Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä (PC) jäännökset neljänneksi suurin syy syövän kuoleman kohtuuttomasti selviytyminen, joka on pysynyt suhteellisen muuttumattomana kuluneiden 25 vuoden aikana. Piilevän tai kliinisten etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi yhdessä tehottomuuteen kemoterapian aiheuttaa pakottava tarve suunnitella uusia ja kohdennettuja terapeuttisia suoritteita, joka suosii kliiniseen tulokseen. Tässä tutkimme anti-Tuumorigeenisuustutkimuksissa polyfenoleja viidestä eri ruskean levät ihmisen PC-soluissa (MiaPaca-2, Panc-1, BXPC-3 ja Panc-3.27). Yhteensä antioksidantti kapasiteetti (TAC) analyysi vaiheittaisen polyfenolien erotukset yhä päin (heksaani-DCM-EA-metanoli) tunnistettu korkeita TAC DCM ja EA uuttoja kaikissa merilevät arvioitu. Kaikki DCM ja EA erotettu polyfenolien indusoi annoksesta riippuvan ja jatkuva (ajasta riippumaton) soluproliferaation inhibointi ja elinkelpoisuus. Lisäksi nämä polyfenolit syvästi parantaa DNA-vaurioita (akridiini oranssi /etidiumbromidivärjäyksellä ja DNA: n fragmentoituminen) kaikissa solulinjoissa tutkittiin. Vielä tärkeämpää on, lusiferaasireportterigeenin määritys paljasti merkittävän NFkB: n transkription käsitellyissä soluissa polyfenolit. Mielenkiintoista, QPCR analyysi tunnisti ero vielä selvä sääntely pro-tuumorigeenisen EGFR, VEGFA, AKT, hTERT, Kras, Bcl2, FGFα ja PDGFα transkriptio soluissa käsitelty DCM ja EA polyfenoleja. Immunoblottausmääritys validoi estävä potentiaali merilevää polyfenolit EGFR fosforylaatiota, Kras, AurKβ ja Stat3. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että väli- polaarisuus perustuu murto merilevää polyfenolit voi merkittävästi voimistaa kasvainsolun tappamisen ja voivat toimia mahdollisina huumeiden suoritteen PC parannuskeinoa. Enemmän tutkimukset leikkelevät aktiivisten ainesosien voimakas jakeet, vaikutusmekanismeja ja synergian mahdollisesti taataan ja ovat parhaillaan käynnissä.

Citation: Aravindan S, Delma CR, Thirugnanasambandan SS, Herman TS, Aravindan N (2013) Anti-Haimasyöpä Tuotokset Sea: ensikäden Todisteita tehon, Molecular tavoitteet ja Mode Toiminta Moninaiset polyfenolit viidestä eri Brown-levä. PLoS ONE 8 (4): e61977. doi: 10,1371 /journal.pone.0061977

