Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain solukuolemaa moduloidaan luontainen solukuolemareittiin ohjaa pro – ja anti-apoptoottisten jäsenten Bcl-2-perheen. Ylössäätöä Antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäseniä on osoitettu tukahduttaa solukuolemaan prekliinisissä malleissa ihmisen syövän ja on liitetty ihmisen syövän etenemiseen. Edellinen voitto-of-function opintoja RIP1-Tag2 malli haiman saarekesolujen Karsinogeneesin joihin yhtenäinen tai paikallinen /ajallinen yli-ilmentyminen Bcl-x

L, osoitti nopeutetun kasvaimen muodostumisen ja kasvun. Arvioida nimenomaan roolia endogeenisen Bcl-x apoptoosin säätelyyn ja syövän etenemistä tässä mallissa, me kehitimme haiman β-solujen erityisiä tyrmäyksellä molempien alleelien

Bcl-x

käyttäen Cre-LoxP järjestelmä homologista rekombinaatiota. Yllättäen ei ollut merkittävää vaikutusta tuumorisolujen apoptoosin hinnat tai kasvaimen kasvua

Bcl-x

hiirten. Muut antiapoptooppinen Bcl-2-perheen jäsenet ilmaisivat mutta ei sisällöllisesti muuttanut mRNA-tasolla

Bcl-x

-null kasvaimia, viittaavia vikasietoisuus ilman korvaavia transkription säätelyä ylöspäin. Mielenkiintoista, kajoavan karsinoomien vähennettiin, ja kasvainsolujen puuttuu Bcl-x oli heikentynyt invaasio kaksikamarinen trans-hyvin määrityksen olosuhteissa jäljitteleviä hypoksiaa. Siten, vaikka funktio Bcl-x tukahduttamaan apoptoosin ja näin edistää kasvaimen kasvua on ilmeisesti tarpeeton, geneettinen ablaatio implicates Bcl-x valikoivasti helpottaa invaasio, sopusoinnussa tuoreessa raportissa dokumentointi pro-invasiivisia kykyä Bcl-x

L upon eksogeeninen yli-ilmentyminen.

Citation: Hager JH, Ulanet DB, Hennighausen L, Hanahan D (2009) Genetic ablaatio Bcl-x Vaimentaa invasiivisuus vaikuttamatta Apoptoosi tai kasvaimen kasvua hiirimallissa haiman Neuroendokriininen Syöpä. PLoS ONE 4 (2): e4455. doi: 10,1371 /journal.pone.0004455

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 23 elokuu 2008; Hyväksytty: 26 joulukuu 2008; Julkaistu: 11 helmikuu 2009

Copyright: © 2009 Hager et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat AP Giannini Foundation for Medical Research (DBU), National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisteri (NIDDK) (LH), ja avustusta National Cancer Institute (DH, R01CA45234). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kaikille pahanlaatuisten vaurioiden kasvavan massan ja pahanlaatuinen potentiaalia, soluproliferaatiota on ylittää solukuoleman [1]. Tätä varten ihmisen kasvaimista kytkeä tai irrottaa erilaisia ​​polkuja paeta tai minimoida apoptoosin. Tarve alas-moduloida apoptoosia johtuu myös siitä, että aktivoivat mutaatiot onkogeenien, sekä yli-ilmentymisen villityypin onkogeenin alleeleja, herättää paitsi hyperproliferaation, mutta myös solukuolemaan [2] – [4]. Huomattava määrä todisteita tukee ehdotusta, että ilman jonkinasteista tukahduttaminen apoptoosin, onkogeenin ilmentävien solujen eivät voi edetä ohi suhteellisen pieni, premaligneja proliferatiivisia leesioita [1], [5].

Ensimmäinen suora geneettinen yhteys modulaatio apoptoosin ja kasvaimen kasvu tuli löytö, että ilmaus

Bcl-2

geeni väärin säädellystä kautta kromosomi translokaatio in follikulaarinen lymfooma, ja että tämä geeni on homologinen

