Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä liittyviä ja ensisijainen lymphedema (LE) liittyvät tuotantoon rasvakudoksen (AT). Mikään ei ole tiedossa, mutta noin lipidi-molekyylit, jotka käsittävät LE AT. Siksi analysoidaan lipidimolekyyliä lipoaspirates ja saatu seerumi LE potilaista, ja verrattiin niitä lipoaspirates alkaen kauneusleikkaus potilaiden ja terveillä verrokeilla kohortin seerumia. LE Potilasseerumin analyysi osoitti, että triglyseridien, HDL- ja LDL-kolesterolin ja lipidien kuljettavien molekyylien pysyivät normaalin rajoissa, mitään muuttamatta yksittäisissä rasvahappoja. Maksan rasvaprofiilin analysointi tunnistettiin myös 275 lipidejä molekyylit, kuten triglyseridien, diasyyliglyseridit, rasvahappoja ja fosfolipidejä AT öljyn ja rasvan. Vaikka suurin lipidimolekyyleistä oli läsnä vastaavassa runsaasti LE ja ei-LE näytettä, oli useita pieniä muutoksia: lisääntynyt C20: 5 sisältäviä triasyyliglyseridejä, vähensi C10: 0 kapriini- ja C24: 1 nervonic hapot. LE AT öljy sisälsi myös allekirjoitus lisääntynyt syklopropaani-tyypin rasvahappojen ja tulehdusvälittäjiä arakidonihapon ja seramideja. Mielenkiintoista C20: 5 ja C22: 6 omega-3-tyypin lipidejä lisääntyneet LE AT, korreloi LE vuotta. Siksi LE AT on normaali lipidiprofiili sisältää allekirjoituksen tulehduksen ja omega-3-rasva-. On edelleen epäselvää, mutta ovatko nämä erot heijastavat pienimuotoinen globaali metabolisia häiriöitä tai vaikutusten sisällä paikallinen tulehduksellinen pesäkkeitä.

Citation: Sedger LM, Tull DL, McConville MJ, De Souza DP, Rupasinghe TWT, Williams SJ , et ai. (2016) Lipidomic Profilointi rasvakudoksen paljastaa tulehduksellinen Signature syöpään liittyvien ja Primary lymphedema. PLoS ONE 11 (5): e0154650. doi: 10,1371 /journal.pone.0154650

Editor: Clarissa Menezes Maya-Monteiro, Fundação Oswaldo Cruz, Brasilia Huoneiston

vastaanotettu: 26 helmikuu 2016; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2016; Julkaistu: toukokuu 16, 2016

Copyright: © 2016 Sedger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Yksityiskohdista yksilöiden potilaan ja normaalin luovuttajan kohortteja varastoidaan mukaisesti Australian National Health ja Medical Research Ohjeet Responsible Conduct of Research ja institutionaalisten Human tutkimuskomitea ohjeita.

Rahoitus: Tutkimusta rahoittivat jonka Lymphedema Program Lääketieteellinen tiedekunta Health Science, Macquarien yliopisto. Rahoitusta myönnetään JB.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet: AT, rasvakudos; BMI, painoindeksi; Cer, keramidia; CE, kolesteroli esteri; DAG, diacylglyceride; GC, kaasukromatografia; HexCer, heksa-seramidi; HDL, HDL; LE, lymphedema; LC, nestekromatografia; LDL, matala HDL; LPC, lyso-fosfatidyylikoliini; LPE, lyso-fosfatidyylietanoliamiinit; PBQC Tasauseläkemenon biologinen laadunvalvonta; PC, fosfatidyylikoliini; PCA, pääkomponenttianalyysi; PE, fosfatidyylietanoliamiini; MS, massaspektrometria; SM, sfingomyeliini; TAG, triacylglyceride; VLDL, hyvin alhaisen tiheyden lipoproteiinien

