Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kasvain-strooman reaktio liittyy aktivointi fibroblasteissa. Nemosis on uudenlainen fibroblastien aktivoitumista. Se johtaa lisääntyneeseen kasvutekijöiden ja proinflammatoristen ja proteolyyttisen proteiineja, kun taas samaan aikaan solun tukirangan proteiinit hajoavat. Täällä käytetty pariksi normaali iho fibroblastit ja syöpään liittyvän fibroblasteja (CAF) ja primääristen ja uusiutuvien suun okasolusyöpä (SCC) soluja tutkia nemosis vastaus.

Keskeiset havainnot

Fibroblastin nemosis oli analysoitiin proteiinin ja geenin ilmentymisen ja parakriinisten sääntelyn kanssa pesäkemuodostusta. Yksi normaali fibroblasti kantoja, FB-43, upregulated COX-2 in nemosis, mutta FB-74-solut eivät. Sen sijaan, CAF-74 pallosia ilmaistuna COX-2, mutta CAF-43-solut eivät. Alfa-SMA ekspressoitiin sekä CAF kantoja ja FB-74-soluissa, mutta ei FB-43 fibroblasteissa. Sen mRNA-tasot olivat vaimentua vuonna nemosis, mutta valuuttalisiin alkoi takaisin ilmaisua. FSP1 mRNA vaimentua normaaleissa fibroblasteissa ja CAF-74-soluissa, mutta ei CAF-43-fibroblasteja. Seriiniproteaasi FAP säädeltiin voimakkaammaksi kaikissa fibroblasteissa, lisää niin nemotic valuuttalisien. VEGF, HGF /SF ja FGF7 mRNA-tasot olivat voimistunut muuttujaan määrin nemosis. Valuuttalisiin lisäsi pesäkkeiden muodostumista ensisijainen kasvainsolulinjojen UT-SCC-43A ja UT-SCC-74A, mutta normaalien fibroblastien esti kiinnittämisestä riippumaton kasvu toistuvien UT-SCC-43B ja UT-SCC-74B soluihin.

Johtopäätökset

Nemosis vastauksen, havaittuna COX-2 ja kasvutekijää induktio, ja ilmaus CAF merkkiaineiden α-SMA, FSP1 ja FAP, vaihtelee fibroblasti populaatioissa. Ilmaisu CAF merkkiaineiden eroaa normaalien fibroblastien ja valuuttalisiin in nemosis. Nämä tulokset korostavat heterogeenisyys fibroblastien ja kehittyvien kasvain edistäviä ominaisuuksia valuuttalisiin.

Citation: Räsänen K, Virtanen I, Salmenperä P, Grenman R, Vaheri A (2009) Erot Nemosis Response of Normal ja Cancer-Associated Sidekudosmuodostussolujen potilailta Oral Okasolusyöpä. PLoS ONE 4 (9): e6879. doi: 10,1371 /journal.pone.0006879

Editor: Immo A. Hansen, New Mexico State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2009; Hyväksytty: 06 elokuu 2009; Julkaistu: 1. syyskuuta 2009

Copyright: © 2009 Räsänen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Suomen Kulttuurirahasto, Magnus Ehrnroothin säätiö, Suomen Diabetestutkimussäätiö, EVO Research Grant, Suomi Cancer Järjestöt ja Suomen Akatemia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvain mikroympäristölle on merkittävä rooli syövän etenemiseen ja fibroblastit tiedetään olevan keskeiset osat kasvain strooman. Äskettäin on ehdotettu, että strooman fibroblastit aluksi estävät alkuvaiheessa syövän synnyn ja myöhemmin alla parakriinisen vaikutuksen transformoitujen epiteeli aktivoituvat johtaa edistämiseen syövän kasvua. Riippuvuus syöpäkasvainten on strooman fibroblastien vähenee syövän edetessä osittain kytkimellä epiteelisolut paracrine autokriinisiä asetuksen [1], [2]. Niistä aktivoituneiden fibroblastien ovat syöpään liittyvä fibroblasteissa (CAF), joille on tunnusomaista lisääntynyt mitoosi-indeksi, mutaatiot tuumorisuppressorigeeneille, kuten p53 ja lisääntynyt eritys kasvutekijöiden, kemokiinit ja komponenttien soluväliaineen (ECM) [2], [3], muutoksia, jotka kaikki ovat mukana invaasio ja tuumorin kasvu [4] .Widely käytetään CAF markkereita ovat α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA), fibroblastien spesifisen proteiinin 1 (FSP1, joka tunnetaan myös S100A4) ja fibroblastien aktivoitumista proteiinin (FAP, joka tunnetaan myös seprase) [5]. a-SMA, osa solun tukirangan, on useimmiten käytetty merkkiaine aktivoituneiden fibroblastien. Se tulee osaksi stressiä kuituihin siten kohensi supistuvien aktiivisuus fibroblastien [6]. FSP1 kuuluu S100 super-perheen kalsiumia sitovia proteiineja. Se edistää kasvaimen kasvua säätelemällä solukierron etenemistä ja cytoskeletal eheys [7]. FAP on seriiniproteaasi, joka ei ilmenny normaaleissa aikuisen kudoksissa, mutta sen ilmentyminen indusoituu aktivoituneiden fibroblastien vastaamaan haavan paranemisen ja tuumorin strooman reaktion [8]. Kuitenkin on hyvin osoitettu, että fibroblastit ovat heterogeenisiä [9], [10] ja että valuuttalisiin eri ilmaista nämä merkit [11], [12].