C. elegans

solu- kuoleman säätelijänä, ced-9 [6] – [9]. Bcl-2 osoittautui perheen prototyyppi rakenteellisesti samankaltaisten apoptoottisten sääntelyviranomaiset, jaettu kahteen alaryhmään, jotka vaihtoehtoisesti tukahduttaa tai apoptoosin [10]. Anti-apoptoottisen varren Bcl-2-perheen sisältää Bcl-2, Bcl-x (useita anti-apoptoottisten silmukoitumisvarianttia), Bcl-w, A1, Mcl-1 ja Boo [10] – [12]. Apoptoosin aktivaatiosta vasteena onkogeenin indusoimaa liikakasvuun on kuvattu erilaisia ​​geneettisesti hiiren malleja syövän, ja erityisesti kaksi mallia haiman neuroendocrine saarekesolujen syöpä. Eräässä tällaisessa mallissa, RIP1-Tag2 [13], [14], SV40: n T-antigeenejä konstitutiivisesti, että β-solujen haiman hallinnassa rotan insuliini-promoottorin, jolloin monivaiheisessa väylän invasiivinen karsinooma, joka on stokastinen luonnossa ja ajallisesti pitkällinen. 2-3 viikon iässä, normaalin synnytyksen jälkeistä kehityshäiriöitä leviämisen saarekesolujen kapenee pois, ja aikuisen hiiren on suhteellisen hidas vaihtuminen β-solujen, joilla on alhainen proliferaationopeus kompensoi alhainen apoptoottisia nopeudella, mikä johtaa hyvin vaatimaton kasvu β-solujen massa iän. Sen sijaan β-solujen RIP1-Tag2 saarekkeiden alkaa liikauudiskasvuisten 3-4 viikon iässä yhdessä samanaikaisen aktivoinnin apoptoosin. Varhainen tutkimus kertoo, että apoptoosin oli korkeimmillaan angiogeenisen luodolle vaiheessa, mutta oli laskenut merkittävästi-moduloitu kasvaimissa, mikä viittaa siihen, että vastustuskyvyn solukuolemaa kriittinen vaihe kasvaimen kehittämiseen angiogeenisten saarekesolujen esiasteista [15]. Uudempi tutkimus tämä malli on osoittanut, että alas-modulaatio ei aina ole, että myöhäisen vaiheen kasvaimet (mukaan lukien invasiiviset karsinoomat) nykyisellä takaisinristeytysanalyysillä sukupolvien tyypillisesti apoptoottista hinnat kaltaisia ​​angiogeenisten saarekkeiden, mikä viittaa hienovaraisempaa ilmiöitä leikkiä laaja kasvaimen kasvua (viite [16]). Kaksi hyvin määritelty vaimentimet apoptoosin on tunnistettu tässä mallissa: toiminnallinen inaktivointi p53 kautta suurten T-antigeenin ilmentymisen, ja ylös-säätely selviytymisen tekijä IGF-II [17], [18]. Geneettiset tutkimukset, joissa ristejä IGF-II null alleelin ilmoitti pitkälti toimii selviytymisen tekijä tässä mallissa, että ilman IGF-II herättänyt paljon lisääntynyt (5 x) apoptoottisten hintojamme hyper-proliferatiivisia leesioita, ja pieniä kasvaimia aiheutuvat oli vähemmän pahanlaatuinen solu fenotyyppi; etenkin, leviämisen pysyi ennallaan [18], [19].

osoitus, että anti-apoptoottiset jäsenet Bcl-2-perheen voi moduloida solukuolemaa tässä mallissa tuli kokeellisen yli-ilmentyminen

Bcl-x

L

in β-soluihin rotan insuliini promoottori (

RIP-Bcl-x

L

), mikä johti tukahdutetaan apoptoosin ja kasvu kasvaintaakkaa sekä yleisesti ”kiihdytys” kasvaimen reitin [15]. Viime aikoina, samaan RIP-

Bcl-x

L

siirtogeeni on myös osoitettu tukahduttaa apoptoosin toisessa hiirimallissa saarekesolujen karsinooma, jossa myc-fuusioproteiinia, myc

TAM, ilmentyi β-solujen valvonnassa rotan insuliinin promoottoria [20]. Myc

TAM on aktiivinen vain läsnäollessa tamoksifeenin mahdollistaa indusoituvaa ja palautuvia geeniekspressiota. Synnytyksen jälkeinen hiirten käsittely tamoksifeenin johtaa nopeaan induktio myc

TAM ilmaisu samanaikainen hyper-leviämisen β-soluihin. Kiinnostavaa kyllä, tämä hyper leviämisen mukana oli massiivinen β-solujen apoptoosin, joka johti saareke kiertyminen sisällä 6-10 päivää. Yli-ilmentyminen

Bcl-x

L

kautta samalla

RIP-Bcl-x

L

siirtogeenin tukahdutetaan tämän apoptoosin, mikä johtaa kasvuun β-solujen massan ja nopea eteneminen invasiivisia karsinoomia. Näin ollen kahdessa eri siirtogeenisen hiiren mallia saarekesolujen karsinooma, jonka saa aikaan kahden toiminnallisesti erillistä onkoproteiineja, yli-ilmentyminen