Johdanto

Lymphedema (LE) on sairaus, jossa imunestejärjestelmän nesteen sisälle kertyy interstitiaalinen kudoksissa aiheuttaa turvotusta. Kehittyneissä maissa LE useimmiten tapahtuu seurauksena, tai ”toissijainen”, hoitoa syöpään. Syöpäpotilaat suurin riski sairastua syöpään liittyvät LE kuuluvat potilaat, joilla on rintasyöpä, jotka tarvitsevat imusolmuke pysähdyspaikan tai hoitoon (vartijaimusolmukkeessa biopsia plus /miinus leikkely ja /tai kainalosta säteilyä, ja usein kemoterapia) johtuen syöpäsolujen leviämiseen [1]. Itse varovaisten arvioiden mukaan jopa 28% tällaisista potilaista kehittyneissä maissa kehittyy varren LE jälkeen niiden rintasyövän hoidossa [1]. Samoin jopa 75% pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta voi kehittyä kurkun, kasvojen, kaulan tai sisäinen LE [2] ja kolmannes lantion syöpäpotilaiden kehittää alaraajojen LE 1 vuoden kuluessa leikkauksesta [3]. Näin ollen, syöpään liittyvien LE on laajalti hyväksytty, koska yksi yleisimmistä pitkän aikavälin komplikaatioita syövän hoitoon. Ensisijainen LE voi esiintyä myös spontaanisti, yleensä ilmenee ensin lapsuudessa, ja usein geneettinen alkuperä [4] tai jotka johtuvat muiden kuin syöpään liittyvien kudosvaurioiden. Siksi LE esiintyy vuoksi vaarantua lymfahierontaa joka voidaan suoraan aiheuttamia, tai osaltaan, vamman tai geneettisiä muutoksia, jotka johtavat viat imusuonien biogeneesin tai epämuodostumia imuneste astiassa venttiilin muodostumista ja vähentää imusuonten toimintaan [4]. Valitettavasti tällä hetkellä ei ole parannuskeinoa pääasiallisia tai toissijaisia ​​(syöpään liittyvien) LE. Siten LE on krooninen sairaus, joka vaikuttaa henkilön kykyä elää normaalia elämää, koska ehto on taipumus pahentua ajan myötä ja fyysisiä kosmeettisen haitan ja toiminnalliseen kyvyttömyyteen vaikutuksia elämänlaatuun [5,6].

One suurimmista ongelmista, jotka liittyvät krooniseen LE on, että vaikuttaa kudosten usein tullut yhdistelty rasvakudoksessa (AT) [7,8]. Kun tämä tapahtuu noudattaen perinteisiin hoitoihin käsittävät puristus, bandaging ja hieronta usein vähenee kun käy ilmi, että ne eivät voi vähentää LE liittyvä AT joka sitten vallitsevana sisällä teennäinen. Onneksi meillä on kirurginen hoitovaihtoehto kanssa elävien kehittynyt AT rikas LE: rasvaimu leikkaus [9-12], joka fyysisesti poistaa AT että vallitsevana kohdealue [7,8]. Vaikka tämä hoito on erittäin hyödyllistä LE potilaille, vähentää välittömästi LE raaja kokoa, syyt tuotannossa LE AT ovat vielä kehitteillä, ja LE patologia on puutteellisesti [13]. Näin ollen, vaikka on selvää, että adipogeneesi normaalisti liittyy sytokiinien, hormonien, transkriptiotekijät, ja miRNA että ajallisesti säädellä geeniekspressiota ajaa kypsymistä ennen adiposyyttien kypsiin lipidejä sisältävien adiposyyttien [14,15], mutta hyvin vähän on tällä hetkellä tiedossa noin adipogeneesi sisällä LE AT itse. Mikään ei ole tunnettu, esimerkiksi, noin erilaisia ​​lipidejä molekyylit, jotka on tuotettu LE kudoksen adiposyyttien. Mielenkiintoista, AT on todella olennainen nisäkkään immuunijärjestelmää ja, itse asiassa, imusolmukkeet normaalisti olla tiiviissä fyysinen yhdistys AT, missä lipolyysiä vapauttaa vapaita rasvahappoja ja lipidejä välittäjien että polttoaine immuunijärjestelmän soluja [16]. Lisäksi vaikka kolesteroli on yleensä kuljetetaan veressä kautta lipoproteiinit, joko kylomikronien, hyvin alhaisen tiheyden lipoproteiinien (VLDL), väli- tai korkea-lipoproteiinien (HDL), kuljetukseen lipidien takaisin soluista ja kudoksista maksaan kautta tapahtuvaa HDL ja imusolmukkeiden-prosessia kutsutaan käänteinen kolesterolin [16]. Täällä ulosvirtaus solun kolesteroli vapautuu solunsisäiseen tilaan vaikka yhdistetyn toimia ABC kuljettajat, sieppaajareseptori-B1, Cyp27A1, caveolin tai passiivinen diffuusio (kukin mekanismi vaihtelee riippuen osittain solutyyppi) [17], jossa se on viime kädessä poistettiin HDL ja ihmiskaupan takaisin interstitium kautta lymphatics (viimeaikaisesta katsaus julkaisussa [18]). Siten lipidikuljetukseen on väistämättä olennainen LE koska lymfahierontaa muuttuu kun imusolmukkeet poistetaan, tai kun imusuonten ja venttiilit ovat vahingoittuneet tai toimintahäiriö. Itse asiassa viime eläinperäisiä tutkimukset viittaavat heikentynyt käänteisessä kolesterolin kuljetus tapahtuu kokeellisesti aiheuttama hiiren LE [19]. Jos on puutteita käänteisessä kolesterolin ihmisen LE sitten, missä määrin rasva-aineenvaihdunta on muuttunut tai epätasapainoinen ovat epäselviä. Niin myös vähän tietoa seurauksista kroonisen LE turvotusta seerumin rasva tasolla ja lipidejä liittyvät lipoproteiinien ihmisen LE. Siksi alkaa ymmärtää paremmin patobiologian AT tuotannon kehittyneen LE tarkastelimme seerumin lipidien ja kokeellisesti tuotettu ensimmäinen AT lipidiprofiilit kehittyneiden syöpään liittyvien LE potilaiden ja vertasi niitä normaalia seerumia, ja anatomisesti yhteensopivat käsi ja jalka normaali , ei-LE, AT.