Nemosis, ilmiö fibroblastien aktivoitumisen (katso katsaus Vaheri et al. 2009 [13]), on aiemmin tutkittu käyttäen normaaleja ihon fibroblasteja [14] – [19]. Muodostuminen fibroblasti pallomaista aiheuttaa lukemattomia geenien ilmentyä erilailla näissä aktivoituneiden fibroblastien. Kaksi erillistä malleja löytyy ilmaisu: i) kasvutekijöiden ekspression ja proteolyyttinen ja proinflammatoristen proteiinien kasvaa ja ii) ilmentymistä solun tukirangan komponenttien vähenee. Joka perustuu aiemmin julkaistut tulokset, syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), jonka tiedetään liittyvän tulehduksen ja alkuvaiheessa karsinogeneesin, ja hepatosyyttikasvutekijä /scatter factor (HGF /SF), joka on osoitettu edistävän tuumorisolun invasiivisuus, on pidetty tunnusmerkki proteiineja nemosis. Spontaani klusterointi fibroblastien pallosia voidaan myös indusoida kasvainsolun väliaine [14], [15]. Olemme aiemmin osoittaneet, että viljellään fibroblasti pallosia vaikutuksen alaisena hyvänlaatuinen HaCaT keratinosyyttien estää nemosis, kuten nähdään tukahdutettu ilmentyminen COX-2, kun taas pahanlaatuisia HaCaT-soluja on nemosis edistävä vaikutus normaalien fibroblastien, ilmenee parannettu ilmentymisen lisääntyminen on COX-2- HGF /SF ja VEGF (verisuonten endoteelin kasvutekijä) [17].

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kuudenneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja yleinen potilaan selviytyminen on huono. Tämä johtuu pääasiassa korkea syövän uusiutumiseen ja paikallinen invaasio, osittain syynä p53-geenin mutaatioita, joita voi esiintyä yli 70% HNSCCs [20], [21]. Leikkaus ja sädehoito ovat yleisimmin käytetty linjat hoidon ja tällä hetkellä ainoa hyväksytty molekyylitason täsmähoitoihin pään ja kaulan alueen syöpä on setuksimabi (Erbitux; ImClone Systems Inc., New York, NY), monoklonaalinen vasta-aine estäjä epidermaalisen kasvutekijän reseptorin ( EGFR). Kuitenkin kaikki HNSCC potilaat hyötyvät EGFR-kohdennettuja hoitoja, koska yli-ilmentyminen, mutta ei mutaatio näyttää määrittää hoitovasteen. Faasi 3 tutkimuksissa HNSCC ovat parhaillaan kohdentamiseksi VEGF (Bevasitsumabilla, monoklonaalinen vasta-aine estäjä) ja p53 (INGN 201, geeniterapia) [22], [23]. Toinen potentiaalinen kohde on COX-2, jonka on todettu olevan koholla suun okasolusyöpä (OSCC) ja sen on osoitettu vähentävän kasvaimen radioherkkyyttä [24]. Tutkimukset käyttäen sovitettu potilaan solujen kannat ovat osoittaneet, että on olemassa korrelaatio radiosensitivities välillä OSCC solujen ihon fibroblasteista ja syöpään liittyvän fibroblastit kerättiin samasta yksilöstä ja että nämä yksittäiset erot radioherkkyyttä voisi ennustaa sädehoidon [25], [ ,,,0],26].

