Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kertyvät näyttöä kannattaa järjestelmää, melanooma on hyvin heterogeeninen ja yllä pieni alapopulaatio melanooman kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Nämä solut pidetään vastuussa kasvaimen vastustuskyky hoitoja. Lisäksi melanoomasoluja on ominaista niiden suuri fenotyyppisten plastisuus. Näin ollen sekä melanooma kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja niiden eriytetympää jälkeläisiä on kitkettävä saavuttaa kestävä hoito. By reevaluating yhdisteiden heterogeeninen melanooman populaatioissa, se voisi olla mahdollista valita yhdisteitä aktiivisuus ei vain nopeasti pyöräily soluissa, mutta myös syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja. Luonnollinen yhdisteet olivat painopiste tässä tutkimuksessa.

Methods

Analysoimme 120 yhdisteitä The Natural Products Set II yhdisteiden tunnistamiseksi tehoaa melanooma populaatioiden kasvatettu kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla ja rikastettu solut kohdistamaan itseuudistuvien kapasiteettia. Solujen elinkelpoisuus, solusyklin pysähtymisen, apoptoosin, geenien ilmentyminen, klonogeeniset selviytyminen ja etiketti pysymistä analysoitiin.

Havainnot

Useat yhdisteet tehokkaasti hävittää solujen klonogeeniset kapasiteetti ja nanaomycin A streptonigriinin ja toyocamycin olivat tehokas 0,1 uM. Muut anti-klonogeeniset mutta ei voimakkaasti sytotoksista yhdisteitä kuten bryostatiini 1, siomycin A, illudin M, michellamine B ja pentoksifylliini vähensi huomattavasti taajuuden ABCB5 (ATP-sitova kasetti, alaryhmä B, jäsen 5) -positiivinen soluja. Päinvastoin, käsittely maytansiini ja kolkisiinia on valittu solut, jotka ilmentävät tätä transporter. Maytansiini, streptonigriinin, toyocamycin ja kolkisiini, vaikka erittäin sytotoksinen, vasen pieni alapopulaatio hitaasti jakautuvien solujen ennallaan. Yhdisteitä, jotka valitaan esillä olevassa tutkimuksessa differentiaalisesti muutettu ilmentymisen melanosyyttejä /melanooman erityisiä mikroftalmia liittyvä transkriptiotekijä (MITF) ja proto-onkogeenin c-myc.

Johtopäätös

Valitut anti-klonogeenisten yhdisteet ehkä tutkittava tarkemmin mahdollisina adjuvantteina kohdistaminen melanooma kantasolujen kaltaisia ​​soluja yhdistetyn anti-melanoomaterapian, kun taas valittu sytotoksinen mutta ei anti-klonogeeniset yhdisteitä, mikä lisäsi taajuus ABCB5-positiivisten solujen ja pysyi hitaasti pyöräily solujen muutu, voidaan harkita keinona rikastuttaa viljelmien soluilla esillä melanooma kantasolujen ominaisuuksia.

Citation: Sztiller-Sikorska M, Koprowska K, Majchrzak K, Hartman M, Czyz M (2014) Natural yhdisteet ”Aktiivisuus Cancer Stem-Like tai Fast-Cycling melanoomasoluja. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10,1371 /journal.pone.0090783

Editor: Christopher Heeschen, Espanjan National Cancer Center (CNIO), Espanja

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2013 Hyväksytty 4 helmikuuta 2014; Julkaistu: 03 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus: tätä työtä tukee taloudellisesti avustusta 2011/01 /B /NZ4 /04921 National Science Centre. Natural Products sarja II annettiin veloituksetta US National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvaimensisäinen fenotyyppinen heterogeenisyys johtuu geneettisestä vaihtelusta, mutta myös alkaen plastisuus kasvainsolujen, joka on havaittu vasteena microenvironmental ärsykkeille. Niistä erilaisia ​​toiminnallisia fenotyyppejä sisällä kasvain, alapopulaatio syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS), joka kykenee uudistamaan itsensä ja suurin osa kasvaimen, joka koostuu nopeasti pyöräily solut ja erilaistuneet solut voidaan erottaa [1] – [3]. Koska fenotyyppinen heterogeenisyys osoitettiin olevan erittäin dynaaminen monissa kasvaimissa mukaan lukien melanooma [4] – [7] ja terapeuttinen hävittämiseksi CSC alaryhmästä voidaan seurata sen uudistaminen ei-CSCS, sekä CSCS ja pääosa väestöstä tulisi harkita kehittämisessä syöpähoidolla [8] – [14]. Siksi lääkeyhdistelmää aiheuttaa täydellisen hävittämisen kaikenlaisia ​​solujen kasvain saattaa olla tarpeen, jotta saavutetaan kestäviä parannuskeinoja. Valintaprosessissa erittäin voimakas lääke ehdokkaita, on huomattava ongelma luomisessa kokeellisen