Bcl-x

L

tukahduttaa apoptoosin, mikä johtaa nopeutetun kasvaimen muodostumisen. Tulokset osoittavat, että apoptoosin havaittu näissä kasvaintyypeissä on, ainakin osittain, välittyy mitokondrioiden syöttämällä reitin. Tässä raportissa, tutkimme roolia että endogeenisen Bcl-x pelaa apoptoosin moduloinnissa ja kasvaimen kasvu RIP1-Tag2 mallin kautta kohdennettua poistaminen geenin onkogeenin ilmentävien β-soluihin käyttäen Cre /loxP-järjestelmä.

tulokset

Bcl-x ilmentymisen RIP1-Tag2 saarekesolujen syövän synnyn

in situ hybridisaatio yleiseurooppalainen isoformi koetin haimakudoksesta osastoja RIP1-Tag2 hiiret aiemmin ehdottanut, että

Bcl-x

mRNA oli vaatimattomasti säädellään ylöspäin kasvaimissa verrattuna esiasteleesioita [15]. Sen vahvistamiseksi, että Bcl-x on huomattavasti ilmaistu proteiinitasolla aikana luoto tuumorigeneesiprosessin menimme arvioimaan tasot Bcl-x-proteiinin Western-blottauksella käyttämällä lysaatit normaalista luotoja ja diskreetti vaiheista haiman saarekesolujen tuumorigeneesiä RIP1-Tag2 hiirillä. Kuten kuviossa 1 juova, joka liikkuu 27 kDa sopusoinnussa Bcl-x

L isoformi havaittiin samalla tasolla normaaleissa luodot ja kolmessa neoplastisten vaihetta. Lisäksi hieman nopeammin liikkuva vyöhyke, mahdollisesti vastaa vaihtoehtoisen silmukointivariantin Bcl-x

β [21], [22], havaittiin angiogeenisten luodolle ja kasvain vaiheessa, mutta ei normaali luodoilla tai hyperplastista luoto vaiheessa. Näin ollen yleiseen tasoon Bcl-x proteiinin vaatimattomasti koholla angiogeenisen luodolle ja kasvaimen vaiheissa.

Proteiiniekstraktit altaat normaalien, ei-siirtogeenisiä saarekkeiden (N), hyperplastisessa saarekkeiden (H), angiogeeninen saarekkeita ( A), ja kasvaimet (T) välillä RIP1-Tag2 hiiriä immunoblotattiin vasta Bcl-x ja β-aktiini kuin latauskontrollina. 27 kDa: n vyöhyke edustaa Bcl-x

L; sitä nopeammin liikkuva vyöhyke läsnä angiogeenisten saarekesolujen ja kasvainuutteiden voi edustaa vaihtoehtoista silmukointivariantin, Bcl-x

β.

generointi β-solun geenistä tyrmäyksellä bcl-x

arvioimiseksi toiminnallista roolia Bcl-x RIP1-Tag2 kasvainten synnyssä, me inaktivoitu

Bcl-x

geenin β-solujen haiman käyttäen Cre /loxP-järjestelmän homologisen rekombinaation. RIP-Cre linjan palveluksessa ilmentää Cre noin 82%: n β-soluihin, välittävä tehokas rekombinaation loxP [23], [24]. ”Floxed” alleeli

Bcl-x

,

Bcl-x

fl /fl

, jossa eksonit 1 ja 2 reunustaa loxP, on osoitettu olevan tehokas substraatti Cre-rekombinaasia, joka tuottaa nolla-alleelin seuraavat rekombinaation muissa kudoksissa [23] – [25]. Ensin syntyy

RIP-Cre

,

Bcl-x

fl /fl

hiiriä (ja erilaiset valvonta genotyyppien) puuttuu onkogeeni, ja vuotiaiden heidät ulos 12 viikkoa arvioida mahdolliset vaikutukset β solujen kehitystä ja homeostaasin.

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja

Bcl-x

fl /fl

hiiriä syntyi odotettua Mendelin suhteissa, ja saavutti aikuisuuteen ilman varhain kuolleisuutta tai ilmeistä patologian. Tutkimme H

Bcl-x

fl /fl

hiirillä olisi, että β-solujen Poistetaan

Bcl-x

kuoli, ja siten normaali saarekkeet havaittu johdettiin kuin rekombinoitua, ” pakenijaksi ”β-soluja, jotka eivät ilmentäneet siirtogeeniä johdettu Cre. Arvioimaan tätä mahdollisuutta, me eristetty genominen DNA altaat saarekkeiden eristettyjen

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiiret ja suoritettiin PCR-analyysi alukkeilla, jotka vahvistavat ja erottaa rekombinoidun alleeli ei-rekombinoitua alleelin (kuvio 2B). Tehokas rekombinaatio havaittiin

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

saarekkeita. Kuten odotettua, uudelleenyhdistetyt alleeli ei havaittu kontrolleilla puuttuu RIP-Cre-siirtogeenin (tai perna

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiiriä, jossa Cre ei ole ilmaistu).

