Krooninen sairaus

tiivistelmä

(-) – Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on laajin tutkittu teen polyphenol sen syöpälääkkeen toiminto. Tässä tutkimuksessa raportoimme uudenlainen toimintamekanismi EGCG-välitteisen solukuoleman tunnistamalla ratkaisevan roolin lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (LMP). Ensimmäinen, EGCG-indusoituvaa solukuolemaa ihmisen syöpäsoluja (sekä HepG2 ja HeLa) havaittiin olevan kaspaasi-riippumaton ja mukana on ilmeistä sytosolin vakuolisaatiota, vain havaittavia, kun solut käsiteltiin seerumittomassa väliaineessa. Sytosolin vakuolisaation havaittu EGCG-käsitellyissä soluissa oli todennäköisesti aiheutunut lysosomaalisen laajentuma. Mielenkiintoista, EGCG pystyi häiritä autophagic vuo hajoamisen vaiheessa heikentyvän lysosomaalisen funktio ja EGCG aiheuttama solukuolema oli riippumaton Atg5 tai autophagy. Keskeinen löydös on se, että EGCG pystyy laukaisemaan LMP, mistä on osoituksena lyso-Tracker Red värjäys, katepsiini D soluliman translokaatio ja soluliman happamoitumista. Johdonmukaisesti, joka on lysosomotropic agentti, klorokiini, tehokkaasti pelastaa solukuoleman kautta tukahduttaa LMP-aiheutti soluliman happamoitumista. Lopuksi löysimme että EGCG edistää tuotanto solunsisäisten ROS ylävirtaan LMP ja solukuoleman, mistä on osoituksena tehostetun ROS käsitellyissä soluissa EGCG ja suojaavia vaikutuksia antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC) vastaan ​​EGCG välittämä LMP ja solukuolemaa . Yhdessä tietoja Tutkimuksemme osoittavat uudella mekanismilla taustalla EGCG-solukuolema mukana ROS ja LMP. Siksi tämän ymmärtäminen lysosomifuusio liittyvä solukuolemareittiin tuoda uusia valot syöpälääkkeen vaikutuksia EGCG.

Citation: Zhang Y, Yang ND, Zhou F, Shen T, Duan T, Zhou J, et al . (2012) (-) – Epigallocatechin-3-gallate indusoi Non-apoptoottista solukuolemaa in Human Cancer Cells kautta ROS-välitteisen Lysosomaalinen kalvo läpäiseväksi. PLoS ONE 7 (10): e46749. doi: 10,1371 /journal.pone.0046749

Editor: Shi-Yong Sun, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 04 syyskuu 2012; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu tutkimusapurahoja Kiinasta National Natural Science Foundation (81028014 ja 81172659 on ZXQ ja SHM) ja Singaporesta National Medical Research Council (NMRC /1260/2010-IRG09nov070 on SHM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hyödyt teetä kulutuksen terveydelle on vakiintunut kautta useat tutkimukset ihmisillä. Useimmat tällaisia ​​etuja, kuten syövän ja sydän- ja verisuonitautien, on katsottu johtuvan polyphenolic komponenttien teetä [1]. Koska runsaimmat ja biologisesti aktiiviset ainesosat keskuudessa teen polyfenolit, (-) – epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on saanut paljon huomiota syöpätutkimuksessa [2]. Tähän mennessä mekanismeista syövän toiminto EGCG on tutkittu paljon. On tunnettua, että egcg voi sitoutua useita molekyyli- tavoitteita, mukaan lukien transmembraani- reseptoreita, kinaasit tai muiden keskeisten proteiineja, vaikuttaa siten erilaisia ​​signalointireittien, jolloin kasvun inhibition, apoptoosin tai poistaminen invaasio, angiogeneesin ja metastaasin [3]. Niistä kyky EGCG induktioon solukuoleman syöpäsoluissa pidetään yhtenä tärkeimmistä mekanismeista, jotka liittyvät sen syöpälääkkeen toiminto [4]. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismit EGCG-solukuolema ei ole täysin selvitetty. Useimmat aikaisempien raporttien ovat todenneet, että EGCG indusoi kaspaasivälitteinen apoptoosin erilaisissa kasvainsoluissa kautta mitokondriaalisen reitin [5], [6] kautta tai kuoleman reseptori [7], kun taas vain harvat tutkimukset osoittivat ei-apoptoosin solukuoleman aiheuttama EGCG [8], [9].

joukossa erilaisia ​​mekanismeja EGCG välittämän solukuoleman, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja oksidatiivisen stressin näyttää olevan erityisen tärkeää. Vaikka EGCG kanssa pyrogalloli-tyyppinen rakenne on B-rengas käsittelee voimakas antioksidantti, tämä rakenne on osoittautunut epävakaa solussa viljellyissä järjestelmään [10]. Auto-oksidaation egcg Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), tuottaa huomattavan määrän ROS, erityisesti H