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 joulukuu 2012; Hyväksytty: 15 maaliskuu 2013; Julkaistu: 16 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Aravindan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tukee tutkimuskehityksen varoja Department of Radiation Oncology yliopiston Oklahoma Health Sciences Center N. Aravindan ja, Intian hallitus, Department of Science and Technology (DBT Sanction tilausnumero Date: BT /PR11535 /AAQ /03/431/2008; 17.09.2009) myöntäminen (arviointi polyfenolit ja polysakkaridit Phaeophytes oksidatiivista stressiä vastaan ​​ja Cancer Progression varten Drug Development) ja T. Somasundaram. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Huomaa, että toinen kirjoittaja Natarajan Aravindan on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikkia ja mitä tahansa PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) jää neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvaltojen odotettu 43920 uutta tapausta vuonna 2012 [1]. Valitettavasti PC kuolleisuus pysyi suhteellisen muuttumattomana vuodesta 1975, jossa on 5 vuoden pysyvyys on vain 5,4% [2]. Piilevän tai kliinisten etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi yhdessä tehottomuudesta kemoterapian myötävaikuttaa korkeaan kuolleisuuteen potilailla, joilla on PC. Tätä varten hoito PC, erittäin luottaa ymmärtää paremmin genetiikan ja biologian [3], joka voidaan tiiviisti kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden muodostumista. Myös PC on yksi olennaisesti lääkkeille vastustuskykyisiä kasvaimia ja kestävyys kemoterapeuttisia aineita on suurin syy hoidon epäonnistumisen PC. Huolimatta laajan tutkimuksen monet kohdistettuja hoitomuotoja erinomainen antituumorivaikutuksia prekliinisissä malleissa, kliininen tutkimus osoitti, että yksi kohdennettuja hoitomuotojen ja useimmat Yhdistelmähoitoihin eivät pystyneet parantamaan ennustetta tämän taudin. On huomionarvoista mainita, että on olemassa 1344 käynnissä kliinisiä kokeita (www.clinical trials.gov näytetty 30. marraskuuta, 2012) tällä hetkellä kohdistaminen monia mahdollisia molekyylikohteista useita lupaavia pipe-line huume-suoritteet. Huolimatta tällainen valtava yritetään lieventää PC etenemistä ja leviämistä, reaaliajassa, olemme läheskään hyväksyttävissä eloonjäämisaste. Osittain tämä johtuu siitä, että tietokone saattaa olla erilaisia ​​ominaisuuksia ja tavoitteita eri vaiheissa synnyssä, huolto ja etäpesäkkeiden [4]. Edelleen, cross-talk välillä soluviestitykseen kulkuväylillä tärkeä ilmiö PC, voi johtaa syöpäsolun selviytymisen ja etäpesäkkeitä, vaikka jotkut reitit estetty täsmähoitoihin. Herkkyys hoito voi myös vaihdella syöpäsoluja eri vaiheissa. Ainutlaatuinen PC rakenne runsas strooman luo kasvain mikroympäristön liittyy hypoksiaa ja alhainen veren Perfuusionopeus, joka estää lääkeaineen syöpäsoluihin. Siksi on kohtalokas tarve suunnitella uusia ja kohdennettuja terapeuttisia strategioita, jotka voivat parantaa kliininen tulos potilaille diagnosoitu PC. Niinpä tässä tutkimme anti-PC potentiaalin polyfenoleja epätavallisesta lähteestä, meri- ruskolevät.

Makro levää (merelle rikkakasvit) ovat tärkeitä proteiinin lähteitä, jodi, vitamiineja ja kivennäisaineita ja siten ovat osoittaneet omaavan chemo ennaltaehkäisevä potentiaalit [5]. Lisätutkimukset ovat johdonmukaisesti osoittaneet, että levät niillä on korkea pitoisuus polyfenolit kuten kate-, epicatechin, epigallocatechin galate ja galliinihapon (katso katsaus [6]). Nämä polyfenoliyhdisteiden ovat osoittaneet monia terveydellisiä hyötyvät bioaktiivisuuksiin, kuten antioksidantti, syövän, anti-virus, anti-inflammatorisia, ja kyky inhiboida ihmisen verihiutaleiden aggregaatiota 6,7. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet positiivista korrelaatiota lisääntynyt ravinnosta antioksidantteja ja alennetun sepelvaltimotaudin, syövän kuolleisuus sekä elinajanodotteen [6], [8]. Läheinen yhteydestä anti-karsinogeeninen ja antioksidantti aktiivisuus on raportoitu hiirimalleissa karsinooma polyfenolit [9] – [12]. Kyseisen muistion, viimeaikaiset tutkimukset osoitti täsmällisesti antiproliferatiivista, pro-apoptoottiset, DNA: ta vaurioittavat, antiangiogeenisiä, kasvua estävä, solusyklin pysähtymisen ja antimetastaattisia toimintoja merileväuutteet useissa kasvainmuodosta lukien melanooma, nenänielun, mahalaukun karsinooma, rintasyöpä jne. [13] – [18]. Kuitenkin nämä tutkimukset rajoittuvat polysakkarideihin ja /tai raakaöljyn uutteita, ja hyöty merilevän polyfenoleja tai niiden aktiivisia komponentteja vastaan ​​haiman syövän synnyn ja /tai sen etenemistä (jos ei mistään kasvain) ei ole koskaan tutkittu. Lisäksi perusteellisen käsityksen vaikutuksista merilevä polyfenolit tässä ympäristössä, niiden potentiaali säätelyssä kasvainsolun signalointi, vaikutustapa (mahdollisten vielä selvä molekyylikohteista, jos niitä on), jää reconnoitered. Johtuen siitä, että polyfenolit kohdistaa keskeinen solun signalointireitteihin, tutkimme vaikutus polyfenolien viidestä eri ruskolevät PC-asetukset. Tutkimus tarjoaa ensi käden todisteita antioksidantti, antiproliferatiivisia ja solujen tappaminen potentiaalit polariteetin perustuu uuttoa näiden merilevien. Lisäksi tämä tutkimus on myös tunnistaa mahdollisuuksia poimitun polyfenolien tärkeistä taudin etenemiseen molekyylikohteista lukien NFKB, EGFR, Kras, STAT3, VEGF, AKT, TERT- FGFA, BCL2 ja PDGFA.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Human Pancin-1 (ATCC-CRL1469), Panc-3.27 (ATCC-CRL2549), BxPC-3 (ATCC-CRL1687), ja MIA PaCa-2 (ATCC-1420) solut saatiin tri Daniel J. Brackett (Department of kirurgian, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK). Kulttuurin ja ylläpito Panc-1, BxPC-3, ja MIA PaCa-2-soluja suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Panc-3,27-soluja ylläpidettiin yksikerroksisina viljelminä, viikoittain serial passage 100 mm kudosviljelymaljoilla runsaasti glukoosia RPMI-1640-väliaineessa, jossa on 2 mM L-glutamiinia, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaattia, 1500 mg /ml natriumbikarbonaattia, 10 yksikköä /ml ihmisen rekombinantti-insuliinia ja 15% naudan sikiön seerumia. MCF10A (ATCC-CRL10317), Human aortan sileän lihaksen soluja (HASMC, ATCC-PCS-100-012) ja ihmisen lonkkavaltimon endoteelisolujen (HIAE, ATCC) solut saatiin Dr. Mohan Natarajan (University of Texas Health Sciences Centerissä San Antonio, TX). Soluja ylläpidettiin yksikerroksisina viljelminä, Medium 199 (Life Technologies, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 1500 mg /ml natriumbikarbonaattia, MEM-vitamiineja, ei-välttämättömiä aminohappoja, pen /strep ja 10% HIFBS. Sillä MCF10A väliaine lisäksi täydennetty rintaepiteelisolulinja Growth Supplement (Life Technologies) ja koleratoksiinin (Sigma). Kulkua varten ja kaikki kokeet, solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä (0,25%) /EDTA (1%), suspendoitiin uudelleen täydelliseen alustaan, laskettiin sähköisesti Countess automatisoitua solulaskijalla (Carlsbad, CA), ja inkuboitiin 95% ilma /5% CO2 kostutetussa inkubaattorissa.

