Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteiini tyrosiinikinaasi-7 (PTK7) on katalyyttisesti aktiivinen reseptori tyrosiinikinaasin (RTK). PTK7 esiintyminen lisääntyy monissa yleisissä ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen syöpä, keuhkosyöpä, mahasyöpä ja akuutti myelooinen leukemia. Syy tähän ylössäätöä ei ole vielä tiedossa. Tutkitaan toiminnallista roolia PTK7, ilmaus PTK7 HCT 116-soluissa tutkittiin käyttäen pientä häiriötä (siRNA) -välitteisen geenien. Transfektion jälkeen siRNA onnistuneesti tukahdutti PTK7 mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Kaatamalla of PTK7 HCT 116 soluissa estivät solujen lisääntymistä verrattuna kontrolliryhmiin ja indusoi apoptoosin. Lisäksi tämä apoptoosi ominaista alentunut mitokondrion kalvon potentiaalia ja kaspaasi-9 ja -10. Lisäksi on kaspaasi-10-estäjä täysin estetty tämän apoptoosin, mikä viittaa siihen, että kaspaasi-10 voi olla kriittinen rooli PTK7-pudotus-indusoitua apoptoosia alavirtaan mitokondrioita. Nämä havainnot saattavat osoittaa rooli PTK7 soluproliferaatioon ja solujen apoptoosia, ja se voi tarjota mahdollisia terapeuttisia koulutusjakson hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä.

Citation: Meng L, Sefah K, O’Donoghue MB, Zhu G, Shangguan D, Noorali A, et al. (2010) vaiennettu PTK7 Colon Cancer Cells: Caspase-10-riippuvaista apoptoosia kautta mitokondrioiden Pathway. PLoS ONE 5 (11): e14018. doi: 10,1371 /journal.pone.0014018

Editor: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 28 lokakuu 2010; Julkaistu: 16 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH), Agency # R01GM066137 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t) muodostavat luokan transmembraanisen signalointi proteiineja, jotka välittävät solunulkoisia signaaleja solun sisään. Misregulation RTK: iden tärkeä rooli kehityksessä ja /tai etenemisen monien syöpäsairauksien [1]. Proteiini tyrosiinikinaasi-7 (PTK7), joka tunnetaan myös paksusuolen karsinooma kinaasi-4 (CCK4), on suhteellisen uusi ja vähän tutkittu jäsen RTK superperheen. Se sisältää solunulkoisen domeenin, jossa on seitsemän immunoglobuliinin kaltaisesta silmukasta, transmembraanidomeeni, ja katalyyttisesti aktiivinen tyrosiinikinaasidomeeniin [2], [3]. Kuitenkin seurauksena aminohapon substituutio katalyyttisen domeenin sisällä, PTK7 on pseudokinase ilman havaittavaa katalyyttinen tyrosiini- kinaasiaktiivisuutta [1], [4]. Se tunnistettiin alun perin geeni ilmentyy paksusuolensyöpä johdettu solulinja, mutta sitä ei ole ilmaistu aikuisen ihmisen paksusuolen kudoksiin [2]. Sitä vastoin korkea PTK7 ilmentymisen nähdään hiiren sikiöstä kaksoispisteet [1], [2], [4]. Ilmaus PTK7 on säädelty monissa yleisissä ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen syöpä, keuhkosyöpä, mahasyöpä ja akuutti myelooinen leukemia [2], [5], [6], [7], [8], [9] . Äskettäin PTK7 tunnistettiin uutena säätelijänä kaanoniin WNT tai tasomainen solun polariteetti (PCP) signalointi [10], [11]. PTK7 näyttää myös tärkeä rooli putken muodostumiseen, muuttoliike, hyökkäys endoteelit ja angiogeneesin HUVEC-soluissa [12]. Kuitenkin toiminnallista roolia PTK7 soluproliferaatioon ja apoptoosiin on edelleen epäselvä.

Aptotosis on ohjelmoidun solukuoleman, tyypillisesti välittää perheen kysteiiniproteaasien tunnetaan kaspaasien [13]. Kaspaasit syntetisoidaan inaktiivisina proentsyymejä joko pitkä (kaspaasi-8, -9 ja -10) tai lyhyt (kaspaasi-3, -6 ja -7) prodomeenille [14], [15]. Jälkimmäiset proteaasit pilkkovat joukon keskeisiä solunsisäisiä proteiineja johtavat solukuolemaan [16].