2O

2, joka on tärkeä rooli sytotoksista vaikutusta egcg syöpäsolulinjoja vastaan ​​[11], [12]. Antioksidanttien kasvualustaan ​​on raportoitu estävän egcg indusoiman apoptoosin [13], [14]. Äskettäin osallisuudesta ROS ja oksidatiivista stressiä kuin apoptoottisen solukuoleman tai nekroosin ovat nousseet arvostettu [15]. Sen vuoksi on kiinnostavaa edelleen ymmärtää rooli ROS ja oksidatiivista stressiä egcg-välitteisen solukuoleman, mukaan lukien sekä apoptoottisten ja ei-apoptoottista solukuolemaa.

lysosomeihin ovat solukalvon suljettu organelleja, jotka sisältävät hydrolyyttisten entsyymien ja jotka säätelevät solunsisäistä liikevaihto /hajoamista makromolekyylien [16]. Viime vuosina, biologista funktiota lysosomeihin on yhä enenevässä määrin, ja se on tunnettua kriittisiä rooleja erilaisissa fysiologisissa prosesseissa kuten autophagy ja ihmisten sairaudet, kuten lysosomaalinen sairauksien, syövän ja neurodegeneratiivisten sairauksien [17]. Lysosomaalinen proteaasit, jotka järjestetään kalvon sisällä normaaliolosuhteissa, vuotaisi sytosoliin sekä apoptoosin ja nekroosin [18]. Yksi keskeinen prosessi, jonka tiedetään olevan tiiviisti mukana solukuoleman on lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (LMP) [19]. Tarkka tulos LMP riippuu laajuudesta lysosomaalisen kalvon vaurioita. Massiivinen repeämä lysosomeihin ja nopean vapautumisen niiden happamassa sisältö on usein kriittinen vaihe kuolion; kun taas osittainen ja selektiivinen lysosomaalisen vuoto liittyy usein apoptoottisten prosessi [20], [21]. On monia tunnettuja tekijöitä häiritä lysosomaalisen kalvon eheyden ja aiheuttaa LMP, kuten ROS, lysosomotropic pesuaineet, mikrotubulusten myrkkyjä ja jotkut lipidien [17], [19]. Esimerkiksi jotkut syöpälääkkeet, kuten vinkristiini, ja siramesine tiedetään aiheuttavan lysosomiin-riippuvaista solukuolemaa [22], [23]. Toistaiseksi ei tiedetä, onko lysosomifuusio on sekaantunut solukuoleman aiheuttama EGCG syöpäsoluissa.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan edelleen molekyylitason mekanismeista EGCG välittämän solukuoleman. Tuloksemme osoittivat ensimmäisinä, että egcg indusoi muodossa kaspaasi-riippumattomien apoptoottisen solukuoleman, joka voidaan merkittävästi vahvistunut seerumia. Toiseksi, olemme huomanneet, että EGCG laukaisee LMP ja siten vuotoja sen keskeisten proteaasien (katepsiini) sytosoliin, ja solukuolemaa. Mielenkiintoista, kuten solukuoleman on riippumaton autophagy. Lopuksi tarjotaan selkeää näyttöä siitä, että EGCG edistää solunsisäisiä ROS muodostumista, joka toimii keskeisenä johtava prosessi LMP ja solukuolemaan. Näin ollen, tästä tutkimuksesta tunnistaa uuden solukuoleman mekanismin aiheuttama egcg syöpäsoluissa, johon liittyy oksidatiivista stressiä, lysosomaalisen vahinkoa ja lopulta solun kuolemaan.

(A) Serum puutteesta edistää egcg solukuolema pitoisuutena -riippuvaisella ja aika-kurssi tavalla. HepG2-soluja käsiteltiin eri annoksilla EGCG kokonaan tai seerumia 12 h (vasen paneeli) tai 60 uM EGCG eri osoittaman ajan (oikea paneeli). Solun elinkelpoisuus määritettiin Hoechst-PI kaksinkertainen värjäys (n = 3, keskiarvo ± SD). (B) edustaja kuvaa Hoechst-PI kaksinkertainen värjäys. HepG2-soluja viljeltiin kokonaan väliaineessa (kontrollina); käsiteltiin 60 uM EGCG 12 h seerumittomassa elatusaineessa; tai inkuboitu 20 ng /ml TNFa: aa ja 10 ug /ml CHX 12 tuntia kokonaan väliaineessa (positiivisena kontrollina apoptoosin). (C) EGCG indusoi kaspaasi-riippumaton solukuolemaa. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 pm x 24 h) tai poissa tai läsnä ollessa 40 uM z-VAD-fmk. Co-hoito TNFa (20 ng /ml) ja CHX (10 ug /ml) 12 h käytettiin positiivisena kontrollina. Solujen elinkelpoisuus määritettiin kuvatulla tavalla ruudussa A. **

p

0,005 verrataan ryhmään ilman z-VAD (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (D) N: o kaspaasi-3-aktivaation ja PARP pilkkominen syy, jonka egcg solukuolema. Soluja käsiteltiin EGCG tai TNF /CHX kuvatun paneeli C, ja solulysaateista kerättiin ja jollei western blot.