polyphenol louhinta ja solun hoitojen

Solut levytettiin 100 mm kudosviljelymaljoille sisältää 6 ml täydellistä kasvualustaa annettiin kasvaa jopa 70%: sta 80 % konfluenssiin. Viisi lajia ruskea levä,

Dictyota dichotoma

(DD),

Hormophysa triquerta

(HT),

Spatoglossum asperum

(SA),

Stoechospermum marginatum

(SM) ja

Padina tetrastromatica

(PT) kerättiin Mandapam rannikolta, Mannarinlahti, Etelä Intian itärannikolla. Merilevä kerätään osana laitoksen Science and Technology, Intian hallitus sponsoroi DBT projekti ja, koska tämä kokoelma ei liity uhanalaisten tai suojeltujen, mitään erityisiä oikeuksia edellytettiin (Forest Department, Intian hallitus vapautettu). Juuri kerättyjä levät pestiin, kuivattiin uunissa ja niiden jauhetta käytettiin sarjauuttaminen polyfenolit kaltevuus (kasvava) liuottimiin, mukaan lukien heksaani (H), dikloorimetaani (DCM), etyyliasetaattia (EA) ja metanolia (M). Lyhyesti, 50 g jauhettua levien kastettu kolmella tilavuudella erityisiä liuotin ravisteltiin 48 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Liete suodatettiin Whatman suodatinpaperin seurasi inkubaatio jäännös seuraavassa liuottimessa. Tuloksena neljä suodokset kuivattiin täysin ennalta punnittu mikro sentrifugiputkia käyttäen SpeedVac (Thermo tieteellinen, Asheville, NC). Kuivattu suodokset punnittiin ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) siten, että lopullinen varastossa pitoisuus on 100 mg /ml. Solujen käsittely, polyfenolien ” kannalla ’laimennettiin edelleen tavallinen soluviljelmässä (DMEM) väliaine on’ ’työskentely’ ’10 mg /ml. Soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla (10, 50, 100 ug /ml), polyfenolit ja annettiin inkuboitua 37 ° C: ssa 3 h ja 24 h, ellei tai muuten tekstissä mainitut. Lopullinen konsentraatio DMSO soluviljelyväliaineesta oli 0,0001%.