Materiaalit ja menetelmät

Human Research Ethics hyväksyminen

Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Macquarie University Human Research Ethics Committee (HREC) ennen sen aloittamista. Kaikki elementit Tutkimuksen tehtiin myöhemmin mukaan HREC hyväksyttyjen käytäntöjen, niin että kaikki normaalin kudoksen luovuttajien, ja potilaille, joilla LE, lahjoitti heidän verensä ja AT rasvaimu näytteitä vapaaehtoisesti ja tietoisen kirjallisen suostumuksensa.

Potilaan ja Terveet ohjaus osallistujat tutkia kriteereillä

Kaikki potilaat, joilla LE (n = 15, taulukko 1) etsivät lääketieteellistä arviointia ja hoitoa varten kehittyneen raaja LE klo Advanced Lymphedema Assessment Clinic Macquarie University Hospital. Nämä potilaat yleensä esitetään raajan tilavuuden ero on vähintään 20-25% ja tarjotaan rasvaimu leikkaus perustuu läsnäolosta LE liittyviä AT määritettynä ensisijaisesti ”ei-pistekorroosiota” LE esitys [8,20] ja vahvistettu magneettikuvaus [9]. Niinpä rasvaimu leikkaus on hoitovaihtoehto potilaille, jotka ovat kokeneet vähäinen viime hyötyvät perinteisen LE hoitojen takia konsolidoituun kertyy huomattavia määriä AT. Vertailun normaaliin kudokseen olemme myös saaneet terveen ihmisen käsi ja jalka (osa) AT (n = 7, taulukko 1). Tämä kudos saatiin kauneusleikkaus potilasta, jotka olivat valinneet rasvaimun leikkaus yksityisellä Melbourne kauneusleikkaus klinikan pimeän henkilökohtaisista syistä. Esimerkki kuva raajan LE potilaan ja LE ja ei-LE lipoasparates esitetään (kuvio 1). Kaikki LE potilaiden ja terveiden luovuttajien myös niiden paino ja korkeus mittauksia, joita käytettiin laskettaessa yksilön painoindeksi (BMI) ja siten mahdollistaa tunnistamisen ja syrjäytymisen tutkimuksen osallistujista, jotka ehkä muutoin ei enää luokitella ”normaalina BMI ”meidän mukaan Heart Foundation Australian luokitusasteikon (https://heartfoundation.org.au/). Näin ollen kaikki tutkimuksessa osallistujat olivat normaalilla BMI normaalitasolle (15 25), lukuun ottamatta kahta LE potilailla, joilla oli ennen leikkausta painoindeksi (BMI) 30 kg /m

2. Nämä kaksi LE potilaita ei pidetä lihavia, koska BMI yksi potilas palasi 30 kg /m

2 nopeasti sen jälkeen raaja rasvaimun, ja toinen on ensisijainen osuudella LE vaikuttaa kumpaankin osaan eli selvästi näitä potilaita pre-kirurginen data heijastuu niiden lymphedematous raajat sijaan edellytys yleisen kehon lihavuutta. Oli myös selvää, että useita henkilöitä sekä LE ja ei-LE ikäluokat olivat ”terve mutta ylipainoinen” (BMI = 25-29) vastaa monien nykyisten länsimaa demografiset (yksittäisiä tietoja ei esitetty). Tilastollinen analyysi kohortin ominaisuuksien tiedot, erityisesti ikä, sukupuoli ja BMI, suoritettiin tavallisella Studentin t-testi ei ole oletus tiedon jakeluun normaaliuden koska kyse on suhteellisen pienestä otoksesta (taulukko 1).