Perustuen aikaisempiin tuloksiin, jotka vaikutuksen alaisena pahanlaatuisten solujen normaalin nemotic fibroblastien alkaa muistuttamaan valuuttalisiin tavoitteena tämän työn tavoitteena oli tutkia nemosis vaste autologisten ihon ja syöpään liittyvän fibroblasteja, jotta vertailla ilmaus CAF merkkiaineiden näiden fibroblastien kantoja ja niiden kohtaloa nemosis ja tutkimaan, miten nämä eri fibroblastien populaatioiden vaikuttaa potilaiden sovitetut suun SCC soluja. Tutkimuksemme osoittaa, että sekä normaali ja syöpään liittyvän fibroblastit vaihdella yksilöiden välillä, nähdään vaihteleva pohjapinta CAF ekspressiotasot ja eri kasvutekijän vasteita nemosis, ja on erilaiset vaikutukset SCC soluihin. Käyttäytyminen tutkittu CAF merkkiaineiden nemosis oli yleisen nemosis vastaus: cytoskeletal α-SMA ja FSP1 olivat vaimentua ja proteolyyttisen FAP oli voimistunut. Ainoa poikkeus oli yksi CAF kantoja, jotka yliaktiivista FSP1 in nemosis. Suuret järjestelmällisiä eroja normaalin ja syöpään liittyvän fibroblasteja vähentynyt pohjapinta tasoilla kasvutekijöiden valuuttalisiin ja kyky nemotic valuuttalisiin aloittaa takaisin α-SMA ilmaisun ja lisääntynyt FAP ilmentymistä nemosis verrattuna niiden normaaliin kollegansa.

tulokset

Eri fibroblasti populaatioiden eronnut vastauksena nemosis

Ensimmäinen halusimme tutkia ilmaus aiemmin käytetty nemosis merkki COX-2 neljässä fibroblastien populaatiot. Ei ollut perusilmennystä COX-2: n minkä tahansa fibroblastien kantojen, ja se ei ollut indusoitu yksikerrosviljelmässä. Kuitenkin, kun viljellään pallosia normaali fibroblastien FB-43 alkoi ilmaista COX-2 jälkeen 48 tuntia (kuvio 1A), mutta tämä ei nähty muissa normaalien fibroblastien kanta FB-74 (kuvio 1 C). Vastapäätä tulokset saatiin kanssa syöpään liittyvän fibroblasteja, joissa ei ole COX-2: ta ilmentyy CAF-43 fibroblastien pallosia (kuvio 1 B), mutta CAF-74-solut alkoivat ilmaista COX-2 24 tunnin kuluttua (kuvio 1 D). Nämä tulokset poikkeavat aiemmin julkaistu ja osoittavat, että COX-2 ei tule yksinomaan käyttää mittaamaan nemosis vastausta.

fibroblastit kasvatettiin rakeita yksikerroksista osoitetun ajan. (A) FB-43 pallosia alkoi tuottaa COX-2 48 tunnin kuluttua eikä α-SMA tuotettiin, kun taas CAF-43-solut (B) ei indusoinut COX-2, mutta ilmaisi α-SMA. Sekä FB-74 (C) ja CAF-74 (D) on tuotettu α-SMA, mutta COX-2 oli vain indusoitiin CAF-74 pallosia. Kaikki fibroblastit tyypit ilmaistu yhtä paljon vimentiinista. (E) Kaikki UT-SCC solut ilmensivät COX-2, mutta vain 74A ja 74B osoitti indusoi p53 tasoilla.

tarkasteltiin myös proteiinin tasot vimentiinista ja α-SMA näissä soluissa. Kaikki neljä fibroblasti populaatiot ilmaistu vimentiinista yhtä suurina määrinä, odotetusti, koska fibroblastit

in vitro

pidetään tilassa muistuttavia haavan paranemista. Molemmat CAF kannat ilmaisivat α-SMA, CAF-74 hieman yli CAF-43. Kiinnostavaa kyllä, myös normaali FB-74-soluissa ilmaistuna α-SMA, mutta ei proteiinin ekspressiota havaittiin muissa normaaleissa fibroblastisolu kanta FB-43. Aikariippuvainen downregulation α-SMA nähtiin sferoideja mutta ei yksikerrosviljelyissä aiheuttama hajoaminen solun tukirangan näissä fibroblasteissa läpi nemosis. Tämä on linjassa aiempien tulosten Bizik et al. [14], jossa laskeva aktiinin tasot käyttää markkerina pallomaisten hajoamista. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

Kuvio 1E on immunoblot neljän UT-SCC sinoomasolulinjoja. Kaikki ne ilmaisivat COX-2, mutta kiinnostavaa vain UT-SCC 74A ja 74B oli indusoi p53-proteiinin taso, mikä viittaa p53-mutaatio. Emme voineet havaita p53 missään fibroblastien väestön käsite, joka yhtyy raportin Qiu et al. [27], joissa ne eivät voineet havaita somaattisten geneettisten muutosten valuuttalisiin.