Kaksi keskeistä apoptoosin väyliä on tunnistettu. Sisäisen reaktiotien (mitokondrioita reitti) liittyy lasku mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamaan sytokromi

c

[17], joka aktivoi kaspaasi-9 kautta apoptosome. Sitten, kaspaasi-9 aloittaa proteolyyttisten kaspaasi Cascade joka tappaa soluja. Ulkoista reitti (kuoleman reseptori reitti) liittyy tuumorinekroositekijän (TNF) reseptorin superperheen. Vastauksena TNF-ligandin sitoutumisen, nämä kalvo-reseptorit rekrytoida sovitin molekyylejä ja aktivoi kaspaasi-8 kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC). Aktivoitu kaspaasi 8 joko suoraan aktivoi alavirran efektorin kaspaasit, kuten kaspaasi-3, tai yhdistää sisäisen reaktiotien pilkkomalla BCL-2 Interacting Domain (Bid) ja katkaistu Bid (tBid) [18].

kaspaasi-10-geeni on kytketty kaspaasi-8-geenin ihmisen kromosomin lokuksen 2q33-34 [19]. Kuitenkin fysiologiasta kaspaasin 10 yhä puutteellisia, vaikka sillä arvellaan olevan tärkeä rooli kuoleman reseptorin kautta. Kaspaasi-10 on myös raportoitu voidaan aktivoida alavirtaan mitokondriot sytotoksisen lääkkeen aiheuttama kasvainsolujen apoptoosin [20]. Hankitut inaktivoivat mutaatiot kaspaasi-10 on havaittu kasvainsolujen potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia, [21], [22], [23]. Äskettäin kaspaasi 10 osoitettiin rooli indusoiman apoptoosin paklitakseli, syöpälääkkeen kautta Fas liittyvä proteiini Death Domain (FADD): sta riippuva mekanismi [24].

Termi RNA-interferenssi (RNAi) käytti ensimmäisenä palo

et al.

[25] työssään

Caenorhabditis elegans

. RNAi on solujen mekanismi, jolla pieni häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) (19-23 nukleotidia) käynnistää hajoamisen spesifisten mRNA [25], [26]. On osoitettu, että siRNA: t voidaan hiljentää sukulais-geenin ilmentymisen kautta RNAi-reitin nisäkässoluissa [27]. Ominaisuudet RNAi, kuten tiukat kohde-geenin spesifisyyden ja yksinkertaisuus suunnittelu ja testaus [28], ovat suuresti laajentanut mahdollisuuksia mekaaniset tutkimukset proteiinien, sekä hoitomenetelmiä sairauksien hoitoon, kuten syövän [29], [30 ].

tässä tutkimuksessa siRNA kohdistaminen ihmisen PTK7 mRNA käytettiin maksimaalisen eston PTK7 ilmaisun jotta koetin roolin PTK7 vuonna apoptoosin ja leviämisen. Kaatamalla PTK7 HCT 116 soluissa estivät solujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia. Lisäksi tämä apoptoosi ominaista alentunut mitokondrion kalvon potentiaalia ja kaspaasi-9 ja -10. Lisäksi on kaspaasi-10-estäjä täysin estetty tämän apoptoosin, mikä viittaa siihen, että kaspaasi-10 voi olla kriittinen rooli PTK7-pudotus-indusoitua apoptoosia alavirtaan mitokondrioita. Siksi nämä havainnot voi ilmoittaa rooli PTK7 soluproliferaatioon ja solujen apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

McCoyn 5A media ostettiin ATCC; naudan sikiön seerumia (FBS) (lämmöllä inaktivoitu) hankittiin GIBCO, ja penisilliini-streptomysiiniä hankittiin Cellgro. Micro-FastTrack 2,0 Kit ostettiin Invitrogen. Kolorimetrinen bromideoksiuridiinia (BrdU) pakki oli BD Pharmingen. IScript One-Step RT-PCR Kit SYBR Green oli Bioradilta. Proteaasiestäjäseostabletit (4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli (AEBSF), E-64, bestatiinia, leupeptiiniä, aprotiniini, ja natrium-EDTA) ja 0,4% trypaanisinisellä olivat Sigma. Proteiini iinianalyysikitissä oli Bio-Rad. Vasta-aineita kaspaasi-9 ja β-aktiini olivat Cell Signaling Technology. Vasta-ainetta kaspaasi-10 oli Milliporesta. Vasta-aine PTK7 oli peräisin Abnova. Vuohen anti-hiiri-IgG HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja vuohen anti-kani IgG HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ostettiin Cell Signaling Technology. Vybrant Apoptosis Assay Kit # 2, 4 x NuPAGE LDS näytepuskuria, 4-12% NuPAGE Bis-Tris geeleillä, 20 x NuPAGE MOPS SDS-ajopuskuria, ja 20 x NuPAGE siirtopuskuriliuoksessa olivat Invitrogen. Immobilon-P siirto kalvo oli Milliporesta. SuperSignal West Dura Extended-Kesto Alustan ja palautus sekä Western blot kuoriminen puskuri olivat Thermo Scientific. Röntgenfilmit olivat ISCBioExpress. JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi) hankittiin AnaSpec. Kaspaasi-9-estäjä (Z-LEHD-FMK), kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD-FMK), kaspaasi-8-estäjä (Z-IETD-FMK), kaspaasi-perheen estäjä (Z-VAD-FMK), caspase- 1-estäjä (Z-YVAD-FMK), kaspaasi-10-estäjä (Z-AEVD-FMK) ja kaspaasi-2-estäjän (Z-VDVAD-FMK) hankittiin BioVision. Kaspaasi-10 Fluorometric Proteaasin Assay Kit oli Millipore.