(A ) Vasen käsi LE, (B) vasen jalka LE, (C) LE AT rasvaimu aspiraatista ja (D) Normaali ei-LE (Kauneusleikkausten) AT rasvaimu aspirate, joka osoittaa läsnäolo nestemäistä öljyä (öljy) ja kiinteän rasvan (Fat). Myös ilmeistä on vesikerros suolaliuosta pestä sisällä kauneusleikkaus aspirate.

Näytteiden keräys ja kudosten käsittelyyn

Rasvaimu leikkaus syöpään liittyvien LE suoritettiin yleisanestesiassa anestesian Macquarie University Hospital tekijän TL joka oli erityisesti koulutettu professori Brorson ja professori Munnoch, jotka ovat kehittäneet mitä nyt vakiintunut menettely kehittynyt LE [10-12,21]. Leikkaus suoritettiin LE-vaikutti käsissä ja jaloissa (kuvio 1A ja 1B) soveltamisen jälkeen kiristyssidettä. Lyhyesti, ihonalainen AT poistettiin läpi useita pienet viillot sijaitsevat pituudelta raaja kautta Helixed Tri Port III kanyyli (yleensä 22-30 cm pitkä ja 4-5 mm) on kytketty tyhjöpumppuun [9]; samaa menettelyä on nyt käytetty menestyksellisesti kansainvälisesti yli vuosikymmenen [10-12]. Uutettu käden tai jalan LE AT lipoaspirate (kuvio 1 C) oli heti kuljetettiin lääketieteellisen tiedekunnan ja Health Research Laboratories, käsitellään jäljempänä kuvatulla tavalla ja säilytettiin -80 ° C: ssa AT Sample Bank tuottaman LMS. Terve ihmisen raajan (käden tai jalan) AT kerättiin luovuttajan tietoon perustuvan suostumuksen, yksityisellä Kauneusleikkausten klinikka, tohtori Lanzer Clinic, Melbourne, asiakkailta valitsevat menossa rasvaimu leikkaukseen. Lyhyesti, terve lipo-aspirate kudoksen (kuvio 1 D) saatiin standardi plastiikkakirurgia nukutuksessa. Sen jälkeen pienet viillot tehtiin, ympäröivä alue oli täynnä Klein paisuva nestettä käyttäen 20 gaugen neulalla, ennen kuin imua ja myöhemmin uuttamalla AT kautta 14 gaugen Klein microcannula on capastrano lajikkeen [22]. Kosmeettiset rasvaimu leikkauspotilaat sitten kulumista puristus sideaine yhtäjaksoisesti noin 2 viikkoa, sitten ajoittain 2 viikkoa leikkauksen jälkeen, jotta voidaan minimoida mahdollisuus haittavaikutusten tai post-kirurgiset komplikaatioita [23].

LE ja normaali (kosmeettinen) rasvaimu leikkauksen aT lipoaspirates (kuvio 1C ja 1D) kaadettiin useita 50 ml: n Falcon-putkiin ja sentrifugoitiin noin 350 g 5 minuutin erottamiseksi neste ”rasva öljy” kiinteästä ehjä aT eli ehjänä rasvasolut muuten tarkoitetun tänne kuin AT ”rasva”. Jäljellä oleva vesipitoinen kudoksen komponentit kerättiin myös, ja veren punasolujen Pelletti heitettiin pois. Sentrifugoinnin jälkeen öljy poistettiin ja varastoitiin jäädytettynä -80 ° C: ssa. Seuraavaksi ehjä rasvasolut, ja vesikerrokset, poistettiin varovasti, erikseen, ja vastaavasti sijoitetaan erillisiin putkiin ja pakastettiin välittömästi myös -80 ° C: ssa. Siten kudos komponentit varastoitiin aikaan niiden kirurgisten kokoelma yli 12-18 kuukausi jakson läpi kunnes yhden sulattaminen myöhempää laboratoriokokeista.

Oheislaitteet verinäytteet kerättiin LE potilaista käyttäen sekä SST-II ja K

2EDTA vacutainer keräysputkiloita välittömästi ennen anestesian rasvaimu leikkaukseen. Perifeerisen veren saatiin myös ei-liittyviä terve iän ja sukupuolen yhteensopivista luovuttajista (n = 13, taulukko 1) tavanomaisilla suonenpuhkaisu- of ääreislaskimoiden, tekee koulutettu phlebotomists. Kaikki LE potilaiden ja terveiden luovuttajien he olivat ”paasto” ja ”lepo”; ne kulutetaan ole ruokaa eikä liikuntaa vähintään 8-10 tuntia ennen suonenpuhkaisu- tai kokoelman rasvaimu leikkauksen. Perifeerisen veren näytteitä sentrifugoitiin 10 minuuttia ja seerumi (ja plasma) kerrokset poistetaan, jaettiin osiin, varastoidaan sitten jäädytettynä, kunnes yhden sulatuksen laboratoriokokeista.

