Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihmisen syöpäsolujen ylläpitää telomeres suojaamaan soluja vanhenemisen kautta telomeraasiaktiivisuutta (TA) tai vaihtoehtoisia pidentäminen telomeres (ALT) eri solutyyppejä. Lisäksi solujen vanhenemista voidaan ohittaa epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) aikana syövän etenemisen erilaisissa kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin, se ei ole selvitetty ominaisuuksia telomeerien huolto- ja etenemisen kyky pitkäaikaisen kulttuurin virtsarakon syövän T24 soluja hTERT toimintahäiriö.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa, jonka käyttämällä hallitseva negatiivinen mutantti ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT) vektori estävän TA virtsarakon syövän T24 soluja, havaitsimme ulkonäkö pitkään fenotyypin telomeeripituuden ja ALT-liittyvä PML runko (APB) kompleksi jälkeen 27

th passage, mikä osoittaa esiintyminen ALT kaltaisten väylän elossa T24 /DN868A solujen telomeraasia esto. Samaan aikaan telomeraasia esto aiheutti merkittäviä EMT mikä näkyy muutos solumorfologialtaan samanaikainen vaihtelu EMT markkereita. Johdonmukaisesti, elossa T24 /DN868A solut osoittivat lisääntynyttä etenemistä kyky

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi löysimme Twist aktivoitiin välittäjäksi EMT elossa T24 /DN868A näytteitä.

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että virtsarakon syöpä T24 soluja saadaan suorittaa telomeraasia-to -Alt kaltainen muuntaminen ja edistää syövän etenemisestä vaiheissa edistämällä EMT, mikä tarjoaa uusia mahdollisia käsityksen resistenssimekanismi telomeraasiestäjät syövän hoidossa.

Citation: Xue Y, Li L, Zhang D, Wu K, Chen Y, Zeng J, et al. (2011) Twisted epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon Edistää eteneminen Elossa Virtsarakon syövän T24 Cells kanssa hTERT-toimintahäiriö. PLoS ONE 6 (11): e27748. doi: 10,1371 /journal.pone.0027748

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 24 lokakuu 2011; Julkaistu: 15 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Xue et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ohjelmassa The National Natural Science Foundation of China (NSFC NO. 30772163). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vakauttaminen telomere on kriittinen ääretön soluproliferaatiota, joka on tarpeen kasvaimen muodostumisen [1]. Ainakin kaksi mekanismia on tunnistettu säilyttää telomeerivasta homeostaasiin solujen

in vivo

sekä

in vitro

. Ensinnäkin useimmat karsinoomasolut käyttää telomeraasin, multi-alayksikön solujen ribonukleoproteiini entsyymin (kutsutaan telomerase polku), lisätä telomeerisesti toistoja päälle kromosomin päistä [2]. Telomeraasin koostuu RNA-alayksikön, telomeraasia liittyvä proteiini 1, ja katalyytti telomeraasin käänteistranskriptaasin (hTERT), joka on rajoittava tekijä säätelemällä telomeraasin [3]. Toiseksi sarkoomasoluja hyödyntää telomeraasia riippumaton mekanismi kutsutaan vaihtoehtoisia pidentyminen telomeres (eli ALT-reitti) ylläpitää kromosomin päät [4]. Alkaminen ALT määräytyy ulkonäkö pitkä, heterogeeninen telomeeripituuden, ja ulkonäkö ALT liittyvien promyelosyyttinen leukemia elimet (APBs) noin 10% interphase ytimien [5].

Aiemmat raportit ovat osoittaneet että telomeraasin ja ALT-mekanismi voisi käyttää samanaikaisesti joissakin kasvaimissa [4], [6]. Lisäksi palautuva konversio telomeraasia positiivisesta telomeraasia negatiiviset solut on raportoitu tapauksia ihmisen papilloomaviruksen tyyppiä 16 E6-ikuisti fibroblastit [7]. Ottaen huomioon, miten tärkeää on telomerase solussa kuolemattomaksi ja puute telomeraasin ilmentymisen useimmissa normaaleissa somaattisten solujen telomeraasiestäjät pidettiin huomattavan lupaus syövän hoidossa aiemmin [8]. Mutta mahdollisuus aktivoinnin ALT, joka on resistentti telomeraasiestäjät monimutkaistaa tilannetta [9]. On tunnettua, että ALT antaa ominaisuuksia, jotka poikkeavat telomeraasin syöpään maligniteetti. Siinä tapauksessa, glioblastooma multiforme, ALT korreloi paremmin potilaan ennusteeseen [10], kun taas huono ennuste havaittiin potilailla, joilla on liposarkooma [11]. Syynä eron syövän maligniteetti edelleen heikko.

