Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimuksen kohteena on tunnistaa N-glykaanin profiloinnin muutoksiin liittyy mahasyövän ja tutkia vaikutusta ydin-fukosyloitu- biologisia käyttäytymistä ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Kaikkiaan 244 aiheita kuten mahasyövän, mahahaava ja terveillä verrokeilla rekrytoitiin. N-glykaanin profilointi seerumista ja yhteensä proteiineja mahalaukun kudoksissa analysoitiin DNA-sekvensseri-avusteinen fluorofori-avusteisen kapillaarielektroforeesi. Runsaus koko ydinfukosyloituja tähteet ja ilmaisu osallistuvien entsyymien core-fukosyloitu- analysoitiin lektiinin blot, kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio, western blot, immunohistokemiallinen värjäys ja lektiini-histokemiallisella. Yhdistelmä-DNA-plasmidit GDP-fukoosia transporter ja α-1,6-fukosyylitransferaasin (Fut8) on rakennettu ja transfektoitiin mahasyövän solulinjoissa BGC-823 ja SGC-7901. CCK-8 ja haavan paranemista määritystä arviointiin käytettiin toiminnallista vaikutusta core-fukosyloitu- modulaatiota soluproliferaatioon ja muuttoliike. Ominaisuus seerumin N-glykaanin profiilit löytyivät mahasyövässä. Verrattuna terveisiin, joka on trianntenary rakenne runsaus, huippu 9 (NA3Fb), lisääntyivät merkittävästi mahasyövän, kun koko runsaasti ydinfukosyloituja tähteet (sumfuc) väheni. Ydinfukosyloituja rakenteet, peak6 (NA2F) ja peak7 (NA2FB) oli kuollut mahakasvaimen kudoksissa verrattuna, että viereisten ei-kasvainkudoksia. Johdonmukaisesti, Lens culinaris -agglutiniinista (LCA) sitoutuvilla proteiinit väheni merkittävästi seerumista mahasyöpä, ja proteiinin taso Fut8 väheni merkittävästi mahakasvaimen kudoksissa verrattuna viereisillä kuin tuumorikudoksia. Ylössäätely GDP-Tr ja Fut8 voisi estää proliferaatiota, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta migraatio BGC-823 ja SGC-7901-soluissa. Core-fukosyloitu- on alaspäin säännellään mahasyövässä. Ylössäätely core-fukosyloitu- voi estää proliferaatiota ihmisen mahalaukun syöpäsoluja.

Citation: Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Et Q, Yi C-H, et al. (2014) Vähentynyt Core-fukosyloitu- Auttaa Maligniteetti mahasyövän. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10,1371 /journal.pone.0094536

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty 17. maaliskuuta 2014; Julkaistu: 14 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81201697, 81101639 ja nro 81271925); Tiede ja tekniikka komissiolle Shanghai kunta (nro 10ZR1439100 ja nro 11JC1416400) kantavassa rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