Automatisoitu biokemiallinen analyysi seerumin lipidien

seerumin lipidien mitattiin seuraavasti: kolesteroli mitattiin kolesterolin entsymaattinen määritys (Abbott), triglyseridien glyserolia fosfataasi oksidaasi perustuva määritys (Abbott), ja HDL-kolesteroli kanssa Ultra HDL kaasupolkimen selektiivinen pesuainetta määritys (Abbot), ja analysoitiin Abbott Arkkitehti c16000 väline Douglas Hanly Moir Pathology, Macquarie Park, Sydney. LDL-kolesterolin tasot laskettiin seuraavasti: LDL-kolesteroli = kolesterolia HDL- (0,45 x triglyseridit), joka on hyvin samankaltainen sekä Friedewaldin ja Amhadi kaavojaKeksinnön [24,25]. Apolipoproteiini-A1 ja -B seerumissa määritettiin immunoturbidimetriset määrityksiä Tina-Quant apolipoproteiini A-1 Ver 2 ja Apolipoproteiinit B Ver 2 (Roche), käyttäen Roche Integra 800 analysaattori klo Sullivan ja Nicolaides Laboratory Brisbanessa Australiassa. Yleisesti hyväksytty Normaalin näistä molekyyleistä ihmisen seerumissa on huomattava, yhdessä tietojen kanssa.

Kaasukromatografia-massaspektrometria (GC-MS) rasvahappojen analyysi

AT näytteet noin 50 mg oli uutettiin 1 ml kloroformi: metanoli (2: 1 v /v) inkuboimalla lämpösekoittajalla (Eppendorf) 10 minuuttia 30 ° C: ssa, sitten sentrifugoitiin 18000g 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 50 ul: n erä supernatanttia kustakin näytteestä myös yhdistetty luoden yhdistettyä biologinen laadunvalvonta (PBQC). Yksittäiset näytteet ja PBQC (5 ui) siirrettiin lasi- insertin, johon 40 ul sisäisten standardien lisättiin: kloroformi: metanoli (2: 1 v /v), joka sisälsi 62,5 uM kutakin

13C

18-stearaatti ja

13C

2-myristaatti. Suoraketjuista rasvahappoa (Sigma) standardit (25 uM) ja monometyyli haaraketjuinen ja syklopropaani-tyypin rasvahappojen standardien (25 uM) syntetisoitiin talon kuten aiemmin on kuvattu [26,27] ja valmistetaan kloroformi: metanoli (2: 1). Insertit sisältäviä AT näytteitä ja PBQC sinetöitiin osaksi GC pulloihin ja transesteröidyt luoda rasvahappometyyliestereitä. Tämän näytteet sekoitettiin 5 ui Methprep-II (Alltech) käyttäen Gerstel MPS2 autosampler robotti, inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa hitaasti ravistellen sekoittamiseen. Rasvahappojen analyysi suoritettiin laitteella Agilent 7890 kaasukromatografi, joka on kytketty 5975 massaselektiivisellä detektorilla. Näytteet (2 ui) injektoitiin jakaa osiin (10: 1) osaksi sisääntulon asetettu 250 ° C: ssa ja Kromatografinen erotus saavutetaan kaikissa SGE BPX70 pylväs (60 m x 0,25 mm sisähalkaisija x 0,25 um kalvon paksuus). Uunin olosuhteet olivat 70 ° C 1 min, sitten 40 ° C /minuutti 150 ° C, 4 ° C /minuutti 200 ° C, 3 ° C /minuutti 220 ° C, 4 ° C /min 250 ° C pidettiin sitten 250 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Helium kantajakaasun virtausnopeus oli vakio 1,5 ml /min ja MS siirtolinjan asetettiin 280 ° C: ssa. Yhdisteet ionisoidun käytetään elektroni vaikutukset pirstoutuminen (-70eV) ja massaspektri kerätty yli 50-450 m /z-alue 3,6 skannausta /sekunti.