Lisäksi telomeerivasta huolto, hankinta täysin pahanlaatuisen fenotyypin myös vaatimus etäpesäke. Epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä rooli etenemistä primaarikasvainten kohti ja etäpesäkkeiden [12]. Viimeaikaiset havainnot viittaavat siihen, että EMT ja solujen vanhenemista ylitetään vuonna syövän etenemisessä [13]. Useita erillisiä transkriptiotekijöitä, joiden on havaittu kykenevän indusoimaan EMT-ohjelmia, kuten Twist ja ZEB1, voi myös suojata soluja vanhenemista aiheuttama

ras

onkogeenin [14], [15].

tässä työssä käytimme hallitseva negatiivinen mutantti hTERT konstitutiivisesti inaktivoimiseksi telomeraasiaktiivisuutta (TA) virtsarakon syöpä T24 soluja. Tuloksemme osoittavat, että pitkät telomeeripituuden ja APBs monimutkainen ilman säätely ylöspäin TA voi esiintyä pitkäaikaisen kulttuurin virtsarakon syövän soluissa

in vitro

. Silmiinpistävän, risteytys EMT ja telomeerivasta ylläpito polku havaittiin samanaikaisesti lisääntynyt eteneminen kyky. Lisäksi Twist aktivoitiin aiheuttavan EMT. Yhteenvetona, kuvaamme uudella mekanismilla hankinnassa invasiivisia ominaisuuksia ja telomeerivasta homeostaasin jälkeen telomeraasin eston virtsarakon syövän T24 soluja, mikä antaa käsityksen lääkeresistensseihin jälkeen telomerase esto virtsarakon syöpään.

Methods

etiikka lausunto

Kaikki kokeet eläimille noudattavat

Ohjeet Animal Care

Xi’an Jiaotong yliopiston ja hyväksytty eettisen Review Board (ERB) komitea (The First Affiliated Hospital of Medical College, Xi’an Jiaotong yliopisto, Kiina), ja hyväksyntä ID etiikan lauta on SCXK2007-0005.

Vasta

Vasta-aineita PML, TRF2, N-cad, vimentiinistä , sytokeratiinivasta-18, 19 (CK-18, CK-19), Matrix metalloproteinaasien-2 (MMP-2) ja Twist olivat Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Soluviljely

ihmisen virtsarakon syövän solulinja T24 ja luusarkoomasolulinjassa U

2OS viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (GIBCO, Grand Island, NY), johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS , Holly lehtiä, Hangzhou, Kiina) 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa.

perustaminen hTERT

DN868A Vakaa soluja ja ohimeneviä Twist transfektio

hallitseva negatiivinen mutantti rakennelma hTERT (PCI-neo-hTERT

DN868A) varmistettiin sekvensoimalla ennen transfektiota viljeltyihin T24 soluihin. siRNA Twist suunniteltiin ja syntetisoitiin Invitrogen (Shanghai, Kiina). Sekvenssi siTwist oli: sense 5′-CACCGGACAAGCUGAGCAAGAUUCACGAAUGAAUCU UGCUCAGCUUGUCC-3 ’; antisense 5’-AAAAGGACAAGCUGAGCAAGAUUCA UUCGUGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3 ’. Transfektio suoritettiin käyttämällä LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Inc., Gaithersburg, VA) mukaan valmistajan protokollaa. Stabiilit transfektantit valittiin 300 ug /ml G418: aa (Merck, Darmstadt, Saksa).

telomeraasiaktiivisuuden määritys

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttäen TRAP-PCR-ELISA-määrityksessä kit seuraten valmistajan ohjeita (Roche, Basel, Sveitsi). Lyhyesti, 2 x 10

5 solut suspendoitiin lyysipuskurilla, ja sama määrä ydin- supernatanttia käytettiin TRAP templaattina PCR-reaktiossa. Reaktioseos inkuboitiin 25 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten PCR-monistettiin 35 sykliä 94 ° C: ssa 30 s sekuntia ja 59 ° C: ssa 60 sekunnin ajan. Sitten tuote sekoitettiin hybridisaatioliuokseen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jota seurasi pesu ja inkuboimalla 30 minuuttia. Sen jälkeen chromogenized ja absorbanssi havaittiin.

