Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) liittyy elämäntapaan liittyvien tekijöiden, jotka vaikuttavat insuliinin /IGF signalointi, josta insuliini reseptori substraatti 1 (insuliinireseptorisubstraatti 1) on keskeinen anturia. Tutkimme ilmaisua, lokalisointi ja patologinen korrelaatiot insuliinireseptorisubstraatti 1 syöpään uninvolved paksusuolen epiteelin, ensisijainen CRC kanssa pariksi maksametastaaseihin ja

in vitro

polarisoivasta Caco2 ja HT29. Insuliinireseptorisubstraatti 1 mRNA ja proteiinia korkeampi suhteessa pariksi limakalvolle, adenoomissa Familiaalisen adenomatoottisen polypoosin potilailla ja kulutustarviketta, joka yli-ilmentynyt

c-MYC

, ß-kateniinin, InsRß, ja IGF1 R. Analyysi insuliinireseptorisubstraatti 1 immunovärjääminen 24 primaarisen CRC pariksi paksusuolen epiteelin ja maksan etäpesäkkeiden osoittivat värjäyksen intensiteetti oli huomattavasti korkeampi etäpesäkkeitä sekä suhteessa ensisijaisen CRC (

P

0,01) ja paksusuolen epiteelin (

P

0,01). Ensisijainen ja metastaattinen CRC verrattuna paksusuolen epiteelin sisälsi merkittävästi suurempi määrä insuliinireseptorisubstraatti 1-positiivisten solujen (

P

= 0,013 ja

P

= 0,014, tässä järjestyksessä). Patologinen korrelaatiot 163 ensisijainen kulutustarviketta paljasti, että hajanainen insuliinireseptorisubstraatti 1 värjäytyminen liittyi kasvaimia yhdistyvät eriytetty fenotyyppiin ja aggressiivisia markkereita (korkea Ki67, p53, ja ß-kateniinin). Vuonna Caco 2 insuliinireseptorisubstraatti 1 ja InsR olivat enimmillään ilmaistiin jälkeen polarisaatio, kun IGF1 R oli suurin pre-polarisoituneet soluissa. Ei ydin- insuliinireseptorisubstraatti 1 havaittu, kun taas, jossa polarisaatio, fosforyloituu insuliinireseptorisubstraatti 1 (pIRS1) siirtyi sivusuunnassa ja apikaalisella solukalvolla ja ilmaistiin pinnalla soluissa vain. Vuonna HT29, jotka kantavat mutaatioita konstitutiivisesti aktivoiva selviytymisen signalointi, insuliinireseptorisubstraatti 1 ja IGF1 R pieneni polarisaatio, kun taas pIRS1 lokalisoitu ydin- paikkoja koko kurssin. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittamaan, että insuliinireseptorisubstraatti 1 moduloidaan mukaan CRC erilaistumista ja tukevat roolia insuliinireseptorisubstraatti 1 CRC etenemiseen ja maksan metastatization.

Citation: Esposito DL, Aru F, Lattanzio R, Morgano A, Abbondanza M , Malekzadeh R, et ai. (2012) insuliinireseptoriin Substrate 1 (insuliinireseptorisubstraatti 1) in Suolen eriytyminen ja peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (4): e36190. doi: 10,1371 /journal.pone.0036190

Editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2010; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Esposito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it/), IG 9168 (2009); Italian valtiovarainministeriön Scientific Research (https://www.istruzione.it/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Paksusuolisyöpä (CRC) on yhdistetty elintapoihin liittyviä riskitekijöitä, erityisesti ruokavalion perustuu energiaa sisältävien ruokien ja vähäinen liikunta [1] – [3]. Epidemiologiset ja kokeelliset todisteet osoittavat, että hormoni insuliini ja insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF: t) 1 ja 2 pelata keskeinen rooli (t) välittämässä monimutkainen vaikutus (t) ruokavalion ja liikunnan CRC riski [4] – [10] . Yli-ilmentyminen insuliinia reseptori (InsR) ja läheisesti liittyvien IGF1- reseptori (IGF1 R) on kriittinen insuliinin /IGF-järjestelmä yli-aktivointi syövän [4], [7], [9]. Suoliston epiteelin, että hänellä yksi korkeimmista uusiminen keskuudessa ihmisen kudoksia, ilmentää sekä InsR ja IGF1 R, ja tasot näiden reseptorien ovat korkeammat CRC suhteessa paksusuolen limakalvolle [4], [7], [8], [ ,,,0],11].

Suoliston epiteelin erilaistumista säätelevät useat reittejä, erityisesti ß-kateniinin riippuva WNT signalointi [12], [13]. Useimmat CRC havaittu aloittavan jälkeen inaktivoivat mutaatiot adenomatoottisen polypoosin coli (

APC

) geeni, joka koodaa keskeinen osa sytosolisen monen proteiinikompleksi, joka ohjaa ß-kateniinin hajoamiseen [14] – [16].

APC

-mutated solut näyttävät korkea sytoplasmista ja ydinvoiman ß-kateniinin; Jälkimmäisessä sitoutumisen jälkeen TCF /LEF transkriptiotekijöitä, muodostaa komplekseja, että kytkemällä useita syöpään liittyvien geenien, määrätä proliferatiivinen crypt kantaisä fenotyyppi (tarkistetaan https://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html ) [17].

