Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molekyyli chaperone CCT /TriC on keskeinen rooli ylläpitää solujen proteostasis koska se välittää taitto suurten solun tukirangan proteiinit tubuliinit ja actins. CCT /TriC on mukana myös onkoproteiinia sykliini E, Von Hippel-Lindaun tuumorisuppressoriproteiinia, sykliini B ja p21

ras taitto mikä viittaa vahvasti siihen, että se osallistuu solujen lisääntymisen ja kasvaimen synty. Arvioimaan osallistumisen CCT /TriC kasvaimen synnyssä, me määrällisesti sen ekspressiotasot ja toimintaa 18 syöpä, yksi ei-syöpä ihmisen solulinjoissa ja ei-syöpä ihmisen maksan. Osoitamme, että ekspressiotasot CCT /TriC syöpäsolulinjoissa on korkeampi kuin normaaleissa soluissa. Kuitenkin CCT /TriC toiminta ei aina korreloi sen ilme tasoilla. Siksi dokumentoitu ekspressiotasot CCT /TriC modulaattorit ja kumppanit PhLP3, Hop /P60, prefoldin ja HSC /Hsp70. Meidän analyysi paljastaa toimivaa yhteispeliä molekyyli saattajia, jotka saattavat selittää tarkasti modulaatioon CCT /TriC aktiivisuutta soluproliferaatiota muutosten kautta solujen tasot prefoldin ja /tai HSC /p70 ja CCT /TriC asiakas proteiinin saatavuutta. Havaintomme ja lähestymistavat tuovat uusia oivalluksia roolissa CCT /TriC välittämää proteiinilaskostumisen koneet syövän solujen kehitystä.

Citation: Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki R (2013) Sytosoliset chaperonin CCT /TriC ja Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 8 (4): e60895. doi: 10,1371 /journal.pone.0060895

Editor: Anna Alisi, Bambino Gesù lastensairaala, Italy

vastaanotettu: 22 marraskuu 2012; Hyväksytty 4 maaliskuuta 2013. Julkaistu: 16 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Boudiaf-Benmammar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ranskan opetus-, tutkimus- ja teknologia, Algerian opetusministeriön korkeakoulu ja tutkimuskeskuksen, Centre National de la Recherche scientifique ja yliopistossa Paris Sud. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jotta koodin taitto muodostuvien polypeptidiketjulle erittäin tungosta ympäristössä solut ovat suunnitelleet luokan proteiineja kutsutaan molekyyli saattajia [1], [2]. Nämä proteiinit sitovat, aikana tai sen jälkeen kääntämisen, taittamista, osittain taitettu ja väärin laskostuneet polypeptidiketjun, usein alttiina hydrofobisia osia [3]. Sitovat molekyyli saattajia asiakkailleen ehkäisee niiden luontaisen yhdistäminen taipumus ja mahdollistaa polypeptidiketjun etsiä taitto maiseman ja saavuttaa sen natiivi, toiminnallinen tila [4]. Molecular chaperones myös valvoa proteiinia homeostaasin normaaleissa ja stressiolosuhteissa. Ne ovat siten laadunvalvontajärjestelmän ylläpito natiivin proteiinin konformaation, translokaatiota proteiinien poikki kalvot ja normaali proteiini vaihtuvuus [2].

osallistuminen molekyylitason saattajia syövän kehittymisessä ja etenemisessä edellyttää aktiivista keskustelua. Useat tutkimukset raportoivat, että chaperones löytyvät kohonneeseen monin kiinteitä kasvaimia ja hematologisia syöpäsairauksia [5], [6]. Niiden ilme voi olla osittain huomioon kykyä pahanlaatuisten solujen ylläpitämiseksi proteiinia homeostaasiin kielteiset hypoksinen ja hapan mikroympäristölle kasvain. Kautta vuorovaikutus keskeisten sääteleviä proteiineja, molekyyli- saattajia säätelevät solusyklin ja suojaavat soluja ohjelmoidun kuoleman. Ne edistävät tuumorisolun eloonjäännin, kasvun ja etäpesäkkeiden, jopa kasvutekijän riistää olosuhteissa sallimalla jatkuva proteiini käännös ja soluproliferaatiota [7]. Lopuksi, molekyyli- kaperoneja pidetään kriittinen mahdollistaa kasvainsolujen sietää geneettisiä muutoksia, jotka muutoin johtaa kuolemaan [5]. Todellakin, molekyyli saattajia kuten Hsp90 toimii biokemiallisia puskurit lukuisia geneettisiä vaurioita, jotka ovat tyypillisiä kaikkein ihmisen syövissä ja asemien oncogenesis [8].

