Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin roolia hypoksian indusoima tekijä (HIFs) in pahanlaatuinen fenotyypin ylläpito ja kanonisen Wnt signalointia. Under normoksia määrittelimme, että molemmat HIF-1α ja HIF-2α ilmentyvät ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, mutta ei niiden ei-pahanlaatuinen kollegansa. Vakaa knockdovvn HIF-1α tai HIF-2α ilmentymisen aiheuttamaa kielteisiä vaikutuksia pahanlaatuinen fenotyyppi koolonkarsinoomasoluissa, jossa laktaatin tuotantoa, apoptoosin, muuttoliike, CXCR4 välittämä kemotaksista, ja tuumorigeenisia aktiivisuus kaikki ovat vaikuttaneet merkittävästi HIF knockdown ja HIF-1α ehtyminen kohdistamaan enemmän vaikutuksia. Knockdown Näiden kahden HIF selostukset aiheuttama erilaisia ​​ja jopa vastakkainen vaikutus β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta koolonkarsinoomasoluissa eri geneettisen Wnt signalointireitteihin. Vuonna SW480-soluissa, HIF-2α Knockdown ei vaikuttanut β-kateniinin tasoja, lisäämällä transkriptionaalista aktiivisuutta β-kateniinin aiheuttamalla sen tumakertymään, kun taas HIF-1α hiljentäminen heikentänyt vakaus- ja transkriptionaalista aktiivisuutta β-kateniinin, asiakkuutta sen poistuminen ytimistä ja palvelukseenotostaan ​​solukalvon E-kadheriinin. Lisäksi, vaikka HIF-1α ehtyminen indusoi käänteinen epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), HIF-2α hiljentäminen muuttunut ilmentyminen kantasolujen merkkiaineita CD44, Oct4, ja CD24 ja differentiaatiomarkkeri CK20 vastakkaiseen suuntaan HIF-1α hiljentäminen. Merkillistä, HIF-2α Knockdown myös parannettu β-kateniinin transkriptioaktiviteettia hypoksiaolosuhteissa soluissa, jotka näytetään normaali Wnt signalointia, mikä viittaa siihen, että geeni negatiivisesti moduloi kanoninen Wnt-signalointi koolonkarsinoomasoluissa. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että HIFs pelata vastakkaiset roolit kanoninen Wnt signalointia ja ovat välttämättömiä stemness ja maligniteetin ylläpito koolonkarsinoomasoluissa.

Citation: Santoyo-Ramos P, Likhatcheva M, García-Zepeda EA, Castañeda-Patlán MC, Robles-Flores M (2014) hypoksian indusoima tekijä moduloida Stemness ja pahanlaatuisuuden koolonkarsinoomasoluissa pelaamalla vastapäätä roolit Canonical Wnt Signaling. PLoS ONE 9 (11): e112580. doi: 10,1371 /journal.pone.0112580

Toimittaja: Gregory M. Kelly, Western University, Kanada

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2014; Hyväksytty: 08 lokakuu 2014; Julkaistu: 14 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Santoyo-Ramos et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että hyväksyttyjä syistä, jotkut pääsy rajoitukset koskevat tietojen taustalla havainnot. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM IN226111 ja IN215514) ja Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT CB2011-151731). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt signalointia on hyvin tunnettu, koska yksi merkittävimpiä tuumorigeneesiä monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Poikkeava kanoninen Wnt signaloinnin tiedetään osaltaan alussa etenemisen useimmissa peräsuolen syöpiä. Itse asiassa suuri määrä kokeellista näyttöä on osoittanut, että mutaatiot adenomatoottisen polypoosin coli (APC) -geenin toimivat portinvartijat molekyyli synnyssä enemmistön satunnaista ja perinnölliset muodot kolorektaalisyöpää [1], [2]. Wnt-polku on myös osoitettu olevan tärkeä rooli kehityksen ja sääntelyn aikuisten kantasolujen järjestelmiä, ja kanoninen Wnt signalointia tukee muodostumista ja ylläpitoa sekä varren ja syövän kantasolut (CSC) [3].