Mielenkiintoista, viimeaikainen todisteet viittaavat SS-kateniinin ja insuliini /IGF: iä signalointireittejä. Itse asiassa,

insuliinireseptorisubstraatti 1

, joka koodaa yhtä kahdesta suuresta insuliinin reseptorin substraatteja (insuliinireseptorisubstraatti 1 ja IRS2), yhdistävien signalointia InsR, IGF1 R ja muut sytokiini- ja kasvutekijäreseptorit [18], on erittäin ylössäädelty soluissa jossa eksogeenisesti aiheuttama tai konstitutiivinen ß-kateniinin signalointi [19]. Tämä näyttää riippuvan suoraan sääntelystä

insuliinireseptorisubstraatti 1

TCF /LEF-ß-kateniinin komplekseja. Lisäksi insuliinireseptorisubstraatti 1 on tarpeen muutoksen soluissa, jotka ekspressoida ektooppisesti onkogeeniset ß-kateniinin ja ylläpidosta neoplastisen fenotyypin

APC

-mutated soluihin [19]. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien näyttöä siitä, että kohdunulkoinen insuliinireseptorisubstraatti 1 edistää muutosta, kun taas hallitseva-negatiivinen

insuliinireseptorisubstraatti 1

mutantti toimii tuumorisuppressorina [20]. Lisäksi

Apc

(

Min Twitter /+) hiirimallissa, suolen tuumorigeneesin vaimennetaan

insuliinireseptorisubstraatti 1

knock-out [21].

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaisun, lokalisointi ja ennusteeseen viittaavia korrelaatiot insuliinireseptorisubstraatti 1

ex vivo

, syöpään uninvolved ihmisen paksusuolen epiteelin ensisijainen CRC ja pariksi maksaetäpesäkettä, ja

in vitro

, vuonna kaksi CRC solumalleja pystyy spontaaniin

in vitro

polarisaatio, Caco2 ja HT29 [22], [23].

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) sarja 24 ensisijaisen CRC kanssa pariksi syöpää uninvolved paksusuolen limakalvolla ja synkronisen maksan etäpesäke oli takautuvasti tunnistettiin laitoksella Kirurginen ja onkologinen Sciences, University of Palermo, Palermo, Italia. Tämän sarjan standardin kokonaisia ​​käytettiin immunohistokemiallinen (IHC). Ylimääräinen FFPE sarja, joka koostuu vain ensisijaisen CRC, antamat Digestive Disease Research Center (DDRC), Teheranin yliopiston Medical Sciences, Teheran, Iran, sisältyi 163 205 CRC kuvattujen tapausten Bishehsari et al. ja Mahdavinia et al. [24], [25], on valittu perustuen kudokseen saatavuuden. Näitä CRC oli aiemmin ominaista mikrosatelliittien epävakaus (MSI) asema ja

p53

ja

KRAS

mutaatioita [24], [25]. Kliinis-patologinen data, kuten ikä ja sukupuoli, kasvaimen koko, vaihe ja laatu, oli saatavilla kaikkien 163 potilasta. Ei seurantaa ja selviytymisen tietoja oli saatavissa. Kudossiruina (TMA) rakennettiin uuttamalla histologisesti varmennettu CRC ydintä luovuttajasta lohkojen Beecher MTA 2 mm Punch Set (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA). Ytimet uudelleen upottaa ruudutetusta parafiiniblokit ja tavallinen TMA leikkeitä käytettiin IHC.

Näytteitä tuumori- ja pariksi paksusuolen limakalvo, pikajäädytettiin tai nopeasti vahvistettu RNAlater (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA), kerättiin klo Kliinisen fysiopatologia, University of Florence, Firenze, Italia, 8 valitsematta CRC tapauksissa ja 2 familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP) sairastavien potilaiden molekyylirakennetta tunnistamattomiksi ituradan

APC

mutaatio (vastaavasti Glu1309fsX1312 ja Ser843fsX860). Kerääminen ja näytteiden analysointi ja kliinis-patologisten tietojen hyväksyi

G. D’Annunzio Tampereen eettisen lautakunnan ja Institutional Review Board on DDRC, Shariati sairaala, University of Teheran (protokolla päivätty 17/03/2004). Kaikki tapaukset olivat anonymisoidaan.

IHC

TMA ja tavallinen koko kudos leikattiin 4 um ja värjättiin anti-insuliinireseptorisubstraatti 1 kanin polyklonaalista (C-20, sc-559, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa) on 1:300 laimennus 30 min, sen jälkeen kun antigeeni haku mikroaalloilla käsittely 750 W: ssa 10 min 10 mM natriumsitraattia, pH 6,0 (Dako, Glostrup, Tanska). Anti-kani-EnVision kit (K4003, Dako) käytettiin signaalin vahvistus. Serial TMA osat inkuboitiin myös seuraavat hiiren monoklonaalisia vasta-aineita: anti-ß-kateniinin (17C2, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK), anti-p53 (DO7, Novocastra) ja anti-Ki67 (MIB-1, Dako), jota varten antigeeni haku suoritettiin termostaatti- hauteessa 96 ° C: ssa 40 minuutin ajan natriumsitraattipuskurissa (Dako), ja anti-EGFR-pharmDx (2-18C9, Dako), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki immunoreaktioita paljastettiin streptavidiini-biotiini-tehostettu peroksidaasisysteemi (Super Sensitive Link-Label IHC Detection System, BioGenex, Milano, Italia). Positiiviset ja negatiiviset kontrollit sisällytettiin kullekin vasta-aineelle ja jokaisesta erästä värjäystä.