Materiaalit ja menetelmät

Chemicals, reagenssit, ja vasta-aineet

(-) – Epigallocatechin-3-gallaatti (EGCG, 90%) hankittiin Zhejiangin yliopistossa Tea tutkimuslaitos. 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti asetyyli esteri (CM-H

2DCFDA), Hoechst33342, ja lyso-Tracker® Red (DND-99) saatiin Invitrogen. z-VAD-fmk oli muodossa Enzo. Akridiinioranssin oli peräisin Immunokemia Technologies. E-64D ja N-acetylcysteine ​​olivat Merk. Propidiumjodidia (PI), digitoniinia, klorokiinin (CQ), bafilomysiini A1 (Baf A1), pepstatiini A: ta ja muita yleisiä kemikaaleja ostettiin kaikki yhtiöltä Sigma-Aldrich. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tutkimuksessa ovat seuraavat: anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), anti-kaspaasi-3 ja anti-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) peräisin Cell Signaling, anti-β-aktiini ja anti-mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3) Sigma-Aldrich, anti-p62 päässä Abnova, anti-Atg5, anti-katepsiini D ja anti-lysosomiin kalvoproteiini (LAMP-1) Santa Cruz. Toissijainen vasta-aineet, piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG, vuohen anti-kani-IgG ja kaniinin anti-vuohi lgG: llä, olivat kaikki Thermo Scientific.

(A) Morfologiset muutokset egcg-käsiteltyjen solujen seerumin vapaa väliaine analysoitiin valomikroskoopilla. Edustavia kuvia HepG2 käsitelty solu EGCG merkityillä pitoisuuksina 12 tuntia (ylempi paneeli) tai 60 uM EGCG varten osoitettuun ajanjaksoista (alempi kuva) esitetään (asteikko bar: 50 pm). (B) HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 tai 240 uM) 12 tuntia. Sitten solut fiksoitiin ja värjättiin hematoksyliinillä, sitten analysoitiin valomikroskoopilla (asteikko bar: 30 um). (C) ontelon sisältö ei ole lipidipisaroita. HepG2-solut olivat EGCG (60 uM) 12 tuntia. Viljellyt solut kokonaan väliaineessa 12 h käytettiin negatiivisena kontrollina, ja soluissa, joita käsiteltiin 1 mM oleaattia happo (OA) DMEM-väliaineessa, joka sisälsi 1% BSA: ssa 12 h käytettiin positiivisena kontrollina. Solut kiinnitettiin ja värjättiin 0,5% Öljy Red O ja hematoksyliinillä (asteikko bar: 30 pm). (D) vacuoles ovat lysosomien alkuperää. Immunofluoresenssivärjäyksen LAMP-1 suoritettiin MEF-soluissa hoidon jälkeen tai ilman EGCG (60 uM) 9 tuntia (asteikko bar: 10 pm).

Soluviljely ja Hoidot

Ihmisen heptoma HepG2 oli American Type Culture Collection. Hiiren alkion fibroblasteja (MEF), sekä villityypin (WT) ja m5-7 solujen indusoituvan poistamisen Atg5 saatiin Dr. N. Mizushima (Tokyo Lääketieteen ja hammaslääketieteen University) [24]. Molemmat kasvatettiin DMEM (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (HyClone), ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen), 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa.

solun Elinkykymääritykset

tässä tutkimuksessa solujen elinkelpoisuus määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen PI -ekskluusiotestillä kuten aiemmin on kuvattu muutoksin [25]. Kunkin näytteen solut ympättiin 96-kuoppalevylle 5 x 10

3 per kuoppa. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin ensin, kuten on kuvattu tuloksia ja kuviossa legendoja, jonka jälkeen inkuboitiin 10 ug /ml Hoechst33342 ja 5 ug /ml PI: ssa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Hoechst voi värjätä kaikki solut sinisellä, kun taas kuolleet solut on esitetty PI tumavärjäystä punaisella. Jokaisesta näytteestä, noin 500 soluja tarkasteltiin, satunnainen talteen ja laskettiin solujen elinkelpoisuuden suhteen perusteella PI-positiivisesta negatiiviseksi soluihin käyttämällä käännettyä fluoresenssimikroskooppia (Nikon ECLIPSE TE2000-S).