TRF analyysi

DNA uutettiin käyttäen DNA eristys-kittiä (Roche, Basel, Sveitsi) ja alikvootit (2 ug) hajotettiin 2 tuntia kanssa restriktioentsyymejä

Rsa

I ja

Hinf

I. Digestoidut DNA-fragmentit erotettiin 0,8% agaroosigeeleillä ja blotattiin positiivisesti varautuneita nailonkalvoille. Telomere restriktiofragmentit paljastetaan hybridisaatio DIG-leimatun telomere koetin ja kemiluminesenssidetektiolla.

Q-FISH sytogeneenisuustutkimuksiin

kromosomien Kolkisiinia pidätys solut valmistettiin ja seurasi standardi Q-FISH tekniikalla [16] käyttäen Telomeeri PNA FISH /FITC kit (Dako Cytomation, USA). Lyhyesti, erillinen soluja käsiteltiin 50 mmol /l KCI: a ja kiinnitetään käyttäen 3:01 metanoli /jääetikkaa; Sitten kalvot valmistettiin. Telomere havaittiin käyttäen FITC-konjugoitua peptidiä (PNA) koettimen ja vastavärjättiin DAPI. Digitaaliset kuvat otettiin kiinni alla konfokaalimikroskopia 60 × tai 120 x tavoitteita.

Double Immunofluoresenssikoe

Solut kasvatettiin lasipeitinlevyille ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA). PBS-pesun jälkeen solut permeabilisoitiin 0,1% Triton X-100-liuosta ja blokattiin 10% aasi seerumia. Inkuboinnin jälkeen primaaristen vasta-aineiden PML ja TRF2, ne inkuboitiin fluoresoivasti leimatut sekundääriset vasta-aineet Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555/568 (Invitrogen). Kuvat kerättiin alla konfokaalimikroskopia ja käsitellään käyttäen Adobe Photoshop 7.0.

Western blotting

Western blottaus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, näytteet analysoitiin 12% SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja tutkittiin primaaristen vasta-aineiden ja sekundäärisiä vasta-aineita piparjuuriperoksidaasiin, havaittiin sitten ECL kemiluminesenssiosoitusta (Amersham, Piscataway, NJ).

Invasion ja migraatiokokeessa

invaasion ja migraatiokykyä of T24 soluja määritettiin Transwell määrityksessä. Sillä invaasiomääritys, 50 ui Matrigel (Sigma, Inc.) levitettiin 8 um-huokoskoko polykarbonaattikalvosuodattimia (Corning, Inc., Corning, NY), alaosaan laitteen, joka sisälsi DMEM, jossa 20% FBS: ää . 5 x 10

3 T24, T24 /PCI, ja 32

toinen kulkua T24 /DN868A (määritelty elossa T24 /DN868A seuraavassa tutkimuksessa) solut ympättiin seerumittomalla alustalla, ja sitten inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen hyökkäsi solut on kiinnitetty alapintaan kalvon kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Giemsa. Solujen määrä laskettiin kolmesta satunnaisesti valitusta mikroskooppikentäs- (10 x) kohti kalvon. Migraatiokokeessa suoritettiin kuten on kuvattu invaasiomääritys ilman pinnoite matrigeelin.

adheesiomäärityksellä

matrigeelin oli laimenna seerumittomalla DMEM 01:20 ja päällystettiin pohjalle 96-kuoppalevylle. 1 x 10

4 solut sato ja ympättiin 96-kuoppalevyllä seerumittomalla alustalla ja annettiin kiinnittyä Matrigel. 6 tunnin kuluttua väliaine irrallinen solut poistettiin ja MTT lisättiin. 4 tunnin inkuboinnin myöhemmin, DMSO lisättiin liuottamaan formatsaanikiteet, ja absorbanssi (OD) 590 nm: ssä mitattiin.