in vitro

malleja luotettavasti ennustaa lääkeaineen aktiivisuutta potilailla. Esillä olevassa tutkimuksessa, melanoomasoluja saatu suoraan patologisesti erillisiä näytteitä, nodulaarinen melanooman ja pinnallisesti levittää melanooma, kasvatettiin ankkurointi-riippumattomalla tavalla kantasolujen väliaineessa, ja ne on rikastunut soluilla, kohdistamalla itseuudistuvien kapasiteettia verrattuna seerumin perustuva monolayers [15]. Tämä

in vitro

kolmiulotteinen malli on myös osoitettu säilyttää heterogeenisuus alkuperäisestä kasvaimesta tarkemmin kuin kaksiulotteinen yksikerrosviljelyissä [16] – [18] ja se oli tärkeä osa uutuuden olevassa

in vitro

seulonta luonnollinen yhdiste kirjasto.

luonnollisia yhdisteitä käytetään laajasti syövän hoitoon ja se voi kohdistaa huomattavan biologinen aktiivisuus [19] – [21]. Vaikka niiden vaikutusmekanismeja usein ole hyvin määritelty, useimmat terapeuttisia aineita peräisin luonnollisista tuotteista ovat pääasiassa tehokkaita poistamaan syöpäsoluja, joilla on korkea proliferaationopeus. Yhdisteet, jotka vaikuttavat solujen jakautumista voi epäonnistua kuitenkin poistamaan alaryhmästä hitaasti pyöräily syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, mikä johtaa lopulta kasvain uusiutumisen. Esillä olevassa tutkimuksessa, vaikka useita lähestymistapoja on käytetty valintaprosessissa, etusijalle niihin yhdisteisiin, jotka kykenivät vähentämällä klonogeenisten solujen. Väheneminen kyky muodostaa klooneja tulkittiin suora vaikutus itseuudistuvien potentiaali syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Lisäksi apoptoosin, etiketti-säilyttäminen, taajuus ABCB5-positiivisten solujen ja ilmentymistä Wnt /β-kateniinin signalointi kohdegeenien,

MITF

ja

c-MYC

, arvioitiin melanooman populaatiot yhdisteitä käsitellään valittu joko erittäin anti-klonogeeniset tai erittäin sytotoksinen. Olemme tutkineet vaikutus valittujen yhdisteiden stemness liittyviä molekyylejä ja polkuja. Slow-pyöräily soluja pidetään syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS) voidaan merkitä etikettiin varaavien soluihin [12]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin fluoresoivaa väriainetta CFSE yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka tälle etiketti pidättävän melanoomasoluja ennallaan. ABCB5 transporter proteiini, välittäjänä chemoresistance melanooma, on myös havaittu olevan mahdollinen merkki melanooman kantasolujen kaltaisia ​​soluja [2], [22]. Melanooma solut, jotka ilmentävät ABCB5 proteiini voisi selektiivisesti selviytyä altistuessaan dakarbatsiinille, vemurafenib ja muiden huumeiden [22]. On osoitettu, että anti-ABCB5 vasta-aine tai siRNA geenien päinvastaiseksi melanooma vastustuskyky syöpälääkkeiden [23], [24]. Me tutkimme, solujen osuus kuljettaa tämän kuljettajaproteiinin muutettiin kun hoito valittujen luonnollisia yhdisteitä. Wnt signalointi on keskeinen rooli säilyttämisessä pluripotenttisuuden Alkion kantasolujen ja syövän kehityksen [25]. Viimeaikaiset raportti ehdotti rooli Wnt /β-kateniinin signalointireitin säilyttämisessä elinkelpoisuuden ja /tai ylläpitää itseuudistumisen rintojen kasvain aloittamista solujen

in vitro

[26]. Melanooma, β-kateniinin signalointi lisääntyy aikana kasvaimen etenemiseen ja se edistää chemoresistance [27]. Meidän äskettäisessä tutkimuksessa kävi ilmi, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin vaimennetaan melanooman väestön alhaisen taajuuden klonogeeniset solujen (Hartman et al., Toimitettu). Vaikutus valittujen luonnollisia yhdisteitä kahteen Wnt /β-kateniinin kohdegeenien,

MITF

ja

c-MYC

tutkittiin. Transkriptiotekijä MITF toimii reostaatti määrittämiseksi fenotyyppiset identiteetin eri alaryhmien melanoomasolujen [28]. Vaikka monistettu vain noin 20%: ihosyövän, MITF on ehdotettu sukuperänä riippuvuus onkogeenin edistää melanooman chemoresistance [29], [30]. Proto-onkogeenin c-MYC on keskeinen rooli kehitettäessä suuri määrä ihmisen kasvaimissa [31]. Viimeksi on osoitettu, että yli-ilmentyminen c-MYC tuumorin sisällä voidaan kohdistaa tiettyihin T-soluihin [32]. Yhdisteet aiheuttamaan apoptoosin ja /tai proliferaation in c-MYC-erityisellä tavalla Laki selvä solukohteita [33], [34]. c-MYC esto melanooman soluissa johtaa pienentää leviämisen mekanismien kautta, joihin osallistuu useita entsyymejä nukleotidibiosynteesiin [35].