Canonical Wnt signalointia toimii kautta sääntelyn fosforylaatiota ja hajoaminen transkriptio koaktivaattoria β-kateniinin. Ilman stimulaatiota Wnt, β-kateniinin kootaan ns tuhoa kompleksi, jossa APC on keskeinen asema, ja tämä kompleksi sisältää myös ak- siini, GSK-3β ja Kaseiinikinaasi 1. Tämä kompleksi ohjaa sarja fosforylaation tapahtumia p-kateniinin, jotka tekevät siitä tavoite ubikinaation ja myöhemmin proteolyysin kautta proteasomista [4]. Stimulaatiosta Wnt johtaa eston β-kateniinin erittely, jolloin β-kateniinin kerääntyä, menevän tuman, ja aktivoi Wnt kohde- geenejä, kuten

sykliini D1

ja

C-MYC

proto -oncogenes, jotka edistävät pääsyn solusta S-vaiheen solusyklin [5].

Kasvaimen hypoksia ja kriittinen välittäjiä solujen hapen signalointireitin, eli hypoksian indusoima tekijä (HIFs) , tiedetään säännellä moniportaisuudesta kasvaimen kehittymisen ja liittyy yleensä muutoksia aineenvaihduntaan, uudissuonittuminen, invaasio, etäpesäke, lääkeresistenssin ja lopulta huono kliinisiin tuloksiin [6]. HIFs ovat heterodimeerisiä transkriptiotekijät koostuu HIF-α ja HIF-β (tai ARNT), jotka on ilmaistu konstitutiivisesti on transkription ja translaation tasolla. HIF-1α ja HIF-2α (tunnetaan myös nimellä EPAS1) ovat kaksi parhaiten tutkittu jäseniä HIF-α perheen. Under normoxic olosuhteissa HIF-α alayksikköä hydroksyloituu avain proliinitähteet, jonka avulla ne voivat tunnistaa von Hippel-Lindaun (pVHL) kasvain vaimentimella substraattitunnistus komponentti E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia, että tavoitteet HIF-α varten proteasomaalisten hajoamista. Hypoksinen signalointi stabiloi HIF-α estämällä prolyyli hydroksylaation, mikä puolestaan ​​ubikitiinipromoottori proteasomaalisten hajoamista, mikä HIF-α pystyy dimeroivalla kanssa ARNT, sitoutumisesta hypoksia-reagoiva DNA elementti, ja rekrytointi transkriptio koaktivaattoriproteiinin p300 /CBP varten transkription aktivoituminen lukuisia hypoksian reagoivien geenien [7].

Koska rakenteelliset samankaltaisuudet HIF-1α ja HIF-2α, luultiin toimimaan redundanttisesti soluvastetta hypoksiaan. Kuitenkin yhä useammat todisteet osoittavat, että HIF-1α ja HIF-2α indusoida erilaista geenejä. Vaikka HIF-1α ja HIF-2α jakanut tavoitteita kuten verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), ne säätelevät myös ainutlaatuinen geenikohteet; HIF-1α säätelee glykolyyttiset entsyymit [8] ja HIF-2α aktivoi kantasolujen tekijä Oct4 [9]. Tämän mukaisesti havainnon, Imamura et al. tunnistettu erillistä sarjaa HIF-1α ja HIF-2α kohdegeenien SW480 koolonkarsinoomasoluissa cDNA mikrosiruanalyysillä [10].

Ylikuuluminen on raportoitu välillä kanoninen Wnt signalointia ja HIF signaloinnin kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja tässä ylikuulumisen jäävät huonosti. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että toiminnan transkriptiotekijöiden säädellä hypoksian tärkeä rooli säätelyssä kantasolujen liikkumattomuus [9] ja että HIF-1α-välitteisen Wnt aktivointi edistää ylläpito kantasolujen toimintaa [11]. Mazumdar et ai. osoittivat, että HIF-1α moduloi Wnt /β-kateniinin signalointi hypoksisiin alkion kantasoluja tehostamalla β-kateniinin aktivointia ja ilmaus loppupään efektoreja LEF-1 ja TCF-1 [11]. Lisäksi on olemassa kokeellista näyttöä, joka tukee oletusta, että sekä hypoksinen olosuhteet ja kanonisen Wnt aktivointi osallistuvat laukaisemaan EMT ohjelmaa monissa syöpäsoluissa [12], [13]. Lisäksi ylikuulumisen on osoitettu välillä kanoninen Wnt signalointia ja HIF signalointi kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden kautta synergistinen vuorovaikutus Wnt kohdegeenin

c-MYC

kanssa HIF-1α [14], [15]. Tässä suhteessa, vaikka normaali fysiologinen HIF-1α vasteita ei-pahanlaatuisia soluja voidaan inhiboida normaalien c-Myc, paradoksaalisesti sääntelemättömään ilmentymiseen onkogeenisten c-Myc, joka on olemassa monissa syövissä, kuten kolorektaalisyövän toimii yhdessä HIF- 1α antaa kasvaimeen aineenvaihdunnan fenotyyppi kuvata Warburg vaikutus tai aerobinen Glykolyysivaiheen sekä edistää angiogeneesiä [14].