Soft Agar Colony muodostumisen määritys

pesäkkeiden muodostumisen Määritys suoritettiin aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, yhteensä 500 solua suspendoitiin 2 ml: ssa DMEM, joka sisälsi 0,3% alhaisen sulamispisteen agar ja päällä olevan 2 ml pohjakerroksen koostui 2 x DMEM ja 1,2% agaria (01:01 sekoitetaan) kuuden kuopan levyillä. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa 14 d, pesäkkeitä yli 50 solusta, laskettiin.

tuumorigeenisyystesti Pitoisuus

Vivo

neljästä kuuteen viikkoa vanhoja nude kateenkorvattomiin BALB /C-hiiriä (Shanghai Experimental Animal Center, Shanghai, Kiina) käytettiin tuumorigeenisyyden määrityksessä. Solut kerättiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan DMEM pitoisuutena 1 x 10

7 solua /ml, ja 1 x 10

6 solua injektoitiin ihon alle. Hiiret tapettiin 8 viikkoa mitata tuumorin paino. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot analyysit tehtiin ohjelmiston SPSS 13.0 for Windows.

P

0,05 pidettiin kynnysarvon tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

telomeraasiaktiivisuus T24-solukloonin ilmentävät vallitsevasti negatiivinen (DN) hTERT

konstitutiivisesti inaktivoivat hTERT, ihmisen virtsarakon syövän solulinja T24 korkea TA transfektoitiin plasmidilla, joka koodaa DN-hTERT tai tyhjä vektori PCI, ja yksittäisen solun kloonit eristettiin G418 seulonta 7 viikkoa. TRAP-PCR-ELISA-analyysi osoitti, että T24 /DN868A solut 3

rd passage, TA on vähennetty huomattavasti verrattuna vanhempien soluihin (Fig. 1). Kolme kloonia vähentynyt TA seulottiin ja nimettiin T24 /DN868A (M1~3). Tyhjän vektorin transfektoidut ohjaus solut nimettiin T24 /PCI.

Telomeraasiaktiivisuus (TA) in T24-soluissa, jotka on transfektoitu eri konstrukteja määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (*

P

b) T24; c) T24 /PCI; d~f) T24 /DN868A subklooneja 8

th, 24

th, ja 27

th kohtia, vastaavasti; g ja h) T24 /DN868A subkloonit 29

th ja 32

nd passage, vastaavasti (120 x). C. TA solujen jokaisena ajankohtana, kun telomeeripituuden analyysi tehtiin. Histogrammit edustavat TA T24 /DN868A versus emosolulinjassa.

Lisäksi olemme värjäsi metaphasic kromosomien T24 /DN868A solut telomeerisesti PNA koetin, ja niitä verrattiin niitä vanhempien tai ohjaus soluja samaan kulkua. Luusarkoomasolulinja U

2OS käytettiin ALT-positiivinen kontrolli (Fig. 2B) [20]. Kuva. Kuvio 2B esittää Q-FISH-analyysillä yksi klooneista. Erittäin voimakas vihreä signaalit lopussa kromosomin vastasi pitkän telomeerit. Havaittava telomere FISH signaali voidaan nähdä jokaisella kromosomissa pää ja useimmissa ytimien eri läpikulun vanhempien T24 soluja tai ohjaus solua T24 /PCI; Lisäksi intensiteetti näitä signaaleja kummassakin kahdesta solusta oli yhdenmukainen (Fig. 2B b~c). Sen jälkeen telomeraasi esto, vaikka intensiteetti vihreän signaalin kummassakin päässä kromosomi tai ytimet oli yhdenmukainen aikaisempien kulkua T24 /DN868A, telomeerivasta signaaleja laski asteittain kunkin kierroksen solunjakautumisen kunnes 27

th passage , jossa pisteessä, yleisen intensiteetin fluoresoivan signaalin oli alhaisin (Fig. 2B d~f). Tämän jälkeen passage, signaaleja, joiden intensiteetti edustaa heterogeenistä telomeeripituuden nähtiin lopussa joidenkin kromosomien T24 /DN868A soluja (Fig. 2B g~h). Kahden muun testattu T24 /DN868A klooneja, jotka ilmentävät DN hTERT, sekä osoitti vahvaa telomeraasin eston, mutta vain yksi (T24 /DN868A-M3), joka näkyy telomeeripituuden vaihtelut kuin kuvio. 2A ja B, kun taas toinen (T24 /DN868A-M2) meni solukuolemaan ja menetys kulttuuriin 16

th kulkua.

luonteen arviointi telomere pidentymisen tapahtumia, tutkimme TA kunakin ajankohtana, jolloin Q-FISH tehtiin näiden kahden elävien solujen klooneja. Esto TA DN hTERT oli vahvaa ja peräkkäisiä (jopa 32

nd passage), ja samalla alhainen TA havaittiin peräkkäin T24 /DN868A soluja (Fig. 2C). Siksi on epätodennäköistä, että jäljellä telomeraasin on syy havaittu telomere venymä.