Tietääksemme ei ole aiemmissa tutkimuksissa tutkitaan niin monet tekijät rinnakkain alkuperäisen valintaprosessissa aktiivisia yhdisteitä The Natural Products Set II (NCI). Perustuen luodun aktiivisuuskäyrät, kukin valitun yhdisteitä voidaan tutkia tarkemmin sen mahdollisen soveltuvuuden osana syöpähoitoa tai välineenä laboratoriotyöskentelyyn. Luonnollinen tuotteet valitaan aktiivisia yhdisteitä vastaan ​​melanoomasoluja voi myös tarjota uusia johtaa muutettaviksi kliinisesti käyttökelpoisia aineita.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet

Natural Products Set II saatu US National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov). Yhdisteet olivat 96-kuoppalevyillä 60 yhdisteiden levyä kohti. Levyjä säilytettiin kuivassa -20 ° C: ssa. Kukin kuoppa sisälsi 0,02 umol yhdistettä 1 ui glyserolia. 10 mM liuos (20 ui) kutakin yhdistettä saatiin lisäämällä 19 ui DMSO: ta kuhunkin kuoppaan. Heti liuottamisen jälkeen lääkeaineen liuoksia aliqouted useisiin testaus levyjä välttää mahdollisia saostumisen yhdistettä. Kaikki kokeet suoritettiin käyttäen yhdisteitä tarjoamia NCI.

Kasvain Kudokset ja eettinen lausunto

DMBC solut saatiin Department of Molecular Biology of Cancer kirurgisista näytteistä melanooman edennyt pitkälle. Potilaiden ominaisuudet melanooma yksilöitä julkaistiin aiemmin [15], [36], [37]. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komission Medical University of Lodz ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Soluviljelmät

Soluja ylläpidettiin kantasoluja väliaineessa (SCM) käytettäessä kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla, kuten aiemmin on kuvattu [36].

mittaus pätevä solujen määrä

melanooma solut laskettiin värjäyksen jälkeen Trypan blue (Sigma-Aldrich) ja maljattiin tiheydellä 4 x 10

3 elävää solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Soluja viljeltiin 45 h ajoneuvon (0,05% DMSO) tai yhdisteiden The Natural Products sarja II 5 uM. Happaman fosfataasin aktiivisuus (APA) määritystä käytettiin mittaamaan elinkelpoisten solujen määrä. Lyhyesti, levyt sentrifugoitiin, väliaine poistettiin ja korvattiin 100 ul: lla määrityspuskuria, joka sisälsi 0,1 M natriumasetaattia (pH = 5), 0,1% Triton X-100 ja 5 mM p-nitrofenyylifosfaattia, pNPP (Sigma-Aldrich) ja inkuboidaan vielä 2 h 37 ° C: ssa. Reaktio pysäytettiin 10 ul /kuoppa 1 M NaOH, ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 405 nm käyttäen mikrolevylukijaa (Infinite M200Pro, Tecan, Itävalta). Melanoomasoluja ei vastannut 0,05% DMSO pienemmällä elinkelpoisuutta.

elinkyvyn

Drug aiheuttamiin muutoksiin solujen elinkelpoisuuden kuluttua 45 h hoidon arvioitiin myös virtaussytometrialla jälkeen propidiumjodidi (PI) värjäystä tai käyttämällä automatisoitua solujen elinkelpoisuuden analysaattori standardimenetelmien mukaisesti. Molemmissa määrityksissä solut analysoitiin käyttämällä FACSVerse virtaussytometriä (Becton Dickinson, San Jose, California, USA), ja tulokset käsiteltiin käyttäen FACSuite ohjelmistoa (Becton Dickinson).