Molecular chaperones ovat läsnä proteiineja, jotka ovat tuotteita erillisten, hyvin säilyneitä , geeni perheet. Ne luokitellaan eri ryhmiin perustuu niiden molekyylimassat, solu ja -toiminnan [9]. Hsp60 perheenjäsenet ovat erikoinen, että ne muodostavat suuren molekyylipainon rengasmainen proteiinikomplekseina. Nämä hiukkaset ovat totta taitto nanokoneiden ruokkii ATP ja kutsutaan Kaperonien. Kaksi luokkaa Kaperonien on määritelty [10]. Kaperonien muodostavat ryhmän I muodostuvat yhdessä polypeptidiketjussa ja on 7-kertaiseksi symmetria. Tähän ryhmään kuuluvat GroEL [11] ja sen mitokondrioiden vastine cpn60. Kaperonien muodostavat ryhmän II on 8 kertainen symmetria ja käsittävät archaebacterial thermosomes ja sytosolin chaperonin pasutetaan t-kompleksin polypeptidin 1 (CCT) tunnetaan myös TCP1 renkaan kompleksi (TriC) [12]; CCT /TriC on 16 alayksiköt monimutkainen koostuu kahdesta back-to-back pinota renkaita, joissa jokaisessa on kahdeksan eri alayksiköiden noin 60 kDa (α, β, γ, δ, ε, ζ-1, η ja θ) [13] ; [14]. CCT /Tric yhteistyötä proteiinin cofactors taittaa kohdeasiakkaalle proteiineja. Hop /p60, kofaktori Hsp70 ja Hsp90, kasvaa taittuvat tehokkuutta helpottamalla nukleotidin vaihtoa [15]. Phosducin kuten proteiini 3 (PhLP3) on negatiivinen modulaattori taitto ja hillitsee asiakkaan proteiinin pääsy taitto kammioon [16]. Lopuksi molekyylitasolla kaperoni prefoldin (PFD) myös moduloi CCT /TriC toimintaa kuin se tuottaa asiakkaalle proteiinit [17], [18].

CCT /TriC välittää taittaminen tubuliinit ja actins [19]; [20] lukien centrosomal γ-tubuliinia ja centractin [21]. Kasvava luettelo CCT /TriC asiakkaita käsittää proteiinit, jotka osallistuvat kasvaimen synnyssä sykliini E [22], Von Hippel-Lindaun (VHL) tuumorisuppressoriproteiinia [23], sykliini B ja p21

ras [24]. Vieressä sen vaatimuksen actins ja tubuliinit taitto, on näyttöä siitä, että CCT /TriC on voimakkaasti säädelty aikana G1 /S faasimuutoksen solusyklin läpi varhaisen S-vaiheeseen, ja että tämä tapahtuma ohjataan mRNA-tasolla [ ,,,0],25]. Lisäksi alas säätely CCTα ilmentyminen liittyy soluproliferaation inhibointi, lasku solujen elinkelpoisuuden, solusyklin pysähtymisen ja solujen apoptoosin [26].

Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että CCT /TriC näytelmiä keskeinen rooli solusyklin etenemisen ja että se voitaisiin osallistuvat kasvaimen kehitykseen.

Tässä määrällisesti i) ekspressiotasot CCT /TriC ja sen yhteistyökumppanit kuten HSC 70 ja Hsp70 (HSC /p70), PhLP3 Hop /P60, prefoldin ja DNAJB1 syöpäsoluissa ihmisen solulinjoissa ja ii) sen toiminta solussa otteita. Kaiken ekspressiotasot CCT /TriC syöpäsolulinjoissa on korkeampi kuin normaaleissa soluissa. Silmiinpistävän kuitenkin CCT /TriC toiminta ei aina korreloi sen ilme tasoilla. Siksi dokumentoitu ekspressiotasot CCT /TriC modulaattorit. Analyysimme tuo uusia oivalluksia roolissa proteiinin taittuvat koneiden syövän solujen kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

ihmisen solulinjoissa ja solu-uutteiden valmistus

Viisitoista ihmisen syövän solulinjoissa , jotka ovat peräisin syövästä eri elimiin ja osoittaa ominaispiirteitä, ja ei-syöpä-solulinja perustettiin normaalista sikiön keuhkokudoksesta saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Kolme muuta solulinjat ovat peräisin muista lähteistä: SH-5YSY ostettiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), OVCAR-8, joka on NCI-solulinja, saatiin tohtori Liscovitch (Rehovot, Israel) ja SF268 saatiin National Cancer Institute (NCI Frederick, MD, USA). MIA-PaCa-2, MRC5-SV2, HepG2 ja KB-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). HCT116, SK-OV3, HT-29, K-562, HL-60, PC3, HeLa, MCF-7, MDA-MB-435S, MDA-MB-431, A549, SF-268, HCT15 ja OVCAR-8-soluja viljeltiin rutiininomaisesti 10% FBS /RPMI 1640, johon oli lisätty penisilliini-streptomysiiniä, fungitsonia ja glutamiini. SH-5YSY soluja viljeltiin DMEM ja Hamin F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% FBS: ää, glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä. Solulinjat ominaisuudet ja viitteet on esitetty taulukossa 1.