APBs tilaansa T24-solukloonin ilmentävien DN hTERT

APBs kompleksi on osajoukko promyelosyyttinen leukemia (PML) elimet sisältäviä telomeerisesti DNA ja telomeerivasta-proteiinien kuten TRF1 ja TRF2. APBs voi olla keskeinen rooli ALT mekanismi, ja niitä ei löydy kuolevainen tai telomeraasia positiivisia soluja [21]. Siksi olemme havainneet läsnäolo APBs by kolokalisaation PML kanssa TRF2 eri T24-soluissa eri kohtia verrattuna luusarkoomasolulinjassa U

2OS. Kuten on esitetty kuviossa. 3 kolokalisaation PML kanssa TRF2 ei voitu havaita vanhempien T24, T24 /PCI soluja, tai aikaisemmin kohtia T24 /DN868A soluja. Kuitenkin 29

th kulkua T24 /DN868A soluja, keltainen kimaltelee edustavat APBs selvästi havaittu joillakin T24 /DN868A soluja. Lisäksi kasvu kokonaismäärä APBs havaittiin 32

toinen kulkua T24 /DN868A soluja. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että läsnä on ALT-kaltainen mekanismi telomere vakaantumisesta osakloonia T24 /DN868A soluja 29

th kulkua. Erottaa myöhään kulkua T24 /DN868A solujen ominaisuuksia ALT kaltaisten aiempien passage, kaikki T24 /DN868A soluja jälkeen 29

th passage kutsuttiin elossa T24 /DN868A soluja. Yksi kutakin elossa solun klooni klo 32

nd kulku oli satunnaisesti käytetään seuraaviin tutkimus.

Double immunofluoresenssianalyysillä varten APBs hTERT-inaktivoitu T24 eri kohtia. Punaiset läiskät edustavat PML, vihreitä pisteitä edustavat TRF2, ja keltainen kimaltelee osoittavat colocalizaiton PML kanssa TRF2. APBs puuttui T24, T24 /PCI, ja aikaisemmin kulkua T24 /DN868A soluissa, mutta läsnä T24 /DN868A solut 29

th ja 32

nd passage (60 x).

induktio EMT in T24 solujen telomeraasin esto

T24 on E-kadheriinin solulinjaan, joka vielä on jokin epiteelin kaltainen morfologia [22]. Pitkäaikaishoidossa kulttuuri, huomasimme, että T24 soluja telomeraasin esto vähitellen näytteillä kara-muotoinen, pitkänomainen morfologia ja löysä välisissä liitoksissa päässä 25

th kulun aikana T24 tai T24 /PCI-solut olivat edelleen polyhedral ja kasvoi tiiviisti liitetty tavalla, joka ehdotti, että solut voivat olla käsiteltyjä EMT (Fig. 4A). Tämän testaamiseksi yksityiskohtainen molekulaarinen EMT merkkiaineiden T24, T24 /PCI, ja eri kulkua T24 /DN868A soluja (mukaan lukien 25

th, 27

th, ja 32

nd passage) havaittiin Western blot. Itse asiassa havaitsimme menetys epiteelin markkereita, mukaan lukien CK18 ja CK19 ja kohonneeseen mesenkymaalisten merkkejä ja invaasio liittyvät proteiinit, kuten N-kadheriinin, vimentiinin, ja MMP-2 T24 /DN868A soluja 25

th passage (kuvio . 4B).