Yhteensä antioksidanttien analyysi

määrittämiseksi hapettumisenestopotentiaali 20 polyfenolien murto koostuu 4 ominainen jakeet kustakin levää yhteensä 5 merilevät, yhteensä hapettumisenestoaine kapasiteetti analyysi (TCA) suoritettiin kuten ovat kuvanneet Prieto ja työtovereiden [20]. Lyhyesti, kaksi osaa jokaisen uuton eri pitoisuuksina (100, 250, 500 ug /ml ja 1 mg /ml) sekoitettiin yhteen osaan TCA-reagenssia (0,6 M rikkihappoa, 28 mM natriumfosfaatti ja 4 mM ammoniummolybdaattia) ja inkuboitiin 95 ° C: ssa 90 min. Absorbanssi mitattiin 635 nm: ssä käyttämällä Synergy II micro levynlukijaa (BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT). Gallushappona (GA) käytettiin positiivisena kontrollina ja negatiivisten kontrollien kanssa plain liuottimet olivat mukana myös. Fraktiot, joilla on korkea koko antioksidantti kapasiteetti hyödynnetään edelleen (anti-PC) analyysi.

elinkykyyn

trypaanisiniekskluusiolla määritystä käytettiin tunnistamaan tehoa merilevää polyfenolit sääntelyssä PC solujen elinkelpoisuuden. Mia-PaCa-2, Panc-1, Panc-3,27 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla (10, 20, 50 tai 100 ug /ml), dikloorimetaania fraktiot (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaattifraktiot (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) tutkittiin 24 h muutoksia solujen elinkelpoisuutta. Määrällinen arviointi tehtiin käyttämällä kreivitär automatisoitua solulaskijaa kuten aiemmin on kuvattu [19] ja verrattiin käsittelemättömiin kontrolleihin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVA Bonferonii post-hoc-testi (GraphPad PRISM v4.03, GraphPad Prism Software Inc., La Jolla, CA) . AP arvo 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä.

Solujen eloonjäänti

Solun eloonjääminen analysoitiin CyQuant proliferaatiomääritystä Kit (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA) Panc- 1 ja MIA PaCa-2-solut käsiteltiin dikloorimetaanilla (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatin (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA , HT-EA) jakeet seuraavat valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja (5000 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppaiselle levylle 200 ul /kuoppa kasvualustaa inkuboitiin 37 ° C: ssa ajan 24 h. Sillä annoseskalaatiotutkimukset solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia (10, 20, 50 ja 100 ug /ml) merilevää polyfenolit ja analysoida sen jälkeen 3 tuntia. Sillä aikaa riippuvainen elpyminen tutkimuksissa soluja käsiteltiin 100 ug /ml polyfenoleja fraktiot ja tutkittiin sen jälkeen, kun 3, 24, 48 tai 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen kasvualusta oli huolellisesti ja kokonaan poistettu, ja maljoja pidettiin jäädytys (-70 ° C) vielä 24 tunnin ajan. Jäädytetyt solut hajotettiin CyQUANT® GR väriainetta /solu-lyysipuskuria (200 ul /kuoppa) huoneen lämpötilassa valolta suojattuna 5 min ja fluoresenssi (480 nm: n virityksellä ja 520 nm: n emissio) käyttämällä Synergy II mikro-levylukijaa ( BioTek). Kaikki näytteet määritettiin kolmena kappaleena. Negatiiviset kontrollit ilman soluja mukana. Ryhmä kerrallaan vertailut tehtiin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVA Bonferonii post-hoc-testi (GraphPad PRISM) ja P-arvo 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä. Edelleen, onko tämä polyfenolien (t) ajettu anti-leviämisen on kasvain-solu valikoivia, hahmotella niiden normaalin solun sytotoksisuus, jos lainkaan, tutkimme niiden vaikutukset ensisijaisesti soluihin. Tätä varten MCF10A, HIAE ja HASMC soluja käsiteltiin 100 ug /ml DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT- EA tai HT-EA tutkittiin 24 h muutoksia solujen lisääntymisen.

Nuclear morfologia dual värjäys

Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 ja Mia-PaCa-2 -soluja (5 x 10

5-soluja) kasvatettiin 4-kuoppalevylle (Nunc), joita hoidettiin 100 ug /ml: aan dikloorimetaania (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatti (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) jakeet analysoitiin 24 tunnin jälkeen ydinvoiman morfologia kuten aiemmin on kuvattu [21].