(A) H

RIP-Cre, Bcl-x

+ /+

;

ja RIP-Cre, Bcl-x

fl /fll

. Moniosaista kunkin eläimen kuvattu mikrovalokuvia tutkittiin. (B) genomista DNA altaat haiman saarekkeiden eristettiin hiiristä erillisiä genotyyppien. PCR suoritettiin käyttäen aluketta, joka sitoutuu vastasuuntaan 5 ’oxP ja toinen aluke, joka sitoutuu 3 ”alavirran LoxP. PCR-fragmentti ei-rekombinoitua alleeli ja rekombinoitua alleeli ovat 2,9 kb: n ja 150 bp, vastaavasti. Haiman saarekkeet eristettiin (materiaalit ja menetelmät) 4-6 eläimistä kunkin genotyypin ja yhdistettiin.

arviointi toiminnallista roolia Bcl-x RIP1-Tag2 tumorigeneesin

tutkimiseksi rooli Bcl-x apoptoosin moduloinnissa aikana RIP1-Tag2 tumorigeneesin, me syntyy yhdiste hiiriä, jotka olivat homotsygoottisia

Bcl-x

fl /fl

alleeli ja joko suorittaa sekä RIP1-Tag2 ja RIP-Cre siirtogeenien, tai vain RIP1-Tag2 siirtogeenin. Lisätarkastuksia sisältyvät hiiret, jotka kantoivat RIP1-Tag2 siirtogeenin, ja joko

Bcl-x

+ /+ tai Bcl-x

fl /+

alleeleja. Me vuotiaiden ulos ikäluokat näiden hiirten 13 viikon iässä, ja määrällisesti sekä kasvaintaakkaa (tilavuus) ja kasvaimen numero. Tavoiteltu tyrmäys

Bcl-x

ei johtanut merkittävää eroa kasvaintaakkaa (kuvio 3A). Tämä lähinnä ”villityypin” tuumoritaakka tyrmäys eläimillä liittyi noin 40% lasku kasvain määrä, mutta tämä vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 3B). Voit selvittää tämän puutteen avointa fenotyyppisen vaikutusta kasvaimen kasvua heijastui myös apoptoottisen korko, suoritimme TUNEL määrityksiä formaliinikiinnitetyt parafiinileikkeillä iältään

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

eläimiä. Ehdottivat kasvaintaakkaa ja kasvainten lukumäärä tiedot, ei ollut merkittävää eroa apoptoottisten korko kasvaimia ”knockout” versus kontrolli eläimillä (kuvio 3C).

(A ja B) Vertailu kasvaimen tilavuuden ja määrä. Makroskooppisesti näkyvä kasvaimia 13 viikon ikäisistä eläimistä leikattiin, liitteenä exocrine kudos poistetaan ja mitataan hallitsija. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa V = (x * y

2) x 0,52. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM; + /+ Ja FL /+: n = 7; FL /FL: n = 24; RIP-Cre; Fl /Fl: n = 22. Tilastollinen merkittävyys määritettiin epäparametrinen T-testiä (Mann-Whitney). P = 0,98 (D) Apoptotic korko. Apoptoottiset solut, jotka määritetään TUNEL merkitsemistä haiman osien 13 viikon ikäisistä eläimistä. Data edustavat keskiarvoa ± SEM (n = 5 hiirtä /ryhmä). Prosentuaalinen TUNEL

+ solut laskettiin kohdissa 16-17 yksittäisten kasvainten /ryhmä. Tilastollinen merkitys määräytyy epäparametrinen T-testiä (Mann-Whitney). P = 0,98.