Eri ilmentymistä CAF merkkiaineiden fibroblastien kannoissa

Koska proteiini tasojen α-SMA vaihtelivat eri fibroblasti populaatioiden, me päätti tutkia myös ilmaus muiden laajalti käytetty CAF markkereita FSP1 ja FAP. Geeniekspressiomalli näiden kolmen geenin fibroblasteissa kasvanut palloset 0, 24, 48 ja 72 tunnin analysoitiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Q-PCR valittiin menetelmä yli immunoblottauksen, koska sen suurempi herkkyys. GAPDH: ta käytettiin viite-geenin, että ilmaisu kohdegeenien normalisoitiin, jonka jälkeen suhteellisen kertainen ekspression suhteet laskettiin. Pohjapinta ekspressiotaso α-SMA, FSP1 ja FAP oli merkitsevästi pienempi (P 0,01) CAF-43 soluja kuin normaalissa FB-43 fibroblasteissa (kuvio 2A). Kuten nähdään kuviossa 2B, tämä ei päde CAF-74 fibroblastit, jossa verrataan FB-74-solujen α-SMA ilmentymisen suhde oli sama, FSP1 1,4-kertainen ja FAP ilmaisun suhde yllättäen 10-kertainen (P 0,01) CAF-43 soluja verrattuna FB-43-soluissa, mutta yhtä suuri tai suurempi CAF-74 fibroblasteissa. (B) Kun kasvanut pallosia kaikki fibroblastien vaimentua α-SMA ilme, mutta valuuttalisiin alkoi takaisin lauseke 72 h (P 0,05 FB-43 vs. CAF-43 ja FB-74 vs. CAF-74) ( C) FSP1 säädeltiin vähentävästi normaaleissa fibroblasteissa ja CAF-74-soluissa, mutta ei CAF-43-solut, (D) ja FAP säädeltiin voimakkaammaksi kaikissa solulinjoissa läpi nemosis, lisää niin valuuttalisiin (P 0,05 72 h CAF -43 verrattuna 72 h FB-43). Sarakkeet: keskiarvo; virhepalkit; SEM.

Nemosis vaste CAF merkkiaineiden näiden fibroblastien populaatioiden osoitti myös vaihtelua. Α-SMA taso rajusti vaimentua vuonna pallosia, mikä proteiinin tasot ja osoittaa hajoaminen solun tukirangan näissä pallosia. Tämä päti myös FB-43-soluja, joita varten ei voitu havaita proteiinin ilmentyminen. Poiketen normaalista fibroblasteista, The valuuttalisiin alkoi takaisin α-SMA ilmentymistä 72 tuntia; verrattuna normaalien fibroblastien kasvua oli tilastollisesti merkitsevä (P 0,05) (kuvio 2C). FSP1 mRNA laskivat odotetusti, sekä normaali fibroblastisolu kantoja ja CAF-74-soluissa, mutta yllättäen kasvoi CAF-43 pallosia (kuvio 2D). Kolmas CAF markkeri FAP aiheutettiin nemosis kaikissa fibroblastien väestön seuraava yleinen nemosis sormenjälki. Tämä induktio oli suurempi CAF sferoideja kuin normaalissa fibroblastien pallosia (P 0,05 vuonna CAF-43 vs. FB-43, ei tilastollisesti merkitsevä 73-soluissa johtuen suuri poikkeama näytteiden välillä) (kuvio 2E).

Differential kasvutekijöiden ekspression normaaleissa ja syöpään liittyvän fibroblastit

Toinen tunnusmerkki nemosis on lisääntynyt tuotanto useiden kasvutekijöiden, kuten VEGF, HGF /SF ja FGF7 (KGF). Siksi käytetään Q-PCR tutkia ekspressiotasot näiden geenien neljä fibroblastien populaatioissa. Molemmat CAF kannat oli pienempi pohjapinta-ilmentymisen määriä VEGF, HGF /SF (P 0,05) ja FGF7 (P 0,01) mRNA verrattuna pariksi normaalien fibroblastien (kuvio 3A ja 3B). Kun kasvanut pallosia kaikki neljä fibroblasti populaatiot osoittivat voimistunut VEGF, HGF /SF ja FGF7 mRNA: n ilmentymisen. VEGF induktio oli suurin CAF-74-solut (yli 15-kertainen) (kuvio 3C), kun taas korkein HGF /SF induktio nähtiin CAF-43-solut (yli 30-kertainen) (kuvio 3D). FGF7 tasot säännellään hieman eri; yli 6-kertainen induktio havaittiin FB-43-solut, muut solut oli keskimäärin 5-kertainen induktio, ja mielenkiintoisesti in CAF-74 solut 72 tunnin kohdalla tämä induktio oli laskenut 2,5-kertaiseksi (kuvio 3E) .