Solut laskettiin, pestiin ja kerättiin. Solutiheys säädettiin 24,10

7 solua /ml hajotuspuskuriin (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Suspendoidut solut laitettiin jäihin ja altistettiin 10 sonikaatio, joka koostuu 1 toinen impulssi lähtöteho 10 wattia välein 15 sekunnin ajan käyttäen Branson-äänilähde 150, kun taas ihmisen maksan fragmentti (HNCL), jonka alkuperä ja keräys ennen 1995 Seuraavassa eettisen komitean Institut National de la Sante et de la Recherche médicale kuvataan [27], [28], homogenoitiin jäissä käyttäen Kontes Teflon-lasihomogenisaattorissa. Täydellinen solulyysi tarkistettiin käyttäen mikroskooppia ja ionivahvuus uutteet säädettiin 140 mM Tris /HCl, pH 7,5, 14 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 70 mM KCI, 4 mM ATP: tä ja 10% glyserolia (v /v). Uutteet kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 x g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja proteiini pitoisuus supernatanteissa määritettiin Bradfordin menetelmällä [29]. Kanin retikulosyyttilysaattia (RRL), joka valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [30], käytettiin kontrollina kaikissa kokeissa.

Vasta-aineet

Hiiren polyklonaalisia vasta-aineita ihmisen PhLP3 (anti TXNDC9), Hop /p60 ( anti STIP1) ja PFD5 (anti PFDN5) ostettiin Abnova (Ontario, Kanada). Hiiren monoklonaalinen vasta-aine Hsc70 /p70 hankittiin StressGen (Victoria, BC, Kanada). Kanin polyklonaalinen vasta-aine DNAJB1 ostettiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Kanin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​CCTα tuotettiin laboratoriossa [24].

Western-blottaus

Vakiovalikoima käsittää CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml), PhLP3 (0,5, 0,25, 0,125 ug /ml), PFD5 (25, 12,5, 6,25 ug /ml), Hop /p60 (6, 3, 1,5 ug /ml) ja Hsp70 (80, 40, 20, 10 ug /ml), erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) käyttäen 12% polyakryyliamidigeelejä [31], jossa on kaksi laimennoksia (1/4 tai 1/8 ja 1/16) kunkin solu-uutetta ja laittaa nitroselluloosafiltterille [32]. Kukin suodatin seulottiin peräkkäin viisi primaaristen vasta-aineiden, kun kalvo palautuminen inkuboimalla 50 ° C: ssa 62,5 mM Tris /HCI, pH 6,8, 100 mM β-merkaptoetanolia ja 2% SDS: ää (tilavuus /tilavuus). Reaktiiviset bändit visualisoitiin kemiluminesenssin avulla Pierce ECL Western blotting alustan (Thermo tieteellinen, Rockville, USA) valmistajan suositusten ja kemiluminesenssi signaali digitaalisesti kanssa LAS-3000 luminoiva kuva-analysaattori (Fujifilm). Kaikki kokeet suoritetaan ainakin kahtena biologisen rinnakkaisnäytteiden vastaa riippumaton soluviljelmissä keskiarvot ja keskihajonta olivat peräisin kahdesta riippumatonta mittausta. Määrät CCT /TriC, PhLP3, PFD5 ja Hop /p60 eri uutteet määrällisesti vertaamalla luminesenssi solun otteita kuin standardien tunnetun pitoisuuden elektroforeesi samalla geelillä.

Folding Activity Pitoisuus

[

35S] -leimattujen unfolded β-aktiini kohdeproteiinin tuotettiin ilmentämällä

E. coli

ja puhdistettu, kuten ovat kuvanneet Gao et ai. [33]. Uudelleenpoimuttava toimintaa solu-uutteiden, RRL ja HNCL tutkittiin ja analysoitiin seuraavien laimennusvaikutuksen denaturointiaine radioleimattujen β-aktiini soluun uutteita, RRL ja HNCL laimennettiin taitto puskuriin (80 mM MES /KOH, pH 6,8, 1 mM MgCI

2, 1 mM DTT: tä, 1 mM EGTA, 1 mM ATP). Proteiinipitoisuus sisällä uutteet oli 15 mg /ml tai 2,5 mg /ml. Reaktion tuotteet erotettiin 6% ei-denaturoivaa polyakryyliamidigeeleillä. Geelit kuivattiin sitten ja altistettiin varastointi fosfori näyttö (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) ja kehitetään Storm Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Esimerkki CCT-välitteisen laskostumattoman β-aktiini Uudelleenlaskostumisreaktio esitetty kuviossa S1. Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Keskiarvot ja standardipoikkeama oli johdettu kaksi riippumatonta mittausta.