Nykyinen tietämys homeostaattisina mekanismeja, jotka säätelevät epiteelin paksusuolen stemness ja maligniteetin edelleen puutteellinen, estetään merkittävät edistysaskeleista hoidossa paksusuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia vakaa HIF-1α ja HIF-2α siRNA knockdovvn pahanlaatuisia fenotyyppiin huolto ja transkriptioaktiviteettia välittämä β-kateniinin. Tuloksemme osoittavat, että vaikka molemmat HIF-1α ja HIF-2α ovat välttämättömiä stemness ja maligniteetin ylläpito, nämä kaksi proteiinia käyttämään erilaisia ​​efektejä ja pelata vastakkaisia ​​rooleja kanoninen Wnt signalointia.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-aineet

seuraavia vasta-aineita käytettiin näissä kokeissa: allofykosyaniini-konjugoitu hiiren anti-CD44, hiiren anti-CD44, ja hiiren anti-CD24-BD Biosciences (San Jose, CA, USA); fykoerytriini (PE) -konjugoitu hiiren anti-CD133 päässä Miltenyi Bio- tec (Auburn, CA, USA); hiiren anti-HIF-1α, hiiren anti-HIF-2α, kanin anti-Oct4, Alexa 647-konjugoitua kanin anti-hiiri Cy3-konjugoitu vuohen anti-kani, ja hiiren anti-lamiini A /C Millipore (Bedford, MA ); kanin anti-β-tubuliinin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); biotiini-konjugoitu hiiren anti-CXCR4 R Hiiren anti-β-kateniinin, hiiren anti-sytokeratiini 20 (CK20), kanin anti-E-kadheriinin, kanin anti-Snail 1, hiiren anti-vimentiinista, kanin anti-GSK-3β, ja vuohen anti (p-Ser9) -GSK-3β Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); Alexa647-konjugoitua vuohen anti-kani-yhtiöltä Molecular Probes, Inc., (Eugene, OR, USA); ja allofykosyaniini-konjugoitua streptavidiinia päässä Biolegend (San Diego, CA, USA). Hiiren IgG1 ja IgG2b US Biologicals (Massachusetts, MA, USA) käytettiin sama konsentraatio kuin ensisijainen vasta-aine, kuten oli isotyyppiä valvonta immunofluoresenssivärjäyksellä ja virtaussytometria kokeissa. Anneksiini V FLUOS Värjäys Kit Roche Applied Science (Mannheim, Saksa) käytettiin havaitsemaan apoptoottisten ja nekroottisten solujen. Puromysiini antibiootti ja L-laktaattidehydrogenaasi saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kasvutekijä-vähennetty matrigeeliä matriisi ostettiin BD Biosciences. Kaikki muut kemikaalit olivat reagenssilaatua.

Plasmidit

pTOPFlash ja pFOPFlash toimittaja plasmidit saatiin Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). HRE-Luc reportteri saatiin Addgene (Plasmid 26731: HRE-lusiferaasi), voittoa organisaatio, jonka tarkoituksena on helpottaa plasmidin jakamisen tutkijoita. Ohjaus plasmidi koodaa sekoitetun shRNA sekvenssi saatiin Santa Cruz Biotechnology. Ohjaus (void plasmidi pSuper), HIF-1α, ja HIF-2α RNAi plasmidit olivat antelias lahja Dr. Daniel Chung, sekä niiden rakentaminen ja tehokkuutta olisi kuvattu aiemmassa raportissa [10].

Soluviljely

Kaikki syöpäsolulinjoilla ja ei-pahanlaatuisten 112CoN solulinja käytetään tässä hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Kaikki nämä solulinjat todennettu tammikuussa 2012 Short Tandem Toista DNA-profilointi suoritetaan Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) Mexico Cityssä.