mahasyöpä (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1] – [3], erityisesti yleistä monissa Aasian maissa, erityisesti Kiinassa [4]. Proteiini glykosylaatio on yksi yleisimmistä posttranslational tehdyt muutokset proteiinien [5]. Glykaanien voidaan kiinnittää proteiineja joko amidiryhmä (N-kytketty glykosylaatio) tai hydroksyyliryhmä (O-kytketty glykosylaatio), joita esiintyy erilaisten biosynteesireiteissä ja mahdollisesti olla riippumattomia toimintoja, [6]. N-sidottu glykosylaatio pelaa perustavanlaatuinen rooli monissa biologisissa prosesseissa, kuten soluadheesiota, solujen vaeltaminen, ja signaalitransduktion [7]. Epänormaali ekspressio N-glykoproteiinien on havaittu eri sairauksiin [8] – [10]. Kun perusteellinen luonnehdinta N-sitoutuneiden glykoproteiinien ja sairauteen liittyvää glykosylaation muutokset, useat menetelmiä on kehitetty. Aiemmissa tutkimuksessa olemme tunnistaneet joitakin N-glykaanin merkkiaineiden heptatocellular karsinooma (HCC) ja paksusuolen syöpä käyttäen kapillaari perustuva elektroforeesi nimeltään DNA-sekvensseri-avusteinen fluoroforileimattuja avustaa kapillaarielektroforeesissa (DSA-FACE) [11]. Lisäksi on raportoitu, että α-1, 6-fukosyylitransferaasin (Fut8) aktiivisuutta ja ilmentyminen lisääntyy useissa ihmisen syövissä, mikä viittaa siihen, rooli tämän entsyymin kasvaimen kehittymisessä ja etenemisessä, kuten HCC [12], paksusuolen ja peräsuolen syövän [ ,,,0],13], nonsmall keuhkosyöpä [14] ja munasarjojen vakavien adenokarsinooma [15]. Altered core-fukosyloitu- on yksi tärkeimmistä epänormaali glykoituneen muutos tunnistettu syöpäsairauksia. Fut8 katalysoi siirto fukoosin peräisin guanosiinidifosfaatti (BKT) -fucose sisimpään GlcNAc hybridi- ja monimutkaisten N-kytkettyjen oligosakkaridien kautta α-1,6-sidos, jolloin ydinfukosyloituja glykoproteiineja [16] – [17] ja muuttamalla biologisen funktion tuloksena glykoproteiinien [18]. Vaikka monet tutkimukset ovat raportoineet yhdistyksen välillä muuttunut core-fukosyloitu- ja muita aggressiivisia kasvaimia, tietojemme mukaan vaikutus ydin-fukosyloitu- mahalaukun syöpä on edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin N-glykaanin profiloinnin DSA-FACE molemmissa seeruminäytteistä mahasyöpä, mahahaava, terveiden verrokkien ja kudosten proteiinien kasvaimia ja viereisen ei-kasvaimia. Sitten laajentaa toiminnallinen tutkimus kun tunnistettu erityisiä glykosylaatiot.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi Kiinan eettisen komitean henkilöstöjohtajaksi toisessa Military Medical University. Kaikki TET kunhan kirjallinen lupa.

Tutkimuskanta

Yhteensä 105 potilasta, joilla mahalaukun syövän (n = 80) ja mahahaava (n = 25) oli mukana välillä joulukuussa 2007 ja lokakuu 2010 Changzheng sairaalan toisen Military Medical University (Shanghai, Kiina). Kaikki tapaukset, joissa mahasyöpä kirjoilla oli histopatologisesti vahvistettiin 2 patologit ja tapauksia mahahaava palvelukseen vahvistettiin gastroscope. Potilaat, joilla on mahasyövän jotka saivat preoperative kemoterapiaa ja joilla oli muita sairauksia kuten tulehdukset suljettiin pois tutkimuksesta. Seeruminäytteet saatiin ennen kirurgista poisleikatuista. Jotta kontrolliryhmään, 139 iältään vastaaviin, tervettä vapaaehtoista otettiin poolista syövän vapaa yksilöitä, jotka kävivät samassa sairaalassa säännöllistä lääkärintarkastus ja jotka vapaaehtoisesti liittyä tutkimuksen samana aikana. Me määritelty terve yksilö henkilönä, joka katsottiin vapaa sairauksien (mukaan lukien ei ollut syöpä) klo terveystarkastus. Seuraavat kliiniset ominaisuudet aiheista saatiin aikaan koko verinäytteen. Yhteenveto tiedot näistä aiheista on esitetty taulukossa 1. etenemistä kaikilla potilailla, joilla mahalaukun syövän luokiteltiin mukaan unionin International Cancer valvonta (UICC) TNM lavastus kriteerit mahasyövän, 13 potilasta (16,25%) oli vaiheen I, 24 potilasta (30,00%) oli vaiheen II, 30 potilasta (37,5%) oli vaiheen III, ja 13 potilasta (16,25%) oli vaiheen IV. Keski-ikä kaikista potilaista oli 54,35 ± 6,69 mukaan lukien 60 urosta ja 20 naarasta. Seerumi kerättiin käyttäen standardia protokollaa kokoverestä, käsiteltiin sentrifugoimalla 10000 g 20 minuutin ajan, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

N-Glycan profilointi seerumin proteiineista

Seerumin proteiinin N-glykaanin analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, N-glykaanien läsnä olevien proteiinien 2 ui seerumia vapautettiin peptidi N-glykosidaasi-F (PNGaasiF) (New England Biolabs, Boston, Mass), ja sitten leimattiin 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulphonic happo (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) .Sialic happo poistettiin Arthrobacter ureafaciens sialidaasia (Roche Bioscience, Palo Alto, Kalifornia), ja käsitellyistä näytteistä analysoitiin DSA-face-tekniikalla kapillaarielektroforeesi-pohjainen ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). 9 voimakkain piikit, jotka havaittiin kaikissa näytteissä (yhdessä näiden huippujen osuus 90% seerumin kokonais-N-glykaanien) analysoitiin käyttämällä GeneMapper ohjelmistoa (Applied Biosystems). Jokainen rakenne N-glykaani kuvattiin numeerisesti normalisoimalla sen korkeus summaan korkeudet kaikki huiput.