Kasvukerroin geenin ilmentymistä tutkittiin Q-PCR. (A ja B) Molemmat CAF solulinjat ovat vähentäneet ilmentymistä HGF /SF (P 0,05) ja FGF7 (P 0,01) ja kaikki kolme kasvutekijät oli voimistunut vaihtelevassa määrin nemosis (C – VEGF, D – HGF /SF ja E – FGF7). Sarakkeet: keskiarvo; virhepalkit; SEM.

paracrine sääntelyn välillä fibroblasteja ja SCC solujen

Anchorage riippumaton kasvu UT-SCC sinoomasolulinjoja testattiin käyttämällä soft-agaroosi määrityksessä. Kolmen viikon tarkkailujakson aikana kaikki neljä sinoomasolulinjoja muodostivat pesäkkeitä, mutta selvä ero primääristen ja uusiutuvien kasvainten solulinjoissa havaittiin (kuva 4). Kun viljelty yksin, sekä toistuvia kasvainsolulinjoja UT-SCC-43B ja UT-SCC-74B muodostetaan kaksinkertainen määrä pesäkkeiden verrattuna ensisijaisen kasvainsolulinjoilla UT-SCC-43A ja UT-SCC-74A; ero oli tilastollisesti merkitsevä molemmissa tapauksissa (P 0,05). Taustalla yksikerroksista normaalien fibroblastien FB-43 ja FB-74 kasvoi hieman lukumäärää 43A ja 74A karsinooma solupesäkkeet, vastaavasti. Kasvu pesäkemäärät entisestään vahvistua 43A ja 74A SCC soluja kasvatettiin vaikutuksen alaisena CAF-43 ja CAF-74 (P 0,05), tässä järjestyksessä. Mielenkiintoista, kun viljellään enemmän invasiivisia 43B ja 74B SCC solujen FB-43 ja FB-74 fibroblastit, laskua pesäkeluvussa nähtiin; tämä vaikutus oli suurempi, 74B solujen (P 0,05 FB-74 kontrolliin verrattuna). CAF-43 ja CAF-74 fibroblastit palautettu määrä pesäkkeiden tasolla ohjaus, mutta ei edelleen parantaa pesäkkeiden muodostumista toistuvia SCC soluja.

UT-SCC pesäkkeiden muodostumisen tutkittiin soft-agaroosilla määritys . Kaikki UT-SCC solut muodostivat pesäkkeitä pehmeässä agaroosi, toistuva SCC (B ja D) kaksi kertaa niin paljon kuin ensisijainen SCC soluja (A ja C) (P 0,05). Normaalien fibroblastien määrä kasvoi pesäkkeitä ensisijaisen karsinoomien soluissa, ja tämä on edelleen täydennetty CAF-solujen (P 0,05) (A ja C). Toistuva SCC solujen pesäkkeiden muodostuminen estää normaalin fibroblastien (P 0,05 FB-74 kontrolliin verrattuna) ja palautettu kontrolloida tasolle valuuttalisiin (B ja C). Sarakkeet: keskiarvo; virhepalkit; SEM.

UT-SCC pesäkkeiden muodostumisen tulokset olivat yhdenmukaisia ​​solujen välillä saatu kaksi yksilöä; oli kuitenkin vaihtelua yksilöiden välillä, kun tarkkailemalla tiiviisti taustalla yksikerroksista fibroblastiviljelmät. Spontaani sferoidi muodostuminen nähtiin taustalla yksikerrosviljelmä FB-43 ja CAF-43 fibroblastit kun viljeltiin yhdessä sekä 43A ja 43B SCC soluja (kuva 5A-D). FB-74 ja CAF-74 ei spontaanisti pallosten muodostamiseksi mihinkään edellä mainitut ehdot, mutta he kasvavat nopeammin kun viljeltiin yhdessä enemmän pahanlaatuisia 74B soluja (kuvio 5G-H). Kuviot 5I-J esitetään spontaani pallomainen muodostumista 43 fibroblastien 43A ja 43B SCC soluja. Sekä UT-SCC solulinjoissa, CAF-43-solut muodostivat merkitsevästi enemmän pallosia kuin FB-43 fibroblasteja (P 0,05). Kaksi erilaista SCC solulinjoista ei vaikuttanut merkittävästi fibroblastien pallomainen muodostumista; vaikka lievää kasvua nähtiin CAF-43 sferoidit toistuvia 43B SCC soluja. Mikään fibroblastien tyypit (FB-43, CAF-43, FB-74 ja CAF-74) muodostivat pesäkkeitä pehmeässä agaroosi.

edustaja kuvaa taustalla fibroblastien yksikerrosviljelmissä. Spontaani klustereiden (nuolet) nähdään FB-43 ja CAF-43 solujen vaikutuksen alaisena pariksi SCC solujen 43A (A ja B) ja 43B (C ja D). Sen sijaan, FB-74 (E ja G) ja CAF-74 (F ja H) ei pallosten muodostamiseksi. Mittakaava 60 pm. Määrä on muodostettu pallosia laskettiin yksikerroksista fibroblastiviljelmät (I ja J). CAF-43-solut muodostivat merkitsevästi enemmän pallosia kuin FB-43-soluja (P 0,05). Sarakkeet: keskiarvo; virhepalkit; SEM.