Cell Cycle Analysis

Melanooma soluja käsiteltiin ajoneuvon tai yhdisteitä ilmoitettuina pitoisuuksina 30 tuntia tai 45 tuntia, sitten kerättiin ja kiinnitettiin 70% (w /v) etanolia -20 ° C: ssa. Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen PI Värjäys, joka sisälsi RNaasi (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Inkuboinnin jälkeen 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä, solut analysoitiin käyttämällä FACSVerse virtaussytometriä (Becton Dickinson). ModFit LT 3.0 ohjelmisto (Vahvista Software, Topsham, MN, USA) käytettiin lasketaan prosenttiosuudet solujen kussakin solusyklin vaiheessa ja FACSuit -ohjelmistoa (Becton Dickinson) käytettiin lasketaan prosenttiosuudet kuolleiden solujen subG

1 .

klonogeeninen määritys

Melanoomasolut inkuboitiin ensin yhdisteiden ilmoitetuilla pitoisuuksilla 4 tuntia. Sitten elinkelpoisuus määritettiin Trypan blue -värjäyksellä ja 1000 yhden, elinkelpoisia melanooma solut siirrettiin 700 ui alkuun agaralustaa seosta (SCM, 0,35% (w /v) agaria) ja saadut solususpensiot päällekkäin päälle 12-kuoppaisille viljelylevyille päällystetään 700 ul: kiinteytyi pohjaan agar seosta (SCM, 0,5% (w /v) agaria). Levyjä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 2 viikkoa, ja joissakin tapauksissa myös 3 viikkoa. Solut värjättiin 500 ul: 0,005% kristalliviolettia 2 h, ja pesäkkeet vähintään 50 um laskettiin mikroskoopin alla. Vaikutus yhdisteiden on kyky muodostaa klooneja ilmaistiin prosentteina vertailusta seuraavan kaavan mukaisesti: numero pesäkkeet jälkeiseltä hoidon yhdisteillä /pesäkkeiden määrä hallita ajoneuvon × 100.

virtaussytometrianalyysin Apoptosis

Detection solukuoleman suoritettiin kaksi värjäys anneksiini V-FITC ja PI (Roche Diagnostics, Manheim, Saksa). Melanoomasoluja ympättiin 12-kuoppalevyille ja käsitelty 45 h yhdisteiden osoitettuina pitoisuuksina. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, sentrifugoitiin 400 x g: ssa 5 minuuttia ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI: 15 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. 15000 tapahtumia analysoitiin kullekin näytteelle virtaussytometrillä FACSVerse (Becton Dickinson), ja tulokset käsiteltiin käyttäen FACSuite ohjelmistoa (Becton Dickinson).

arviointi ABCB5-positiivisten solujen

taajuus solut, jotka ilmentävät ABCB5 arvioitiin virtaussytometrialla. Konjugoimattoman anti-ABCB5 primaarinen vasta-aine Sigma-Aldrich ja FITC-konjugoitua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (BD Pharmingen) käytettiin tässä tutkimuksessa. Tyypillisesti, 30000 solut analysoitiin näytettä kohti. Isotyyppikontrolleja Jokaisessa kokeessa. Jos haluat jättää kuolleita soluja analyysistä, 7-aminoactinomycin D värjäytymistä (7-AAD; eBiosciences) käytettiin. Virtaussytometriset hankinta suoritettiin käyttäen FACSVerse virtaussytometriä (Becton Dickinson) ja analysoitiin käyttäen FACSuite ohjelmistoa. Muutokset taajuus ABCB5-soluilla päihdehoitoon 45 h ilmaistiin prosentteina ohjaus ajoneuvon.

CFSE Värjäys

CFSE analyysiä, melanooma solut värjättiin 1,5 uM CFSE (aihiolääke karboksifluoreseiini diasetaatti sukkinimidyyli esteri) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, pestiin kahdesti, ympätään kaksitoista-kuoppalevyille 1,25 x 10

5 /kuoppa, ja altistetaan yhdisteiden 5 päivää osoitettuina pitoisuuksina. Sitten alusta vaihdettiin ja soluja inkuboitiin lääkkeen väliaineessa lisää 6 päivää, ja arvioidaan virtaussytometrialla. Vihreä fluoresenssiemissio mitattiin käyttämällä FACSVerse virtaussytometriä (Becton Dickinson) ja analysoitiin käyttäen FACSuite ohjelmistoa.