solu-uutteet Immuno-ehtyminen

kaksi mielivaltaisesti valittu solu-uutteita (MIA-PaCa-2 ja OVCAR-8) ja ohjaus- immunosaostettiin köyhdytettyä käyttäen joko anti PhLP3, anti-Hop /p60, anti PFD5, anti-HSC /p70 tai anti-CCTα vasta-aineita. Uutteet inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa varovasti liikkeen riittävä vasta-aineen ja proteiini-vasta-aine-kompleksit sedimentoitiin jälkeen inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa proteiini-A Sephrose CL-4B-helmiä (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu 50 mM Tris HCl: lla, pH 7,0. Supernatantit otettiin talteen, proteiinipitoisuus mitattiin ja kyky immunologiseen köyhdytettyä uutetta poimuttuvan [

35S] -leimattujen unfolded β-aktiini määritettiin

in vitro

.

kuva-analyysi, tilastollinen analyysi ja laskutoimitukset

Digitaaliset kuvat saatu Fujifilm LAS-3000-analysaattori ja Storm Phosphorlmager analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa NIH Image (US National Institute of Health, Bethesda, MD).

intensiteetit on johdettu kuva-analyysin analysoitiin kahden otoksen yksisuuntainen riippumaton Studentin t-testejä.

määrä CCT /TriC ja PFD hiukkaset solua kohti oli peräisin konsentraatiomittauksia käyttäen seuraavaa yhtälöä : Kun n on määrä tullitariffin /TriC tai PFD hiukkasia, C, määrä CCT /TriC tai PFD arvioitiin western blot mittauksia vertaamalla tunnettuihin määriä CCTα tai PFD5 mg /ml, C

N, on solujen määrä /ml, Mw, on molekyylipaino CCT /TriC tai PFD hiukkasia (750000 CCT /TriC, 100670 varten PFD) ja

N

vakio Avogadron (6,023 x 10

23).

tulokset

CCT /TriC Expression ja Activity

CCT /TriC on ehdottoman välttämätöntä taitto kahden tärkeimmän tukirangan proteiineja actins ja tubuliinit

vuonna vivo

. Kuitenkin vähän tiedetään sen ilmentymisen ja aktiivisuuden syöpäsoluissa. Vertasimme ekspressiotasot ja aktiivisuus CCT /TriC 18 syöpäsolulinjoissa eri elimiin ja normaali solulinja (MRC5-SV2), ihmisen syöpäsolujen maksahomogenaattia (HNCL) ja kanin retikulosyyttilysaattia (RRL), jossa CCT /TriC tiedetään ilmentyvän ja erittäin aktiivinen. Kvantifiointi CCT /TriC western blotissa (Kuva 1) paljasti, että keskimääräinen pitoisuus CCT /TriC syöpäsolun uutteita on noin 5 ug mg kokonais- proteiineista ja noin 3-4,10

8 CCT /TriC hiukkasia ( katso koetoimenpiteet osio laskemista Taulukko S1 CCT /TriC hiukkasia numero eri solulinjoissa) lukuun ottamatta MIA-PaCa2, MRC5-SV2, MDA-MB-231 ja HL-60-solulinjoissa, jossa CCT /TriC määrät ovat 2-3 kertainen keskiarvo. Vuonna HNCL ja RRL määrä CCT /TriC on puolet keskimääräisestä mitattu syöpäsolun linjat. On myös syytä huomata, että tämä määrä on alhaisin (1.6μg /mg yhteensä proteiinit) ihmisen neuroblastooma SH-SY5Y solulinjassa. CCT /TriC ilmaisu täten tunnu yläreguloituja kaikissa syöpäsolulinjoissa, erityisesti in MIA-PaCa2, MDA-MB-231 ja HL-60 solulinjoista (kuvio 1). Sen määrittämiseksi, ovatko CCT /TriC ilmaus korreloi sen toiminta me määrällisesti radioleimattua, denaturoitu, aktiini taitto solun uutteiden täydennetty Mg

2+ ja ATP kuvatulla koemenettelyt osiossa. Tulokset, esitetty kuviossa 2 osoitti, että CCT /TriC toiminta ei aina korreloi sen ilme tasolla. Todellakin, kun taas taitto aktiivisuuteen CCT /TriC in MIA-PaCa2, MDA-MB-231 ja MDA-MB-435S solulinja uutteita oli hyvin pitkälti merkittävillä CCT /TriC sisällä otteita, havaittiin hyvin alhainen HL-60-solulinja uute eli solulinjasta sisältävät eniten määriä CCT /TriC, vertaa kuvio 1 kuvioon 2.

määrä CCT /TriC 18 syövän ja normaali (MRC5-SV2) solulinjat uutteet, valmistettu kuten on kuvattu kokeellisessa menettelyjä osassa, joka ei ole syöpä maksahomogenaatti (HNCL) ja kanin retikulosyyttilysaattia (RRL) määritettiin vertaamalla CCTα intensiteetti mitataan solu-uutteiden laimennettiin 4 ja 16 kertaiseksi, että tunnettuja määriä CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml) siirtää samalla 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä Western-blottauksella. Keskimääräinen määriä CCT /TriC eri uutteet ilmaistaan ​​funktiona proteiinien kokonaispitoisuus uutteet.