Western blotting

Näytteet proteiinia (50 ug) erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), jota seurasi elektroforeettinen siirto nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), kuten on kuvattu aiemmassa raportissa [14]. Aktiinia vasta-ainetta käytettiin kontrolloimaan yhtä suuri kuormitus.

immunosaostus

Solut pestiin ja homogenisoitiin jääkylmässä pH 7,5 hajotuspuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100 ja proteaasi-inhibiittorien seos ja proteiinifosfataasi-inhibiittorit. Proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin käyttäen pesuaineiden kanssa yhteensopivissa proteiinin määritys (Bio-Rad). Alikvootit uutteisiin (1 mg /ml) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 2 ug /ml ensisijaisen vasta-aineen kanssa kevyesti ravistellen. Sitten 25 ui proteiini A-sepharose (30%, Calbiochem) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia. Immuunikompleksien pestiin sitten kahdesti puskurilla A (50 mM Tris-HCl ja 0,6 M NaCl, pH 8,3), jota oli täydennetty 0,1 mg /ml trypsiini-inhibiittoria ja 1 mM PMSF, ja kerran puskurilla B (50 mM Tris-HCI ja 0,15 M NaCl, pH 7,5), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit.

HIF-1α tai HIF-2α pudotus

indusoimiseksi vakaa hiljentämisen HIF-1α tai HIF-2α, solut transfektoitiin pSuper HIF-1α tai HIF-2α RNAi plasmidi, joka rakennettiin ja analysoitiin Dr. Daniel Chung kuvatun aiemman raportin [10], tai ohjaus- plasmidilla (koodaa salattu shRNA sekvenssi tai pSuper mitätön plasmidi) käyttämällä Lipofectamine 2000 . Tavoitteena on tuottaa vakaa transfektioissa solut transfektoitiin joko 1 ug valvonnan plasmidin tai 1 ug pSuper HIF-1α RNAi tai HIF-2α RNAi plasmidit. Stabiilit transfektantit valittiin 3 ug /ml puromysiiniä (Sigma) neljän viikon ajan, ja kloonit valikoitiin ja seulottiin HIF-1α tai HIF-2α hiljentäminen virtaussytometrialla.

FACS-analyysi

solut irrotettiin ja hajotettiin 10 mM EDTA-liuosta. Solususpensio pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, jota oli täydennetty 4% vasikan sikiön seerumia (FCS) (värjäyspuskuria), värjättiin vastaavan primaarisen vasta-aineen, ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen. Solut värjättiin sekundäärisellä vasta-aineella yksinään, käytettiin negatiivisena kontrollina. Ydin- värjäys, tumat puhdistettiin solusta näytteistä käyttäen Nuclei Isolation Kit (Sigma-Aldrich) val- mistajan ohjeiden mukaisesti. Tumat pestiin, kiinnitettiin, permeabilisoitiin, tukossa, ja leimattiin anti β-kateniinin ja Alexa 647-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aineen värjäyspuskurilla. Negatiivisena kontrollina, ytimet ylläpidetään erillisissä putkissa seulottiin rinnakkain Alexa 647-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aine. Lopullisen pesun jälkeen, tumat kiinteä ja analysoitiin virtaussytometrialla.

laktaatti mittaus määrityksessä

Laktaatin määrä syöpäsolujen eritetään elatusaineeseen mitattiin käyttäen entsymaattista määritystä, jossa käytetään L laktaatti dehydrogenaasi (Sigma). Tässä määrityksessä, laktaatti eritetään elatusaineeseen näyte pelkistetään pyruvaatiksi ja NADH: n läsnä ollessa (LDH) (Sigma) ja ylimäärä NAD. Määrä NADH reaktiossa muodostuneen, mitataan absorbanssin muutos 340 nm: ssä, on verrannollinen pitoisuuteen laktaatin läsnä näytteessä. Häiriön välttämiseksi LDH, jotka voivat olla jo läsnä seerumin käyttää täydentämään viljelyväliaineeseen, näytteet altistettiin deproteinisoimalla 8% trikloorietikkahappoa (TCA), että ne ovat proteiini-free ennen määritystä.

Apoptosis

SW480 ohjaus tai HIF-1α tai HIF-2α-vaiennetaan-solut ympättiin 24-kuoppalevyille tiheydeksi 1,5 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä apoptoosin indusoija H

2O

2 (1 mM) 12 tuntia. Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä käyttämällä anneksiini V-FITC Kit (Roche), kuten valmistajan suosittelemia ohjeita. Kuolio mitattiin propidiumjodidi (PI) läpäisevyys ilman pesuainetta. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin virtaussytometrialla.

Haavan paranemista määrityksessä

Ohjaus tai HIF-1α- tai HIF-2α-vaimennettu SW480-solut ympättiin yhtenäisiksi päälle poly-L- lysiini päällystetty dioja DMEM F12 täydennetty 5% FBS. 24 tunnin kuluttua, naarmu tuotettiin käyttämällä steriiliä pipetin kärkeä. Viljelmiä pestiin PBS: llä. Tänä ajankohtana (t = 0 h), haavan marginaalien valokuvattiin. Soluja viljeltiin sitten väliaineessa, jota oli täydennetty 0,05% FBS: ää jopa 72 tuntia, ja haavan marginaalien valokuvattiin eri ajankohtina.