(A) EGCG lisää LC3-II ja p62-proteiinin taso. HepG2 ja MEF-soluja käsiteltiin EGCG (60 uM) ja ilmoitetaan kestot kokonaan väliaineessa tai seerumia kuten on osoitettu. Solulysaatit kerättiin western blot. (B) EGCG lisää muodostumista GFP-LC3 puncta. MEF vakaat GFP-LC3 (m5-7 solua) käsiteltiin kanssa tai ilman 60 uM egcg 9 h seerumittomassa elatusaineessa, ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla (asteikko bar: 20 um). (C) EGCG ei edistä autohpagic muutostilassa. HepG2-soluja käsiteltiin seerumittomassa väliaineessa 60 uM egcg, 50 nM Baf A1, tai molemmat 9 tuntia. Solulysaatit kerättiin ja jollei western blot. (D) egcg ei ole mitään vaikutusta autophagosome-lysosomifuusio. MEF-soluja, joilla on stabiili GFP-LC3 viljeltiin seerumittomassa alustassa 9 h (kontrollina); käsiteltiin EGCG (60 uM x 9 h) seerumittomassa väliaineessa; tai viljeltiin EBSS alustassa 2 h (positiivisena kontrollina). Sitten solut, värjättiin LAPM-1, kuten on kuvattu kuviossa 2D. Solut analysoitiin konfokaalimikroskopiaa (asteikko bar: 10 pm).

Oil Red O Lipid pisaroiden Värjäys

Lipid pisara värjäys suoritettiin käyttäen vakiintunutta menetelmää [26]. Lyhyesti, HepG2-solut ympättiin 24-kuoppalevylle on peitelevyllä ja viljeltiin yön yli. Positiivisen kontrollin, soluja käsiteltiin 1 mM öljyhappoa seerumittomassa DMEM, joka sisälsi 1% BSA: ta. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin formaldehydillä, ja sitten värjätään 0,5% Öljy-Red-O isopropanolissa 30 min ja tumat vastapäivään värjättiin hematoksyliinillä.

Immunofluoresenssivärjäys

Tässä tutkimus, lysosomiin kalvoproteiini (LAMP-1) tutkittiin immunofluoresenssivärjäyksellä, joka perustuu vakiintunut menetelmä [27]. Käsiteltyjä soluja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja läpäiseviksi 0,01% saponiinia PBS: ssä 10 min. Kun oli salvattu 1% BSA: lla PBS: ssa 30 minuutin ajan, soluja inkuboitiin rotan anti-hiiri-LAMP-1 (1D4B) primääristä vasta-ainetta (Developmental Studies Hybridoma Bank) on 1:100 laimennus yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen Alexa Fluor 555 vuohen anti-rotta-sekundaarista vasta-ainetta (Invitrogen). Solut tutkittiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Olympus Fluoview FV1000) ja edustava solut valittiin ja valokuvattiin.

(A) MEF-solujen indusoituvan poistamisen Atg5 (m5-7 soluja) viljeltiin kanssa tai ilman 10 ng /ml Dox 4 päivän ajan, sitten EGCG (60 pm x 6 h), ja solulysaateista kerättiin ja jollei western blot. (B) muodostuminen ontelot on Atg5 riippumaton. m5-7 soluja, kuten on kuvattu paneeli A käsiteltiin EGCG (60 uM) 12 tunnin ajan, ja havaittiin valomikroskoopilla (asteikko bar: 30 um). (C) egcg-solukuolema on riippumaton autophagy. m5-7 soluja, kuten on kuvattu paneeli A käsiteltiin EGCG (60 uM) 24 tunnin ajan. Solun elinkelpoisuus määritettiin Hoechst-PI kaksinkertainen värjäys (n = 3, keskiarvo ± SD).

Lysosomaalinen Värjäys

Lysosomaalinen värjäys suoritettiin käyttäen Lyso-Tracker lysosomotropic koetin (Invitrogen) [28]. Käsitellyt solut inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa 5 nM lyso-Tracker. Solut tutkittiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla ja edustavat kuvat kuvattiin.