Kunkin merkki prosenttiosuudet positiiviset solut arvioitiin neljällä 400-kertainen suurennus (≈1000 solut). Insuliinireseptorisubstraatti 1, Ki67, p53, EGFR ja ß-kateniinin katsottiin positiiviseksi, kun 1% tuumorin solut värjättiin, ß-kateniinin teki erikseen immunovärjäystä sytoplasmassa, tumaan ja pitkin solukalvoa. Riippumaton otosten t-testiä käytettiin arvioimaan eroja insuliinireseptorisubstraatti 1 lausekkeen (% positiivisten solujen) mukaan patologisia ja mutaatiostatuksesta ominaisuuksia. Expression of insuliinireseptorisubstraatti 1 korreloi kuin kaikkien muiden markkereiden Spearmanin rho testi. SPSS (versio 15.0) ohjelman (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) käytettiin kaikkiin tilastolliset analyysit. Kaikki mainitut

P

arvot ovat kaksipuolisia;

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tiheys insuliinireseptorisubstraatti 1 immunovärjääminen pariksi syöpään uninvolved paksusuolen epiteelin, ensisijainen CRC ja maksan etäpesäke määritettiin semikvantitatiivinen digitaalinen analyysi käyttäen ImageJ ohjelmisto ( https://rsbweb.nih.gov/ij/). Kuvat otettiin klo standardoitua kirkkaan kentän asetukset (400-kertainen suurennus). Otetut väri JPEG-kuvia muunnettiin harmaasävy 8 bittinen kuvia, sitten kiinnostuksen kohteena olevan alueen johtaja toimintoa käytettiin hahmotella sytoplasman alueilla, joista kukin käsittää 5-15 soluja. Ei-toivotut ydin- tai peruskudoselementeistä oli editoitu pois. Alueet analysoitiin 4 Hyväksytty sarjaa crypt epiteelin, ensisijainen CRC ja maksan etäpesäke olivat 11 alhaalta krypta epiteelin, 10 huippu krypta epiteelin, 78 täydellistä paksusuolen epiteelin, 84 perus CRC, ja 84 metastaattisen CRC. Käyttämällä default ImageJ asetukset, yksiköt mitattiin kullekin alueelle oli tiheyden arvo, kokonaispinta-ala neliön pikseliä, keskimääräinen koko ja alueen osa. Tiheys arvot krypta epiteelin ensisijainen CRC ja metastaattinen CRC, normalisoitu per alue kokoja, analysoitiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä. Arvo

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä [26].

Quantitative real-time PCR (RTqPCR) B

Yhteensä RNA pariksi limakalvolla CRC näytteiden eristetty kanssa QIAzol (QIAGEN, Hilden, Saksa), käsiteltiin DNAase-1 (Ambion), tarkastetaan spektrofotometrillä ja agaroosigeelielektroforeesilla, ja retro-transkriptoidaan High Capacity DNA Archive Kit (Applied Biosystems) noudattaen valmistajan ohjeita. RTqPCR määritykset suoritettiin kahtena kappaleena käyttämällä 96-kuoppaista optisen reaktion levyille ja ABI 7500HT kone (Applied Biosystems). Lähtötason vahvistus juoni arvot asetetaan automaattisesti ja kynnysarvot pidettiin vakiona saada normalisoitu jaksoaikoja ja lineaarinen regressio tiedot. Reaktioseoksen per kuoppa sisälsi 10 ui Virta Syber Green (Applied Biosystems), 2,4 ui aluketta (lopullinen pitoisuus 150 nM), 4,6 ui RNaasi-vapaata vettä, 3 ui cDNA: ta (60 ng). Kaikissa kokeissa PCR-protokolla oli seuraava: denaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 sekuntia. Kvantifiointi suoritettiin suhteessa

Syklofiliiniesimerkkeihin

[27] käyttäen ΔΔCT menetelmällä. Validoitu RTqPCR alukkeita, suunniteltu Primer Express 3.0 ohjelmisto, olivat:

Syklofiliiniesimerkkeihin

, FW 5’TTTCATCTGCACTGCCAAGA3 ’; RV5’TTGCAAAACACCACATGCT3 ”;

insuliinireseptorisubstraatti 1

, FW 5’GCAACCAGAGTGCCAAAGTGA3 ”RV5’GGAGAAAGTCTCGGAGCTATGC3 ’;

c-MYC

, FW5’CCACCACCAGCAGCGACT3 ”, RV5’CAGAAACAACATCGATTTCTTCCTC3”.