Migration määrityksessä

kemotaktinen vastaus stroomasolujen -johdannainen tekijä-1α (SDF-1α) ja HIF-1α ja HIF-2α-vaiennetaan ja ohjaus solut arvioitiin käyttämällä Boyden kammiot (3 um huokoskoko). Yhteensä 1 x 10

5 solua lisättiin yläosaan kammion, ja alaosa kammion sisältämän SDF-1α (200 ng /ml 0,05% FBS). Saadakseen absoluuttinen määrä vaeltavien solujen virtaussytometria laskee kullekin näytteelle saatiin vakio, ennalta määrätty tilavuus ja sitten verrataan kahtena virtaussytometristen laskee saatu kontrollikuoppiin.

Vieraslajisiirteen kasvainmuoto

Valitut kloonit vakaa ohjaus-, HIF-1α- tai HIF-2α-transfektoidut solut valittiin ja seulottiin virtaussytometrialla määrittää HIF-1α ja HIF-2α hiljentäminen tehokkuutta verrattuna kontrolli soluihin. Solut näyttää korkeimman knockdown hyötysuhde viljeltiin ja käytettiin ksenotransplantaatioon heikentynyt immuunivaste hiiriin. Kunkin injektiokohdassa, 1 x 10

6 HIF-1α- tai HIF-2α-vaimennettu solut suspendoitiin uudelleen korkea pitoisuus Matrigel (BD Biosciences), laimennettiin PBS: ään lopulliseen pitoisuuteen 50% ja ihon alle (sc ) ruiskutetaan kyljet kuuden viikon ikäisten nude-hiiriin (n = 5). Jokainen hiiri injektoitiin yläkulmassa oikeaan kylkeen kanssa säätökennoja, pohjaan oikeaan kylkeen kanssa HIF-1α-vaiennetaan soluja, ja pohjaan vasempaan kylkeen HIF-2α-vaiennetaan soluissa.

vieraskudossiirteet käyttäen CD44

– /CD133

– tai CD44

+ alapopulaatioista, solut saatiin SW480 pysyvästi transfektoitujen solujen valvontaa pSuper plasmidilla tai pSuper HIF-1α tai HIF-2α RNAi FACS-solujen lajittelua. Puhdistettu osapopulaatioiden kullekin tilalle kerättiin trypsinoimalla. Sitten 1 x 10

4 solut injektiokohtaa kohti suspendoitiin uudelleen kasvutekijän vähennetty matrigeeliä matriisi, laimennettiin PBS: ään lopulliseen pitoisuuteen 50% ja s.c. ruiskutetaan kyljet kuuden viikon ikäisten nude-hiirissä. Kukin hiiri (n = 5 kussakin ehto) injektoitiin oikeaan kylkeen kanssa CD44

– /CD133

– soluja ja vasempaan kylkeen kanssa CD44

+ solujen puhdistettu kustakin ehto (ohjaus, HIF- 1α knockdown tai HIF-2α knockdown). Neljä viikkoa (ja RKO tai SW480 peräisin olevat solut) tai kahden viikon kuluttua (ja SW620 peräisin olevat solut) istutuksen jälkeen eläimet tapettiin ja tuumorit poistettiin ja punnittiin.

transfektio ja lusiferaasin reportterigeenimäärityksessä

solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 1,2-1,8 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Kaksikymmentäneljä tuntia ymppäyksen jälkeen solut pantiin seerumittomassa elatusaineessa ja transfektoitiin 1 ug: lla reportteriplasmidi (pTOPFlash) tai kontrolli-plasmidi (pFOPFlash) ja 0,05 ug PRL lusiferaasiplasmidin tai CMV-GFP-plasmidin (transfektio kontrolli). Lusiferaasireportteri aktiivisuus solulysaateista mitattiin 24 h transfektion jälkeen käyttäen Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA). Aktiivisuus oli normalisoitu suhteessa aktiivisuuteen

Renilla

lusiferaasin tai suhteessa proteiinipitoisuus kussakin näytteessä.