Cell Culture

HCT 116 (paksusuolisyöpä) -solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA) ja pidettiin kudosviljelmässä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. p53-null HCT 116 solua saatiin Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center). Soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (lämmöllä inaktivoitu) ja 100 IU /ml penisilliiniä-streptomysiiniä.

RNA-interferenssi

HiPerFect transfektioreagenssia, HP- validoitu siRNA spesifinen PTK7, nimeltään PTK7 siRNA (sense: 5′-CGGGATGATGTCACTGGAGAA-3 ’), ja epäspesifinen siRNA (AllStars negatiivinen kontrolli siRNA) hankittiin Qiagen. HCT 116-solut transfektoitiin siRNA: lla, jonka HiPerFect transfektioreagenssia. Päivänä 1, solut eksponentiaalisen kasvun vaiheessa kerättiin ja suspendoitiin kasvualustaan. Solut jaettiin neljään ryhmään ja käsiteltiin PTK7 siRNA, epäspesifisen siRNA negatiivisena kontrollina, HiPerFect ajoneuvon vain, tai jätettiin hoitamatta. Kutakin transfektiota varten 500 ui solususpensiota transfektoitiin 25 nM siRNA käyttämällä 4 ui transfektioreagenssia 24-kuoppaisilla levyillä. Soluja pidettiin normaaleissa viljelyolosuhteissa ja kerättiin 2, 3 tai 4 päivää transfektion jälkeen analyysiä varten.

Virtaussytometrinen analyysi

transfektion jälkeen siRNA: illa, kuten edellä on kuvattu, solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja laskettiin hemosytometrillä. Alikvootit 5 x 10

5-soluja inkuboitiin ylimäärän phycoerythring (PE) -leimattua anti-PTK7 200 ui: aan sitoutumispuskuria (PBS, joka sisälsi 5 mM MgCI

2, 4,5 mg /ml glukoosia, 0,1 mg /ml hiivan tRNA: ta, 1 mg /ml BSA: ta ja 20% FBS: ää), jäillä 30 minuutin ajan. Sitten solut pestiin kahdesti 1 ml: aan sitoutumispuskuria ja suspendoitiin 0,3 ml: aan sitoutumispuskuria. Fluoresenssi määritettiin FACScan-sytometrillä (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). PE-leimattu anti-IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä mRNA soluista, käsiteltiin erilaisilla siRNA: t uutettiin Micro-FastTrack 2,0 Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden . Reaaliaikainen PCR suoritettiin mRNA: ta (50 ng) kanssa iScript One-Step RT-PCR Kit käyttämällä SYBR Green Biorad iCycler. Kaikki reaktiot suoritettiin 50 ul: tilavuus kolmena kappaleena. Alukkeet ihmisen PTK7 hankittiin Qiagen (QT00015568). PCR-parametrit olivat seuraavat: 50 ° C: ssa 30 min, 5 min Taq-aktivaation 95 ° C: ssa, jota seurasi 45 PCR-sykliä: 95 ° C x 30 s, 57 ° C x 60 s, ja 72 ° C x 60 s. Suhteellinen määrä kohde-mRNA normalisoitiin GAPDH mRNA. Spesifisyys varmistettiin sulamiskäyräanalyysillä. Keinot ja keskivirheet vähintään kolme toistoa kunkin kokeen lasketaan. Merkittävyys määritettiin t-testiä, ap value≤0.05 merkitty tähdellä.