Soluviljelmät

modulaatio insuliinireseptorisubstraatti 1 ja insuliinin /IGF1- akseli tutkittiin vuonna Caco- 2 ja HT29 CRC solulinjoissa, jotka tietyissä viljelyolosuhteissa, tapahdu spontaania

in vitro

erilaistuminen [22], [28], [29]. Caco-2, kehittynyt ensisijainen CRC, joka on leikattu 72 vuotta vanha mies valkoihoinen, on MSI-vakaa ja kuljettaa inaktivoivan

APC

pistemutaatio, jossa toinen osumasta Heterotsygotian menetys (LOH), missensemutaatio in

ß-kateniinin

eksoni 5 (joka ei näytä vaikuttavan hajoamista), ja on villityypin varten

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

ja

PTEN

[23], [30] – [32]. HT29, kehittyi ensisijainen CRC, joka on leikattu 44 vuotta vanha nainen valkoihoinen, on myös MSI-vakaa ja kuljettaa kaksinkertainen osuma inaktivoivan

APC

mutaatioita (joka kuitenkin mahdollistaa rajoitetun ß-kateniinin fosforylaation ja ubikitinaatio), samoin kuten mutaatiot

Smad4

,

BRAF

,

TP53

, ja

PI3KCA

, joka koodaa p110α katalyyttinen alayksikkö luokan I fosfatidyyli 3-kinaasien ( PI3K) [23], [31] (katso myös Luettelon Somaattiset mutaatiot Cancer, https://www.sanger.ac.uk/cosmic).

Caco-2 ja HT29 saatiin ATCC (ATCC-LGC Promochem, London UK). Caco-2-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), L-glutamiinia (2 mM), penisilliiniä (100 yksikköä /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml) alle kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO 2 37 ° C: ssa. Solut maljattiin 10 cm: n petrimaljoille, ja niiden annettiin kasvaa konfluenssiin. Kun konfluenttisuuden (nimetty nolla ajankohtana) Caco-2 kulttuuri suoritettiin DMEM 20% FBS. Koko ajan kulku suoritettiin kahdesti ja kokosolulysaateille saatu 3, 7 ja 14 päivän konfluenssiin. HT29-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää ja annettiin kasvaa 3 (preconfluent), 7 (konfluentteja) ja 14 (post-konfluentteja) päivää, joina aikoina kokosolulysaateista saatiin.

Western blotting

koko solun tai koko kudoksen lysaatit valmistettu käyttäen jääkylmää lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X-100, 50 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM NaF, 4 mM natriumpyrofosfaatti, 2 mM Na3VO4) täydennettynä proteaasinestäjät (1 mM phenylmethylsulphonylfluoride, 2 ug /ml aprotiniinia, 2 ug /ml leupeptiiniä). Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla (10000 x g 20 min) ja proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä. Viisikymmentä mikrogrammaa (50 ug) kokonais- proteiinit erotettiin pelkistävissä olosuhteissa on 7,5% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin vahvistettu nitroselluloosalle. Membraani blokattiin 3% ei rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä, jossa oli 0,01% Tween 20: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sitten niitä inkuboitiin yön yli seuraavien primaaristen vasta-aineiden: anti-insuliinireseptorisubstraatti 1 kanin polyklonaalista (C-20, Santa Cruz), laimennettu 1:500; anti-tyrosiini 632-fosforyloitiin insuliinireseptorisubstraatti 1 (pIRS1 Tyr632) polyklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz) laimennettuna 1:200; anti-ß-kateniini (Ylem, Rooma, Italia), laimennettu 1:50 tai anti-ß-kateniinin polyklonaalista (# 9562, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), laimennettu 1:1000; polyklonaalinen vastaan ​​ß alayksikköä InsR (InsRß) (C-19, Santa Cruz) laimennettuna 1:200; polyklonaalinen vastaan ​​ß alayksikköä IGF1 R (anti-IGF1Rß, Cell Signaling Technology /Euroclone, Milano, Italia) laimennettu 1:800; anti-aktiini monoklonaalisia (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) laimennettu 1:10000. Membraani pestiin sitten PBS: ssä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa vastaavan piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, laimennettiin 1:2000 (GE Healthcare, Milano, Italia). Sitoutuneet vasta-aineet detektoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssi (ECL) menetelmää (Pierce-Celbio, Pero, Italia). Kvantifiointi western blot signaaleja (keskiarvo ± SE vähintään kahdesta itsenäisestä kokeesta) saatiin analysoimalla digitoitua signaaleja ImageJ ohjelmisto (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Aineisto normalisoitiin ß-aktiini ja ilmaistiin prosentteina suurimmasta arvosta.

Immunofluoresenssikoe

Caco-2 ja HT29, kasvatettu peitinlaseista olosuhteissa edellä kuvattujen, kiinnitettiin metanolissa (-20 ° C) ja inkuboitiin anti-ß-kateniini (BD Science, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-insuliinireseptorisubstraatti 1 kanin polyklonaalista (C-20, Santa Cruz), laimennettiin 01:50; ja anti-pIRS1 (Tyr632) polyklonaalinen (Santa Cruz) laimennettuna 1:50. Tumat värjättiin 4,6-diamido-2-fenyyli (DAPI, Sigma-Aldrich) ja solukalvojen vehnänalkio agglutiniinin (WGA, Sigma-Aldrich). Ensisijainen vasta-aineet visualisoitiin käyttäen vuohen anti-hiiri-IgG fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoidulla (Cappel, MP Biomedicals Europe, Illkirch, Ranska) tai vuohen anti-kani-lgG-Texas-Red-konjugoidulla (Jackson ImmunoResearch Laboratories Euroopassa, Newmarket, Suffolk, UK) ja 30 min huoneen lämpötilassa. Solut analysoitiin käyttämällä Apotome Axio Observer Z1 käänteinen (Zeiss, Oberkochen, Saksa) varustettu AxioCam MRM Rev.3 40-kertaisella suurennuksella. Rinnakkaispaikantumisen Fluoresenssisignaalien analysoitiin AxioVision 4.6.3 ohjelmistolla. Kuva-analyysi suoritettiin käyttäen Adobe Photoshop.