CCT /TriC taittuvat aktiivisuus 18 syöpäsolulinjoissa, normaali solulinja MRC5-SV2 ja ihmisen ei-syöpä maksassa määritettiin käyttäen [

35S] -leimattua, denaturoitu β-aktiini taittuvat, kuten on kuvattu kokeellisessa menettelyjä osassa. Reaktion tuotteet analysoitiin 6% ei-denaturoivaa polyakryyliamidigeeleillä. CCT /TriC spesifinen aktiivisuus, joka on johdettu kvantifiointia β-aktiini nauhojen intensiteetit ilmaistaan ​​funktiona kokonaisproteiinipitoisuus. Kuvat, äänitetty käyttäen phosphorimager- varten [

35S] -merkityn aktiini uudelleenpoimutusreaktioissa taitto puskurissa, RRL, MIA-PaCa-2 ja HeLa solu-uutteita päätti natiivi 6% polyakryyliamidigeelillä, esitetään upotettavat.

ilmentäminen CCT /TriC Activity modulaattorit

Koska ilmentymistason CCT /TriC ei korreloi sen toiminnan ja ymmärtää paremmin, miten jälkimmäinen moduloidaan syöpäsoluissa, me määrällisesti CCT /TriC aktiivisuuden modulaattorit, prefoldin, Hop /P60 ja PhLP3, että solulysaateista. Data esitetään kuviossa 3A osoittavat, että Hop /p60 keskittymä solulinjoja käytettiin noin 0,4 ug /mg kokonaisproteiinia proteiinien keskimäärin. Hop /p60 ilmestyy-ilmaistu suurin osa solulinjoja käytettiin, kun sen ekspressiotaso on normalisoitu, että ei-syöpä maksahomogenaatti (HNCL) käytetään läpi tämän tutkimuksen (kuvio S2). Hop /p60 ilmaus on korkein MRC5-SV2, HCT116, PC3 ja HL-60-solulinjoissa kuin se on HNCL.

määrä (A) Hop /p60, (B) PhLP3 ja (C ) PFD 18 syövän ja normaali (MRC5-SV2) solulinjojen uutteita, ei-syöpä maksahomogenaattia (HNCL) ja kanin retikulosyyttilysaattia (RRL) määritettiin vertaamalla kemiluminesenssin signaali kirjattiin Hop /p60, PhLP3 ja PFD vuonna solu-uutteita laimennetaan 4 ja 16 kertainen kuin tunnettuja määriä proteiinien samalla Western blotit.

CCT /TriC ilme on myös runsaasti MRC5-SV2 ja HL-60. Yllättäen kuitenkin, koska Hop /p60 on nukleotidin vaihdon tekijä odotetaan suosivan CCT /TriC välittämän taitto, taitto aktiivisuus MRC5-SV2 ja HL-60 solu-uutteiden on alhainen. Samoin vaikka CCT /TriC ja Hop /p60 pitoisuudet ovat suhteellisen korkeat HCT116 solu otteita, taitto aktiivisuus uutteesta alhaisimpia. Tästä voimme päätellä näistä havainnoista, että ilmaisu taso Hop /p60 ei ole yksin vastuussa Lisääntyneiden CCT /TriC välittämän taitto tehokkuutta. Siksi dokumentoitu PhLP3, toiminnallinen antagonisti Hop /p60, ilmentymistä syöpäsolulinjoissa käytimme. PhLP3 ilme vaihtelee merkittävästi solulinjan toiseen. Proteiini ei ollut havaittavissa 11 syöpäsolulinjoissa käytettiin ja noin 0,03 ug /mg proteiinien kokonaismäärän (kuvio 3B) 8 muita solulinjoja. Kun havaittavissa, PhLP3 näyttää yli ilmaissut sen ekspressiotaso normalisoidaan että HNCL (kuva S2). Tässäkin emme pystyneet korreloida korkean PhLP3 ilmentymistaso alhaisella CCT /TriC aktiivisuutta. Todellakin, PhLP3 pitoisuus on suurimpia PC3 ja MDA-MB-231 solu-uutteiden (kuvio 3B), jossa CCT /TriC aktiivisuus on suurimpia (kuva 2).

