoittaa menetys FRET vuoksi Caspase -välitteisen pilkkomisen linkkerin DEVD sijoitettu luovuttajan ja akseptorin kasvaessa ECFP ja lasku EYFP fluoresenssin. Edesmennyt apoptoottiset solut havaittavissa solun kutistuminen nähtiin kirkas elimet kuvassa riittävän suhde muuttuu suhde kuva (kuvio 6A).

(A) MCF-7-solut ilmentävät Caspase FRET-koettimet altistettiin 100 ug /ml FAE 24 h ja 48 h. ECFP, EYFP-FRET-kanavat ja yhdistetyt kuvia DMSO käsitelty ja FAE käsitellyt solut näytetään. ECFP /EYFP suhde kuva on myös esitetty. Käyrä näkyy on määrällinen suhde muutos DMSO ja FAE käsitellään kuolevat solut analysoituna NIS elementtejä ohjelmisto (n = 4). (B) Samat solut värjättiin TMRM ja altistetaan 100 ug /ml FAE ja kuvaamisen varten TMRM, ECFP, EYFP-FRET on Viivästys tilassa välein 5 min kuvatulla tavalla. Yhdistetyn kuvan of TMRM, ECFP, EYFP-FRET päässä Viivästys kuvien ilmoitettuina ajankohtina pisteet näkyvät. ECFP /EYFP suhde muutos DMSO ja FAE käsiteltyjä soluja on esitetty kaavio. Käyrä osoittaa määrällinen suhde muutos DMSO ja FAE-käsiteltyjen kuolevat solut (Complete kehys esitetään Video S1). (C) FRET-ilmentävät solut käsiteltiin kuten edellä ja kuvantaminen suoritettiin, kuten on kuvattu välein 2 min. Edustava kuvan ilmoitettuina ajankohtina näkyy (Complete kehys esitetään Video S2). (D) Sama käsiteltyjä soluja DMSO ja kuvattiin kuten kuvattu C. edustaja kuvaa ilmoitettuina ajankohtina näkyy (Complete kehys esitetään Video S3).

FAE Possessed Strong herkistävän Effect

analyysi valolle vaikutuksen FAE, kaspaasi anturi ilmentävät solut ympättiin 8- hyvin chambered lasi pohja- ja värjättiin mitokondrion kalvon potentiaalia erityisiä fluoresoiva väri TMRM (tetrametyyli rodamiini metyyliesteri) kuten aiemmin on kuvattu [28 ]. Soluja käsiteltiin 100 ug /ml FAE ja altistettiin jatkuvaan Imaging TMRM sekä luovuttajan ja vastaanottajan fluoresenssin avulla ve (BD Biosciences) -konfokaalimikroskoopilla 24 tunnin ajan säännöllisin väliajoin 5 min. Kuten on esitetty kuviossa 6B, ja video S1, 30 minuutin ja kuvantamisen, solut menettivät TMRM fluoresenssi osoittaa mitokondrion kalvon potentiaalia. Huomattavaa soluhävikkiä näkyi jo 60 min, että nopeasti eteni loppuun menetys solujen kuvantamistaso 7 h. Vain lievä muutos ECFP /EYFP suhde havaittiin näissä soluissa osoittaa osittainen Caspase aktivaation (kuvio 6B). Edelleen, perustelemaan herkistävän rooli FAE, olemme vähentäneet altistumista aikaväli 2 min jatkuva kuvantamisen enintään 200 kuvaa. Mielenkiintoista, solunmenetyksen korreloivat hyvin rungon numero sijaan ajoitus FAE hoidon jotka osoittavat, että herkistymisvaikutuksia vaikutti suuresti viritysvalon- altistuminen sijaan FAE hoidon kestosta. Käsittelemätön solut altistetaan samat kuvantamisen ehtoja ole osoittanut mitään muutosta suhde tai solun menetys jopa 24 tuntia kuvantamisen validointi, että vaikutus havaittiin johtui FAE (kuviot 6B, C, D ja videot S2, S3). Solut säilytti myös TMRM fluoresenssi osoittaa ylläpito mitokondrion kalvon potentiaalia koko kuvantamisen aikana. Kaiken kaikkiaan tulokset vahvistivat, että FAE riivaamaa valolle vaikutus, joka oli liittynyt nopeaa mitokondrion transmembraanisen potentiaalin ja osittainen Caspase aktivointi.