elektronimikroskopialla

Solut kiinnitettiin seoksella 2% paraformaldehydillä-2% glutaraldehydillä PBS: ssä (pH 7,4), jälkifiksattiin 1% osmium miumtetroksidilla veronaalipuskurissa asetaattipuskurissa (pH 7,4) 1 tunnin ajan 25 ° C: ssa, värjättiin 0,1%: parkkihappo samassa puskurissa 30 minuutin ajan 25 ° C: ssa ja uranyyliasetaatilla (5 mg /ml) 1 tunnin ajan 25 ° C, kuivattu asetoniin ja upotettiin Epon 812. Palanäyte lopulta tutkitaan Philips CM10 transmissioelektronimikroskoopin, jälkikäsitelty värjäyksen uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla.

tulokset

insuliinireseptorisubstraatti 1 in CRC

määräytyy RTqPCR konstitutiivinen ilmentyminen

insuliinireseptorisubstraatti 1

ja

c-MYC,

avain WNT tavoite ja efektori [17], yhteensä RNA pariksi peräsuolen limakalvolla ja CRC-näytteet (kuvio 1A). Viisi CRC yliekspressoitu

insuliinireseptorisubstraatti 1

suhteessa pariksi limakalvolle. Kaiken mRNA tasot

insuliinireseptorisubstraatti 1

olivat hyvin yhtäpitäviä

c-MYC

.

Paneeli A esittää histogrammeja suhteellisen ilmentymisen

insuliinireseptorisubstraatti 1

(vasemmalla) ja

c-MYC

(oikealla) transkriptien pariksi näytteitä syöpää vaikuta peräsuolen limakalvon (valkoinen) ja CRC (musta), määritettynä kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (RTqPCR). Limakalvon näytteet asetetaan yhtä 100% ja normalisoitiin suhteellinen ilmentyminen housekeeping-geeni,

Syklofiliiniesimerkkeihin

. Cancer näytteet ilmaistiin suhteessa limakalvon ja normalisoitiin suhteellisen ilmentymisen housekeeping-geenin. Pareittain M1T1 on M4T4 ja M8T8, sekä

c-MYC

ja

insuliinireseptorisubstraatti 1

kasvu CRC suhteessa limakalvolle, vain M5T5 ja M6T6

insuliinireseptorisubstraatti 1

ja

c-MYC

eri mieltä (

insuliinireseptorisubstraatti 1

:

P

= 0.05,

c-MYC

:

P

0,001, pariton t-testi keinoista kaikkien erojen tuloksia ei ole esitetty). Paneeli B esittää western blot -analyysiä insuliinireseptorisubstraatti 1, beeta-alayksikön insuliinin reseptorin (InsRß), beeta-alayksikön insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1Rß), ß-kateniinin ja ß-aktiini, kuten kuormituksen valvonta, että pariksi paksusuolen limakalvon ja CRC näytteet on esitetty A (lukuun ottamatta M6T6, jonka kudoksen western blot-analyysi ei ollut saatavilla). Histogrammit Paneeli C näyttää kvantitaatiot, normalisoinnin jälkeen SS-aktiini, että insuliinireseptorisubstraatti 1, InsRß, IGF1Rß ja ß-kateniinin signaaleja. Suhteessa pariksi limakalvolle, insuliinireseptorisubstraatti 1 yliekspressoituu CRC: t pareja M1T1-M4T4 yhdessä InsRß, IGF1Rß ja ß-kateniinin (insuliinireseptorisubstraatti 1:

P

= 0,017, InsRß:

P

= 0,044 , IGF1Rß:

P

0,001, SS-kateniinin:

P

0,001, paritonta t-testin avulla kaikkien erojen tuloksia ei ole esitetty). On huomattava, että CRC että yli-ilmennetään insuliinireseptorisubstraatti 1, InsRß, IGF1Rß ja ß-kateniinin proteiinit myös yli-ilmentyy

insuliinireseptorisubstraatti 1

ja c-

MYC

mRNA.