Olemme vihdoin määrällisesti prefoldin ekspressiotasot kuin tämä co-kaperonin auttaa CCT /TriC sisään puskurointia asiakkaan proteiinin pitoisuudet sytosoliin ja toimittamisessa ne CCT /TriC. Prefoldin pitoisuus vaihtelee hiukan yhdestä solusta toiseen ja on keskimäärin 2 ug /mg proteiinien kokonaismäärän (kuvio 3C). Prefoldin ilmentymistaso on kaksi kertaa pienempi kuin keskimäärin MIA-PaCa2, MRC5-SV2, HCT116, SH-SY5Y ja SK-OV-3 solu tiivisteet ja on merkittävästi korkeampi kuin keskimäärin HL-60, K562, HeLa, KB, MDA -MB-231 ja MCF7 solu otteita. Siten korrelaatio välillä CCT /TriC aktiivisuuden ja ilmentymisen taso prefoldin. Korkeimmat prefoldin ilmaistaan, alin aktiivisuus CCT /TriC on. Lopuksi on syytä huomata, että PFD ilmentyy korkeammalle tasolle kaikissa syöpäsolulinjoissa verrattuna HNCL (kuva S2). Koska tämä proteiini on osa monimutkaista koostuu 6 alayksiköstä, keskimäärin aktiivisten hiukkasten solua kohden vaihtelee 5-24 10

8 (taulukko S1).

puuttuminen korrelaatio lisääntynyt tai vähentynyt ekspressiotasot Hop /p60 ja PhLP3 ja CCT /TriC aktiivisuus viittaa siihen, että viimeksi mainittu ei ole tehokkaasti moduloitu näitä polypeptidejä. Tämän varmistamiseksi on todellakin näin ja paremmin ymmärtää, kuinka Hop /p60 ja PhLP3 vaikuttaa CCT /TriC taitto toimintaa, tarkastelimme seurauksia immunologiseen heikentävien Hop /p60 tai PhLP3 kahdesta mielivaltaisesti valittu solu otteita: MIA-PaCa-2 ( Kuva 4A) ja OVCAR-8 (kuvio 4C) on CCT /TriC aktiivisuutta. Immunoaktiivisuus ehtyminen Hop /p60 ei ollut vaikutusta CCT /TriC aktiivisuutta (kuvio 4B, D). Sen sijaan, PhLP3 immuno-ehtyminen päässä solu-uute, jossa se on selvästi ilmaistu, kuten OVCAR-8, johti dramaattiseen laskuun CCT /TriC aktiivisuutta (kuvio 4B, D). Tämä viittaa vahvasti siihen, että PhLP3 on vahvasti mukana moduloivan CCT /TriC aktiivisuutta.

CCT /TriC taitto aktiivisuutta (A) MIA-PaCa-2 ja (C) OVCAR-8 solu-uutteiden ennen ja jälkeen CCT /Tric Hop /p60 tai PhLP3 immunodepletion analysoinnissa käytettiin [

35S] -leimattua, denaturoitu β-aktiini. Proteiinipitoisuus MIA-PaCa-2 ja OVCAR-8 solu-uutteiden oli 2,5 ja 15 mg /ml, vastaavasti. Natiivi β-aktiini kaistan intensiteetti mitattiin käyttäen Phosphorlmager. Määrä natiivin β-aktiini jälkeen mitattu immunodepletion ilmaistaan ​​murto-määrä mitattiin solu-uutteissa ennen immunodepletion (B) MIA-PaCa-2 ja (D) OVCAR-8 solu-uutteista.

HSC /p70 moduloida CCT /TriC Activity

CCT /TriC yhteistyötä muiden molekyylien chaperoneiksi [2]. HSC 70 ja Hsp70 (HSC /P70) on osoitettu edistää asiakkaan sitoutuvien proteiinien CCT /TriC esimerkiksi [34], [35]. Sen määrittämiseksi, onko HSC /P70 ekspressiotasoja korreloivat että CCT /TriC aktiivisuutta, määrät HSC /p70 syövän solulinjaa uutteita käytimme koko tämän tutkimuksen kvantitoitiin Western blottauksella. Jakku bändejä havaittu blotit peräisin konstitutiivista (Hsc70, 73 kDa) ja stressiä muoto (Hsp70, 72 kDa) ja saattaja. Hsp70 näyttää yli-ilmentynyt solulinjoissa käytimme ovat osoituksena intensiteetti kevyin bändejä Länsi blotit. Tämä viittaa vahvasti siihen, että stressi liittyvät muodossa kaperonia indusoidaan syöpäsolulinjoissa. Määrä HSC /p70 eri solu- uutteiden mittasimme on 5 ug /mg kokonaisproteiinia proteiinien keskimäärin paitsi MRC5-SV2, A549, K-562, MDA-MB-435S ja KB solulinjoissa jossa HSC /p70 pitoisuus on 2-3-kertaa korkeampia ja SH-5YSY, jossa se on 2 kertaa pienempi (kuvio 5). Samoin rinnan adenokarsinooman MCF7 ja maksasyöpä HepG2, HSC /p70 on 7-12-kertainen keskiarvon. Lopuksi on syytä huomata, että HSC /p70 ilmentymistä ylössäädellään kaikissa syövän solulinjoissa ekspressiotasot menevän HepG2-soluissa 160 kertainen sisällä ei-syöpä maksahomogenaattia (HNCL) käytetään viitteenä HepG2-soluissa (kuvio 5).