. solun morfologia T24, T24 /PCI ja T24 /DN868A soluja havaittiin alle faasikontrastimikroskopiaan (20 x). Solun morfologia muuttunut polygonaalinen, epiteelin rakenne (ylempi) karan kaltainen mesenkymaaliset rakenne (alas). B. Western blot-analyysi N-kadheriinin, vimentiinistä, MMP-2, CK18, ja CK19 tasot T24, T24 /PCI, ja eri kulkua T24 /DN868A soluja. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

Vähentynyt pito, lisääntynyt maahanmuutto, invaasio, ja pesäkkeiden muodostuminen elossa T24 /DN868A solujen

in vitro

tutkimiseksi mahdollinen osallistuminen telomeerien huolto- ja EMT kasvaimen kehitystä, käytimme elossa T24 /DN868A solujen mallina tutkia niiden solujen käyttäytymistä jälkeen tämän muuntamisen. TranswellTM määrityksen tulokset osoittivat, että molemmat muuttoliike ja invasiivisia potentiaalin elossa T24 /DN868A solut merkittävästi lisääntynyt verrattuna vanhempien tai kontrolli-soluissa (kuvio. 5A).

. TranswellTM määritys soluinvaasiota ja muuttoliike mahdollisia suoritettiin. B. Tarttuvuus määritys liiman kyky määritettiin. C. Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin. (*

P

0,05 verrattuna kontrolli solut).

adheesiomääritystä matrigeelin käytettiin päällystämään 96-kuoppalevylle matkia soluväliaineen (ECM) . O.D. arvo puolesta liima solujen osoitti, että liima kapasiteetti elossa T24 /DN868A solusta matrigeelin oli merkittävästi vähentynyt (kuvio. 5B).

tutkia edelleen vaikutusta tämän muunnoksen kyky muodostaa klooneja T24 soluja. Kuten odotettua, pehmeä agar määrityksessä osoitti, että elossa T24 /DN868A solujen näkyvästi muodostuu yhä suurempia pesäkkeitä kuin vanhempien T24 ja hallita T24 /PCI-solut (Fig. 5C).

Lisääntynyt kasvaimen kehittymisen elossa T24 /DN868A soluja

in vivo

on osoitettu aikaisemmin, että ALT koulutusjakson ei korvaa telomerase prosessissa tumorigeneesin

in vivo

[23]; Siksi loimme -tuumoriksenografti ihonalaisella 1 x 10

6 T24, T24 /PCI, tai elossa T24 /DN868A solut 6-8 viikkoa vanhoja karvattomia hiiriä (n = 4 hiirtä ryhmää kohti). Kasvain näytteet analysoitiin edelleen H 0,001, verrattuna T24 ja T24 /PCI-solut). B. Edustavia kasvaimet eristetty T24, T24 /PCI, ja elossa T24 /DN868A suihkutuksella nude-hiiriin. C. HE ja immunohistokemiallisella värjäyksellä EMT merkkiaineiden kasvainten peräisin T24, T24 /PCI, ja elossa T24 /DN868A soluja, vastaavasti (40 x).

Histologinen värjäys osoitti, että kasvaimia peräisin elossa T24 /DN868A solut johto kaltaisia ​​ja aggressiivisempi, kun kasvaimia peräisin T24 tai T24 /PCI-soluja pyöristetty ja vähemmän pahanlaatuinen (Fig. 6C). Edelleen vahvistaa, että elossa T24 /DN868A soluista tehtiin EMT

in vivo

immunohistokemiallinen tutkimus suoritettiin kasvaimen yksilöitä nude-hiirissä. Tämän seurauksena, kohonneeseen N-kadheriinin ja vimentiinin tumassa ja sytoplasmassa sekä alenemisesta CK18 ja CK19 välillä solun rajapintojen havaittiin kudoksissa, jotka ovat peräisin elossa T24 /DN868A solut (Fig. 6C).