tutkia modulaatio insuliinireseptorisubstraatti 1 ja muiden insuliinia /IGF-reitin osia, arvioimme western blot proteiini tasoilla insuliinireseptorisubstraatti 1, InsRß, IGF1Rß ja ß-kateniinin 7 8 edellä raportoitu CRC tapauksissa (joka kudos oli saatavilla), ja Parilliset paksusuolen limakalvon ja adenooman näytteitä kaksi asiaan FAP potilasta [33]. Ensisijainen CRC insuliinireseptorisubstraatti 1-proteiinin tasot heijastuu mRNA-tasoja, on korkeampi suhteessa pariksi limakalvolle, 4 ja 5 tapauksessa, että yli-ilmentynyt

insuliinireseptorisubstraatti 1

ja

c-MYC

mRNA. Nämä CRC myös yli-ilmentyy InsRß, IGF1 R, ja ß-kateniinin, kun taas muissa tapauksissa limakalvon tasot InsRß, IGF1 R, ja ß-kateniinin olivat samalla tasolla tai korkeammat kuin pariksi CRC (kuvio 1 B-C). Kahdessa FAP tapauksessa insuliinireseptorisubstraatti 1 selvästi lisääntynyt kasvain suhteessa limakalvolle yhdessä InsRß, IGF1Rß ja ß-kateniinin, ja IHC osoitti diffuusin insuliinireseptorisubstraatti 1 adenoomissa (kuva S1).

lisäksi arvioitiin insuliinireseptorisubstraatti 1-proteiinin ilmentymisen IHC yksilöllisesti sovitetun parafinoidut osia paksusuolen limakalvon, primaarinen ja metastaattinen CRC. Kaksikymmentäneljä tapauksia pariksi ensisijainen CRC ja maksan etäpesäke, sisältäen myös syöpään uninvolved paksusuolen limakalvolla, oli saatavilla analyysiä varten. Immunoreaktiiviset insuliinireseptorisubstraatti 1 oli selvästi havaittavissa krypta epiteelin, sekä ensisijainen ja metastaattinen CRC (kuva 2A-E). Ensisijainen ja etäpesäkkeitä verrattuna paksusuolen epiteelin sisälsi korkeammat numerot ilmentävien solujen insuliinireseptorisubstraatti 1 (80,8 ± 6,2% perus- ja 81,3 ± 6,6% metastasoineeseen CRC vs. 59,1 ± 5,6% paksusuolen epiteelin,

P

= 0,013 ja

P

= 0,014, vastaavasti, kuvio 2F). Tiheys arvot pikseliä insuliinireseptorisubstraatti 1, sillä määrällisesti käyttäen ImageJ ohjelmistoa, eivät eronneet ensisijainen CRC ja paksusuolen epiteelin, mutta olivat merkittävästi korkeammat maksassa etäpesäkkeitä verrattuna CRC (

P

0,01) ja paksusuolen epiteelin (

P

0,01) (taulukko 1). Erot tiheyden arvojen insuliinireseptorisubstraatti 1 välillä paksusuolen epiteelin alhaalta ja ylhäältä krypta eivät olleet merkittäviä. Olemme edelleen pohdittava patologisen korrelaatiot insuliinireseptorisubstraatti 1 ilmaisun sarjassa 163 ensisijainen CRC testattu IHC on TMA (taulukko 2). Kaiken 151/163 tapausta (92,6%) oli insuliinireseptorisubstraatti 1-positiivisia. Insuliinireseptorisubstraatti 1 ilme ei merkittävästi eroa suhteessa ikä diagnoosin, sukupuoli, kasvaimen sijainti (oikealla vs. vasen paksusuolen), Duke vaiheessa ja MSI tila. Kuitenkin CRC korkea /kohtalainen eriyttäminen olivat todennäköisesti osoittaa suuri osuus insuliinireseptorisubstraatti 1-positiivisten solujen kuin huonosti eriytetty kasvaimet (

P

= 0,001), kun taas CRC kanssa mucinous /sinettisormus-rengas fenotyypin liittyi polttoväli tai no insuliinireseptorisubstraatti 1 (

P

0,001). Huonosti eriytetty CRC usein ilmenee tumavärjäystä lisäksi sytoplasman reaktiivisuus. Kuvio 3A-E esimerkki insuliinireseptorisubstraatti 1 värjäytymiskuvion.

Paneeli A esittää insuliinireseptorisubstraatti 1 immunovärjääminen täyspitkän pitkittäiskuvan syöpää uninvolved paksusuolen crypts. Paneelit B-E ovat esimerkki insuliinireseptorisubstraatti 1 immunovärjääminen ensisijainen CRC (B-C) versus pariksi etäpesäke (maksabiopsiassa ydin, D-E). Molemmat osoittavat diffuusi sytoplasman insuliinireseptorisubstraatti 1, jossa on paljon vahvempi immunovärjääminen metastaattisen soluissa. Paneeli F näyttää histogrammeja keskiarvon prosenttiosuuksien insuliinireseptorisubstraatti 1-positiivisten solujen 24 tapauksessa vastaavia ei-neoplastisia paksusuolen epiteelin, ensisijainen CRC ja metastaattinen CRC (virhepalkkeja keskiarvo ± SEM). Oli merkittäviä eroja paksusuolen epiteelin (59,1 ± 5,6%) ja ensisijaisen CRC (80,8 ± 6,2%,

P

= 0,013 riippumattomien otoksen t-testi) sekä epiteelin (59,1 ± 5,6%) ja maksan etäpesäkkeiden ( 81,3 ± 6,6%,

P

= 0,014). Ero primaarinen ja metastaattinen CRC ei ollut merkitsevä (

P

= 0,964).