Cell Number havaitseminen trypaanisinieksluusiolla Pitoisuus

Neljän päivän kuluttua hoidosta, solususpensiot valmistettiin trypsinoimalla, ja solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: ssa väliainetta. 25 ui solususpensiota, 25 ui 0,4% trypaanisinistä, lisättiin, ja solut laskettiin hemosytometrillä.

proliferaatiotestillä

Solujen proliferaatio tutkittiin käyttäen kolorimetristä bromideoksiuridiinia (BrdU ) kit mukaan valmistajan ohjeiden. Ensimmäinen, solut transfektoitiin siRNA. 48 tunnin kuluttua hoidon, 10 uM BrdU lisättiin väliaineeseen. Väliaine heitettiin pois 2 tunnin kuluttua, ja solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin BD Cytofix /Cytoperm puskuri 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Poistamisen jälkeen Cytofix /Cytoperm puskuri, soluja inkuboitiin 100 ui laimennettua DNaasia (laimennettu 300 ug /ml PBS: ssä) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa paljastus on sisällytetty BrdU. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 50 ui BD Perm /Wash Buffer sisältävät laimennettiin FITC-leimatun anti-BrdU ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi soluja inkuboitiin 20 ui 7-AAD ratkaisu. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla. Keinot ja keskivirheet vähintään kolme rinnakkaisnäytettä kustakin kokeessa laskettiin. Merkitsevyys määritettiin t-testillä; ap value≤0.05 on merkitty tähdellä.

anneksiini V /propidiumjodidia Double-värjäys Pitoisuus

anneksiini V /propidiumjodidia (PI) double-värjäys suoritettiin käyttäen Invitrogen Vybrant Apoptosis Assay Kit # 2. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS-puskurilla ja sentrifugoitiin 900 rpm: ssa 3 minuutin ajan. Pelletit suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin tiheydellä 10

6 solua /ml. Näyte (100 ui) oli kaksinkertainen-värjätty 5 ui anneksiini V /Alexa Fluor 488 ja 2 ui 100 ug /ml PI. Kun oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 15 minuuttia, 400 ui: aan sitoutumispuskuria lisättiin, ja solut analysoitiin virtaussytometrialla.

Western blot analyysit

jälkeen HCT 116 -solut transfektoitiin PTK7 siRNA varten 12 h, 24 h, 30 h, ja 48 h, koko solut kerättiin ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Sitten solut hajotettiin radioimmunosaostuksella puskurissa (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, ja 2 mM EDTA) läsnäollessa proteinaasi inhibiittoricocktailia 20 minuutin ajan jäillä. Lysaatit sentrifugoitiin 14000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä. Viisikymmentä mikrogrammaa supernatanttia proteiinien sekoitettiin 4 x NuPAGE LDS-näytepuskuria ja kuumennettiin 70 ° C: ssa 10 min. Proteiinit erotettiin 4-12% NuPAGE Bis-Tris geeleillä 1 x NuPAGE MOPS-SDS-ajopuskuria ja sitten sähköllä PVDF siirto kalvo NuPAGE siirtopuskurina 50 V: ssa 1 tunti. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS-puskurissa, joka sisälsi 0,2% Tween 20: tä (PBST) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvot testattiin primaarisilla vasta-aineilla PBST: hen, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa yön yli 4 ° C: ssa. Kolmen peräkkäisen pesua PBST 10 min, kalvot inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta tai vuohen anti-kani-lgG-vasta-aineella PBST: ssä, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 h huoneen lämpötilassa. Kolmen peräkkäisen pesua PBST 10 min, proteiinit signaalit kehitetään SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Kit ja siirretään kalvon röntgenfilmit. Proteiini lastaus normalisoitui luotaa saman kalvo anti-aktiini vasta-aine. Varten β-aktiini havaitseminen, aiemmin käytetty kalvot upotettiin Palauta Plus Western Blot strippaus Buffer huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ja hybridisoitiin anti-β-aktiini.

mittaus mitokondrion kalvon Mahdolliset

Dye JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi) käytettiin määrittämään mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m), menetys, joka pidetään ratkaisevana askeleena apoptoosireitin. HCT 116-solut transfektoitiin siRNA: lla 48 h tai 72 h, minkä jälkeen solut pestiin kylmällä PBS: llä ja värjättiin inkuboimalla 2 uM JC-1 20 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten, mitokondrion kalvon potentiaalia havaittiin fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla 590 nm: ssä.

kaspaasi-10 aktiivisuuden mittaus

kaspaasi-10-aktiivisuus mitattiin käyttämällä kaspaasi-10 Fluorometic proteaasi Assay Kit . Lyhyesti, solut transfektoitiin PTK7 siRNA, ja sen jälkeen 24 h tai 48 h solut kerättiin. Kaksi miljoonaa solua suspensoitiin uudelleen jäähdytetty lyysipuskuria ja inkuboitiin jäillä 10 min. Sitten 50 ui 2 x reaktiopuskurilla ja 5 ui 1 mM AEVD-AFC substraattia (50 uM lopullinen pitoisuus) lisättiin kuhunkin näytteeseen. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 2 tuntia, näytteet analysoitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa, jossa on 400 nm: n virityssuodatin ja 505 nm: n emissiosuodatin. Keinot ja keskivirheet vähintään kolme rinnakkaisnäytettä kustakin kokeessa laskettiin. Merkittävyys määritettiin t-testiä, ap value≤0.05 on merkitty tähdellä.