RNA: n eristäminen, cDNA Synthesis and Real-Time PCR

-RNA eristettiin ja puhdistettiin käyttäen kokonais-RNA eristyspakkausta mini Pylvään (A biotekniikan, Gdynia, Puola). RNA-pitoisuus ja puhtaus mitattiin Tecan NanoQuant (TECAN, Itävalta). cDNA syntetisoitiin käyttäen 300 ng satunnaisia ​​alukkeita ja SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Roottori-Gene 3000 Real-Time DNA analysointijärjestelmä (Corbett Research, Morklake, Australia) käytettiin arvioimaan geeniekspressiota kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Monistus suoritettiin käyttäen KAPA SYBR FAST qPCR Kit Universal 2X qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, Kapkaupunki, Etelä-Afrikka), 200 nM kutakin aluketta ja 25 ng cDNA-templaattia reaktiota kohden. Käytetyt alukkeet Real-Time PCR olivat seuraavat: MITF: 5′-ACC GTC TCT CAC TGG ATT GG-3 ’ja 5′-TAC TTG GTG GGG TTT TCG AG-3′; C-MYC: 5’-AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC C-3 ’ja 5′-GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C-3′; Sox2: 5’- GCT AGT CTC CAA GCG ACG-3 ’ja 5′-GCA AGA AGC CTC TCC TTG-3’. Hehkutus lämpötila kaikkien geenien oli 56 ° C. Suhteellinen ilmentyminen kohdegeenien laskettiin verrattuna viite-geenin RPS17 (käyttäen alukkeita: 5′-AAT CTC CTG ATC CAA GGC TG-3 ’ja 5′-CAA GAT AGC AGG TTA TGT CAC G-3’), ja matemaattinen mallin mukaan lukien hyötysuhde korjaus Real-Time PCR käytettiin.

tilastollinen analyysi

Data edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta, ellei toisin mainita. Merkitys ilmeinen ero keskiarvojen mistään testattu parametrien validoitiin Studentin pariksi t-testiä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

valinta strategia luonnollisten yhdisteiden melanoomasoluissa kasvatettu Anchorage riippumattomalla tavalla

Natural Products Set II, joka koostuu 120 yhdisteitä (taulukko S1 File SI) johdettu DTP Open Repository kokoelma 140000 yhdisteiden, seulottiin yhdisteiden tunnistamiseksi tehoaa melanoomasoluja. Pre-näytön yhdisteiden, kaksi solulinjaa, jotka ovat peräisin pitkälle melanooma käytettiin, yksi nodulaarinen melanooma (DMBC12) [15] ja yksi pinnallinen leviämisen melanooma (DMBC11) [37]. Molemmat populaatiot kasvatettiin SCM käynneistä riippumattomalla tavalla monisoluisina 3-ulotteinen pallosia. Ensisijainen seulonta, melanooma soluja dissosioitunut sferoidit altistettiin kutakin yhdistettä yhdellä pitoisuudella 5 uM. Sekä ei-klonogeeniset ja klonogeeniset määrityksissä käytettiin rinnakkain (Fig. 1).

Ensinnäkin yhdisteitä The Natural Products sarja II testattiin kaksi Melanoomasolulinjojen saatu patologisesti erillisiä yksilöitä, DMBC11 ja DMBC12, yhdellä pitoisuudella 5 uM. Muutokset elinkelpoisuuden (APA määritys, tilavuudeltaan määritys, PI värjäys ja subG

1 koe) mitattiin lyhytaikaiset vaikutukset ja muutokset klonogeeniset mahdollisia pitkän aikavälin vaikutuksia tutkittujen yhdisteiden. Kaikki kannattavuuden testaamiseksi verrattiin mahdollisia eroavaisuuksia. Kahta kriteeriä käytettiin valita yhdisteiden tarkempaa analysointia: yhdiste pitäisi vähentää solujen elinkykyä (PI-värjäys) on ≤ 50% valvonta- ja kyky muodostaa klooneja on ≤ 20% valvonnan. Seuraavaksi valitaan yhdisteitä käytettiin pienemmillä pitoisuuksilla ja annos-vaste-käyrät. Voimakkaimmat yhdisteet sitten tutkittiin niiden kyky indusoida apoptoosia, vaikuttaa taajuus ABCB5-positiivisten solujen ja etiketti pidättävän hitaasti pyöräily soluja, ja muuttamaan geenin ilmentymistä.

Short-Term sytotoksiset ja Sytostaattiset Effects of Natural yhdisteiden melanoomasoluissa

neljä ei-klonogeeniset menetelmät valittiin alustava seulonta. Muutokset elinkelpoisten solujen lukumäärät määritellään perustuen kvantifiointia sytosolin hapanfosfataasiaktiivisuuden (APA määritys) (Fig. S1A File SI) ja virtaussytometrialla automaattisella solujen elinkykyä analysaattori (tilavuuden määritys) (Fig. S1B File SI ). Sytotoksisuus yhdisteiden mitattiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen, joko taajuus PI-positiivisia soluja (kuvio. 2 ja Fig. S2 File SI) tai prosentteina solujen subG

1 osa. Histogrammit ne yhdisteet, jotka kertynyt yli 40% melanoomasolujen subG

1 osa sisältyy kuvioon. 3 ja Fig. S3A File SI. Kaikki nämä määritykset arviointiin käytettiin lääkeaineen jälkeen lyhyen inkuboinnin joko sen jälkeen 45 h kvantifiointiin jakeet elinkelpoisten ja PI-positiivisia soluja, tai 30 h prosenttiosuudet solujen subG