DNA Fragmentation agaroosigeeleillä

DNA tikapuunmuodostuksen määritystä käytettiin tunnistamaan tehoa merilevää polyfenolit asiakkuutta PC solussa DNA: n fragmentoituminen. Lyhyesti, DNA Panc-1, Panc-3.27, BxPC-3 ja Mia-PaCa-2-solut käsiteltiin DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA -Ea, SM-EA, PT-EA ja HT-EA 24 tunnin uutettiin DNA stat-60 (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA) seuraavat valmistajan ohjeita. DNA-näytteet (5 ug) ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia, visualisoidaan ChemiDoc ™ XRS lämpökamera (Biorad, Hercules, CA) ja kvantifioidaan Määrä-One kuva-analyysi-ohjelmisto (Biorad). Ryhmä kerrallaan vertailut tehtiin käyttämällä analyysiä ristiriidassa Tukeyn post-hoc-korjaus. AP arvo 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä.

plasmidivalmiste DNA transfektio, ja Luciferase Reporter Assay

Muutokset NFicB promoottoriaktivoinnilla dikloorimetaanissa (DD-DCM, SA-DCM, SM -DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatin (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) jakeet käsiteltiin Panc-1, BxPC-3 ja MiaPaca-2 solut olivat tutkittiin käyttämällä lusiferaasireportterigeenin määritys. PNFκB-Luc-plasmidi-konstrukti monistettiin ja puhdistettiin kuten kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [22], [23]. Solulysaatit solusta käsiteltiin 24 h määritettiin lusiferaasiaktiviisuuden kohti valmistajan protokollaa (BioVision Research Products, Mountain View, CA) ja ryhmä viisas vertailut tehtiin käyttäen ANOVA kanssa Tukeyn post-hoc-korjaus. AP arvo 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä.

QPCR

Transcriptional korjauksilla keskeisten syövän etenemiseen molekyylejä kuten,

Bcl2, EGFR, PDGFA, VEGF, AKT, TERT- Kras ja FGF

dikloorimetaanissa (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatin (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA ) fraktiot käsiteltiin (3 h) Panc-1, Panc-3,27, BxPC-3 ja MiaPaca-2-solut analysoitiin reaaliaikaista QPCR kuten aiemmin on kuvattu [23]. Käytimme β

aktiini

positiivisena kontrollina, ja negatiivinen kontrolli ilman templaatti-RNA oli myös mukana. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena, ja

ΔΔ

C

t arvot laskettiin normalisoimalla geeniekspressiotasot ß

aktiini

, ja suhteellinen ilmentymistaso ilmaistiin kertamuutos.

Immunoblottausmääritys

Panc-1, BxPC-3 ja MiaPaca-2-solut altistettiin dikloorimetaaniin (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT -DCM) tai etyyliasetaatissa (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraktiot analysoitiin 24 tunnin kuluttua, että muutoksia fosforylaatio EGFR ja proteiinin tasot Kras, STAT3, EGFR ja AURKβ. Yhteensä proteiiniuutto ja immunoblottaus suoritettiin kuten kuvattu aiemmissa tutkimuksissa [23], [24]. Tässä tutkimuksessa, proteiini-siirretty membraaneja inkuboitiin joko kanin monoklonaalista anti-pEGFR

(Tyr1068) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), kras (Proteintech Group, Inc. Chicago, IL, USA), STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA) tai hiiren monoklonaalinen EGFR (Santa Cruz), AURKβ vasta-aine (Proteintech). Kalvoista poistettiin ja reblotted hiiren monoklonaalisten anti-α-tubuliinin-vasta-ainetta (Santa Cruz) määrittää yhtä suuri näytteiden lataamisesta. Densitometria-analyysi suoritettiin käyttäen Määrä-One (Biorad) ja suhteellinen kaistan intensiteetti piirretään histogrammi käyttäen PRISM 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Ryhmä viisasta vertailut tehtiin käyttämällä analyysiä ristiriidassa Tukeyn post-hoc korjaus.

Tulokset

merilevä polyfenolit satama korkeita antioksidantteja

määrittämiseksi antioksidantti potentiaalien merilevää polyfenolit selvitimme koko antioksidantti kapasiteetti uutettu jakeet kuten heksaani, dikloorimetaani, etyyliasetaatti ja metaani jakeet kaikkien viiden merilevät tutkittu. Gallushappo käytettiin positiivisena kontrollina ja polysakkaridifraktio vastaavista merilevää tutkittiin myös aikaansaada suhteellisen suurennus antioksidantteja polyfenoleja. TCA paljasti merkittäviä antioksidantteja kaikissa merilevä polyfenolien jakeet (Fig. 1). Annoksesta riippuva nousu antioksidantti tasot kaikkien jakeet tutkittiin tarkasti vahvistaa antioksidantti saatavuus ja keskittyminen. Suhteellisen, havaitsimme erittäin korkeita antioksidantteja dikloorimetaaniin ja etyyliasetaattifraktiot kaikkien merilevät tutkittu (Fig. 1). Inimitably, polyfenolit uutetaan