kudosnäytteitä

Kaikki kudokset käytettiin mukaisesti Institutional Review Board sovellettavat Toisen Military Medical University. Kudosnäytteet saatiin yhteensä 10 potilasta 80: stä mahalaukun syöpä. Tissue näytteet ovat 2 viipaletta, tuumorikudoksessa ja viereisen ei-kasvainkudoksessa. Pariksi kudosnäytteet (noin 0,5 x 0,5 x 0,5 cm

3, monistaa kutakin näytettä) valitaan joko jäädytettiin välittömästi -80 ° C: ssa RNA: n ja proteiinien erottamisessa ja kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin jopa 24 tuntia ja sitten jalostetaan parafiiniin lohko ja säilytettiin huoneenlämpötilassa histokemiallista värjäystä.

N-Glycan profilointi kudoksesta proteiineista ja rakenteellinen analyysi käyttäen exoglycosidase ruoansulatusta

proteiinit uutettiin noin 25 mg jäädytetyt kudosnäytteet . Kudosnäytteet keskeytettiin ja pestled lyysipuskuriin joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Ranska). Hajoamattomat osat poistettiin sentrifugoimalla (12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa) kaksi kertaa. Pitoisuus liukoiseksi proteiinien määritettiin käyttäen BCA-pakkausta (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), ja proteiini säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikkiaan 40 ug kudoksen proteiineja käytettiin luomaan N-glykaanin profiileja käyttämällä säännöllisesti N-Glycan profiloinnin menetelmä on sama kuin se, joka suoritetaan seerumin edellä on kuvattu. Tunnistaa core-α-1, 6-fukosyloituja N-glykaanin rakenteet, asianmukainen määrä APTS-leimattua N-glykaanit pilkottiin molemmat Arthrobacter ureafaciens sialidaasi ja naudan munuaisen α-1, 6-fukosidaasin (Prozyme, San Leandro, CA , USA). DSA-FACE tekniikkaa käytettiin analysoimaan digestiotuotteista ja GeneMapper ohjelmistoa käytettiin analysoimaan korkeutta huiput.

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Yhteensä-RNA: t uutetaan jäädytetty kudokset ja solut, käyttäen kokonais-RNA liuuttovälinepakkausta mukaan valmistajan ohjeiden (Axygen Biosciences, Hangzhou, Kiina). Puhtaus ja pitoisuus RNA määritettiin spektrofotometrillä (Eppendorf, Hampuri, Saksa), ja sen jälkeen säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. CDNA syntetisoitiin käyttäen ReverTra Ace-α-RT-PCR-kittiä (Toyobo Co., Osaka, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Express-ohjelman (Applied Biosystems, sekvenssit on esitetty taulukossa S1). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen SYBR® Green reaaliaikainen PCR Master Mix Kit (Toyobo Co., Osaka, Japani) ja analysoitiin Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR-järjestelmä (ABI, Foster City, CA, USA) . Kaikki määritykset suoritettiin itsenäisesti kolmena kappaleena. PCR-syklien koostuivat denaturoinnista 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 59 ° C: ssa tai 55 ° C: ssa 15 sekunnin ajan, ja havaitseminen 45 sekuntia 72 ° C: ssa. Suhteellinen määrä Fut8 tai guanosiinidifosfaatti (BKT) -fucose transporter (GDP-Tr) transkriptien kussakin näytteessä normalisoitiin housekeeping-geeni β-aktiini ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) vähentämällä syklin. Tasot geeniekspression määritettiin käyttämällä Delta-Delta Ct menetelmällä. Absoluuttinen transkriptioekspressiokuvio arvot yli 40 sykliä katsottiin havaittavien tasojen alapuolelle. Sulata käyrät tarkastettiin kussakin reaktiossa sen varmistamiseksi, että yhden tuotteen monistettiin.