Tulokset

inhibitio PTK7 ilmentymisen PTK7 siRNA

Expression of PTK7 HCT 116 , ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja, tutkittiin virtaussytometrialla (Fig. 1A, käsittelemätön) ja Western blot (kuvio. 1B, 0 h). Verrataan fluoresenssin signaalin PE-leimattua anti-PTK7 PE-leimattua anti-hiiri-IgG osoittaa selvästi, että PTK7 on ilmaistu HCT 116-soluissa.

(A) Virtaussytometria määritys sitoutumisen PE-leimattua anti-PTK7 kanssa HCT 116 soluja (Grey käyrät). Mustat käyrät edustavat taustalla sitoutuminen anti-IgG-PE. Pitoisuus vasta-aineen sitoutumisen puskurissa oli 2 ug /ul. (B) Western blot-analyysi PTK7 HCT 116 transfektoiduissa soluissa mukaan PTK7 siRNA. Kalvo tislattiin ja uudelleenseulottiin jonka β-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. (C) tukahduttaminen PTK7 mRNA ilmaisun HCT 116 soluissa PTK7 siRNA. Solut kerättiin 48 tunnin jälkeen hoidon. RT-PCR suoritettiin käyttäen geenispesifisiä alukkeita. Määrä PTK7-mRNA normalisoituna käsittelemättömän ryhmän. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05.

Expression of PTK7 pudotettiin käyttäen PTK7 kohdistettuja siRNA ja virtaussytometria tulokset kohdennettuja soluja verrattiin alttiina ajoneuvon vain, epäspesifinen siRNA tai käsittelemätöntä, kuten on esitetty kuviossa. 1A. 48 tunnin kuluttua huippu anti-PTK7-PE HCT 116 transfektoitu PTK7 siRNA siirtynyt takaisin huippu taustavertailuna proteiini, anti-IgG-PE, mikä osoittaa, että PTK7 ekspressiotaso HCT 116 transfektoiduissa soluissa PTK7 siRNA huomattavasti vähentynyt. Samaan aikaan, ei ollut vastaavaa muutosta ohjaus siRNA tai ajoneuvon-hoidetuilla ryhmillä, mikä osoittaa, ettei HiPerFect transfektioreagenssin eikä epäspesifinen siRNA vaikuttaa PTK7 ilmaisua. Kun PTK7 ilmentyminen tutkittiin sen jälkeen 12 h, 24 h, 30 h ja 48 h transfektion käyttäen Western-blot (Fig. 1 B), tulokset osoittivat selvästi, että taso PTK7 ilmentymisen jälkeen vähentynyt 48 h transfektion jälkeen. Lisäksi kokonais-mRNA uutettiin käsittelemättömän, ajoneuvo, epäspesifinen siRNA, ja PTK7 siRNA ryhmiä. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, PTK7 siRNA aiheuttama 75-80% vähennys PTK7 mRNA HCT 116-soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että molemmat PTK7 proteiini ja mRNA: n ilmentymisen tasot suuresti vähentynyt PTK7 siRNA. Tämä osoittautui toiminta ja tehokkuus PTK7 siRNA ja vankan perustan tutkimus PTK7 n toiminnallista roolia.

elävyys ja leviämisen PTK7 siRNA-käsiteltyjen HCT 116 solua

The effect of PTK7 tukahduttaminen elinkelpoisuudesta HCT 116-solujen tutkittiin laskemalla yhteensä elävien solujen lukumäärä joka päivä transfektion jälkeen. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, määrä elävien HCT 116-solut, jotka on transfektoitu PTK7 siRNA: n osoitettiin olevan merkittävästi erilainen kuin käsittelemättömän ryhmät päivänä 4. Tämä havainto osoitti merkittävää inhibitiota solujen elinkelpoisuus HCT 116 soluja käsiteltiin PTK7 siRNA. Sen varmistamiseksi, että lasku solujen elinkelpoisuuden johtui tukahduttaminen PTK7, suoritettiin samat määritykset tehtiin HCT 116 transfektoitujen solujen epäspesifinen siRNA tai käsitelty vain vehikkelillä. Tulokset osoittivat, että PTK7 siRNA-käsitelty näyte sisälsi pienin määrä soluja. Vaikka ajoneuvojen saaneista ja epäspesifinen siRNA käsiteltyjä soluja oli pienempi solujen määrä kuin käsittelemättömät solut, oli merkittävästi vähemmän soluja PTK7 siRNA-käsitellyn näytteen.