Membraanifraktion valmistus tekijänä Digitonin Extraction

menetelmä erottaa sytosolisia fraktioita membraanifraktioiden käytettiin, kuten aiemmin on raportoitu [29 ]. Sen jälkeen, kun nimetty hoitoja, solut suspendoidaan ensin uuttopuskuria (250 mM sakkaroosi, 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, johon on lisätty 250 ug /ml digitoniinia (Sigma) 10 minuutin ajan jäillä toistettiin vorteksoimalla, ja sen jälkeen sentrifugoimalla (90 sekuntia, 13000 rpm, 4 ° C). Saatu supernatantti säilytetään sytosolifraktion ja pellettiä membraanifraktion. Tämä optimaalinen pitoisuus digitoniinipuskuriliuosta uuttopuskuriin määritettiin jotka se antaa tehokasta louhintaa sytosolin proteiinien (analysoitiin immunoblot käyttämällä GAPDH merkkiaineena), jättäen samalla lysosomaalisen kalvoja ehjä (käyttäen katepsiini D merkkiaineena).

Western blotting

lopussa nimetyn hoitoja, solut lyysattiin kokonaan soluhajotuspuskurin (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glyserolia, 2% SDS, 2 mM DTT: tä, 100 uM PMSF ja proteinaasi inhibiittoricocktailia). Näytteet, joissa sama määrä proteiinien SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo (Bio-Rad). Sen jälkeen kun esto 5% rasvatonta maitoa, koetettiin nimetty ensimmäisen ja toisen vasta-aineita. Kalvo kehitettiin parannettu kemiluminesenssin menetelmällä (Thermo Scientific) ja visualisoidaan Kodak Image Station 4000R (Kodak).

(A) vaikutus EGCG solunsisäisiin hapan osastoihin. HepG2 solut olivat EGCG (60 uM) ja osoitetun kestot tai Baf A1 (50 nM) 6 tuntia. Happamat osastot leimattiin 5 nM Lyo-Tracker Red ja tutkittiin konfokaali (asteikko bar: 20 pm). (B) EGCG indusoi vuoto katepsiinit välillä lysosomien ja sytosoliin. Cell suoritettiin fraktiointi erottaa lysosomaalisen ja solulimafraktiot HepG2 käsiteltiin 60 uM EGCG seerumittomassa väliaineessa, kuten on ilmoitettu. Katepsiini D: tä havainnoitiin Western-blottauksella eri fraktioiden ja kokosolulysaateista. LAMP-1 käytettiin markkerina lysosomien. (C) EGCG aiheuttaa lysosomaalisen neutralointi ja soluliman happamoitumista. HepG2-soluja käsiteltiin 60 uM EGCG kuten seerumittomassa väliaineessa, mitä seurasi värjäys 5 ug /ml akridiinioranssia (AO) 30 minuutin ajan ja analysoitiin konfokaalisella (asteikko bar: 20 um).

akridiinioranssia (AO) Värjäys

AO on metakromaattisen ja heikon emäksen Kalvonläpäisevä fluoresoivaa väriainetta, jonka fluoresenssiemissio on pitoisuudesta riippuvainen, punaisesta korkeina pitoisuuksina (lysosomeihin) vihreäksi pieninä pitoisuuksina (sytosoliin), keltainen välituotteena joissakin olosuhteissa [19]. Meidän kokeissa solut ympätään peitelevyllä dia kammio 3 x 10

4 kuoppaa kohti. Sen jälkeen, kun nimetty hoitoja, ne ladattiin AO (5 ug /ml) 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, huuhdeltiin ja sitten tutkitaan -konfokaalimikroskoopilla virityksen aallonpituus 488 nm: ssä, kun taas kaksi erillistä emissiokaistat (505-570 nm ja 615 -754 nm) lisättiin samanaikaisesti talteen.

Detection of Reactive Oxygen Species

Analyysi solunsisäisten ROS suoritettiin käyttäen vakiintunutta menetelmää [30]. Lyhyesti, HepG2-solut osoitetaan hoitoja inkuboitiin 10 uM CM-H

2DCFDA 37 ° C: ssa 15 ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Edustavia kuvia ajanjaksoista valittiin ja valokuvattiin.

Tilastollinen analyysi

numeerista tietoa esitettiin keskiarvona ± SD vähintään 3 itsenäisen kokeen. Tilastollinen analyysi laskettiin Studentin

t

-testi (kaksihäntäinen jakelu, varianssi on erisuuruinen).

(A) Eri lysosomifuusio estäjät esillä erilaisia ​​vaikutuksia EGCG-solukuolema. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 pm x 24 h) seerumittomassa väliaineessa läsnä ollessa tai ilman erilaisten estäjien, mukaan lukien E64-D (10 ug /ml) + pepstatiini A: ta (10 ug /ml), klorokiinin (CQ , 25 uM), Baf A1 (50 nM). Solun elinkelpoisuus määritettiin Hoechst-PI kaksinkertainen värjäys (n = 3, keskiarvo ± SD).

p

arvot määritettiin Studentin

t

-testi (*

P

0,05, **

P

0,005). (B) SA, mutta ei Baf A1 tukkii sytosolin happamoituminen aiheuttamien EGCG. HepG2-soluja, joissa EGCG (60 uM), CQ (25 uM) tai Baf A1 (50 nM) seerumivapaassa väliaineessa 6 tunnin ajan, mitä seurasi värjäys 5 ug /ml AO 30 minuutin ajan ja analysoitiin konfokaalisella (asteikko bar: 20 pm).