Voit tarkistaa, että

Bcl-x

oli tehokkaasti poistettu kasvaimet syntyvät

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiiriä, me seurataan rekombinaatio oli PCR-pohjainen määritys on genomista DNA: 12 sattumanvaraisesti kasvaimet (alue 5,2 mm

3-229 mm

3) : 10/12 kasvaimet näytteillä täydellinen rekombinaatiolla, 1/12 osoittivat osittaista rekombinaation, ja 1/12 ei ollut rekombinaatiota (kuvio 4A ja tietoja ei ole esitetty). Koska Cre-siirtogeenin ei ole tehokkaasti ilmaistaan ​​10-20% β-solujen, ja toteaa, että suhde kasvainten rekombinaatio- vs. ei-rekombinoitua

Bcl-x

alleelien oli -10 %, voimme päätellä, että ei ole valikoivaa kasvua etuna

Bcl-x

+ /+

solut, jotka ilmeni klonaalisen seuraus β-solujen kätkeminen ei-rekombinoitu alleelit, toisin kuin tilanne muiden geenien, jotka ovat kriittisiä rooleja RIP1-Tag2 kasvaimien syntyyn (esim VEGF [26]). Huomattakoon, että joitakin suurimpia kasvainten näytteillä täydellinen rekombinaatiolla, mikä tukee käsitystä, että menetys Bcl-x toiminta ei haittaavaa kasvaimen kasvua. Toisena mittana rekombinaation tehokkuus, arvioimme

Bcl-x

ilmentymisen kvantitatiivisen RT-PCR (Taqman) ensimmäisen juosteen cDNA on peräisin 10 itsenäistä

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia ja 10

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

säätimet (kuviot 4B ja S1). Oli merkittävä väheneminen

Bcl-x

ilmentymisen 9/10

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimissa verrattuna

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

valvontaa, mikä osoittaa, että

Bcl-x

poistettiin suurin osa β-solujen näiden kasvainten. Kuitenkin yksi kasvain ilmaistu villityypin tasot

Bcl-x

, mikä viittaa siihen, että se oli seurausta siitä, β-solu, joka ei ilmaissut Cre, ja siten kanna ei-rekombinoitunutta alleeli. Tämä ennustus vahvistettiin seulomalla kaikki 10

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimet Cre ilmaisun, ja kuten on ennustettu tämän poikkeuksellisen kasvain ei ilmaista Cre, toisin kuin 9 kasvaimia, jotka osoittivat paljon pienempi

Bcl-x

ilmaisu (kuvio 4C). Ilman tätä Cre-negatiivinen, Bcl-x-positiivinen ”pakenijaksi” kasvaimen analyysi, keskiarvo

Bcl-x

ilmaisun ”KO” kasvaimia oli 9,5 kertaa pienempi kuin valvontaa. Siten poistetaan

Bcl-x

on β-soluosastoon näistä kasvaimista johti ~90%: n vähennys

Bcl-x

ilmentymisen, mikä vahvistaa, että voittopuolisesti

Bcl-x

ilmentymisen RIP1-Tag2 kasvaimia on β-solujen alkuperä ja että Cre oli tehokkaasti poistamalla

Bcl-x

ilman näkyvää fenotyyppisiä seuraus. Jäljelle jäänyt

Bcl-x

ilmentyminen todennäköisesti peräisin strooman komponentti vaurioita (pääasiallisesti verisuonten ja immuunijärjestelmän solutyyppejä), vaikka emme voi muodollisesti sulkea pois mahdollisuutta, että nämä kasvaimet ovat oligoklonaalinen, ja että jotkut jäljellä

Bcl-x

mRNA on peräisin suhteellisen harvinaisia ​​β-solujen kätkeminen kuin rekombinoitua

Bcl-x

alleeleja. Sen määrittämiseksi, onko merkittävä vähentäminen

Bcl-x

mRNA havaittu Bcl-x ”KO” kasvaimia johti oikeassa väheneminen Bcl-x-proteiinin tasot, toteutimme Western blot analyysi lysaatit 5 riippumaton

RIP1-Tag2, RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia. Yhdenmukainen PCR-pohjainen analyysi rekombinaation ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Bcl-x

mRNA-tasot, Bcl-x-proteiinin tasot olivat merkittävästi vähäisempää kuin villityypin (wt) kasvaimia (kuvio 4D) osoittaa, Cre-välitteistä deleetion

Bcl-x

lokukseen valtaosa beta solujen

RIP1-Tag2, RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia. Lisäksi, tämä tulos vahvistaa sen, että immunoreaktiiviset bändejä havaittu normaalissa saarekkeiden ja RIP1-Tag2 leesioita (kuvio 1) olivat itse asiassa johdettu

Bcl-x

. Yhdessä tulokset tukevat päätelmää, että Bcl-x ei ole keskeinen rooli moduloinnissa kasvaimen apoptoosia tämän reitin, ja että sen toiminta on joko kuin keskeisiä, tarpeeton, ja /tai helposti korvata muita geenejä, kuten muut antiapoptoottisia jäseniä Bcl-2-perheen.