Tulokset ovat ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (A) määrä elävien solujen laskettiin päivittäin 4 päivää käyttäen trypaanisini. (B) BrdU suhteessa käsittelemättömiin soluihin havaittiin virtaussytometrialla. Soluja inkuboitiin 10 uM BrdU 2 h kuluttua 48 h hoidon jälkeen. Määrä BrdU-inkorporaatio normalisoituna käsittelemättömän ryhmän. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05. (C) Apoptoosin esiintyminen HCT 116 soluissa havaitaan anneksiini V /PI tahra vuorokausina 1-4 transfektion jälkeen. Solut värjättiin negatiivisesti sekä anneksiini V ja PI katsottiin terveitä.

selville suppression vaikutusta PTK7 on HCT 116 soluproliferaatioon, joka on BrdU koe suoritettiin mittaamiseksi DNA-synteesiä. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut ympättiin 24-kuoppaisille viljelylevyille ja inkuboitiin 10 uM BrdU: ssa 2 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin ja BrdU-inkorporaatio havaittiin käyttäen FITC-leimattua anti-BrdU-vasta-ainetta (Fig. 2B). Hiljentäminen PTK7 merkittävästi estyy BrdU HCT 116-soluissa, mikä viittaa suorasta vaikutuksesta PTK7 proteiinin HCT 116 soluproliferaatioon.

lisäys apoptoosin PTK7 siRNA-käsiteltyjen HCT 116 solua

anneksiini V /PI-värjäys koe suoritettiin tutkimaan mahdollisuutta, että kaatamalla PTK7 voi vaikuttaa apoptoosia HCT 116 solua. Fosfatidyyliseriinin (FS) sijaitsee sisä- pakkausselosteessa solukalvon terveissä soluissa. Apoptoosin aikana, PS tulee kulkeutua ulkopintaan solukalvon ja anneksiini V /PI-määritys havaitsee PS ulkopinnalle. Tulokset Kuviossa 2C osoittavat, että PTK7 siRNA ryhmä osoitti merkittävää kasvua apoptoottisten solujen 4. päivänä verrattuna niihin, ajoneuvojen, ja epäspesifinen siRNA kontrolliryhmiin.

Muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia ja kaspaasi-9 HCT 116 solua käsiteltiin PTK7 siRNA

tutkia mekanismi, jonka avulla kaatamalla PTK7 indusoi apoptoosia HCT 116-soluissa, vaikutus kaatamalla PTK7 mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨ

m) määritettiin fluoresenssi mikroskopialla (Fig. 3A) ja virtaussytometria (Fig. 3B). Dye JC-1 käytettiin indikaattorina. Vuonna terveitä soluja, polarisoitunut mitokondriot on negatiivinen varaus, joka mahdollistaa JC-1 väriaine kanssa delocalized positiivinen varaus tulla mitokondrioiden matriisi ja kerääntyä siellä. Kun kriittinen pitoisuus ylitetään, JC-1 muotojen J-aggregaattien ja soluista tulee fluoresoiva punainen (FL2). Vuonna apoptoottisia soluja, mitokondrion kalvon potentiaalia sortumiset, ja JC-1 ei voi kertyä mitokondrioita. Näissä apoptoottisia soluja, JC-1 pysyy sytoplasmassa on vihreä fluoresoiva monomeerisen muodon (FL1). Jälkeen HCT 116-solut transfektoitiin siRNA: lla tai kontrolli, kuten edellä on kuvattu, ja inkuboitiin 48 h tai 72 h, lasku ΔΨ

m HCT 116-soluissa, jotka on transfektoitu PTK7 siRNA havaittiin. 72 tunnin jälkeen transfektion prosenttiosuus solujen polarisoidun mitokondrioita oli 90%, 87% ja 88% soluille käsittelemättömän, ajoneuvon ja epäspesifinen siRNA ryhmiä, vastaavasti. Kuitenkin vain 35% kaikista soluista PTK7 siRNA ryhmällä oli polarisoitunut mitokondrioita. Tämä suuntaus oli nähtävissä jopa 48 tuntia, kun vain 58% soluista oli polarisoitunut mitokondrioita. Nämä tiedot osoittivat, että mitokondrioiden oli mukana indusoiman apoptoosin PTK7 knockdown.

(A) fluoresenssimikroskooppiin havaitseminen mitokondrion kalvon potentiaalia käsitellyissä HCT 116 solua. (B) Virtaussytometria havaitseminen mitokondrion kalvon potentiaalia käsitellyissä HCT 116 solua. (C) kaspaasi-9 mukana indusoiman apoptoosin kaatamalla PTK7. Kalvo oli riisuttu ja uudelleenseulottiin mukaan β-aktiini-vasta-aineen latauskontrollina.