Western blot ja lektiini blot

Proteiinit uutettiin jäädytetyistä kudoksiin edellä kuvattua menettelyä, ja yhteensä 50 ug proteiinit erotettiin elektroforeesilla 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelillä (SDS-PAGE). Geelit värjättiin Coomassie-sinisellä G250 tai proteiinien geelin siirrettiin nitroselluloosamembraanille () havaitsemiseksi Fut8 tai prosenttiosuus ydinfukosyloituja proteiineja. Seerumin näytteiden, yhteensä 85 tapausta mahasyöpä (n = 80), mahahaava (n = 25) ja terveisiin (n = 30) käytettiin SDS-PAGE: lla ja lektiini-blot. Membraanit blokattiin yön yli 4 ° C: ssa 5% rasvatonta maitoa proteiinia tai 5% naudan seerumin albumiinia tris-puskuroidussa suolaliuoksessa [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI (TBS)] ja inkuboitiin sitten 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 1:100 laimennettua anti-humaani-Fut8 vasta-ainetta (15C6, anti-ihmisen Fut8, Fujirebio Corp., Japani) tai 5 ug /ml biotinyloitua lens culinaris agglutiniini A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia) TBS, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (TBST-puskuri), ja sitten inkuboitiin 1:10,000 laimennus fluoresenssin-leimatut sekundääriset vasta-aineet (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) tai IRDye 800CW-streptavidiini (LI-COR Biosciences) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa . Kalvot kehitettiin Odyssey IR Imaging System. Anti-beeta aktiini (1:2000) käytettiin sisäisessä vasta-Länsi-blot. Puhdistettu albumiinia käytettiin negatiivisena kontrollina lektiinin blot ja kokonaisproteiinin värjättiin Coomassie blue avulla laskettiin prosenttiosuus ydinfukosyloituja proteiinia.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäystä ja lektiini-histokemiallisella

kiinteä valetut kudosnäytteet parafiiniin leikattiin 4 mm: siivut immunohistokemiallista värjäystä varten Fut8 ja lektiini-histokemiallisella varten LCA. Kun niitä deparaffinization, nesteytys, endogeeninen peroksidaasi esto, ja antigeenin haku (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, autoklaavin käsitelty), näytteitä inkuboitiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella ihmisen Fut8 (1:100) tai biotinyloitua LCA (1 :500) yön yli 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta tai Fluoreseiini leimatulla streptavidiinilla 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä tai Draq5. Negatiivinen kontrolli koostui identtisesti käsitelty histologisia kohdat hiiren IgG korvata hiiren Fut8.

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa, BGC-823 ja SGC-7901, hankittiin alkaen Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia ja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 RPMI 1640 väliaineessa ja DMEM-alustassa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), vastaavasti, 10% FBS, 1% glutamiinia ja 1% antibiootti liuosta.

rakentaminen GDP-Tr ja Fut8 rekombinanttiplasmidien ja transfektio mahalaukun syöpäsolujen

pEGFP-N1-BKT-Tr ja pEGFP-N1 -Fut8, plasmidivektori, joka koodaa ihmisen GDP-Tr tai Fut8, muodostettiin insertoimalla GDP-Tr tai Fut8 cDNA osaksi pEGFP-N1 -vektoriin (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), joka sisältää CMV-promoottorin ja SV40: n aikainen promoottori, sekä neomysiini /kanamysiiniresistenssigeenin Tn5. Vektoriosasta sisältää myös SV40: n replikaation nisäkässoluissa. Monikloonauspaikan (MCS) vieressä on välitön varhainen promoottori CMV. Ihmisen GDP-Tr tai Fut8 geeni kloonattiin mRNA uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA) ihmisen maksakudosta suorittamalla RT-PCR: llä käyttäen alukkeita (taulukko S2), jossa Xho I tai KpnI-restriktiokohdan sisällytettiin, pilkkomalla XhoI tai KpnI ja ligatoimalla pEGFP-N1. PEGFP-N1-BKT-Tr tai pEGFP-N1-Fut8 transfektoitiin Escherichia coli DH5a monistamista ja DNA-sekvensoinnilla käytettiin varmistaa uskollisuus. Plasmidi-DNA valmistettiin käyttäen Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidit transfektoitiin ihmisen mahasyövän solulinjoissa, BGC-823 ja SGC-7901 80% yhtymäkohdassa ja 5 x 10

5 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyn käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektoituja soluja, jotka ilmensivät kohdegeenin varmistettiin kvantitatiivisen RT-PCR.

Soluproliferaatiomääritys

soluproliferaatiomäärityksissä suoritettiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Solujen kasvua seurattiin joka 24. tunti 5 vuorokauden kuluessa, ja kunakin ajankohtana suoritettiin kahtena kappaleena. Absorbanssi mitattiin kustakin kuopasta aallonpituudella 450 nm.