Immunofluoresenssianalyysi

SW480 ohjaus tai HIF-1α- tai HIF-2α knockdown soluja kasvatettiin coverslip. Solut kiinnitettiin, läpäiseviksi ja yhteistyö immunovärjättiin vasta-aineiden β-kateniinin, E-kadheriinin, vimentiinistä ja Snail 1. fluoresenssi analysoitiin laser- konfokaalimikroskopiaa kuten kuvattu aiemmassa raportissa [16]. β-kateniinin ja vimentiinin visualisoitiin Alexa 647-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta, ja E-kadheriinin ja Snail 1 visualisoitiin Cy3-konjugoitu vuohen anti-kani-vasta-aine. Solu Fluoresenssi kuvattiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Leica TCS SP5) ja krypton argon laser. Kontrollinäyte soluja värjättiin sekundaarisen vasta-ainetta ainoastaan ​​vahvistaa, ettei fluoresenssisignaalisuhteet havaittu näistä soluista.

Ethics selvitys

Kaikki eläimet käsiteltiin tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntöjä määrittelemän Animal Experimental Bio-Ethics Guidelines Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México. Lisäksi kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Animal Experimental bioetiikkaneuvoston n lääketieteellisen tiedekunnan Universidad Nacional Autónoma de México. Milloin on osoitettu, hiiret lopetettiin CO

2.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastotiedot analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

testiä tai yksisuuntaisen-ANOVA Tukeyn monivertailutestillä. Arvoa p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

HIF-1α ja HIF-2α ilmentyvät koolonkarsinoomasoluissa mutta ei ei-pahanlaatuisia soluja happiolosuhteissa

Hypoksia on yleinen sairaus havaitaan monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, ja HIF yli-ilmentyminen liittyy usein etäpesäkkeitä ja huono kliinisiä tuloksia.

In vivo

, hypoksia on myös todennäköisesti toimiva osaa tavanomaisesta kantasolujen markkinarako. Kuitenkin merkitys hypoksia CSC huolto vielä tunneta laajalti [17]. Koska korkea HIF ilmentymistä on havaittu kasvainsoluissa ilman hypoksia, vertasimme ilmentymistä näiden tekijöiden viljellyissä paksusuolen syövän soluja normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa, joissa viljeltiin ei-pahanlaatuisten 112CoN solut, jotka inkuboitiin samoissa olosuhteissa Western blot . Tulokset on esitetty kuviossa 1 osoittavat, että kuten odotettua, hypoksia (3% O

2) indusoi ilmentymistä sekä HIF-1α ja HIF2-α sekä normaaleissa (112CoN) ja syöpäsolujen; kuitenkin alle normoxic viljelyolosuhteet (20% O

2), ainoastaan ​​koolonkarsinoomasoluissa koekspressoi sekä HIF-1α ja HIF-2α, kun taas ei-pahanlaatuiset 112CoN solut eivät ilmaista nämä tekijät alla happiolosuhteissa.

Normaali paksusuolen (112CoN) tai paksusuolensyöpä soluja viljeltiin normoksia (20% O

2) tai hypoksian (3% O

2) 12 tuntia. Yhteensä solu-uutteita paksusuolen solulinjat valmistettiin ja näytteet altistettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Immunoblot-analyysi suoritettiin käyttäen anti-HIF-1α tai anti-HIF-2α-vasta-aineita, kuten kuviossa on esitetty, ja kehitettiin käyttäen piparjuuren peroksidaasi-konjugoitua toista vasta-ainetta. Aktiini vasta-ainetta käytettiin ohjaamaan samasta lastaus. Densitometrinen analyysi tehtiin arvioida tasot HIF-1α ja HIF-2α ilmaisu, joka normalisoitiin vastaavaan ekspressiotasot ei-pahanlaatuisten 112CoN soluja. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen määrityksissä. * P 0,05.

Stable knockdovvn HIF-1α mutta ei HIF-2α pienenee laktaatintuotto koolonkarsinoomasoluissa alle happiolosuhteissa