(A) Tehokas rekombinaatio

Bcl-x

in

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia. Genomi-DNA: ta eristettiin yksittäisistä kasvainten

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /f

l

hiirillä. PCR suoritettiin käyttäen aluketta, joka sitoutuu vastasuuntaan 5 ’oxP ja toinen aluke, joka sitoutuu 3 ”alavirran LoxP. PCR-fragmentti ei-rekombinoitua alleeli ja rekombinoitua alleeli ovat 2,9 kb: n ja 150 bp, vastaavasti. (B)

Bcl-x

ilmentyminen vähenee merkittävästi

Bclx

-ko kasvaimia. Kvantitatiivinen RT-PCR (Taqman) suoritettiin 1

st säikeen cDNA syntetisoitiin RNA eristettiin yksittäisistä kasvaimia

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

. Virittävän koetin että havaitaan kaikki suuret antiapoptooppinen silmukoitumisvarianttia käytettiin. Geenien ilmentyminen oli normalisoitiin ja funktiona GAPDH ilmaisun. (D) RIP-Cre siirtogeeni ei ilmenny

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia, jotka säilyttävät

Bcl-x

ilme. Cre-mRNA: n ilmentymistä seurattiin RT-PCR: llä 1

st cDNA-juoste syntetisoidaan RNA: sta eristettiin yksittäisiä kasvaimia

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

hiirillä. Seuraavat 27 PCR-sykliä, cDNA fraktioitiin agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä. PCR-tuote on 520 bp. * Ei-rekombinoitua, Cre-negatiivinen kasvain. (D) Bcl-x-proteiinin tasot ovat vähentyneet huomattavasti

Bcl-x

-ko kasvaimia, kuten kävi ilmi, Western-blottauksella, kuten kuviossa 1. β-aktiini käytetään latauskontrollina.

Expression profilointi muiden Bcl-2-perheen jäsenten saarekesolujen kasvainten synnyssä

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään, onko 5 muita tunnettuja anti-apoptoottisen jäseniä Bcl-2-perheen voidaan ilmaista aikana RIP1-Tag2 tuumorigeneesiä ja näin mahdollisesti kompensoiden puuttuminen Bcl-x. Kvantitoimme

Bcl-2

,

Bcl-w

,

A1

,

Mcl-1

ja

Boo

mRNA-tasoja käyttäen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi (Taqman) 1

st säikeen cDNA normaalista saarekkeita (eristetty ei-siirtogeenisiä hiiriä), hyperplastinen luotoa, angiogeenisen luodot, ja kasvainten RIP1-Tag2 hiirillä. Kuten kuvioissa 5 ja S2, neljä-geenit; Viidennen,

Boo

, ei havaittu joissakin näytteiden ja oli erittäin vaihteleva kaksoiskokeina määrityksissä, johdonmukainen sen ilme on rajoittunut pitkälti miehen ja naisen sukupuolielimet [27]. Niistä neljä ilmaisi jäsentä, vain

Bcl-w

ilmentyi vastaavia määriä kuin

Bcl-x

. Ekspressiotasot esitetään suhteessa kontrolliin geenin, GAPDH, joka osoitti ainakin muuttuvat ilmentymisen verrattuna L19 ja Gus normaalin saarekkeiden ja eri neoplastisten saarekesolujen vaurioita (kuva S3). Sen määrittämiseksi, yksi tai useampi anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsentä oli transcriptionaly säädelty ilman Bcl-x ja siten mahdollisesti toiminnallisesti kompensoi

Bcl-x

”knockout”, suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi samalla 10 itsenäistä

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

ja 10

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

kasvaimia, joissa

Bcl-x

ilmentyminen kvantifioitiin (kuvassa 4B). On osoittautunut olevan mitään merkittävää eroa mRNA: n ilmentymisen tasoja näissä 5 geenien (kuviot 6 ja S4). Lisäksi Taqman analyysi saman kasvaimen cDNA ylössäätöä jäsenten IAP luokan anti-apoptoottisten proteiinien (CIAP1, CIAP2, surviviinia XIAP, ja BRUCE) vastaavasti ei havaittu merkittäviä transkription säätely ylöspäin näiden geenien

Bcl-x

-ko kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty).

mRNA-tasot pro-selviytymisen Bcl-2-perheen jäsentä

Bcl-x

,

Bcl-2

,

Bcl-w

,

A1

,

Mcl-1

ja

Boo

arvioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR (Taqman) ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA-altaat (4-6 eläintä per pool) normaalien, ei-siirtogeenisiä luotoa, ja hyperplastisten luotoja, angiogeenisen luodot, ja kasvainten RIP1-Tag2 hiirillä. Geenien ilmentyminen oli normalisoitiin ja piirrettiin prosentteina GAPDH ilmaisun.