paneelit A ja B esittävät vastaavasti diffuusi sytoplasman insuliinireseptorisubstraatti 1 ulkopuolisissa mucinous peräsuolen CRC, mukaan lukien kohtalaisen eriytetty kasvain, jolla on vahvat immunovärjäystä syöpäsolujen, ja huonosti eriytetty kasvain, jossa heikompia ja mahdollisesti myös ydinaseiden insuliinireseptorisubstraatti 1 (nuolenpäät). Paneelit C-E esittävät huonosti eriytetty CRC mucinous, enimmäkseen sinettisormus-rengas fenotyyppi. Erityisesti on reuna-alueen (single tähti) yksityiskohtaisesti paneeli D, kasvainsolut ei-mucinous fenotyyppi näyttää ydin- /perinuclear insuliinireseptorisubstraatti 1 (nuolenpäät), kun taas sinettisormus-rengas solujen kelluu mukiinia (double tähti), yksityiskohtainen paneelissa E, do ei näytä insuliinireseptorisubstraatti 1 immunovärjäystä.

Kuten taulukosta 3, joka raportoi Spearmanin korrelaatioita IHC markkereita, insuliinireseptorisubstraatti 1 positiivisesti liittyy Ki67 (

P

= 0,008 ), p53 (

P

= 0,032), kalvo (

P

= 0,001) ja sytoplasman (

P

0,001) ß-kateniinin. Muut liitot solukalvon ß-kateniinin, korreloi positiivisesti soluliman ß-kateniinin (

P

0,001) ja EGFR (

P

= 0,005), ja sytoplasminen ß-kateniinin, korreloivat positiivisesti ydinalan ß-kateniinin (

P

0,001), Ki67 (

P

= 0,002) ja p53 (

P

= 0,009), kun taas ydinvoiman ß-kateniinin positiivisesti korreloi p53 (

P

= 0,049). Odotetusti, positiivinen korrelaatio löytyi Ki67 ja p53 (

P

= 0,029).

Nämä tulokset viittaavat siihen, että korkea insuliinireseptorisubstraatti 1 liittyy CRC yhdistyvät hyvin /kohtuullisesti erilaistunut histologisia ilmiasuun immunohistokemiallinen merkkiaineiden huonoon ennusteeseen (ilmaus Ki67, p53, ja sytoplasminen ß-kateniinin).

insuliinireseptorisubstraatti 1 in Caco-2 polarisaatio

Caco-2 kuljettaa inaktivoiva APC-mutaatio, jossa toisella osumasta LOH , mutta tiedetään olevan negatiivinen mutaatioiden

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

ja

PTEN

[23], [31] (ks myös COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic). Caco-2-solut pystyvät spontaanin erilaistumisen, dokumentoidaan ilmentymistä suolinukan, entsyymien ja kuljettajat ominaisuus polarisoitunut enterosyyttien ja kehittämällä tiukka liittymissä, joka

in vivo

ympäristössä, tarvitaan ylöspäin migraatio crypt epiteelisolujen kohti limakalvon pintaa [28], [29], [34]. Insuliinireseptorisubstraatti 1 ilme ja aktivointi analysoitiin western blot Caco-2 kulttuureissa aikana polarisaatio 3, 7 ja 14 päivän kuluttua konfluenssiin, läsnäollessa ja puuttuessa seerumin yhdessä ilmaus InsRß ja IGF1Rß (kuvio 4A). Sekä viljelyolosuhteet insuliinireseptorisubstraatti 1 vähenivät 7. päivänä, mutta kasvoi sen jälkeen, jossa korkein ilme päivänä 14. Etenkin sekä normaali ja seerumitonta kulttuureissa InsRß, johti heikosti ilmaistu päivä 3 ja lisäsi merkittävästi päivänä 7. mahdollisimman ilmennetty päivänä 14. Kääntäen, jälleen molemmissa olosuhteissa, IGF1Rß oli suurin päivänä 3 ja merkittävästi vähentynyt päivinä 7 ja 14. arvioimiseksi insuliinireseptorisubstraatti 1 aktivointi, Caco-2-solujen 3, 7 ja 14 päivää alkaen konfluenssiin olivat ilman seerumia yli yön ja sitten stimuloidaan tai ilman insuliinia (100 nM) tai IGF1- (10 nM) 5 min. Kokonaisproteiinin lysaatit (80 ug) saatiin 5 minuutin kuluttua hoidon ratkaistiin ja blotattiin anti-pIRS1 Tyr632 (Kuva 4G). Insuliinireseptorisubstraatti 1 tyrosiinifosforylaatio oli merkitystä 7. päivänä polarisaation ja ei näyttänyt on mukautettava insuliinista tai IGF1- (kaista 4-6). Kuitenkin päivä 3, vain eksogeeninen IGF1 aktivoitu insuliinireseptorisubstraatti 1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että insuliinireseptorisubstraatti 1 voisi välittää autocrinely-aktivoitu InsR signalointia polarisoitunut soluissa (jossa insuliinireseptorisubstraatti 1 ja InsRß ovat maksimaalisesti ilmaistaan ​​ja IGF1Rß on pienin), ja IGF1 R signalointi, aktivoitu eksogeenisen IGF: t, pre-polarisoituneet soluja (jossa insuliinireseptorisubstraatti 1 on ilmaistu alemmilla tason ja IGF1Rß ja InsRß on korkeimman ja matalimman tason, vastaavasti).