Ymmärtää roolit HIFs syövässä fenotyypin ylläpito ja niiden mahdollinen vuorovaikutus kanoninen Wnt signalointia selvitimme vaikutuksia vakaa knockdovvn HIF-1α ja HIF-2α by siRNA SW480-soluissa, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen kanoninen Wnt signalointia. Plasmidit tässä tutkimuksessa käytetyt rakennettiin ja aiemmin menestyksellisesti koetettiin Dr. Daniel C. Chung [10], joka ystävällisesti lahjoitti plasmidit meille. SW480-soluja transfektoitiin kontrolli salatun shRNA plasmidi, pSuper HIF-1α RNAi tai pSuper HIF-2α RNAi. Stabiilit transfektantit valittiin käyttäen antibiootti neljä viikkoa, ja kloonit valikoitiin ja seulottiin virtaussytometrialla HIF-1α ja HIF-2α hiljentäminen verrattuna kontrollisoluihin. Vakaa transfektantteja näytteille laskua vähintään 85%: in HIF-1α ilmaisun ja lasku on vähintään 90%: in HIF-2α ilmentyminen saatiin ja valittujen virtaussytometrialla, kuten on esitetty kuviossa 2A. Syöpäsolut osoittavat lisääntynyttä Glykolyysivaiheen ja laktaatin tuotanto ja supistui O

2 kulutusta verrattuna ei-transformoitujen solujen, ilmiö tunnetaan nimellä Warburg vaikutus [18]. Yhdenmukainen tämä vaikutus, kuvio 2B osoittaa, että merkittävä kasvu laktaatintuotantovaiheessa näkyi SW480 ja RKO koolonkarsinoomasoluissa verrattuna ei-pahanlaatuisten 112CoN paksusuolen soluja. Sitten tutkittiin vaikutuksia vakaa hiljentäminen kunkin HIF on laktaatintuotto SW480 syöpäsolujen alla normoksia tai hypoksiaa. Kuten havaitaan kuviossa 2C, vakaa knockdovvn HIF-1α in SW480-soluissa vähensi laktaatintuotto vähintään 50% kontrolliin verrattuna soluja happiolosuhteissa, kun taas HIF-2α Knockdown vain johti 20% lasku laktaatti eritys verrattuna kontrolli solut samoissa olosuhteissa (kuvio 2B). 12 h kuluttua altistumisen akuutin hypoksian, tasot HIF proteiinien olivat koholla, ja tasot laktaatin talteen (kuvio 2C). Siten vältetään HIF yli-ilmentymisen, joka voisi ohittaa taintumisen hyötysuhde (kuvassa S1) ja vaikeuttavat leikellä roolia kukin HIF ylläpidossa pahanlaatuinen fenotyyppi, päätimme suorittaa useimmat analyysit alle happiolosuhteissa.

A). Vakaa HIF-1α- tai HIF-2α-taintumisen tai ohjaus (salattu shRNA plasmidi) transfektantit saatiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. Valitut kloonit seulottiin virtaussytometrialla arvioida vaiennettaisi HIF-1α ja HIF-2α verrattuna kontrolli soluihin. B). Laktaatti eritys lisääntyi merkittävästi kolorektaalisyövässä solulinjoissa verrattuna ei-pahanlaatuisia 112CoN soluissa. C). Muutokset laktaatti eritystä HIF-1α- tai HIF-2α- vaiennettu SW480-soluissa verrattuna ohjaus solujen (Ctr kuvassa) viljeltiin normoksia (20% O

2) tai hypoksia (3% O

2) 24 tuntia. L-laktaatti määritettiin jota LDH entsymaattisella määrityksellä, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät”. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen määrityksissä. *: P 0,05.

Stable knockdovvn HIF-1α tai HIF-2α tuotettu kasvua pohjapinta tai H

2O

2 aiheuttaman apoptoosin SW480 koolonkarsinoomasoluissa

on hyvin tunnettua, että HIF-1α edistää solujen eloonjäämistä ja apoptoosiresistenssiin useassa solussa järjestelmissä hypoksiaolosuhteissa. Me tutkimme, saarto HIF-1α tai HIF-2α ilmentymistä syöpäsoluissa, jotka ilmentävät sekä tekijöihin normoksia vaikuttaa myös solujen eloonjäämistä. Käytimme vetyperoksidi aiheuttaa akuutin apoptoosin, koska se on laajalti raportoitu olevan voimakas apoptoosin indusoija syöpäsoluissa, koska tuotannon vakavan oksidatiivisen stressin. HIF-vaimennettu SW480-soluja käsiteltiin 1 mM H

2O

2: ssa 12 h, ja sitten aste solujen apoptoosi määritettiin anneksiini V-PI värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysi. Sekä apoptoosin ja kuolion parannettiin alle normoksia seurauksena HIF-1α tai HIF-2α hiljentäminen kontrolliin verrattuna soluihin, jopa ilman, että apoptoosin indusoija (yläosa kuviossa 3). Kuitenkin osuus apoptoottisten ja nekroottisten solujen tuloksena saatu HIF-1α hiljentäminen oli suurempi kuin se, minkä indusoivat HIF-2α pudotus suhteessa kontrolleihin, ja tämä vaikutus oli ilmeistä, kun soluja käsiteltiin 12 h 1 mM H

2O

2 (kuva 3). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että HIFs, erityisesti HIF-1α, ovat mukana edistämiseen solujen eloonjäämistä ja kestävyys apoptoosin.