määrä HSC /p70 18 syövän ja normaali (MRC5-SV2) solulinjojen uutteita, maksan homogenaattia (HNCL) ja kanin retikulosyyttilysaattia (RRL) määritettiin vertaamalla kemiluminesenssin signaali kirjattiin HSC /p70 solu-uutteissa laimennettiin 4 ja 16 kertaiseksi, että tunnettuja määriä proteiinia samalla Western blotit. Keskimääräinen määriä HSC /p70 eri otteita ilmaistaan ​​funktiona proteiinien kokonaispitoisuus otteet.

Tuloksemme viittaavat siihen, että CCT /TriC aktiivisuus on alhaisimpia jotka ilmentävät korkein HSC /p70 tasot (vertaa CCT /TriC aktiivisuuden määrät HSC /p70 MCF7 HepG2 ja K-562). Samoin CCT /TriC aktiivisuus näkyy korkein solulinjassa otteita jossa HSC /p70 tasot ovat keskimääräistä pienempi (vertaa CCT /TriC aktiivisuuden määrät HSC /p70 in MIA-PaCa-2, HCT15, PC-3, ja MDA -MB-231). Tämä saattaa olla seurausta asiakkaan proteiinin eristämistä HSC /p70 ja CCT /TriC lisääntyneisiin asiakkaan proteiinien poissa sitoutumisesta CCT /TriC läsnäollessa korkean HSC /p70 pitoisuuksia.

Edelleen dokumentti HSC /p70 ja CCT /TriC yhteistyötä proteiinin laskostumiseen, me analysoitiin CCT /TriC asiakas proteiinilaskostumisen aktiivisuutta syöpäsolujen otteita seuraavat HSC /p70 immunodepletion. Tiedot esitetään kuviossa 6 osoittaa selvästi, että CCT /TriC välittämää β-aktiini taitto vähenee yli 65% vuonna MIA-PaCa-2 ja OVCAR-8 upon HSC /p70 immunodepletion. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että HSC /p70 ja CCT /TriC yhteistyötä.

CCT /TriC välittämän leimattu, denaturoitu β-aktiini taitto in (A) MIA-PaCa-2 ja OVCAR-8 solu-uutteiden ennen ja jälkeen HSC /p70 immunodepletion. Proteiinipitoisuus MIA-PaCa-2 ja OVCAR-8 solu-uutteiden oli 2,5 ja 15 mg /ml, vastaavasti. Native β-aktiini bändi intensiteetti recoded käyttäen Phosphorlmager. Määrä natiivin β-aktiini jälkeen mitattu immunodepletion ilmaistaan ​​murto-määrä mitattiin solu-uutteissa ennen immunodepletion (B) MIA-PaCa-2 ja (C) OVCAR-8 solu-uutteista.

havainnot ovat sopusoinnussa sen kanssa, että HSC /p70 puskurit CCT /TriC asiakas proteiinit [36]. Todellakin, immunodepletion HSC /P70 johtaa vähenemiseen CCT /TriC asiakas polypeptidipoolin laskun vuoksi määrästä käytettävissä CCT /TriC asiakas proteiineja.

Keskustelu

CCT /TriC on keskeinen rooli solujen lisääntymisen kautta sen kyky helpottaa taittamista i) – solun tukirangan proteiinit, jotka osallistuvat solun jakautumisen, esim α, β ja γ-tubuliinit [23], [15], [31], [25], α ja β actins ja centractin [14], [36], [25], ii) – onkoproteiineja kuten sykliini E [ ,,,0],22], Von Hippel-Lindaun (VHL) tuumorisuppressoriproteiinia [23], sykliini B ja p21

ras [24]. CCT /TriC ilme on lisäksi säädelty aikana G1 /S faasimuutoksen solusyklin [25], kun sen alassäätöä johtaa soluproliferaation inhibointi, lasku solujen elinkelpoisuuden, solusyklin pysähtymisen ja solujen apoptoosin [26 ].