Erilaisia ​​signalointipolkujen voi olla osallisena apoptoosin, ja mitokondriot on merkittävä rooli. Mitokondriovauriot aiheuttaa vapautumisen sytokromi

c

, joka aktivoi kaspaasi-9 puolestaan ​​ruokkii apoptoosin. Kaspaasi-9 aktivaatio havainnoitiin Western blot jälkeen HCT 116 -solut transfektoitiin PTK7 siRNA ja viljeltiin 12 h, 24 h, 30 h, ja 48 h, vastaavasti. Kuten kuviossa 3C on esitetty, kaspaasi-9 aktivoitiin ja mukana indusoiman apoptoosin PTK7 pudotus.

Role kaspaasi-10 PTK7-pudotus-indusoitua apoptoosia

Sen määrittämiseksi, onko kaspaasin välittäjänä indusoiman apoptoosin knock alas PTK7, soluja esikäsiteltiin pancaspase estäjän tai yksi monista yhden kaspaasi-spesifisiä inhibiittoreita. Rescue soluista apoptoosin merkitsisi sitä, että esti kaspaasi on osallisena PTK7-puutteellinen solukuolemaa. Sen jälkeen kun esi-inkubointi HCT 116 solut 20 uM pancaspase-perheen estäjää 37 ° C: ssa 3 h, solut transfektoitiin siRNA: lla 48 tuntia. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, solujen elinkykyisyys testattiin käyttäen anneksiini V /PI (Fig. 4A). -Soluja pre-inkuboitiin pancaspase-perheen estäjä oli hyvä solujen elinkykyä (80 ± 13%) transfektion jälkeen PTK7 siRNA kuluessa epävarmuus solun elinkelpoisuuden epäspesifinen siRNA ryhmä (83 ± 7,5%). Samaan aikaan, solut suoraan transfektoitu PTK7 siRNA oli huomattavasti pienempi solujen elinkykyä (36 ± 12%). Pancaspase perheen estäjän tukossa kaspaasiaktiivisuus ja esti myös indusoiman apoptoosin kaataa of PTK7, mikä osoittaa, että indusoiman apoptoosin kaataa of PTK7 on kaspaasiriippuvaisen.

(A) indusoiman apoptoosin kaatamalla PTK7 oli kaspaasi -riippuvaisella. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05. (B) kaspaasi-10-estäjä täysin tukossa indusoiman apoptoosin kaataa of PTK7. Data: keskiarvo ± S.D. Kolmen itsenäisen kokeen, * Studentin t-testi: P 0,05.

tutkimiseksi joka kaspaasi näyttelee kriittistä roolia tässä apoptoosin, HCT 116-soluja esikäsiteltiin kaspaasi-9-estäjä (Z -LEHD-FMK), kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD-FMK), kaspaasi-8-estäjä (Z-IETD-FMK), kaspaasi-perheen estäjä (Z-VAD-FMK), kaspaasi-1-estäjä (Z-YVAD -FMK), kaspaasi-10-estäjä (Z-AEVD-FMK), kaspaasi-2-estäjän (Z-VDVAD-FMK), tai DMSO: ajoneuvon 37 ° C: ssa 3 h, minkä jälkeen transfektion PTK7 siRNA. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, solun elinkelpoisuus testattiin anneksiini V /PI-virtaussytometriaa käyttämällä. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, esto kaspaasi 10 tukossa apoptoosin, 79 ± 3% soluista elinkelpoisia. Tämä tarkoitti, että caspse-10 voi olla kriittinen rooli apoptoottisen reitin aiheuttama kaataa of PTK7.

Vahvista kaspaasi-10 indusoiman apoptoosin PTK7 Knockdown, prokaspaasi-10-proteiinin tasot solussa lysaatit transfektoitu PTK7 siRNA tutkittiin käyttäen Western blot (kuvio. 5A). Prokaspaasi-10 jälkeen vähentynyt 12 h transfektion ja kasvoi 30 h transfektion. Lisäksi, kuten välisen yhteyden sisäisen reaktiotien ja ulkoinen tie, lohkaisu Bid on tBid tutkittiin, eikä ollut selvää tBid, mikä osoittaa, ettei signaalia siirto ulkoinen tie luontaisen reitin. Toisessa kokeessa, PTK7 ilmentyminen HCT 116 on suppressoida alun perin käyttäen PTK7 siRNA, jolloin apoptoosin näissä soluissa. Kyky solulysaattien lohkaista peptidi substraattien (Ac-AEVD-AFC) testattiin indikaattorina kaspaasi-10 toimintaa. Tulokset kuvassa 5B esittävät merkittävän kasvun kaspaasi 10 aktiivisuutta soluissa käsitelty PTK7 siRNA.