Valaistaan ​​syy eri käyttäytymistä fibroblasti paineita yksikerroksisiin, ja erityisesti hitaan kasvun CAF-74-solut, suoritimme vanhenemista liittyvän beeta-galaktosidaasia (SA- p-gal) värjäys. SA-β-gal-aktiivisuus on yleisimmin käytetty markkerina solun vanhenemista. Ennenaikainen stressin aiheuttama vanhenemista johtuu oksidatiivista stressiä, DNA-vaurioita ja onkogeeni aktivointi [28]. Kuten odotettua, CAF-74-solut osoittivat voimakasta SA-β-gal värjäys. CAF-43 fibroblastit olivat hyvin positiivisia, mutta CAF-74 oli merkittävästi enemmän (P 0,01) senescent soluja (kuvio 6).

edustaja kuvaa fibroblastien yksikerrosviljelmiä värjättiin SA-β-gal-aktiivisuuden. FB-43 (A) ja FB-74 (C) osoittaa vähän tai ei lainkaan värjäytymistä; Valuuttalisiin ovat positiivisia (B ja D). Mittakaava 200 pm. CAF-74 oli merkittävästi enemmän (P 0,01) SA-β-gal-soluja verrattuna CAF-43 (E). Sarakkeet: keskiarvo; virhepalkit; SEM.

Keskustelu

Ensisijainen karsinoomat katsotaan järjestäytymättömiä elimiä, jotka koostuvat eri solutyyppejä, kuten syöpäsoluja, fibroblastit ja muut mesenkymaaliset solut ja solut, jotka liittyvät immuniteetin ja verisuoniston. Kasvain-stroomaan mikroympäristön johtaa fibroblastin aktivointia ja paracrine välinen signalointi fibroblasteja ja syöpäsolujen [29]. Vuonna nemosis, aktivoituneiden fibroblastien alkaa tuottaa proteiineja, jotka liittyvät tulehdukseen, proteolyysin ja syövän etenemistä ja samalla downregulate ilmentymisen solun tukirangan proteiinien [14] – [19].

Tämän työn tavoitteena oli tutkia nemosis vaste potilaan vastaaviin normaaleihin ja syöpään liittyvän fibroblasteissa ja tutkia ekspressiokuviota CAF markkereita ja käyttäytyminen nemosis. Vain yksi normaali fibroblasti kantoja (FB-43) ja yksi valuuttalisiin (FB-74) indusoi COX-2: nemosis. Tämä on ristiriidassa aiemmin julkaistut tulokset, joissa COX-2-induktio on pidetty tunnusmerkki ominaisuus nemosis. Kuitenkin näissä tutkimuksissa fibroblasteissa ovat peräisin vastasyntyneen alkuperää ja tässä olemme käyttäneet fibroblasteja saatu aikuisista. Tämä ristiriitaisia ​​tulos siis osoittaa, että COX-2 ei tule yksinomaan käyttää mittaamaan nemosis vastausta, mutta muita markkereita, kuten profiilia eritettyjen proteiinien, olisi tutkittava samoin.

Toinen keskeinen piirre nemosis on aikariippuvaisella hajoamista solun tukirangan. Proteiinin taso kolme fibroblasti kantojen ilmaistaan ​​α-SMA, yllättäen myös normaalin ihon fibroblastit FB-74. Toinen normaali fibroblasti kanta FB-43 ei ilmaissut α-SMA proteiinitasolla. Kuitenkin mitattaessa mRNA tasojen kanssa herkempi Q-PCR-menetelmällä, kaikki neljä fibroblasti populaatiot osoittivat α-SMA ilmaisun ja tämä vaimentua vuonna nemosis. Aikariippuvaisella downregulation molemmilla proteiini- ja mRNA-tasolla on yhdenmukainen aiempien tuloksia nemosis, osoittaa hajoamista solun tukirangan. Mielenkiintoista valuuttalisiin alkoi takaisin α-SMA-mRNA: n ilmentymistä 72 h, ero oli merkittävä verrattuna normaalin kanssa. Toisin kuin meidän tuloksia tutkimuksesta Shannon et al. [30] osoittivat, että normaali iho fibroblastit, mutta ei suun fibroblasteja ilmaista α-SMA. Kuitenkin uudempi tulokset osoittivat, linjassa tuloksia, että normaali suullinen fibroblastit ilmaista α-SMA ja tätä ilmaisua kasvaa, kun näitä soluja viljeltiin kunnostetussa alustassa saatu OSCC soluista [31]. Nämä ristiriitaiset tulokset saattavat tulevat osin menetelmästä, jota käytettiin mittaamaan α-SMA ilmaisu; in ensimmäinen immunoblottaus käytettiin toisessa menetelmässä oli hieman herkempi immunohistokemiallisesti.