FAE Mediated ilmentäminen Apoptotic Regulators

Monena perustelemaan tärkeyttä Caspase cascade takana apoptoosin induktion, olemme analysoineet lohkaisu tärkeää Kaspaasit, kuten kaspaasi 8, kaspaasi 7, kaspaasi 9 ja PARP (poly (ADP-riboosi) polymeraasi) in MCF-7, T47D ja MCF10A. Kuten kuviossa 7A, FAE hoitoa 80 ja 160 ug /ml indusoi lohkaisu kaspaasi 8, kaspaasi 7 ja kaspaasi 9 MCF-7 sekä T47D. Pilkkominen PARP havaittiin myös näissä soluissa. Kuitenkin MCF10A, vain lievän pilkkominen oli ilmeinen sekä Kaspaasit ja PARP.

(A) MCF-7-soluja käsiteltiin FAE (80, 160 ug /ml) 48 tuntia ja kerättiin. Immunoblotit tehtiin kokosolu-uutetta käyttäen ilmoitettuja aineita. Vastaava täyspitkä ja pilkottiin fragmentit on esitetty. PARP blot, soluja käsiteltiin 160 ug /ml FAE 48 tuntia. (B) MCF-7 ja T47D-soluja käsiteltiin 100 ug /ml FAE 24 tuntia. FAE aiheuttamaa ROS sukupolvi MCF-7 sekä T47D solut kuin DMSO-kontrollin kuten osoitetaan lisääntyminen DCF-DA fluoresenssi käsitellyissä soluissa. (C) MCF-7 ja T47D-soluja käsiteltiin 100 ug /ml FAE yksin ja jälkeen esikäsittely NAC ajaksi 24 tuntia. Kuten on esitetty, pre-solujen käsittely antioksidantin NAC vähensi indusoimaa solukuolemaa FAE. Solujen prosenttiosuus kondensoituneilla kromatiinin kunkin ryhmän esitetään kaavio (N = 3).

FAE – solukuolema Mukana sukupolven ROS

Aiemmin Tulokset osoittivat, että useimmissa ja käytetyt solulinjat, FAE voisi laukaista mitokondrion kalvon eheyden ja kondensaatio kromatiinin mahdollisesti Bax riippuvaisella tavalla. Lisäksi kun elävien solujen kuvantamisen olemme vahingossa havaittu valolle vaikutuksen luomiseksi FAE otteen MCF-7 ilmentävän solun kaspaasi anturi nopeutuneen mitokondrion kalvon potentiaalia. Aiemmin on raportoitu, että suurin osa valoherkisteiden solukuolema kautta sukupolven ROS [29], yksi merkittävä laukaisee Bax konformationaalisia aktivointia. Siksi meillä oli analysoitu ROS jälkeen käsittelemällä soluja 100 ug /ml FAE 24 h FACS. Kuten kuviossa 7 B, FAE aiheuttamaa ROS sukupolvi MCF-7 sekä T47D solut osoitetaan kasvu 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H

2-DCF-DA) fluoresenssi käsitellyissä soluissa kuin kontrolli . Pre-solujen käsittely antioksidantin N asetyylikysteiini (NAC) vähensi indusoimaa solukuolemaa FAE, kuten on esitetty kromatiinin kondensaatio tulokset (kuvio 7 C). Se taas validoitu että sukupolven ROS solujen sisällä oli ensisijainen laukaista apoptoottisen solukuoleman ja joka saattaa aiheuttaa sen herkistävän aktiivisuuden.

Keskustelu

Luonnontuote otteet on tutkittu laajalti lääke- teollisuus ja on pidetty arvokkaana uusien lääkkeiden [30]. Keinona tunnistaa syöpälääkkeet, käänteinen farmakologian, tai ”sängyn” muotoon ”penkki” lähestymistapa on selvitetty, että kyse tutkimalla lääkkeen kasveja, jotka on perinteisesti käytetty hoitoon eri vaivoihin. Eri tutkimukset osoittavat, että

Ficus

lajeja käytetään laajasti hallintaan eri sairauksia, kuten hengityselinten sairaudet, seksuaalinen häiriöt, keskushermoston häiriöt (CNS), sydän- häiriöt (CVS), mahalaukun ongelmia, ihotulehduksia ja diabetes jne [31], [6]. Useimmat farmakologiset tutkimukset, joiden tavoitteena on validoida sen perinteiseen käyttöön [32]. Vaikka nykyiset lääkekehityksessä painottaa liiketoiminnassaan yksittäisinä aineina, joilla on erityisiä tavoitteita, että koko ote on osoitettu olevan tehokkaampia kuin yksittäiset aineosat (käsite nimeltä kasviperäisten synergia) ehdottaa rajoituksia tämän lähestymistavan [3]. Kasvainsolujen tappamista läpi apoptoosin on nyt tunnustettu strategia, jolla syöpälääkkeet [33]. Esillä olevassa mietinnössä pyrittiin määrittämään mekanismeja, joilla asetonilla osa

F.religiosa

lehtiuutteen kykenee sen antiproliferatiivinen vaikutus useita rintasyövän soluja.

Anti-proliferatiivinen vaikutus