paneeli A esittää western blot -analyysiä insuliinireseptorisubstraatti 1, beeta-alayksikön insuliinin reseptorin (InsRß), beeta-alayksikön insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1Rß) ja ß-aktiini, kuten lastaus valvontaa, Caco-2-solut päivinä 3, 7 ja 14 jälkeinen yhtymäkohta, monistaa puuttuessa (-) ja läsnäolo (+) seerumin kasvualustaan. Histogrammit osoittavat kvantitaatiot, normalisoinnin jälkeen SS-aktiini, että insuliinireseptorisubstraatti 1, InsRß ja IGF1Rß signaaleja (keskiarvo ± SE kahdessa kokeessa). Sekä viljelyolosuhteet lisääntynyt espression of insuliinireseptorisubstraatti 1 ja InsRß näkyy selvästi polarisoituneet soluissa päivänä 14 (insuliinireseptorisubstraatti 1) ja päivinä 7 ja 14 (InsRß), kun taas enintään ilmentyminen IGF1Rß havaitaan vasta päivänä 3. Transmissioelektronimikroskopia of Caco- 2-soluja päivänä 3 spontaanin polarisaation ajan myötä paljastaa muodostavat elektronitiheisiin liittymissä kärkeen sivusuunnassa kalvojen vierekkäisten solujen (paneeli A, nuoli). Jossa eteneminen polarisaatio, tiukka liittymissä ja desmosomeja (paneelit C-D, nuolet) ja tarttuvuus liittymissä (paneeli D) selvinnyt elektroni-tiivis laattoja vieressä sivusuunnassa kalvoilla päivinä 7 ja 14, tässä järjestyksessä. Lisäksi tiukka monisoluisista klustereita, joissa erilaistuminen ominaisuuksia, kuten solunsisäinen lumina rikas apikaalisella harjareunusten (paneelit E-F), käynyt selväksi päivänä 14. Lyhenteet: tj, tiiviin liitoksen; mainos, tarttuvuus risteykseen; ds, Desmosomi. Paneeli G näyttää western blot tasoja tyrosiini 632-fosforyloituu insuliinireseptorisubstraatti 1 (IRS1tyr632) ja, kuten lastaus valvonta, ß-aktiini, seerumin puutteessa Caco-2-solut stimuloimaton (-) ja stimuloi (+) ja insuliinia (100 nM) tai IGF1 (10 nM). Insuliinireseptorisubstraatti 1 tyrosiinifosforylaatio on merkitystä päivänä 7 polarisaatio, riippumatta lisäämättä eksogeenistä insuliinia tai IGF1. Kuitenkin päivä 3, vain eksogeeninen IGF1- ratkaisee insuliinireseptorisubstraatti 1 fosforylaatiota.

Transmissioelektronimikroskopia että Caco-2 kulttuureissa dokumentoitu päivä 3 muodostuminen paikallisen elektronitiheisiin alueilla lähellä opposition vierekkäisten sivusuunnassa plasman kalvot, ominaisuus muodostaa tiiviiden liitosten, ja päivänä 14 läsnä täydellisen solujen välistä liitok- komplekseja, samoin kuin polarisaation imukykyisen apikaalisella sukasauman (kuvio 4B-F). Kaiken kaikkiaan tämä vahvisti enterocytic polarisaatio viljelyn aikana ajan funktiona [28].

Immunofluoresenssianalyysi osoitti eroja solunsisäisen jakautumisen koko insuliinireseptorisubstraatti 1 ja pIRS1 Tyr632 aikana Caco-2-kulttuuri ajan myötä (kuvio 5). Päivänä 3 insuliinireseptorisubstraatti 1 immunoleimaus oli selvästi vähäisempää kuin 7. ja 14. päivänä, ja todettiin pääasiassa lokalisoitu pitkin sivu- ja basolateraalisessa solukalvot. Sulauttaminen ß-kateniinin ja insuliinireseptorisubstraatti 1 kuvia vahvisti rinnakkaispaikantumisen kahden proteiinin pitkin basolateraaliseen kalvoja. Päivänä 3 värjäys pIRS1 Tyr632 oli suhteellisen heikko ja oli jakelu samanlainen kuin koko insuliinireseptorisubstraatti 1. Päivänä 7 pIRS1 Tyr632 lisääntynyt ja enimmäkseen esiintynyt pistemäistä värjäytymistä päälle pinnalla solujen viittaavia lokalisointi alapuolelle solukalvon apikaalisella puolella. Yhteensä insuliinireseptorisubstraatti 1 pysyi pääasiassa lokalisoitu pitkin basolateraalisessa kalvot, yhdessä SS-kateniinin. Erityisesti, 14. päivänä pIRS1 Tyr632 on rajoitettu vähemmän pinta-solut, jotka kuitenkin vaikutti voimakkaammin leimattu kuin päivänä 7, jossa tyypillinen apikaalisen solukalvon pistemäinen kuvio (alempi määrä positiivisten solujen yhdenmukainen lasku pIRS1 Tyr632