nestekromatografia-massaspektrometria (LC-MS) lipidejä analyysi

LC-MS lipidi-analyysi suoritettiin oleellisesti tavanomaisten menetelmien mukaisesti aiemmin kuvattu veren rasva- [28]. Lyhyesti, rasva-öljy (~ 50 mg ”Oil”) ja kiinteää rasvaa (~ 50 mg ”Fat”) näytteet uutettiin käyttäen 1 ml kloroformi: metanoli (2: 1, v /v), joka sisälsi sisäisen standardin 5 uM C17 : 0 LPC 1 tunnin ajan RT: ssä. Uutteet sentrifugoitiin 18000 g: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa (jääkaapissa mikrosentrifugissa) ja supernatantit siirrettiin uuteen putkeen. Pelletti uutettiin uudelleen 500 ul: kloroformi: metanoli (2: 1, v /v), sentrifugoitiin, kuten edellä on kuvattu ja supernatantit yhdistetään. Rasva-öljyn ja kiinteän rasvan uutteet kuivattiin typpikaasussa sitten uudelleen 100 ul: butanoli: metanoli (1: 1), joka sisälsi 5 mM ammoniumformaattia (Sigma). Lipidit analysoitiin Agilent 1200 nestekromatografia (LC) järjestelmä ja kolmoiskvadrupolisen 6460 massaspektrometri (MS). Lyhyesti, lipidit erotettiin injektoimalla 5 ui näytettä päälle 50 mm x 2,1 mm x 2,7 um Ascentis Express RP-Amide-pylvääseen (Supelco), jota seurasi eluointi virtausnopeudella 0,2 ml /min 5 min: n gradientti vesi /metanoli /tetrahydrofuraania (50:20:30, v /v /v) vesi /metanoli /tetrahydrofuraanissa (5:20:75, v /v /v) ja lopullinen puskuri pidettiin 3 min. Lipidit tunnistettiin sähkösumutusionisaatiota-massaspektrometrialla käyttäen menetelmää, joka on optimoitu käyttäen paneelia aitoja lipidin standardeja. Lipid tunnistus suoritettiin käyttäen kahta skannaustoimintoja käytettävissä triple-nelinkertaistaa massa-spektrometri, esiaste skannaus ja neutraali menetys skannata. Molemmat skannaa ovat profilointi tunnistaminen edeltäjä massojen lipidilajien perustuu m /z fragmentin pään ryhmään. Fosfatidyylikoliinit (PC) ja sfingomyeliinit (SM) tunnistettiin skannaamalla esiasteita osoitteessa 184,1 m /z, kun taas ceramideilla (Cer), kolesterolin esterit (CE) ja fosfatidyyliglyserolit (PG) tunnistettiin skannaamalla lähtöaineiden at 264,6, 369,4 ja 189 m /z vastaavasti, kaikki positiiviset MS-tilassa. Fosfatidyletanoliamiinit (PE) tunnistettiin skannaamalla neutraali menetys 141 m /z positiivisessa MS-tilassa. Diasyyliglyserolia (DAG) ja triasyyliglyseroli- (TAG) tunnistettiin käyttämällä neutraalia menetystä skannaa mahdollisia rasva asyyliryhmiä. Näin rasva tunnistukset ovat otaksuttu ja useimmat eivät ole validoitu muilla keinoin. Lipidit kvantitoitiin käyttämällä useita reaktionseuraamista kapillaa- jännite 4000V, fragmenttori jännite 140-380 V, törmäys energiaa 15-60 V ja törmäys (typpi) nopeudella 7 l /min. Kvantifiointi perustui suhteelliset muutokset piikin alueilla.