(A) Western blot-analyysi prokaspaasi-10 ja Bid HCT 116 transfektoiduissa soluissa mukaan PTK7 siRNA. Kalvo tislattiin ja uudelleenseulottiin jonka β-aktiini-vasta-aine, latauskontrollina. (B) kaspaasi-10 aktiivisuus HCT 116 soluissa: käsittelemätön ja käsitelty ajoneuvo, epäspesifinen siRNA ja siRNA. Tulokset annetaan suhdeluvut kaspaasi-10 aktiivisuus käsittelemättömissä soluissa. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05.

Proteiini p53 osallistumista PTK7-pudotus indusoiman apoptoosin

Proteiini p53 on osoittautunut niin tuumorisuppressoriproteiinia ihmisellä [31] , ja HCT 116-solut ilmentävät laaja-p53. [32], [33] jotta voidaan tutkia osallistumista p53 indusoiman apoptoosin PTK7 knockdown, p53-null HCT 116 käytettiin toisena solulinja suorittamaan PTK7 knockdown ja muut asiaan liittyvät kokeet. Ensinnäkin, PTK7 ekspressiotaso ilman /siRNA hoidon seurattiin virtaussytometrialla (Fig. 6A). P53-null HCT 116 ilmentävät suuren määrän PTK7 solukalvon, mutta sen jälkeen 48 tunnin PTK7 siRNA transfektion huippu anti-PTK7-PE p53-null HCT 116 siirtynyt takaisin huippu taustavertailuna proteiinia, anti-IgG-PE. Tämä osoitti, että PTK7 ekspressiotaso p53-null HCT 116-solut, jotka on transfektoitu PTK7 siRNA pieneni suuresti. Seuraavaksi useita live p53-null HCT 116-solut, jotka on transfektoitu PTK7 siRNA: n osoitettiin olevan merkittävästi erilainen kuin käsittelemättömän ryhmät päivänä 4, osoittaa merkittävää inhibitiota solujen elinkelpoisuuden p53-null HCT 116-solut käsittelemällä PTK7 siRNA (Fig. 6B). Ja joka BrdU kokeilu, vaimentaminen PTK7 merkittävästi estyy BrdU p53-null HCT 116 solua, mikä viittaa suorasta vaikutuksesta PTK7 proteiinin soluproliferaatioon (Fig. 6C). Sitä vastoin anneksiini V /PI-värjäyksen koe osoitti, että PTK7 siRNA-käsitellyn p53-null HCT 116 osoitti merkittävää kasvua apoptoottisten ja kuolleiden solujen päivänä 4 verrattuna niihin, ajoneuvojen, ja epäspesifinen siRNA kontrolliryhmiin.

(A) Virtaussytometria määritys sitoutumisen PE-leimattua anti-PTK7 p53-null HCT 116-soluja (harmaat käyrät). Mustat käyrät edustavat taustalla sitoutuminen anti-IgG-PE. Pitoisuus vasta-aineen sitoutumisen puskurissa oli 2 ug /ul. (B) määrä elävää p53-null HCT 116 solua laskettiin päivänä 4. hoidon jälkeen ajoneuvo, epäspesifinen siRNA ja PTK7 siRNA. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05. (C) BrdU-suhteessa käsittelemättömiin soluihin havaittiin virtaussytometrialla. p53-null HCT 116 Soluja inkuboitiin 10 uM BrdU 2 h kuluttua 48 h hoidon jälkeen. Määrä BrdU-inkorporaatio normalisoituna käsittelemättömän ryhmän. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. * Studentin t-testi: P 0,05. (D) Apoptoosin esiintyminen p53-null HCT 116 solua havaitaan anneksiini V /PI tahra päivää 4 transfektion jälkeen. Solut värjättiin negatiivisesti sekä anneksiini V ja PI katsottiin terveitä ja prosenttiosuus oli kuvassa.

indusoiman apoptoosin PTK7 Knockdown on osoittautunut kaspaasi-10 riippuvainen villityypin HCT 116. joten apoptoosireittiä p53-null HCT 116 aiheuttama PTK7 knockdown tutkittiin tarkemmin. JC-1 kokeen tarkkailtiin molemmat fluoresenssimikroskopialla (Fig. 7A) ja virtaussytometria (Fig. 7B). On selvää, mitokondrion kalvon potentiaali laski p53-null HCT 116 solua käsiteltiin PTK7 siRNA. Kuten on esitetty kuviossa.