(A) EGCG indusoi solunsisäistä ROS tuotanto. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 uM) ja 6 h kokonaan väliaineessa tai seerumia Käsittely H

2O

2 (200 uM) 3 h käytettiin positiivisena kontrollina. Solunsisäisen ROS havaittiin CM-H

2DCFDA ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla. (B) NAC estää ROS muodostumisen aiheuttama EGCG seerumittomassa väliaineessa. Soluja käsiteltiin EGCG (60 uM x 6 h) puuttuessa tai sen läsnä ollessa N-asetyylikysteiini (NAC, 5 mM). (C) Suojaus NAC EGCG-solukuolema. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 uM) tai H

2O

2 (200 uM) kuvan 12 tuntia poissa tai läsnä 5 mM NAC. Solun elinkelpoisuus määritettiin Hoechst-PI kaksinkertainen värjäys (n = 3, keskiarvo ± SD). **

P

0,005 verrattuna ryhmään ilman NAC (Opiskelijan

t

-testi). (D) NAC estää katepsiini D translokaation aiheuttamat EGCG. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 uM x 6 h) tai ilman 5 mM NAC. Sekä lysosomaalisen ja sytosolin fraktiot analysoitiin western-blotilla. (E) NAC estää EGCG aiheuttamaa soluliman happamoitumista. HepG2-soluja käsiteltiin EGCG (60 pm x 6 h) tai H

2O

2 (200 uM x 3 h) tai ilman 5 mM NAC. Sitten solut värjättiin AO 30 minuutin ajan ja analysoitiin konfokaalisella (asteikko bar: 20 um). (F) CQ ei vaikuta ROS tuotanto aiheuttama EGCG. HepG2-soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa 1 tunnin ajan, sitten lisättiin 60 uM egcg, tai ilman että läsnä oli 20 uM SA: ssa 6 tuntia. (G) kuvitusta mekanismeista EGCG välittämää kaspaasi-riippumaton solukuoleman, joihin ROS ja LMP.

Tulokset

seerumistarvaatio Parantaa EGCG aiheuttama solukuolema

EGCG on aiemmin raportoitu aiheuttavan apoptoottisen solukuoleman erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa [31]. Yksi yllättävä havainto aikana Tutkimuksemme on, että läsnä oli 10% seerumia on suuri vaikutus sytotoksisuuteen EGCG testattu. Kuten kuviossa 1A on esitetty, HepG2-soluissa olivat suurelta osin resistenttejä egcg kokonaan väliaineessa niinkin korkea kuin 240 uM viljeltiin korkeintaan 36 tuntia, kun taas egcg pystyy merkittävästi vähentämään solujen elinkelpoisuuden HepG2-soluissa, kun käsiteltiin seerumia. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin muissa ihmisen syöpäsolulinjoissa, kuten HeLa-soluja (tietoja ei esitetty). Näin ollen tulokset viittaavat siihen, että seerumistarvaatio pystyy edistämään egcg solukuolema.

Seuraavaksi asetetaan määrittämään muodossa indusoimaa solukuolemaa egcg seerumittomassa väliaineessa. Voit tehdä tämän, ensin tutkinut morfologiset muutokset ytimien kanssa Hoechstin värjäystä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, ytimet käsitellyissä soluissa EGCG eivät osoittaneet mitään ilmeistä muutoksia, kun taas selvästi ydin- tiivistyminen havaittiin soluissa, joita käsiteltiin TNFa: n ja CHX, positiivisena kontrollina tyypillinen apoptoottisen solukuoleman. Lisäksi, z-VAD-fmk, yleisen kaspaasi-inhibiittori ei suojaamaan egcg solukuolema, kun taas se estää täysin solukuolema, TNFa ja CHX (kuvio 1C). Johdonmukaisesti, ei ollut aktivoitu kaspaasi-3 (17 kDa) tai lohkaistaan ​​PARP (89 kDa) havaittiin Western-blottauksella (kuvio 1 D) HepG2-solut, joita käsiteltiin EGCG. Sen sijaan, kuten apoptoosi tunnusmerkkejä havaittiin soluissa, joita käsiteltiin TNFa: n ja CHX ja estää z-VAD-fmk. Yhdessä se on selvästi, että EGCG indusoi solukuolemaa seerumittomissa olosuhteissa on todennäköisesti kaspaasi-riippumaton apoptoottisen solukuoleman.