Twist aktivoitiin välittäjäksi EMT elossa T24 /DN868A solujen

Seuraavaksi mietimme molekyylitason mekanismi, jonka T24 /DN868A muuntaminen voi moduloida EMT. Tutkimme monia transkriptiotekijöitä kuten Slug, Twist, Etana, Smad4 ja ZEB1 RT-PCR. Alukesekvenssit RT-PCR on esitetty taulukossa S1. Tämän seurauksena vain Slug ja Twist parannettiin vuonna elossa T24 /DN868A soluja, kun taas muut transkriptiotekijät eivät osoittaneet tietenkin vaihtaa (Kuva. S1). Koska Twist liittyy edistämisessä EMT [24], ja se pystyy voittamaan onkogeenin aiheuttamaa vanhenemista erilaisissa ihmisen soluihin [25], keskityimme sen muuttumiseen elossa T24 /DN868A soluja. Tämän seurauksena, Twist dramaattisesti ylösajettu näissä soluissa sekä mRNA: n ja proteiinin tasot (Fig. 7A ja kuvio. S2). Lisäksi immunohistokemiallinen värjäys ja kudosnäytteiden osoitti, että suuri osa Twist värjäytymistä elossa T24 /DN868A soluja. Lisäksi ruskehtava pisteitä, jotka edustavat Twist tumassa enemmistön soluja, solujen määrä oli myös sekä soluliman ja tuman värjäytymisen (kuvio. 7B). Tutkimiseksi edelleen merkitystä Twist tässä EMT prosessi, emme pudotti Twist siRNA. Varsinkin alas-modulaatio Twist vähensivät valmiudet maahanmuuton ja hyökkäyksen elossa T24 /DN868A soluja (Kuva. 7C ja 7D). Samaan aikaan nämä vaihtelut olivat samanaikainen korkeus CK18, CK19, ja tukahduttaminen N-kadheriinin, vimentiinistä, ja MMP-2 elossa T24 /DN868A soluja (Kuva. 7E).

. RT-PCR ja Western blot-analyysi Twist ilmaisun T24, T24 /PCI, ja elossa T24 /DN868A soluja. B. havaitseminen Twist ilmaisun immunohistokemiallisella värjäyksellä nude-hiirissä kasvaimen näytteitä. C ja D. Elossa T24 /DN868A soluja käsiteltiin siRNA erityisiä Twist, ja analysoitiin hyökkäyksen ja muuttoliike kyky. E. Western blot-analyysi EMT liittyvien proteiinien.

Keskustelu

aikana pahanlaatuinen etenemistä syöpäsoluja, ylläpito telomeeripituuden on ratkaiseva edellytys niiden kuolemattomaksi [26], joka saavutetaan telomeraasiaktiivisuuden (TA) tai vaihtoehtoisia pidentäminen telomeres (ALT) [27]. Esto TA pidetään mahdollisena kohteena syövän hoidossa; tilanne kuitenkin mutkistaa olemassaolo ALT mekanismi. Nykyinen käsitys telomeeripituuden kinetiikan puuttuessa TA ja myöhemmin sitoutuminen ALT reitin perustuu ensisijaisesti ristiriitaiset korjaus puutosta ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja kurkunpään syövän solulinja Hep-2 [28], [29]. Tässä työssä, DN hTERT käytettiin toiminnallisesti estää TA virtsarakon syöpä T24, 5637, ja 253J solulinjat, ja sekvensoitiin muuttaminen telomeeripituuden määritettiin. Valitettavasti, transfektion jälkeen suurin osa näistä virtsarakon syövän solulinjat oli kuolemaan, ja mikään yksittäinen soluklooni voisi olla viljeltiin ja nuorennettiin paitsi T24-soluissa. Tuloksemme osoittavat, että vaikka leviämisen nopeus T24 solujen telomeraasin eston hidastui ja telomeeripituuden lyhennettiin aikaisemmissa passage, piirteitä liittyy ALT kaltaisia ​​reitin aikana havaittu pitkäaikaiseen viljelyyn. On myös syytä huomata, että kokonaistaso PML ja MRN monimutkainen lisääntynyt selvästi, koska enemmän pesäkkeitä MRE11, RAD50 ja NBS1 havaittiin tuman elossa T24 /DN868A soluja (Kuva. S3). Vaikka estämällä telomeraasia johtanut joko solukuoleman tai jälleen esiintyvän TA kuten raportoitu aiemmin [30], [31], meidän nykyinen tutkimus osoittaa mitään selvää ylössäätöä telomeraasi kullakin passage perustuu Q-FISH ja TRF määritys, mikä viittaa siihen, että on epätodennäköistä, että jäljellä telomeraasin on pääsyy havaitun telomere venymän T24 /DN868A soluja. Sen sijaan meidän tiedot osoittavat, että ALT-kaltainen mekanismi voisi olla vaihtoehtoinen tapa, jolla virtsarakon syöpäsolut paeta telomeraasin eston.

aktivointi ALT tulosten sarjaa geneettisiä muutoksia, jotka ovat kasvain-tyypille ominainen, ja monet tekijät edistävät valinta tämän mekanismin telomere huoltoa. T24 ilmentävät mutantti tuumorisuppressoriproteiinia p53 ja erittäin alhainen MSH6 [32], [33], joita katsotaan vaikuttavan tekijöitä ALT aktivointi [34], [35]. Tämä saattaa osittain selittää, miksi monien virtsarakon syövän solulinjat, vain T24 karannut solusta kriisin vaiheessa ja edelleen elossa.