Haavan paranemista määrityksessä

haavan paranemista määrityksessä, ihmisen mahasyövän solulinjoissa, BGC-823 ja SGC-7901 ( 1 x 10

5 solua /35 x 11 mm astiat) ympättiin ja inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa ja sitten transfektoidaan yhdistelmä-DNA-plasmideja. Saavutettuaan yhtymäkohta, matkapuhelinverkon kerroksen kussakin levy naarmuuntunut käyttäen muovista pipetin kärki. Migraatio solujen reunalla tyhjästä analysoitiin 0, 24 ja 48 tuntia, kuvat otettiin kiinni ja analysoitiin Leica fluoresenssimikroskooppiin ja sovittaa kuva-analyysi-ohjelmisto (Comet määritys IV Kuva-analyysi järjestelmä, PI, UK).

Säännöllinen Kasvain Maker Detection

Kliiniset ja biokemialliset tiedot potilaiden on koottu taulukkoon 1. Säännöllinen biokemialliset testit mitattiin tavanomaisilla menetelmillä ja sovitettu reagenssit (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokio, Japani) . tuumorimarkkeri tasoilla, myös hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9), Karsinogeenisyys alkion antigeeni (CEA), sytokeratiinivasta 19 (CK19), CA125 ja CA724, määritettiin Roche E170 modulaarinen Hyväksytty reagenssien.

tilastollinen analyysi

Kaikki määrälliset muuttujat ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeamat ellei toisin mainita. kvantitatiiviset muuttujat verrattiin Studentin t testit, analyysit varianssi (ANOVA), tai nonparametric testejä. Pearsonin korrelaatiokertoimet (Spearman korrelaatiokertoimet laskettiin järjestysluku kategorinen muuttujat) ja niihin liittyvillä todennäköisyyksillä (

p

) käytettiin arvioimaan korrelaatioita parametrit. Kaikki raportoidut

p

arvot olivat 2-tailed, ja

p

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 16.0 for Windows tilasto-ohjelmalla (SPSS Inc.).

Tulokset

Eri seerumin N-Glycan profiloinnin kuvioita mahasyövän, mahahaava ja terveiden verrokkien

Käyttämällä DSA-FACE, selvitimme N-glykaanin profiilit desialyloidaan sairastavien potilaiden seerumi mahasyöpä (n = 80), mahahaava (n = 25), ja ikä Hyväksytty terveiden yksilöiden (n = 139). Me määrällisesti ja tilastollisesti verrattiin näiden huippujen kesken 3 eri ryhmiin. Vähintään 9 N-glykaanin rakenteet (piikit) tunnistettiin kaikissa näytteissä (kuvio 1A). Rakenteellinen analyysi Näiden N-glykaanien julkaistiin aikaisemmin Callewaert [11]. Keskimääräinen suhteellinen runsaus näiden N-glykaanin rakenteet on kuvattu taulukossa 2. runsaasti rakenteiden piikkien 2, 3, 5, 6, 7, 8 ja 9 paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja mahasyövän, mahahaava, ja terveisiin ryhmiä, mikä osoittaa, että eri N-glykaanin malleja ilmestyi eri patofysiologisia olosuhteissa. Verrattuna terveisiin ryhmä, peak5 (bigalacto kaksiantenniset glykaani, NA2) ja peak9 (haarautuvia α-1,3-fukosyloituja triantennaarisilla glykaani, NA3Fb) olivat koholla (P 0,001) (kuvio 1 B); ottaa huomioon, että ydin- fukosyloituja huiput, kuten peak2 (agalacto core-α-1,6-fukosyloituja bisecting kaksihaaraisen glykaani, NGA2FB), peak3 (single agalacto core-α-1,6-fukosyloituja kaksihaaraisen glykaani, NG1A2F), peak6 (bigalacto core -α-1,6-fukosyloituja kaksiantenniset glykaani, NA2F) ja peak7 (bigalacto core-α-1,6-fukosyloituja bisecting kaksiantenniset glykaani, NA2FB) määrä väheni mahasyövän ryhmä (P 0,001). Samoin runsaasti ydinfukosyloituja rakenne glykaanien nimeltään sumfuc (osoittaa yhteensä ydinfukosyloituja rakenteita, kuten huippu 1, 2, 3, 4, 6, ja 7) väheni merkittävästi mahasyövän (P 0,001) (kuvio 1 C ). Mahasyövän ryhmä luokitellaan edelleen 4 alaryhmiin TNM lavastus UICC mahasyövän. Rakenne runsaus ja sumfuc ei muuttunut merkittävästi joukossa 4 eri alaryhmiin; kuitenkin, sumfuc väheni asteittain etenemisen vaiheissa mahasyövän (taulukko 3).