mRNA-tasot on

Bcl-x

,

Bcl-2

,

Bcl-w

,

A1

,

Mcl-1

ja

Boo

arvioitiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR (Taqman) ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin totaali-RNA eristetty yksittäisistä kasvaimia

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

(n = 9 kasvainten 5 hiirtä, 1 kasvain todettiin ilmaista Cre ja niillä villityypin tasot

Bcl-x

kuulu näihin data) ja

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

-hiiriä (n = 10 kasvainten 5 yksittäisistä hiiristä). Suhteellinen geenin ilmentyminen normalisoitiin ja esitettiin prosentteina GAPDH ilmaisun. Data edustaa keskiarvo ± SEM. Tilastollinen merkitys määräytyy epäparametrinen T-testiä (Mann-Whitney). P 0,05 pidettiin merkittävinä.

Role of Bcl-x moduloinnissa hyökkäyksen RIP1-Tag2 tumorignesis

Lisäksi apoptoosin moduloinnissa kasvainsoluissa, on raportoitu, että Bcl- 2 perheenjäsenet voivat lisäksi edistää syövän synnyn kautta vaikutuksia kasvainsolun invaasiota [28] – [31]. Yhdessä raportti, erottaminen toisistaan ​​kyky Bcl-x

L moduloida apoptoosia ja invasiivisuus ihmisen gliooma solujen havaittiin [29]. Viime aikoina säätely ylöspäin Bcl-x

L somaattisten geeninsiirto aikana RIP1-Tag2 tumorigeneesin ilmoitettiin kohonneen invasiivisuus, vähentämättä apoptoosin [32]. Motivoi nämä tulokset, ja jonka ilmeinen puute vaikutuksen menettämisen Bcl-x yleiseen RIP1-Tag2 tuumorisolun apoptoosia ja kasvain taakka, joka on mahdollinen rooli Bcl-x kasvaimen invaasio arvioitiin. Kasvaimet alkaen

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

ja

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiiret pisteytettiin ei-invasiivisia, kapseloitu kasvaimet (IT) tai invasiivisia karsinoomia (IC1-microinvasive, IC2-erittäin invasiivisia) kriteerien mukaisesti Lopez ja Hanahan [ ,,,0],16]. Mielenkiintoista on, oli merkittävästi suurempi osuus kapseloitu, ei-invasiivisia kasvaimia

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiirissä verrattuna

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

hiiriä (22,8% vs. 4,3%; p 0,02) (kuviot 7 ja S5).

kasvaimia H

Bcl-x

fl /fl

(n = 46 kasvainten 5 hiirtä) ja

RIP1-Tag2

;

RIP-Cre

;

Bcl-x

fl /fl

hiiriä (n = 35 kasvainten 5 hiirtä) pisteytettiin joko ei-invasiivisia luoto kasvaimet /adenoomia (IT) tai invasiivisia karsinoomia (joko IC1 tai IC2) ja osuus kasvaimia kussakin luokassa laskettiin. Jakelu kasvainten tyyppiä verrattiin ryhmien välillä käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. p = 0,017.

Tukeakseen vaikutuksen menetyksestä Bcl-x on invaasio, syöpäsolujen villin tyypin tai poistetaan

Bcl-x

(βTC-Bcl-x- paino- tai βTC-Bcl-x-knockout [KO]) tuotettiin johtamalla β-kasvainsolulinjoja ( ”βTC”) alkaen kasvaimet

RIP1-Tag2

;

Bcl-x

fl /fl

hiiriä, ja infektoimalla solut adenoviruksia, jotka eivät tai eivät ilmennä Cre (Ad-Cre-GFP tai Ad-GFP). Kaksi viikkoa infektion jälkeen Ad-Cre-GFP, tasot Bcl-x-proteiinin sisällä solupopulaation vähenivät noin 75-80% (kuvio 8A), johtui todennäköisesti rekombinaatio

Bcl-x

geenin suurin osa soluista; seerumipuutteinen solut +/- Cre ympättiin yläkammiot huokoisen siirtokuoppaan inserttien joko päällystämätöntä tai Matrigel päällystettyä arvioida vaikutuksen menetyksestä