Tietojen käsittely ja tilastollinen analyysi

Suoraketjuiset lipidilajien tasaisesti viittasi kautta Cx: y nimikkeistön jossa viitataan kokonaismäärä hiiltä (x) ja kaksoissidosten (y) lipidien. Esimerkiksi kolesteroliesteri CE (14: 1) on 14 hiiltä ja 1 kaksoissidos-huomata että kanta kaksoissidos ei ole määritelty. Haaraketjuisia rasvahappoja tutkimukset ovat iso-rasva acidsm sisältävät metyyliryhmä viimeistä edellisessä hiiltä. Näin ollen, iso-C15: 0 tarkoittaa 13-metyylimyristiinihappoa. Syklopropaani- rasvahappoja tutkittu sisältävät cis-9,10-methylenehexadecanoic happo (MHA), dihyrosterculic happo (DHS) ja lactobacillic happo (LBA). Lipidi nimistön ja luokituksen mukainen että LIPD MAPS https://www.lipids.org. Sekä GC-ja LC-MS-tulokset käsiteltiin käyttäen Agilent Mass Hunter Quantitative Software (B.06.00). Raakadataa osoittavat suhteellinen runsaus (pinta-ala käyrän) analysoitiin Microsoft Excel (versio 14.5.9 Mac OS), laskemalla keskiarvo, keskihajonta (SD) ja mediaani LE tai normaali kohortissa tietoja. Raakadataa ensin tukin transformoitiin sitten säätää mediaani normalisoituminen (x /mediaani) [29], jossa mediaani arvo määritelty erikseen kunkin luokan rasva mukana tutkimuksessa (esim rasvahapot, DAG, TAG, CE, PE /LPE , SM, Cer, jne), jotta selittää heteroscedastic luonnetta metabolomiikan tietoja. Jos lipidi havaittaisi nolla-arvoon tilalle ”0” tai ”1” sallia myötävirtaan analyysi (raakadata, boxed solut täydentävät tiedot). Keinot ja SD jälleen laskettiin tällä kertaa lokista transformoitu mediaani-normalisoitu data, ja merkittäviä eroja LE vs. normaali AT näytteitä, arvioitiin kukin lipidilajien, jonka tunnuksena käyttäen kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin t-testiä; tilastollista merkittävyyttä p 0,05, ilman oletuksia tiedon jakelu (normaalius). Global-mediaani normalisoitu tietoja myös itsenäisesti analysoitiin sallia pääkomponenttianalyysi (PCA), joka arvioi maailmanlaajuisen eroja kaikkien aineenvaihduntatuotteiden kussakin näytteessä kohorttien samanaikaisesti; kumppanuus- suoritettiin käyttäen R ohjelmisto ja tulokset löytyvät S1 kuvassa. Aineisto lisäksi tutkittiin tunnistaa mahdollisia vääriä löydöistä käyttäen Benjamini-Hochberg korjaus menetelmä [30]. Lopuksi, data analysoitiin korrelaatio LE vuosien Pearsonin korrelaatio menetelmällä käyttäen GraphPad Prism -ohjelmaa (versio 60F Mac OS X), jossa vastaava R

2 arvot taulukkona,

p

0,05 indikaattorina merkitys. Tiedot jotka piirrettiin PRISM ja multicomponent data lukuja rakennettiin Canvas Draw 2 (versio 1.01) for Mac OS.

Tulokset

Yhteensä seerumin lipidien kehittynyt LE

onko ollut mitään systeemistä lipidipohjaisista aineenvaihdunnan epätasapaino liittyy raajan AT laskeuman kroonisten kehittynyt syöpään liittyvien LE, 15 LE potilaan seerumit (taulukko 1) analysoitiin yhteensä kiertävän kolesterolin ja triglyseridien tasoja, ja verrattiin 13 normaalin terveen, sukupuolen Hyväksytty seerumi terveiltä luovuttajilta. Seerumin näistä molekyyleistä ovat hyvin samankaltaisia ​​LE potilailla oli läsnä terve, ei-LE, verenluovuttajia, ja molemmat ikäluokat sisälsi useita hyperkolesterolemisina henkilöitä eli yksilöiden kolesterolitaso yli suositellun tason terveille henkilöille, eli yli ”normaali alue ”(kuvio 2A). Huolimatta näistä yhtäläisyyksistä, seerumin HDL-kolesterolin määrän todettiin olevan pienempi (tilastollisesti merkitsevä, p = 0,0340), LE potilaista verrattuna terveen luovuttajan kohortin näytteitä, vaikkakin nämä näytteet olivat vielä normaalin rajoissa (kuvio 2A). Laskennallinen LDL-kolesteroliarvot olivat myös samanlaiset välillä LE ja normaali kohortti näytteistä (kuvio 2A), samoin kuin seerumin rasva-kuljettavien molekyylien, apolipoproteiini A1 ja apolipoproteiini B (kuvio 2B). Siten runsaasti seerumin lipidien ja lipidejä liikenne molekyylit ovat pitkälti ennallaan pitkälle syöpään liittyvien LE verrattuna normaaliin luovuttajien, ja normaalin rajoissa terveille aikuisille.

(A) Laatikko ja hiuksenhienosti tontit seerumin kokonaiskolesterolin, triglyseridien, HDL-kolesteroli ja lasketaan LDL-kolesteroli, ja (B) kokonaismäärä seerumin lipoproteiinin apoproteiini A1 ja apolipoproteiini B: n, LE potilaan (n = 15) ja normaaleille kohortin (n = 11) perifeerisen veren näytteitä. Linjan kunkin Ruudussa maailmanlaajuinen mediaani lasketaan kohortissa. Yleisesti hyväksytty väestö normaalitasolle (ET) on esitetty kussakin kuvaajan (pystysuora viiva, oikealla puolella). Tilastollinen merkitys (

p

arvo) välillä LE ja Normal (ei-LE) on myös esitetty, määritettynä kaksisuuntaisella t-testiä, ei olettaen yhtä suuri varianssi.