Stoechospermum marginatum

osoitti satamaan mahdollisimman antioksidantteja, ~ 3,5 kertaa suurempi DCM ja EA jakeet (Fig. 1). Johtuen siitä, että DCM ja EA jakeet sisältää suuren antioksidantteja koko ruskolevät tutkitaan me selektiivisesti käyttää nämä kaksi fraktioita kustakin merilevästä rajaamiseksi anti-PC mahdollisia.

polyfenolit uutettiin viisi lajien ruskolevät,

Dictyota dichotoma

(DD),

Hormophysa triquerta

(HT),

Spatoglossum asperum

(SA),

Stoechospermum marginatum

( SM) ja

Padina tetrastromatica

(PT) käyttäen gradienttia liuottimiin, mukaan lukien heksaani (H), dikloorimetaani (DCM), etyyliasetaattia (EA) ja metanolia (M). Yhteensä antioksidanttien analyysi suoritettiin Gallushappo (GA) positiivisena kontrollina, tavallinen liuottimia negatiivisina kontrolleina ja polysakkaridifraktio vastaavista merilevästä suhteellisena toimenpiteenä.

Antioksidantit-rikas polyfenolien jakeet hidastaa PC solujen elävyyden

Mia-PaCa-2, Panc 3,27, Panc 1 ja BxPC3 soluja käsiteltiin dikloorimetaanilla (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatin (DD-EA , SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraktiot (10, 20, 50 tai 100 ug /ml) tutkittiin muutoksia solujen elinkelpoisuus käyttäen trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Kaikki DCM ja EA polyfenoli fraktiot osoittivat merkittävää (P 0,001) inhibitiota solujen elinkykyä niinkin alhainen kuin 10 ug /ml pitoisuus (Fig. 2A). Kasvavien pitoisuuksien kanssa polyfenolien jakeet, havaitsimme annoksesta riippuva esto solujen elinkelpoisuuden MiaPaca-2-solut altistettiin DCM tai EA fraktiot (Fig. 2A). Johdonmukaisesti, 100 ug /ml kaikkia DCM: n ja EA osa (t) huomattavasti sisäänpäin kääntynyt solujen elinkykyä ( 60%) in BxPC3 soluissa (kuvio. 2B). Kuitenkin HT-EA osoitti suhteellisesti vähemmän estäjä tässä solulinjassa. Kuten-viisasta, havaitsimme johdonmukaisesti estävä tehokkuus (-50%) kaikista DCM jakeiden Pancin 3.27 soluissa (Kuva. 2C). Toisaalta, EA jakeet osoittivat rinteessä tehosta matalan aktiivisuuden kanssa DD-EA on maksimaalinen-toimintaa HT-EA Pancin 3.27 soluissa (Kuva. 2C). Vuonna Pancin 1-soluissa, sekä DCM ja EA jakeet merkittävästi esti solujen elinkykyä (Fig. 2D). Suhteellisen, havaitsimme maksimaalisen eston solun elinkelpoisuutta, SM-DCM: llä ja DD-EA ( 50%) fraktioita. Nämä tulokset osoittavat, että merilevää polyfenolit mahdollisesti estävät PC solujen elävyyden ja edelleen tunnistaa ”

cell-tyyppihyväksynnän

riippumaton” minimaalinen tehokas (50%) estävä annos tässä ympäristössä.

Annos liittyvä sääntely solujen elinkelpoisuuden kunkin polyfenolien fraktiot verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVA Bonferonii post-hoc-testi ja P-arvo on 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä. Viivadiagrammeissa osoittaa merkittävää inhibitiota solujen elinkelpoisuuden (B) BxPC-3, (C) Panc-3,27 ja (D) Panc-1-soluja käsiteltiin 100 ug /ml DCM tai EA: n fraktioita.