Bcl-x

ilme muuttoliikettä ja invaasio, vastaavasti. Jotta voidaan ottaa huomioon mahdolliset erot solujen kasvua välillä βTC-Bcl-x-wt tai βTC-Bcl-x-KO-soluista ajankul- siirtymä /invaasio määritykset, yhtä monta solua maljattiin kolmena kappaleena, ja yhteensä solujen määrä määritetään sen jälkeen, kun 48-tunnin inkubaation. Tämän ajanjakson aikana, ei havaittu selvää eroa solujen kasvua välillä villityypin ja Bcl-x-KO-soluja (kuvio 8B). Tämä oli yhdenmukainen vaikutuksen puuttuminen menetyksen Bcl-x toiminnon kasvaimen kasvua ja apoptoosia in vivo. Lisäksi ei ollut merkittävää eroa määrä vaeltavia tai tunkeutumaan solujen pitkin seerumin kaltevuus (kuva 8C, D). Kuitenkin βTC solut olivat huonosti invasiivisia näiden ex vivo, kuten on raportoitu aiemmin [32], toisin kuin yhteisen ulkonäköä invasiivisen syövän solujen aikana syövän etenemiseen. Mietimme, siis, onko tyypillinen Soluviljelyolosuhteiden ehkä ole kunnolla malli hyökkäyksen aiheuttavia mikroympäristön in vivo. Erityisesti erilaisia ​​raportteja, kuten aikaisemmissa tutkimuksissa on RIP1-Tag2 malli, ovat osoittaneet rooli hypoksia edistämisessä kasvaimen invaasio [33] – [36]. Siksi toistuva siirtymä /invaasion määrityksissä olosuhteissa matkimalla hypoksia, sisällyttämällä kobolttikloridia (CoCl

2), joka on osoitettu aiheuttavan biokemiallisia vasteita samanlaisia ​​kuin pienessä happipitoisuudessa olosuhteissa [37], [38]. Tässä tilassa, yleistä solujen eloonjääminen laskettiin (kuvio 8B), vaikka villityypin soluissa osoitti 2-kertaisen lisäyksen määrä vaeltavia solujen (p = 0,006), ja 1,5-kertainen nousu tunkeutuvat soluihin (p = 0,07 ) (kuvio 8C, D) suhteessa kokonaismäärään eloonjääneiden solujen. Samanlainen nousu muuttoliikettä havaittiin vastauksena CoCl

2 käsittelemällä βTC-Bcl-x-KO solujen (p = 0,02) (kuvio 8C); sen sijaan nämä solut eivät osoittavat lisääntynyttä hyökkäyksen näissä pseudo-hypoksisissa olosuhteissa, ja verrattiin villin tyypin solujen osoitti vaatimaton mutta merkittävän vähenemisen (45%; p = 0,005) suhteellisen määrän tunkeutumaan solujen (kuvio 8D) . Nämä tiedot, sopusoinnussa in vivo analyysissä, viittaavat siihen, että vaikka ilmaisua useiden Bcl-2-perheen jäsenet voivat tehdä Bcl-x toiminnallisesti tarpeeton mitattuna vaikutuksia tuumorisolujen apoptoosiin, Bcl-x voi esiintyä ei-tarpeeton ja erillisiä toimintoja osalta kasvaimen invasiivisuus.

βTC-

Bcl-x

fl /fl

kasvainsoluja infektoitiin adenoviruksella ilmentämään Cre tai valvoa GFP ja maljattiin kolmena kappaleena läsnä ollessa tai poissa ollessa kobolttikloridia arvioida vaikutusta vähensi Bcl-x ilmentymisen solujen vaeltamiseen ja invaasiota. (A) Western blot Bcl-x ja aktiini-proteiinin tasot βTC-

Bcl-x

fl /fl soluja käsitellään +/- Cre hetkellä muuttoliikkeen /invaasion määrityksissä. (B) Solujen kasvua. 2 x 10

5 βTC-

Bcl-x

fl /fl

solut +/- cre maljattiin läsnä ollessa tai ilman CoCI

2 ja solut laskettiin 48 tunnin kuluttua. (C ja D) Cell muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Solut maljattiin ohjaus trans-hyvin insertit (C) tai Matrigel päällystettyjä insertit (D). Migraatiokokeessa, tulokset piirretään keskimääräinen määrä vaeltavia solua /10 x kenttä (8 ruutua /kalvo lasketa), kun taas hyökkäys määrityksissä kokonaismäärä hyökkäävän solua /kalvo piirretään. CoCl

2-hoito johti vähentynyt merkittävästi hyökkäyksen βTC-Bcl-x-KO solua verrattuna villin tyypin solujen (P = 0,005). Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SEM Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena ja korjataan muutoksiin solujen kokonaismäärä (B) kontrolliin verrattuna soluihin (-Cre, COCI

2).

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet onko geneettinen poistettaisiin yksi merkittävimmistä antiapoptoottisen jäsen Bcl-2-perheen, Bcl-x, vaikuttaisi kasvaimen kehittymisen.