EGCG käynnistimet Sytosoliset vakuolisaation lysosomaalisten Dilation seerumittomalla Medium

Yksi morfologinen piirre havaittavissa valomikroskoopilla oli sytosolin vakuolisaatiota soluissa käsitelty EGCG seerumittomassa väliaineessa ja aika ja annoksesta riippuvat muutokset esitettiin kuviossa 2A. Erityisesti, ei ole tällaista vakuolisaatiota havaittiin soluissa, joita käsiteltiin EGCG kokonaan väliaineessa (kuvio 2B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös HeLa-soluissa, joilla on sama hoitoon (tietoja ei esitetty). Tällainen vakuolisaation näkyi myös soluissa värjättiin hematoksyliinillä, ydinvoiman väriaine (kuvio 2B). Toinen näkyvä morfologiset piirre käsitellyissä soluissa korkein pitoisuus EGCG seerumivapaassa väliaineessa on menetetty sytosolin sisällön lisääntynyt solun kokoa (kuvio 2B).

Ottaen huomioon läheisen suhteen vakuolisaatiota ja solukuolemaa, Yritimme sitten selvittää luonne lähteet sytosolin vakuolien. Vakuolisaatiota raportoitiin indusoivan monenlaisia ​​induktiivinen ärsykkeisiin ja mukana monia erilaisia ​​organellit ja rakenteita, kuten endoplasmakalvostoon (ER), Golgin, ja lysosomiin [32]. Tutkimuksessamme ensin sulkea pois sitä mahdollisuutta, että onteloita aiheuttama egcg ovat lipidi putoaa, koska ne ovat negatiivisia värjäystä Oil Red O (kuvio 2C), toisin kuin solut, joita käsiteltiin OA, joita käytettiin positiivisena kontrollina. Lisäksi tällaiset ontelot myös ei liittynyt ER: ään tai Golgin perustuu immunovärjäystä vastaavien markkeriproteiinien (tuloksia ei ole esitetty). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että tällaiset vacuoles hyvin kolokalisoituvat kanssa lysosomaalisen kalvoproteiini LAMP-1 (kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että onteloita osallistuivat tiiviisti lysosomeihin.

EGCG Blocks Autophagic Flux

se, että seerumistarvaatio parantaa EGCG-solukuolema saa meidät tutkimaan roolia autophagy in EGCG välittämän solukuoleman. On hyvin tunnettua, että nälkään indusoi autophagy ja autophagy läheisesti osallinen solukuoleman prosessi, joko pro-selviytymisen tai pro-kuolema mekanismi [33]. Tämän testaamiseksi ensin tutkinut autophagy tasolla käsitellyissä soluissa EGCG, analysoimalla LC3-II -tason, joka on laajalti käytetty merkkiaine autophagosomes [34]. Kuten kuviossa 3A on esitetty, oli merkittävä kasvu LC3-II egcg-käsitellyissä soluissa, sekä HepG2 ja MEF, seerumittomassa väliaineessa, mutta ei kokonaan väliaineessa. Samoin oli merkittävä kasvu GFP-LC3 puncta in MEF vakaa ilmentyminen GFP-LC3 (kuvio 3B). Tässä tutkimuksessa käytimme useita lähestymistapoja tutkia lisääntynyt autophagic markkereita havaittiin EGCG-käsitellyissä soluissa johtuu tehostettuun autophagic flux tai tukos autophagosome kypsymisen tai hajoaminen on myöhäisessä vaiheessa. Ensimmäinen, käytimme bafilomysiini A1 (Baf A1), estäjä lysosomaalisen V-ATPaasin, estää autophagosome-lysosomifuusio [35]. Erityisesti Baf A1 ei lisätä LC3-II-tasoja (kuvio 3C). Toiseksi tutkimme muutos p62-proteiinin tasoa. Tiedetään, että p62 selektiivisesti sisällytetään autophagosomes suoraan sitoutumisen LC3 ja tehokkaasti hajottaa autophagy [34]. Havaitsimme selvää kerääntymistä p62-proteiinin sekä HepG2 ja MEF käsiteltiin EGCG (kuvio 3A, 3C). Lopulta huomasimme, että EGCG hoito paransi merkittävästi kolokalisaation autophagosome (merkitty GFP-LC3) ja lysosomifuusio (merkitty LAMP-1), verrataan kontrolliin solujen seerumin nälkään (kuvio 3D). Yhdessä kaikki tiedot edellä kuvatut osoittavat selvästi, että EGCG kykenee estämään autophagic vuo estämällä myöhäisessä vaiheessa autolysosome hajoamista.