(A) Kolme paneelit (ylhäältä alas) ovat tyypillisiä seerumin N-glykaanin profiilit terveistä ohjaus, mahahaava ja mahalaukun syövät. Yhdeksän suuren huiput voidaan identifioida. Rakenteet N-glykaanin piikit on esitetty alla kaaviossa. Tasoa huiput 5 ja 9 ovat koholla (ylös nuolet), ja tasot huiput 2, 3, 4, 6, 7 ja 8 pienenevät (alanuolien) mahasyövän verrattuna terveissä ja tautien valvonta. Piikit 1, 2, 3, 4, 6 ja 7 ovat ydinfukosyloituja glykaanien. (B) arvo peak9 (haarautuminen α-1,3-fukosyloituja triantennaariset N-glykaani, NA3FB) on koholla peräkkäin terveistä ohjaus, mahahaava syöpään (P 0,001), Error pylväät edustavat 95%: n luottamusväli (95 % CI) keinoin. (C) arvo sumfuc on vähentynyt mahasyövässä (P 0,001). Sumfuc osoittaa yhteensä runsaasti ydinfukosyloituja rakenne glykaanien (piikit 1, 2, 3, 4, 6 ja 7). Virhe pylväät edustavat 95% CI keinoja.

Korrelaatio N-glykaanien ja rutiini kasvainmerkkiaineet

Toistaiseksi CEA käytetään edelleen laajalti seulontaan ja seuranta mahasyövän. Analysoimme korrelaatiot keskuudessa yksittäisten N-glykaanin markkeri kanssa CA19-9, CEA, CK19, CA125 ja CA724. Pearsonin korrelaatio analyysi osoitti, että CEA liittyi positiivisesti peak1 (r = 0,19; P 0,01), ja peak9 (r = 0,28; P 0,01), kun taas negatiivisesti peak6 (r = -0,18; P 0,01) ja peak8 (r = -0,23; P 0,01) (taulukko 4).

vertailu sumfuc välillä mahasyövän ja muut ruoansulatuskanavan syöpien

Aiemmin olemme tutkineet N-Glycan profilointi maksasolusyövän (HCC) [19] ja peräsuolen syöpä (CRC) [20]. Runsaus sumfuc paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja mahasyövän (41.32 ± 6,39), HCC (50.99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) ja terveillä verrokeilla (47,67 ± 5,08) ryhmät (P 0,001, taulukko 5), mikä osoittaa, että eri tason core-fukosyloitu- ilmestyi syövät eri kudoksista peräisin. Niistä 4 ryhmää, taso core-fukosyloitu- HCC oli korkein, kun taas fukosyloitu- taso mahasyövän oli alhaisin, ja oli jopa pienempi kuin terveillä valvontaa.

N-Glycan profilointi malleja mahakasvaimen ja ei-tuumorikudoksia

N-glykaanin profiilit tutkittiin desialyloidut proteiinin mahakasvaimen ja ei-tuumorikudoksia. Kolme yleisin bigalacto kaksihaaraisen glykaanien osoitti seerumin, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) ja preak7 (NA2FB) tunnistettiin myös kudoksen proteiineja (kuvio 2A). Peak6 ja Peak7 varmistettiin olevan ydinfukosyloituja rakenteita dervied päässä peak5 jälkeen käsitelty ydin-α-1, 6-fukosidaasin pilkkomalla (kuvio 2A). Korkeudet nämä kolme piikkiä analysoitiin käyttämällä GeneMapper ohjelmistoa. Suhde peak6 ja peak5 oli alhaisempi kasvaimen kudoksissa kuin viereisillä ei-tuumorikudoksissa (0,83 ± 0,18 vs. 1,05 ± 0,42, kuvio 2B), samoin kuin suhde peak7 ja peak5 (0,13 ± 0,06 vs. 0,16 ± 0,04, kuvio 2C). Kuitenkin, ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja (P 0,05) välillä kasvain ja ei-tuumorikudoksissa.