Apoptoosi indusoitiin viljelemällä HIF-vaimennettu tai ohjaus (transfektoitu salattu shRNA plasmidi ja osoitettu kuviossa kun Ctr) solujen puuttuessa tai läsnä on 1 mM H

2O

2 12 tuntia. SW480-soluja käsiteltiin trypsiinillä, pestiin kahdesti PBS: llä, ja käsittelemättömiin (vehikkeli) tai käsiteltiin H

2O

2: ssa 12 h. Viljelmät värjättiin anneksiini V: n ja PI, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena (edustaja histogrammin tiedot on esitetty), ja kaavio esittää keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta; *: P 0,05; **: P 0,01.

Stable knockdovvn HIF-1α tai HIF-2α pienentynyt solun migraatio SW480 syöpäsoluja, mutta vain HIF-1α pudotus vaikuttaa rankasti CXCR4 välittämän kemotaksista

Suoritimme arpeutumisprosessit määrityksiä tutkimaan vaikutuksia näiden proteiinien on solujen vaeltamiseen. Vakaa HIF-1α- tai HIF-2α-vaiennetaan soluja kasvatettiin normoksia yhtenäiseksi, ja sitten naarmuja tehtiin yksikerroksista. Kuvia naarmut vangittiin 0 ja 48 tuntia, ja tyhjästä alue analysoitiin näissä ajankohtina. Kuten voidaan havaita kuviossa 4A, verrattuna kontrolleihin, muuttoliikettä esti knockdovvn HIF-1α tai HIF-2α (katso viite raja linjat piirretään kuvia). Lisäksi arvioinnin solumigraatiota perustuu kemotaktinen aktiivisuus SDF-1α, jota välittää CXCR4-reseptorin osoitti, että CXCR4: ää ilmentyminen väheni seurauksena HIF-1α, mutta ei HIF-2α pudotus (kuvio 4B). Tämän mukaisesti havainnon, vaiennettaisi HIF-1α ilmaisu lähes poisti SDF-1α- CXCR4 välittämää kulkeutumista syöpäsolujen kautta TranswellTM kammioiden, kun taas vaiennettaisi HIF-2α ilmaisu laski migraatiota ainoastaan ​​45% suhteessa valvonnan (kuvio 4C).

A) haavan paranemista määritystä käytetään määrittämään, onko solujen siirto on riippuvainen joko HIF-1α tai HIF-2α ilme. SW480 pudotus ja ohjaus (salattu shRNA plasmidi), soluja kasvatettiin konfluenssiin 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille, ja haava-parantava määritys suoritettiin, kuten on kuvattu kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. Naarmuuntuneet alue kuvattiin heti haavoittaen (aika 0) ja 48 h jälkeen haavoittaen. Nämä kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. B) CXCR4 ilmaus pieneni seurauksena HIF-1α knockdown. SW480 ohjaus tai vaiennettu soluja, kuten kuvassa, irrotettiin käyttäen EDTA: ta ja pestään, ja 1 x 10

5 soluja inkuboitiin hiiren biotiinikonjugoitua anti-CXCR4 ja allofykosyaniini-konjugoitua streptavidiinia vasta-aineella ja tutkittiin virtaussytometrialla. Tiedot osoittavat mediaani fluoresenssivoimakkuudet CXCR4 ilmaisun ja SSC (sivulle sironnut valo, verrannollinen solun rakeisuus), ja ne edustavat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *: P 0,05; **: P 0,01. C) Merkittäviä eroja havaittiin SDF-1α aiheuttama kemotaktinen vaste. Kemotaksista vaste SDF-1α ja HIF-1α- tai HIF-2α-Knockdown tai ohjaus soluja (Ctr kuvassa) arvioitiin käyttämällä Boyden kammioita kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. Soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan, jotta muuttoliikettä ja talteen käyttämällä EDTA. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM kolmesta kokeesta, jotka suoritettiin kahtena kappaleena. *: P 0,05; **: P 0,01.

Stable vaiennettu HIF-1α tai HIF-2α pienensi in vivo tuumorigeenisen aktiivisuus Siirto tehty koolonkarsinoomasoluissa

vaikutus vakaa siRNA-