Vaikka ALT kasvaimissa ei ole tutkittu laajasti, se on nyt käymässä selväksi, että solujen epiteelin alkuperä säilyttää telomeres kautta telomeraasin reitin, kun taas ALT on useammin läsnä mesenkymaaliset kasvaimet [5]. EMT on prosessi, jossa epiteelisolujen menettävät epiteelin fenotyyppi ja hankkia uusia ominaispiirteet mesenchyme [36]. Kiinnostavaa kyllä, solu vanhenemista voidaan ohittaa aktivaation aikana EMT jotka tyypillisesti mukana syövän etenemistä [15]. Vuonna kaihisen koiran linssin epiteelisolujen, prosessi EMT liittyy myös TERT [37]. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että morfologia hTERT inaktivoitua T24 solut osoittivat asteittaista mesenkymaalisten muutos 25

th kulun aikana johdonmukainen kulttuurin osoituksena karan muoto ja menetys välisissä liitoksissa. Vähentynyt epiteelin markkereita ja lisääntynyt mesenkymaalisten markkereita näkyvät sekä elossa T24 /DN868A soluja ennen päälle joukko ALT-ominaisuuksiltaan, ja kasvain näytteet peräisin eloonjääneiden solujen, mikä viittaa siihen, että EMT aktivoitiin ohittaa solujen vanhenemista nähty muissa julkaisuissa (13 , 15). Perustuu eri aikaan APBs ulkonäkö ja EMT muodostumista, erittäin todennäköistä, polut johtavat nämä muutokset voivat olla erilaisia.

Telomerase ja ALT uskotaan olevan toiminnallisesti epäoikeudenmukaisia ​​in kehotukset syövän etenemiseen, mutta se on edelleen ristiriitaisia ​​joka reitti on aggressiivisempi. Jotkut tutkimukset viittaavat siihen, että ALT-reitin, ainakin joissain solulinjoissa, ei toiminnallisesti korvaa telomeraasin suhteen tuumorigeenisyyteen ja etäpesäkeleesioita [38]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme tutkineet etenemistä kyky selvitä T24 /DN868A soluja. Verrataan vanhempien T24 tai valvonnan soluja, liikkuvuuteen, invaasio, ja klooni muodostuminen kyky

in vitro

ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

elossa T24 /DN868A solut huomattavasti korkeampia, kun taas liima kyky elossa T24 /DN868A solujen

in vitro

estyi, mikä tarjoaa vahvan tuen, että tämä täysin pahanlaatuinen fenotyyppi aktivoituneen elossa T24 /DN868A solujen EMT.

perus helix-loop-helix ( bHLH) transkriptiotekijä Twist on nopeampaa EMT [39], ja sen yliekspressio korreloi merkitsevästi vaiheessa ja arvosana ihmisen virtsarakon kasvain [40]. Yhteydessä syövän, Twist voi samanaikaisesti estää vanhenemista vasteen ja aiheuttaa EMT [41]. Tässä tutkimuksessa, huomasimme, että Twist yliekspressoituu elossa T24 /DN868A soluja 24

th passage, ja edelleen yhdistettyjä eläinten virtsarakkokasvain kudoksiin. Tasaisen, ehtyminen Twist vähentää etenemistä kykyä selvitä T24 /DN868A ja indusoi mesenkymaalisten-to-epiteelin (MET) kaltainen muutos. Siksi aktivointi EMT alle telomeraasin esto vaatii yhteistyötä Twist-signalointireitin virtsarakon syöpään.

Yhteenvetona tietomme osoittavat, että piirteitä liittyy ALT kaltainen mekanismi ja EMT voitiin indusoida jälkeen telomeraasin eston