Tutkimme myös mRNA-tasoja kahden muun CAF markkereita, FSP1 ja FAP. Vuonna nemosis FSP1 pinnat laskivat FB-43, FB-74 ja CAF-74 palloset, mutta kasvoi CAF-43 soluihin. Kolmas tutkittu CAF markkeri FAP oli yläreguloituja nemosis, enemmän valuuttalisiin kuin normaalissa fibroblasteissa, ero oli merkitsevä kanssa 43 fibroblastien kantoja. Kun kaikki kolme CAF merkkiaineista nemosis vastaus seurasi rakenteessa vähentynyt ilmentyminen solun tukirangan geenien (α-SMA ja FSP1) ja kasvu proteolyyttisten geenien ilmentyminen (FAP). Selvästi erilainen vastaus nähtiin CAF-43 soluihin, joissa sen sijaan downregulation FSP1 tasot nousi nemosis.The heterogeenisyyden fibroblastien käy ilmi, kun tarkastellaan pohjapinta tasoilla CAF merkki ilmaisu; CAF-43-solut oli alhaisempi kaikkien kolmen merkkiaineita, CAF-74 oli vähemmän α-SMA, hieman FSP1 ja yli 10-kertaisesti enemmän FAP. Nämä tulokset myös korostaa, että α-SMA, yleisimmin käytetty CAF /myofibroblastin merkki, ei tulisi käyttää ainoastaan ​​määrittää aktivoituneiden fibroblastien.

Toinen tunnusmerkki nemosis on induktio kasvutekijöitä. On osoitettu, että suun kautta fibroblastit tuottavat merkittävästi enemmän FGF7 ja HGF /SF verrattuna ihon fibroblastit [30]. Nämä kaksi kasvutekijöitä, yhdessä VEGF: n, tiedetään olevan tärkeitä haavan ja syövän etenemistä [32], [33]. Pohjapinta VEGF: n ilmentymistä, HGF /SF ja FGF7-mRNA oli matalampi valuuttalisiin kuin normaalien fibroblastien, ja tämä on päinvastoin kuin aikaisemmat tulokset [30]. Kuitenkin kasvuvauhti näiden solujen oli hitaampaa kuin normaalin kollegansa, jotka saattaisivat vaikuttaa niiden vähentynyt kasvutekijöiden. SA-β-gal-aktiivisuuden valuuttalisiin tukee tätä teoriaa, mikä osoittaa, että nämä solut ovat senescent. Että näiden kasvutekijöiden erittyvän fibroblasteja voidaan vähentää siinä valuuttalisiin koska itse kasvainsoluihin, sekä läpitunkema makrofagien ja endoteelisolujen, jotka pystyvät tuottamaan näitä tekijöitä. Kuten odotettua, VEGF, HGF /SF ja FGF7 mRNA: t yläreguloituja fibroblastien nemosis, ja taso induktion vaihteli fibroblastien populaatioissa. VEGF induktio oli suurin CAF-74 palloset, HGF /SF CAF-43 sferoideja ja FGF7 in FB-43 pallosia.

Näiden tulosten perusteella näyttää siltä, ​​että valmiutta normaali ja syöpään liittyvien fibroblasteja tuottamaan näiden kasvutekijöiden nemosis liittyy jossain määrin siltä osin kuin niitä tarvitaan syövän etenemiseen. Riippuvuus kasvainten strooman fibroblasteissa, ja erityisesti kasvutekijöitä ne tuottavat, pienenee aikana syövän etenemisen. Epiteelisolujen vaativat FGF7 rikkoa epiteelin polarisaatio. FGF7 ilmentyy vain stroomasolut ja sen reseptorin FGFR2IIb vain epiteelisolujen, mikä osoittaa roolin FGF7 alussa syövän etenemisen [34]. Tutkituista fibroblasti väestön FB-43-soluissa, jotka näyttävät olevan kaikkein normaalia tutkituista kannoista (perustuen induktion COX-2 ja puute α-SMA), oli korkein FGF7 induktion nemosis. HGF /SF tarvitaan muutolle /sironta epiteelisolujen alkuperäisestä taitekohta. Nemotic CAF-43-solut tuottivat enemmän HGF /SF kuin muut kolme solukantoja. Tätä tukevat Kankuri et al. [15] ovat osoittaneet, että HGF /SF tuottama fibroblasti pallosia suoraan edistää syöpäsolujen invaasiota. Myös toinen tutkimus on osoittanut, että suun fibroblasteja ajaa invaasio OSCC solujen lisäämällä eritystä HGF /SF [35]. VEGF tarvitaan myöhemmin syövän etenemisen kun syöpäsolu massa ulottuu pisteeseen, jossa se ei voi enää kasvaa ilman hapensaantia. VEGF, erittävät fibroblastit, indusoi angiogeneesiä rekrytoimalla endoteelisolujen muodostaa uusia verisuonia [36]. CAF-74-solut, jotka ovat senescent, on ylivoimaisesti korkein VEGF nemosis.