merilevä polyfenolit estää PC soluproliferaatiota

lisäksi perustelemaan solun elinkelpoisuus estävä potentiaali antioksidanttia runsaasti polyfenoleja todellakin kääntää sen myötä sääntelyn solun selviytymisen, selvitimme anti-proliferatiivista potentiaalia DCM ja EA jakeet. Tämän saavuttamiseksi, mittasimme DNA: n kokonaismäärä (joka on vastaava solujen määrä) ja laajuus leviämisen määritettiin vertaamalla solujen määrä on huumeiden käsitellyn MiaPaca-2 ja Panc-1-soluissa käsittelemättömiin kontrolleihin. Verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, CyQuant-NF-analyysi paljasti merkittävän annoksesta (10, 20, 50 ja 100 ug /ml) riippuvaisen soluproliferaation inhibointi sekä MiaPaca-2 ja Panc-1-solujen kunkin dikloorimetaanilla (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) tai etyyliasetaatin (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fraktiot (kuva 3). Nämä antioksidantti rikas fraktiolla oli ”solu-tyyppi riippuvainen” ja /tai ”liuotin-riippuvaisen suuruus soluproliferaation inhibition. On selvää, että kaikki viisi DCM jakeet (100 ug /ml) perinpohjaisesti (-50%) esti MiaPaca-2 soluproliferaatiota mahdollisimman (~75%) inhibition jälkeen havaittiin HT-DCM hoidon (Fig. 3A). Kuten-viisasta, vuonna Panc-1-solut, DD-DCM, PT-DCM ja HT-DCM hoito voimakkaasti (-50%) esti solujen lisääntymistä kanssa maksimaalisen eston in PT-DCM käsitellyt solut (Fig. 3B). Vielä tärkeämpää on, kaikki EA jakeet myös näytteillä DCM vertailukelpoisia (-50%) solujen lisääntymisen esto potentiaalia MiaPaca-2-solut (Fig. 3C). Ilmeisesti PT-EA hoito näkyy maksimaalisen eston näissä soluissa. Tosin DD-EA, PT-EA ja HT-EA osoitti estäjä in Pancin-1-solut, suhteellisen (toisin kuin DCM), EA jakeet tuotti marginaalinen vaikutus (Fig. 3d). Toiseksi tutkittiin, merilevä polyfenolien esti solujen selviytyminen on ohimenevä (ajan riippuvainen talteenotto) tai pysyvä syy vaikutus. MiaPaca-2-soluja käsiteltiin 100 ug /ml DCM: ää ja EA fraktiot altistettiin CyQuant analyysin jälkeen 3, 24, 48 ja 72 tuntia. Verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin, merilevää polyfenolit kykenee merkittävästi (P ​​ 0,001) anti-leviämisen niin alhainen kuin 3 h (Fig. 3E). Vielä tärkeämpää on, tämä DCM ja EA jakeet indusoidun soluproliferaation inhibointi pysyi johdonmukaisesti 24, 48 ja 72 h (Fig. 3E). Nämä tulokset osoittavat anti-proliferaatiopotentiaali merilevästä polyfenolit PC-soluissa ja edelleen lyhyen listan mahdollisista jakeet tässä asetelmassa.

Solut altistettiin merilevä polyfenolien arvioitiin solujen lisääntymisen 3 tuntia hoidon jälkeen. Annos liittyvät soluproliferaation inhibointi kunkin polyfenolien fraktiot verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVA Bonferonii post-hoc-testi ja P-arvo on 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä. (E) viivadiagrammeissa DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA ja HT-EA alttiina MiaPaca-2-soluissa osoittaa merkittävää ja jatkuvaa (3, 24, 48 ja 72 h) soluproliferaation inhibointi. (F) viivadiagrammeissa DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA ja HT-EA altistuvat normaalin ihmisen MCF10A, HASMC ja HIAE solut osoittavat yhdenmukaisia ​​solujen selviytymisen 24 tunnin käsittelyn jälkeen. Käsittelemättömiin kontrolleihin verrattuna, kaikki DCM ja EA jakeet paljastanut mitään merkittäviä soluproliferaation inhibointi kaikkien kolmen solulinjoissa tutkittiin. Time-line in line-tonttien näkyy fluoresenssi (480 nm: n virityksellä ja 520 nm emissio) mittauksia jatkuvasti jopa 60 minuuttia.

lisäksi määrittämään kasvaimen valikoitumispotentiaalin merilevää polyfenolit ja rajaamiseksi normaali solun sytotoksisuus, jos lainkaan, tutkimme vaikutuksia näillä jakeet terveen solun eloonjäämiseen. Tämän MCF10A, HIAE ja HASMC soluja käsiteltiin 100 ug /ml DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA tai HT-EA tutkittiin 24 h muutoksia solujen lisääntymisen. Fluoresenssi (480 nm: n virityksellä ja 520 nm emissio) mitattiin jatkuvasti jopa 60 minuuttia. Verrattuna käsittelemättömiin verrokkeihin, CyQuant NF analyysi ei paljastanut mitään merkittävää inhibitiota solujen selviytymistä MCF10A soluissa. Kuten-viisasta, havaitsimme johdonmukainen solujen selviytymistä sekä HASMC ja HIAE soluja käsiteltiin DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA tai HT-EA mikä ole varmaa sytotoksisuutta näiden jakeiden normaaleissa soluissa.