1 jakeet. Samanaikaisesti, luonnollisia yhdisteitä 5 uM arvioitiin lääkeresistenttiä, p53 puutteesta leukemiasolulinjan K562 (Fig. 2, kuva. S1-S2 File SI). Vertailu sytotoksisuuden luonnontuotteiden melanoomaa vastaan ​​ja leukemiasolujen (Fig. 2) paljasti, että useita yhdisteitä aktiivisia melanoomasoluja eivät olleet aktiivisia K562-soluissa. Esimerkiksi, streptonigriinin (32), crassin (68) ja geldanamysiini analogisen (72) alennettu elinkelpoisuus melanoomasolujen alle 3% valvontaa, mutta vähentää elinkelpoisuuden K562-solut eivät pääse 50% verrokista. Melanoomasoluja olivat myös paljon herkempiä fastigilin B (63), bactobolin (84), didemniini-B (104), siomycin A (107), toyocamycin (108), geldanamysiini (110) ja tubulosine (119) mm (Fig. 2). K562-solut puolestaan ​​olivat paljon herkempiä lapatsoni (20) kuin melanoomasoluja.

Elävyys jälkeen 45% ajoneuvon (0,05% DMSO) hoidetun ohjaus. Vertailun vuoksi leukemia K562 käytettiin. Kukin neliö edustaa vastetta melanooman tai leukemiasolujen yksi 120 yhdisteitä. Värit osoittavat taso soluvasteen. Selvyyden vuoksi numerot nimetty esillä olevassa tutkimuksessa testatut yhdisteet (taulukko S1 File SI) laitetaan ensimmäinen raaka ja ensimmäisessä sarakkeessa. Katso kuva S2 File SI kvantitatiivista tietoa.

edustaja histogrammit DMBC11 käsiteltyjen solujen luonnollisia yhdisteitä 30

1 ei ylittänyt 40%, histogrammeja analysoitiin käyttämällä ModFit ohjelmistoa laskea prosenttiosuudet solujen kussakin solusyklin vaiheessa. Histogrammien solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe oli merkitty vihreällä kehys, S-vaiheessa sininen runko ja G

2 /M punainen reunus, ja prosenttiosuudet melanoomasolujen pidätettiin näitä vaiheita on merkitty. Kun kertymistä melanoomasolujen subG

1 ylitti 40%, FACSuit ohjelmistoa käytettiin ja prosenttiosuudet kuolleet solut on merkitty. Saadut tulokset DMBC12 solut kuvassa S3A File SI. Vaikutukset pienemmät pitoisuudet kaikkein sytotoksisten yhdisteiden tai pidemmän altistumisen yhdisteiden tehottomia 30 h sisältyvät kuvassa S3B File SI.

solusyklin analyysi, useat yhdisteiden pitoisuus 5 uM kertynyt melanoomasoluja joko eri solusyklivaiheista tai tuotettu vaurioituneita soluja kerätään subG

1 (Fig. 3 DMBC11 soluja ja Fig. S3A File SI DMBC12 soluja). Kolkisiini (1), rotenoni (19), vinkristiini (39), maytansiini (60) ja ritsoksiini (86) pidätettiin suurin melanoomasolujen G

2 /M vaihe. Resorufiinin (12), michellamine B (101) ja fumagilliinia (120), muiden muassa pidätettyjen solujen S-vaiheessa, kun taas brefeldin A (47) ja kamptotesiiniä (48) kertynyt solujen G

0 /G

1 tai subG

1 riippuen huumeiden ja solulinjaa. Useita yhdisteitä, jotka 5 uM ei aiheuttanut vaikutuksia solusyklin hoidon jälkeen 30 h, käytettiin seuraavassa kokeessa 45 h, kun taas yhdisteet aiheuttavat kertyminen solujen subG

1 testattiin 1 uM, ja jos voimakkaimmista yhdisteet 0,1 uM (kuvio. S3B File SI). Streptonigriinin (32) tuottaa suuren joukon soluja subG

1 5 uM, kertynyt DMBC12 soluja S-vaiheessa, kun käytetään 0,1 uM.