(A) Viiden paneelit (ylhäältä alas) ovat desialyloitujen N-glykaanin profiilit seerumista referenssinä, desialyloidut N-glykaanin profiilit tuumorikudoksia, desialyloitujen N-glykaanin profiilit kasvainkudoksista käsitelty α-1,6-fukosidaasin ruoansulatusta, desialyloitujen N-glykaanin profiilit viereisistä kuin kasvain kudosten ja desialyloitujen N-glykaanin profiilit viereisten ei- tuumorikudoksista käsitelty α-1,6-fukosidaasin ruoansulatusta. Nuoli viivat osoittavat muutoksia N-glykaani huiput käsitelty α-1,6-fukosidaasin ruoansulatusta. Peak6 ja peak7 poistaa sen jälkeen kun α-1,6-fukosidaasin ruoansulatusta, mikä reveale että peak5, 6 ja 7 ovat samat rakenteet kuin seerumissa, ja peak6 ja peak7 ovat α-1,6-fukosyloituja N-glykaanien. (B): n arvo peak6 /peak5 on vähentynyt kasvainkudoksissa, mutta ero ei ole tilastollisesti merkitsevä. Virhe pylväät edustavat 95%: n luottamusväli keinoin. (C) arvo peak7 /peak5 on myös vähentynyt kasvainkudoksissa, mutta ero ei ole tilastollisesti merkitsevä.

Vähentynyt veren kokonaiskolesterolia ytimen fukosyloitu- yksilöityjen sekä seerumeissa ja kudoksia mahasyöpä

Koska LCA voi spesifisesti tunnistaa glykoproteiineja, joissa α-1,6-fukosyloituja-sidottu N-asetyyli-D-glukosamiini-asparagiini (GlcNAc-Asp) on trimannosyl ydin, tutkimme yhteensä ydinfukosyloitujen proteiinien seerumeista ja kudosten mahasyövän LCA validoida löydös DSA-FACE. Seerumin taso LCA-sitovan ytimen fukoositähdettä oli alhaisempi mahasyövän kuin, että mahahaavan ja terveillä verrokeilla (kuvio 3A). Yhteensä ydinfukoosin runsaasti myös tiettyjä kehityssuuntia olevan pienempi mahan kasvaimissa verrattuna, että pariksi viereisiin kudoksiin (kuvio 3B). Sen määrittämiseksi, onko muutos koko ydin fukosyloitu- mahalaukun kasvainkudoksessa on merkitystä muuttaminen glykosylaation biosynteesipolun, kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin analysoimaan runsaasti nisäkkäiden Fut8 ja GDP-Tr mahalaukun kasvaimet ja viereisten kudosten. Tulokset paljastivat, että mitään merkittävää eroa Fut8 ja GDP-Tr mRNA ilmaisu ei havaittu kasvaimia ja viereisten kudosten (kuvio 3C ja 3D). Suhteellinen runsaus Fut8 proteiinin havainnollistettiin käyttämällä western blot (raakadata on kuvassa S1). Fut8 viereisissä kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimen kudokset (P 0,05) (kuvio 3E). Immunohistokemia paljasti, että Fut8 voimakkaasti positiivisesti ilmaistiin luminaalinen rajoilla ei-kasvain mahan soluihin (kuvio 4B), mutta se heikosti positiivisesti ilmaistuna kasvainsoluissa (kuvio 4A). Ekspression LCA-sitovan ydinfukosyloituja glykoproteiineja oli suurempi kuin kasvaimen mahalaukun soluja kuin kasvainsoluissa (kuvio 4C, 4D). Joten, taso koko ydin fukosyloitu- tunnistettiin laski sekä seerumeissa ja kudokset mahasyöpä.

(A) Lectin blotteja seerumin proteiinit koetettiin LCA. Vaaka-akseli edustaa koeryhmään: terveisiin (n = 30), mahahaava (n = 25), ja mahasyöpä (GC) (n = 30); pystyakseli osoittaa suhde fukosyloitujen proteiineja yhteensä proteiineja. Taso fukosyloitujen proteiinien mahasyövän on alhaisin 3 ryhmään (P 0,001). (B) Lectin blotteja kudoksesta proteiinit koetettiin LCA. Vaaka-akseli edustaa koeryhmään: kasvaimen kudokset (n = 10) ja viereisiin kudoksiin (n = 10). Pystysuora akseli ilmaisee suhde fukosyloitujen proteiineja yhteensä proteiineja. Ydin-fukosyloituja taso oli alhaisempi mahakasvaimen, mutta ero ei osoittanut mitään tilastollista merkittävyyttä (P 0,05). (C) ja (D) Suhteellinen lähetti-RNA (mRNA) ilmentymisen tasot Fut8 tai GDP-Tr kudoksissa mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Vaaka-akseli edustaa koeryhmään: kasvaimen kudokset (n = 10) ja viereisiin kudoksiin (n = 10). Pystyakseli osoittaa suhteellisen ekspressiotasot Fut8 tai GDP-Tr. Ero ryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (P 0,05). (E) suhteellinen runsaus Fut8 proteiinin havainnollistettiin käyttäen western blot. Vaaka-akseli edustaa koeryhmään: kasvaimen kudokset (n = 9) ja viereisiin kudoksiin (n = 9). Pystyakseli osoittaa suhteellisia tasoja Fut8 proteiinia. Suhteellinen runsaus Fut8 proteiinin viereisiin kudoksiin oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimen kudokset (P 0,05).