Voit selvittää CCT /TriC aktiivisuus riippuu pelkästään sen ilmaisun tasolla, vertasimme ekspressiotasot CCT /TriC 18 ihmisen syöpäsolujen linjat, normaali solulinja ja normaalin ihmisen maksan. Osoitimme, että CCT /TriC toiminta ei aina korreloi sen ilme tasolla. Siksi määrällisesti CCT /TriC aktiivisuus modulaattorit syövän solulinjoissa käytetään tässä tutkimuksessa. Osoitimme, että Hop /p60 ei ole yksin vastuussa Lisääntyneiden CCT /TriC välittämän taitto tehokkuutta. Samoin emme pystyneet paljastaa korrelaatio PhLP3 ekspressiotaso ja CCT /TriC aktiivisuus solulinjoissa jossa PhLP3 ilmentyminen oli havaittavissa. Siksi määrällisesti tasot proteiineja, jotka auttavat erityisesti CCT /TriC, kuten prefoldin tai puskureita asiakas proteiineja allas sytoplasmassa kuten HSC /p70. Olemme osoittaneet, että suurempi prefoldin ilmaistaan, alempi aktiivisuus CCT /TriC on. Osoitimme myös, että CCT /TriC aktiivisuus on suurinta solulinjassa otteita jossa HSC /p70 tasot ovat alhaisimmat. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että asiakas proteiinit väliseinän prefoldin ja /tai HSC /p70 ja CCT /TriC. Läsnäollessa korkean prefoldin ja /tai HSC /p70 pitoisuuksia, huomattava osa asiakkaan proteiinien puskuroi jälkimmäisen molekyyli- chaperones ja poissa sitoutumisesta CCT /TriC samalla kun prefoldin ja /tai HSC /p70 pienilläkin pitoisuuksilla osa asiakas sitoutuneet proteiinit CCT /TriC lisääntyy. Näin ollen vaihtelut ekspressiotasot prefoldin ja /tai HSC /p70 moduloivat saatavuus asiakkaan proteiinin CCT /TriC. Tätä kuvaa se havainto, että immunologiseen ehtyminen HSC /p70 sytosolin allas johtaa ehtyminen eristettyä asiakkaan proteiinien ja merkittävä lasku vakaassa tilassa CCT /TriC aktiivisuutta. Havainto, että yhteisen tullitariffin /TriC ja prefoldin hiukkasten sytosoliin syöpäsolulinjoja eivät poikkea yli kertaluokkaa osoittavat joko että taitto kone on kehittynyt siten, että prefoldin ja /tai HSC /p70-toiminto yhdessä CCT tai että enimmäismäärä asiakkaan polypeptidien kokoontaitettava koneita voi tallentaa /puskuroida ja solu mahtuu on samaa suuruusluokkaa kuin CCT /TriC hiukkasia. Tämä pätee erityisesti siinä tapauksessa, että altaan polypeptidien liittyvät prefoldin ja /tai HSC /p70 sytoplasmassa edustaa ainoana CCT /TriC asiakas proteiineja.

Kaiken tutkimuksemme osoittaa toimivaa yhteispeliä molekyyli saattajia, jotka saattavat selittää tarkasti modulaatioon CCT /TriC aktiivisuutta soluproliferaatiota muutosten kautta solujen tasot prefoldin ja /tai HSC /p70. Meidän havainnot osoittavat myös, että saatavuutta asiakkaan proteiinin CCT /TriC on rajoittava vaihe, joka säätelee CCT /TriC aktiivisuutta. Todellakin, lisääntynyt prefoldin ja /tai HSC /p70 solunsisäisiä pitoisuuksia johtaa vähentyneeseen määriä vapaata asiakkaan proteiineja ja torjua CCT /TriC aktiivisuutta. Samoin kasvua määrän asiakkaan proteiinin pitoisuudet tietyllä prefoldin ja /tai HSC /p70 pitoisuuden sadot vapaa asiakkaan proteiineja ja palauttaa CCT /TriC aktiivisuutta. Siten kolmikantainen vuorovaikutus CCT /TriC, prefoldin ja /tai HSC /p70, toisaalta, asiakas proteiineja, toisaalta näyttää kriittinen solun uudiskasvun moduloimiseksi, erityisesti tilanteessa, jossa tukirankaproteiinin ja onkopsykologista proteiineja, jotka ovat kriittisiä solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus ovat yksi suurimmista asiakkaista on CCT /TriC.

HSC /p70 yhteistyössä chaperones päässä Hsp40 perheen moduloivat vuorovaikutusta HSC /p70 sen asiakkaan proteiineihin [37]. Siksi määrällisesti ilmentymistason yksi suurimmista indusoituvan Hsp40 perheenjäsenten [38] ja syöpäsolulinjoissa käytetään koko tämän tutkimuksen. DNAJB1 ilmentymisen taso on korkein MIA-PaCa-2, MDA-MB-231 ja HT29-soluja (ei esitetty). Tämä havainto on sopusoinnussa suuremman liikevaihdon HSC /p70-sidottu asiakkaan proteiinit ja myöhemmin keskimääräistä CCT /TriC aktiivisuus mitattiin uutteisiin. Kuitenkin DNAJB1 ekspressiotasot olivat suhteellisen vaatimattomia kahdessa muita solulinjoja (HCT15 ja PC-3), joilla keskimääräistä CCT /TriC aktiivisuutta.