Pre-näytön klonogeenisten Capacity kuin pitkäaikainen vaikutus luonnollisten yhdisteiden melanoomasoluissa

klonogeeniset määritys käytettiin tutkimaan vaikutuksia luonnon yhdisteiden itseuudistuvien kapasiteetti melanoomasolujen. Soluja inkuboitiin yhdisteiden kanssa vain 4 tuntia, ja pitkän aikavälin vaikutukset Tämän inkuboinnin arvioitiin kyky muodostaa palloja pehmeässä agarissa jälkeen 2 viikkoa. Neljäkymmentä kahdeksan ja neljäkymmentäkuusi yhdisteiden 5 uM vähentäneet maassa kloonien muodostettu agariin ≤1% valvonnan vuonna DMBC11 ja DMBC12 populaatiot, vastaavasti (kuvio. 4 ja Fig. S4 File SI). Kuten klonogeeniset soluja voisi jakaa hitaammin, ja siirtomaa ehkä pääse sopiva koko 2 viikon kuluessa, useiden yhdisteiden siirtomaa laskenta tehtiin viikon kuluttua. Ei ollut merkittäviä eroja kloonien määrää, joka saadaan, kun kaksi ja kolme viikkoa (tuloksia ei ole esitetty).

Soluja inkuboitiin yhdisteen sisältävässä elatusaineessa 4 tunnin ajan ja sitten ne kasvatettiin pehmeässä agarissa ja 14 päivää läsnäollessa huumeettomia väliaineessa. Cell pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Yhdisteet on ryhmitelty perustuu niiden anti-klonogeenisten aktiivisuus ilmaistaan ​​prosenttiosuutena ohjaus vehikkeliä (0,05% DMSO). Ainakin kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kahtena rinnakkaisena. Katso kuva S4 File SI kvantitatiivista tietoa.

vertailu lyhyt- ja pitkäaikaisia ​​vaikutuksia Active luonnollisia yhdisteitä melanoomasoluissa

Kun ensimmäinen seulonta suoritetaan 5 uM, jokaisen yhdisteen The Natural Products sarja II voitaisiin valita viiteen luokkaan (Fig. 5). Neljäkymmentä kuusi yhdisteiden 5 uM eivät olleet aktiivisia missään Työllisten määrityksissä molemmissa testattu populaatioissa. Ne jätettiin muihin analyyseihin. Osa niistä ei-aktiivisia yhdisteitä, kuten curcumine (27) tai rapamysiini (69) ovat hyvin ominaista niiden syövän vastaista aktiivisuutta, mutta ilmeisesti 5 uM he eivät olleet aktiivisia kiinnittymisestä riippumaton melanoomasoluja. Useat yhdisteet kykenivät indusoimaan solukuolemaa kahden ensimmäisen päivän aikana ja lisäksi ne tehokkaasti hävittää solujen klonogeeniset potentiaalia. Ne yhdisteet pidettiin erittäin voimakas, ja niiden toimintaa, sekä ei-klonogeeniset ja klonogeeniset, mitattiin pienemmillä pitoisuuksilla seuraavissa kokeissa. Kahta lääkettä, aktinomysiini D (105) ja syklofosfamidi (117), jätettiin pois lisäanalyysiä, koska ne ovat erittäin hyvin tunnettu niiden

in vitro

ja

in vivo

syövän vastaista aktiivisuutta. Lisäksi Parthenolide (61) oli myös suljettu pois meidän yksityiskohtaisen raportin sen vaikutuksista kiinnittymisestä riippumaton melanoomasoluja, julkaistiin äskettäin [36]. Kuten etusijalle asetettiin yhdisteitä, jotka vähensivät melanoomasoluja osoittaa itseuudistuvien kapasiteetti, valittujen yhdisteiden ryhmästä vastaisten klonogeeniset mutta ei erittäin sytotoksisia Myös analysoitiin edelleen.

Kun alustava seulonta, yhdisteet ryhmiteltiin perustuu niiden toimintaan. Yhdiste määriteltiin anti-klonogeenisten, kun se vähensi prosenttiosuus klooneja muodostettu pehmeässä agarissa alle 20% valvonnan vehikkeliä (0,05% DMSO). Yhdiste nimettiin sytostaatit, kun se vähentää elävien solujen määrä on vähemmän kuin 50% kontrolli käyttämällä elävien solujen lukumäärän laskenta, ja sytotoksiset käyttäen virtaussytometrillä sen jälkeen, kun PI-värjäyksen. Numerot vastaavat yhdisteitä, jotka kertynyt melanoomasolujen subG

1 on alleviivattu. Yhdisteet, jotka aiheutti solukierron pysähtymisen on merkitty vihreällä G

0 /G

1 vaihe, sininen S-vaiheessa ja punainen G

2 /M vaiheessa. Useita yhdisteitä (46) eivät olleet aktiivisia missään määrityksessä. Harvat yhdisteet olivat sytotoksisia mutta ei merkittävästi vaikuttanut numerot muodostuneiden pesäkkeiden agarissa. Harva muita yhdisteitä aiheutti niiden vaikutuksia vain klonogeeniset soluja tai pienentää kyky muodostaa klooneja alle 20% valvonnan, aiheutti sytostaattinen /sytostaattinen vaikutus aiheuttamatta merkittäviä solukuoleman. Useat yhdisteet olivat sytostaattinen ja sytotoksisia ja lisäksi ne tehokkaasti hävittää solujen klonogeeniset potentiaalia. He olivat painopiste lisätutkimuksia. Katso taulukko S1 File SI nimiä yhdisteiden vastaavat numerot on esitetty kuviossa.