(A): n immunohistokemiallinen värjäys Fut8 tuumorisoluissa (200 x), ilmentymistä Fut8 on heikosti positiivinen. (B): n immunohistokemiallinen värjäys Fut8 ei-kasvain mahalaukun soluja (200 x), ilmaus Fut8 on voimakkaasti positiivinen. (C) lektiini-histokemiallisella kanssa LCA tuumorisoluissa, bar 75 um: n ilmentyminen LCA-sitovan ydinfukosyloituja proteiinit on heikosti positiivinen. (D) lektiini-histokemiallisella kanssa LCA ei-kasvain mahalaukun soluissa, bar 75 pm, ilmaus ydinfukosyloituja proteiinit on voimakkaasti positiivinen.

vaikutus Fut8 ja GDP-Tr leviämisen ja muuttoliike ihmisen mahasyövän solulinjoissa

ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa, BGC-823 ja SGC-7901 käytettiin in vitro tutkimuksessa. Koska BGC-823 ilmaistaan ​​alhaisempi BKT-Tr taas SGC-7901 ilmaissut alhaisempi Fut8 meidän pilot tutkimukseen, pEGFP-N1-GDP-Tr transfektoitiin BGC-823 varten yliekspressoivia GDP-Tr ja pEGFP-N1- Fut8 oli transfektoitiin SGC-7901 varten yliekspressoivia Fut8. Yhdistelmä-ilmaisut olivat onnistuneet osoittamaan reportterigeenin GFP: n ilmentymisen (kuva S2). Tutkia mahdollista osallistumista GDP-Tr ja Fut8 kasvaimen proliferaatio ja migraatio, BGC-823 ja SGC-7901-soluissa tutkittiin transfektion jälkeen käyttäen CCK-8 ja haavan paranemista migraatiokokeessa vastaavasti. Tulokset osoittivat, että ylössäätely GDP-Tr laski BGC-823 proliferaatiota 2-5 päivää transfektion jälkeen ja säätelyä Fut8 laski SGC-7901 proliferaatiota 2 päivää transfektion jälkeen (kuvio 5A ja 5B). Nämä tulokset osoittivat, että korkea ilmentyminen GDP-Tr ja Fut8 hillitsevän leviämisen ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Haavan paranemista määrityksessä osoitti, että GDP-Tr ja Fut8 ei ole merkittävää vaikutusta maahanmuuttoa BGC-823 ja SGC-7901 48 tunnin käsittelyn jälkeen (kuvio 5C ja 5D).

(A) ja (B) toinen leviämisen BGC-823-solut ja SGC-7901-solujen transfektion jälkeen pEGFP-N1-GDP-Tr ja pEGFP-N1-Fut8 vastaavasti analysoitiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritykset. Edustavia tuloksia neljästä itsenäisestä kokeesta on esitetty. * P 0,05 verrattuna kontrolliryhmään. (C) ja (D) Haavanparantamislaite migraatiokokeessa of BGC-823-solujen transfektion jälkeen pEGFP-N1-GDP-Tr sekä SGC-7901-solujen transfektion jälkeen pEGFP-N1-Fut8. Kuilu etäisyys (gm) in migraatiokokeessa voidaan kvantitatiivisesti arvioida käyttäen ohjelmistot. Edustavia tuloksia 3 erilliselle kokeelle on esitetty. P 0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

Keskustelu

Glykosylaatiota on yksi yleisimmistä translaation jälkeiset modifikaatiot esiintyi noin 70% kaikista tunnetuista proteiineista. Muutoksia glykosylaation rooli monipuolinen kokoelma biologisten ilmiöiden kuten kasvainsolujen etäpesäkkeitä, solunsisäinen viestintä ja tulehdus [21] – [23]. Yhä useammat tutkimukset osoittavat, että korjauksilla glykosylaatiota ja tasojen glykosyylitransferaasien toimintojen johdettu pahanlaatuisiin ovat merkityksellisiä ihmisen syöpäsairauksia [24] – [25].