On hyvin tunnettua, että valuuttalisiin, mutta ei normaalien fibroblastien, pystyvät edistämään kasvaimen etenemistä [37] – [ ,,,0],39]. Uudemmat tulokset ovat osoittaneet, että aluksi normaalien fibroblastien estävät syöpäsolujen kasvua [2], ja meidän nykyinen tulokset yhtyä tähän käsitteeseen. Osoitamme tässä, että normaalien fibroblastien todellakin estää pesäkkeiden muodostumista toistuvia SCC soluja, mutta kumma tämä ei nähty ensisijaisena syöpäsoluja. Valuuttalisiin näyttävät olevan mahdollisuus vaikuttaa vain ensisijainen SCC soluja eikä toistuvia soluja. Valuuttalisiin tuotti alhaisempi kasvutekijöiden, ja se voisi olla, että tästä syystä he pystyvät vaikuttamaan herkemmin ensisijaisen SCC, mutta vähemmän herkkä toistuva solut eivät reagoi tähän alhaisempi määrä eritettyjä kasvutekijöiden.

havaitut spontaanisti pallomainen muodostuminen FB-43 ja CAF-43 yksikerrosviljelmissä on sopusoinnussa tulosten Kankurilla et al. [15], jossa spontaani ryhmittely fibroblastit, ts nemosis, voitaisiin saavuttaa lisäämällä kasvainsolujen johdettu väliaine on fibroblastien yksikerroksinen. Emme kuitenkaan ei löytänyt tätä kanssa fibroblasti kannat muista SCC potilas. Tämä saattaa johtua osittain induktion kasvaimen p53 vuonna 74A ja 74B SCC soluja. Tästä huolimatta fibroblastit teki kasvaa nopeammin vaikutuksen alaisena 74B SCC solujen tämä oli myös totta kanssa CAF-74 soluja, jotka näyttävät olevan tilassa stressin aiheuttama vanhenemista. Vielä enemmän, emme nähneet kiinnittymisestä riippumatonta kasvua fibroblastien, kanssa ristiriidassa saadut tulokset prostate- ja eturauhassyöpä liittyy fibroblastien [40]. Mahdollisia selityksiä tälle ovat yksilöllisiä eroja ja alkuperä fibroblasteissa. On syytä huomata, että pehmeä-agaroosi kokeissa SCC solut ja fibroblastit eivät olleet suorassa kosketuksessa mutta erotettu kiinteä kerros agaroosia, ja viljelmiä ei täydennetään tuoreella alustalla. Siksi paracrine signalointi näiden kahden solutyypin on välittyvän liukoisen tekijät.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa selvästi, että fibroblastit saatu eri yksilöiden vaihtelevat geenien ilmentymistä ja toimintaa ja että ilmaus CAF merkkiaineiden vaihtelee normaalien fibroblastien ja valuuttalisiin in nemosis. Sekä normaalin ja syöpään liittyvän fibroblastien moduloida kasvainsolujen, normaali fibroblastien kasvun estämiseksi invasiivisia SCC solujen ja valuuttalisiin paranevat entisestään kasvun ensisijaisen SCC soluja. Nemosis, joka on

in vitro

malli fibroblastien aktivoitumisen, voi olla sen

in vivo

vastine syöpään liittyvän fibroblasteissa ja on arvokas väline tutkittaessa erot fibroblastit saatujen eri henkilöitä. Nemosis vastaus, erityisesti CAF merkkiaineiden α-SMA ja FAP, voitaisiin siksi käyttää ennustetekijöiden merkki ennustaa tukikudosten reaktio kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Solun kantoja ja soluviljelmissä

Kaikki käytetyt solukannat oli aiemmin vahvistettu [25], [26], [41] ja toimitti tri Reidar Grenman (TYKS, Suomi). Lyhyesti, UT-SCC-43A (43A) solut saatiin primäärikasvain on 75-vuotias nainen gingivaalisella haavaumia ja etäpesäke. Histologia (T4N1M0) oli hyvin erilaistunut SCC. UT-SCC-43B (43B) solut perustetaan resektoidun toistuva kasvain. UT-SCC-74A (74A) solut saatiin 31-vuotias mies, jolla SCC monikielinen oikeassa marginaalissa (T3N1M0). UT-SCC-74B (74B) solulinja perustettiin peräisin etäpesäke löytyy myöhemmin niskaan. Potilas-täsmäsi FB-43 ja FB-74 normaalien fibroblastien saatiin ihon ja CAF-43 ja CAF-74 fibroblasteja saatiin stroomaan vastaavien suun SCC. Mesenkymaaliset alkuperä fibroblastien kantojen alunperin vahvistettiin positiivista värjäytymistä varten vimentiinista ja negatiivinen värjäytyminen sytokeratiinia käyttäen immunohistokemiaa.

Kaikki solupopulaatioiden viljeltiin +37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja joka oli täydennetty 5% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Invitrogen), 0,3 mg /ml glutamiinia, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä. Fibroblastien sferoidit muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, 150