Ensinnäkin, sytotoksisia vaikutuksia tehokkaita luonnollisia yhdisteitä vahvistettiin kuuden potilaan solulinjat, mukaan lukien neljä lisäksi johdetut solulinjat kirurgiset näytteet nodulaarinen melanooma, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] ja DMBC9 [36]. Pitoisuudet Yhdisteiden alennettiin 1 uM ja 0,1 uM, ja joissakin tapauksissa 0,01 uM tai jopa 0,001 uM, kunnes IC

50 vaikutus saavutettiin (taulukko S2 File SI). Yleensä vain pieniä eroja vasteiden melanoomasolujen eri DMBC populaatioiden oli nähtävissä lääkeaineen pitoisuudet 1 uM ja 0,1 uM. DMBC8 solut näyttivät olevan vähemmän herkkä useita yhdisteitä kuin muut populaatiot.

Seuraavaksi annos-vaste käyrät valmistettiin 45 yhdisteiden kohdistamaan voimakas anti-klonogeeniset ja /tai sytotoksisten potentiaalien (Fig. 6 ja Fig. S5 File SI). Perustuen annos-vaste käyrät, paremmuusjärjestystä voimakkaimmista yhdisteiden päästöt Natural Products sarja II valmistettiin (taulukko 1). Anti-klonogeeniset aktiivisuus sijoittui edellä sytotoksista aktiivisuutta. IC

50-arvot seitsemän yhdisteet olivat alle 0,1 uM, kun lääke vaikutus kapasiteetin muodostavien kloonien pehmytagarissa arvioitiin. Niistä yhdisteistä, maytansiini (60) kohdistuva voimakkaampi yleinen sytotoksinen vaikutus kuin anti-klonogeeniset vaikutus, streptonigriinin (32), toyocamycin (108), kolkisiini (1) ja echinomycin A (102) oli samankaltainen voimakkuus kummankin toiminnan, kun taas nanaomycin (74) ja illudin M (114), olivat tehokkaampia hävittämään solujen klonogeeniset potentiaali kuin vähentää elinkelpoisuus sisällä lyhytaikaisen inkubaation. Samanlaisia ​​ilmiöitä havaittiin useita yhdisteitä, jotka olivat tehokkaita suuremmilla pitoisuuksilla. Esimerkiksi IC

50-arvot anti-klonogeenisten yhdisteitä, bryostatiini 1 (112), siomycin A (107), fumitremorgin C (118), fumagallin (120) michellamine B (101) ja pentoksifylliini (100) oli välillä 0,1-1 uM klonogeeniset määrityksessä mutta alueella 1-5 uM elinkelpoisuuden määrityksessä.

Annosvastekäyrät valmistettiin yhdisteitä, jotka korkean anti-klonogeeniset ja /tai sytotoksista potentiaalia. Sininen käyrät, anti-klonogeeniset toimintaa; musta käyrät, sytotoksinen aktiivisuus. Käyrät tiivistää tulokset vähintään 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä DMBC11 (täytetty neliö) ja DMBC12 (avoin neliö) solulinjat. Kemialliset kaavat tutkittuja yhdisteitä mukana. Annos-vastekäyrät tehottomampia yhdisteitä on esitetty kuviossa S5 File SI.

apoptoosin melanoomasolujen Exposed Valitut yhdisteet

virtaussytometrianalyysin anneksiini V /PI-värjättyjen solujen paljasti, että erittäin solumyrkkyjen aiheuttaman apoptoosin melanoomasoluissa, kun taas yhdisteet poistamisen lähinnä solujen kyky muodostaa klooneja (taulukko 1) ei laukaissut apoptoosin pitoisuuksina tehokkaita niiden anti-klonogeeniset aktiivisuutta (Fig. 7) . Esimerkiksi, maytansiini (60) indusoi apoptoosin useimmissa solut konsentraatio oli niin alhainen kuin 0,01 uM. Päinvastoin, nanaomycin A (74), joka on 0,1 uM lähes kokonaan hävittää solujen klonogeenisten potentiaalia ei indusoinut apoptoosia tässä pitoisuudessa.

Apoptoosin määritettiin virtaussytometrialla jälkeen anneksiini V /propidiumjodidivärjäys . Tyypillisiä ääriviivapiirrokset melanoomasolujen käsitelty yhdisteitä ilmoitettuina pitoisuuksina näkyvät. Kuva S2. Kuva S3. Kuva S4. Kuva S5. Taulukko S2.