merilevä polyfenolit kiinnostavuus apoptoottisen solukuoleman PC soluissa

hahmotta- onko anti-PC potentiaalin merilevää polyfenolit liittyy apoptoottisen solukuoleman ja tunnistaa mahdolliset suuruutta eri jakeiden ominaista, tutkimme liittyviä muutoksia DNA: n fragmentoituminen. Koska arviointi apoptoosin ei voida vedota yhdelle päätepiste, me hyödyntää sekä laadullisia akridiiniorans- /etidiumbromidivärjäyksellä ja semikvantitatiivinen agaroosigeelissä DNA pirstoutuminen Panc-1, Panc 3,27, BxPC3 ja MiaPaca-2-soluissa. Käsittelemättömiin kontrolleihin verrattuna, fluoresenssimikroskopia osoitti, että kaikki antioksidantti runsaasti polyfenoleja jakeet mukaan lukien DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT -Ea ja HT-EA osoittaa apoptoottisten ominaisuuksien (Fig. 4). Ilmeisesti havaitsimme ero DNA: n fragmentoituminen suuruudet neljällä PC solulinjojen hoitaa näillä polyfenolit. Tasaisen, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, agaorse geeli-DNA: n fragmentoituminen analyysi osoitti tilastollisesti merkittävää (P 0,05) induktio DNA pirstoutuminen Panc 1, Panc 3,27, BxPC-3 ja MiaPaca-2: lla käsiteltyjen solujen merilevää polyfenolit, paitsi DD- DCM (Fig. 5). Verraten, havaitsimme maksimaalinen ( 2 kertainen) DNA vahingollista vaikutusta kaikkien merilevää polyfenolit Pancin-1 ja Panc-3.27 soluissa. Laajuus DNA: n fragmentoituminen aiheuttaman nämä polyfenoleja osoittaa, että levät käyttävät apoptoottisten solujen tappaminen PC.

Lisää: Voimakas suurennos mikrovalokuvia esittäen kromatiinin kanssa kupliminen, ydin- tiivistyminen, ja pirstoutuminen osoittaa tyypilliset apoptoottisia piirteitä soluissa käsitelty merilevä polyfenolit.

DNA-näytteet ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia ja kvantifioidaan Määrä-One.

merilevä polyfenolit estää toiminnallisen aktivaation NFKB

lisäksi tutkia, että merilevä polyfenolit indusoi apoptoottista solukuolemaa liittyy eston pro-selviytymisen NFKB selvitimme sääntelyä NFKB promoottoriaktivoinnilla näillä DCM ja EA jakeet PC soluissa. Tätä varten ihmisen Panc-1, BxPC-3 ja MiaPaca-2-soluja transfektoitiin ohimenevästi pNFκB-Luc-plasmidi-konstrukti, joka ilmentää lusiferaasireportterigeenillä käytettäessä NFKB-riippuvaisella tavalla. Sitovat NFKB promoottori aktivoi transkription, jolloin Luc reportterigeenin ilmentymisen. Transfektoidut solut altistettiin DCM: llä ja EA fraktiot (erikseen), ja lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin 24 tunnin kuluttua. Solut käsiteltiin merilevää polyfenoleja DCM ja EA jakeet johtivat syvällinen eston lusiferaasiaktiivisuudessa, mikä osoittaa, että nämä jakeet voisi konkreettisesti lieventää transkription aktivoituminen NFKB (Fig. 6). Vaikka löysimme marginaalinen erot jakeet ja eri solulinjoja, yleensä data selvästi muotokuvia merkittävä vähentäminen Lusiferaasiaktiivisuuden paljon vähemmän kuin pohjapinta tasot osoittavat niiden potentiaali lieventävien NFKB transkriptio.

Sitten solut kerättiin 24 h käsittelyn jälkeen. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvo ja keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä lasku lusiferaasiaktiivisuudessa merilevästä polyfenoleja käsitelty PC-soluissa.

merilevä polyfenolit säädellä syövän etenemiseen molekyylien PC soluissa

Myös leikellä pois eduksi antioksidantti rikas merilevä polyfenoleja