EGCG välittämä solukuolema on Riippumaton Autophagy

Kun perustamisesta estävä vaikutus egcg on autophagy, pyrimme testaamaan, onko häiriintyy autophagic vuon edistää egcg solukuolema. Tässä käytimme m5-7 solut indusoituvan Atg5 poistamisen [24]. Kuten kuvassa 4A on esitetty, lisäksi on doksisykliini (Dox) poistetaan Atg5 ja muutos LC3-II. Mielenkiintoista on, poistetaan Atg5 ei ollut vaikutusta sytosolin vakuolisaatiota aiheuttama EGCG (kuvio 4B), ja lopulta solukuolemaan (kuvio 4C). Siksi uskotaan, että EGCG välittämä solukuolema on riippumaton Atg5 tai autophagy.

EGCG indusoi Lysosomaalinen Membrane läpäiseväksi (LMP) B

Aiemmin tietoja löytyy tässä tutkimuksessa ilmi mahdollisuus lysosomaalisen vahinkojen aiheuttama EGCG. Jotta edelleen tutkia muutoksia lysosomaalisen toiminto aiheuttama EGCG, ensin käytetty lyso-Tracker Red (LTR) merkitä ja seurata hapan solunsisäisiin osastoihin (lysosomeihin) elävissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 5A, lisäksi egcg vähensi huomattavasti fluoresenssin ajasta riippuvalla tavalla, mikä osoittaa vähennystä solunsisäisen happamien komponenttien aiheuttama egcg hoitoon. Kuten odotettua, hoito Baf A1 täydellisesti poisti LTR värjäytymisen takia poistetun lysosomaalisen happamoitumista.

Koska acidotropic anturi, vähentynyt LTR fluoresenssi voi paitsi vastaamaan lisäystä lysosomaalisissa pH, mutta myös siihen mahdollisuuteen lysosomaalisen kalvo läpäiseväksi (LMP) [19]. Sen määrittämiseksi, ovatko EGCG voi laukaista LMP, jakelu katepsiini B ja katepsiini D, kaksi keskeistä lysosomaalisten entsyymien, verrattiin immunopilkkujen välillä sytosolin ja membraanifraktioiden. Kuten kuviossa 5B on esitetty, oli aika-riippuva lisäys kypsän muodon katepsiini D soluliman uuttamalla käsitellyissä soluissa egcg, joka vastaa lasku membraanifraktion. Tällainen aikamallissa on itse asiassa vastaa vähentäminen LTR värjäyksen kuviossa 5A, joka osoittaa vuodon ja lysosomaalisen sisällön sytosoliin.

egcg aiheuttama LMP vahvistettiin edelleen värjäämällä akridiinioranssilla (AO) , joka on lysosomotropic metakromaattisen fluorokromi, mikä yleensä fluoresoi punaista sisällä lysosomeihin, joissa se on erittäin keskittynyt, ja heikosti vihreä sytosoliin pitoisuutta on pienennettävä [19]. Kuten kuviossa 5C, EGCG hoito aikariippuvainen johti menetykseen punaista puncta lysosomeihin, ja kasvu leviää punaisen fluoresenssin sytosoliin, jolla johdonmukaisesti aikamallissa kanssa LTR värjäys ja vuoto katepsiini D esitetty aikaisemmin. Tällaiset havainnot viittaavat siten siihen, että EGCG aiheuttaa repeämä lysosomiin, joka sitten laukaisee vapauttamaan hapan sisältö lysosomaalisen ontelosta sytosoliin, jossa vähentäminen lysosomaalisen happamoitumisen ja dramaattinen kasvu sytosolin happamoitumista. Huomionarvoista, nuk- vihreä fluoresenssi myös parannettu ajan, mikä osoittaa ytimet happamaksi pitkäaikainen hoito EGCG (kuvio 5C). Tärkeys tällaisia ​​muutoksia EGCG-solukuolema jää vielä tutkia.

EGCG indusoi LMP-riippuvainen Cell Death

Tähän asti olemme osoittaneet, että EGCG indusoi kaspaasin riippumaton solukuoleman riippumatta autophagy. Vielä tärkeämpää on, olemme tunnistaneet lysosomifuusio kuin pääkohde EGCG, osoituksena lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi, menetys sytosolin happamoitumisen ja lysosomien laajentuma. Tässä pyrittiin testaamaan onko heikentyvän lysosomeihin näyttelee kausaalinen rooli EGCG-solukuolema. Ensinnäkin, käytimme useita erilaisia ​​lysosomifuusio estäjiä ja niiden joukossa, klorokiinin (CQ), joka on lysosomotropic agentti tarjosi tehokkaimman suojan EGCG-solukuolema (kuvio 6A). Kaksi katepsiini estäjät (E64-D ja pepstatiini A) olivat myös tehokkaita, vaikkakin paljon vähäisemmässä määrin.