Serum Maksan rasvaprofiilin analysointi LE Potilaat

Koska nämä nopean diagnostisen laboratorion analyysit eivät anna tietoa tyypistä tai runsauden yksittäisten lipidien lajien, 7 satunnaisesti valittuihin LE potilasnäytteillä ja 3 ”normaali” (terve) luovuttajan seeruminäytteet analysoitiin edelleen kaasukromatografialla massaspektrometriaa (GC-MS). Tämä sallittu erityisiä molekyylitunnistus noin 31 rasvahappojen ihmisen seerumissa, mukaan lukien 4 haaraketjuisia rasvahappoja, jälkimmäinen ei analysoidaan usein muissa julkaisuissa tutkimiseen seerumin lipidejä. Kuitenkin ja sopusoinnussa seerumin lipiditasoja, ei yksittäinen seerumin rasvahappoja todettiin olevan läsnä LE Potilasseerumin joilla on muuttunut runsaasti kuin oli läsnä terve ”kontrolli” (non-LE) kohortti seerumia (data nyt osoittaneet; S1 data File; Sheet ”Serum”). Periaate komponenttien analyysi (PCA) suoritettiin myös, mutta, kuten odotettua, ei ole merkittävää maailmanlaajuista erot olivat ilmeisiä välillä LE ja normaali seerumi näytteitä, koska kaikki LE ja normaali kohortin datapisteitä olivat yleisesti ottaen inter-hajallaan (tuloksia ei ole esitetty). Kun otetaan lisäksi huomioon koko rasva-seerumi analyysi edellä kuvattuja, nämä tiedot osoittavat, että läsnäolo suuria määriä AT sisällä LE-vaikutti raajat kehittyneiden syöpään liittyvien raajan LE potilaille ei aiheudu havaittavissa eroja profiileja tai kiertävässä veressä -born lipidejä, joka arvioidaan näitä menetelmiä. Lisäksi tämä tulos kohdistuu tarkasti normaalin runsaasti seerumin liikenteen proteiinien apolipoproteiini A1 ja B LE seerumissa (edellä mainittu, kuvio 2).

Lymphedema rasvakudos (AT) Maksan rasvaprofiilin analysointi

puutteesta huolimatta eroa seerumin lipidien, se jäi tuntemattomaksi, jos LE AT itse koostui epätavallinen lipidimolekyyli profiilin tai muuntunut suhteellinen runsaus verrattuna normaaliin ihmisen raaja. Siksi molekyylirakennetta analysoitiin sekä kiinteän AT ( ”rasva”) käsittää ehjiä adiposyytin-rikas kudosta, samoin kuin jo vapautettu adiposyytin öljyä (eli rasva öljyä; jäljempänä nimitystä ”öljy”) läsnä lipoaspirates saatu LE potilaalla, joille rasvaimu leikkaus, ja verrataan tätä rasva ja rasva öljyä läsnä lipoaspirates saatu terveistä yksilöistä olevien liposurgery kosmeettisista syistä. Huomattavaa on, että kaikki lipoaspirate näytteet anatomisesti toisiaan, eli kaikki olivat käden tai jalan AT ja sekä kiinteän AT rasva, ja rasvan öljy, analysoitiin erikseen GC-MS ja LC-MS: llä. Tämä sallitaan samanaikaisen tunnistamisen ja suhteellinen kvantifiointiin (log muuttaneet mediaani-normalisoitu suhteellinen runsaus) noin 275 lipidejä molekyylit, mukaan lukien: 25 diasyyliglyseridit, 66 triglyseridien, 34 rasvahappoja, ja 150 fosfolipidejä eri luokkia, rasvaa ja rasva öljyä ihmisen lipoaspirate kudosnäytteitä.

Ensimmäinen, käytimme LC-MS tunnistaa diasyyliglyseridit (DAG) ja triacylglyceride (TAG) lipidejä sekä LE ja normaalia raajan AT. Vaikka suurin osa DAG ja TAG jotka havaittiin öljyn ja rasvan ihmisen LE AT oli läsnä samanlaiset runsaasti kuin havaittu normaalissa raajan AT (eli välillä -0,1-0,1 vähentää tai lisätä vertaamalla LE normaaliin), oli useita lipidilajien että yksitellen tilastollisesti merkitsevästi kasvaa tai pienenee LE verrattuna terveeseen kudokseen (kuvio 3A ja 3B, ja S2 Data File). Vaikka nämä muutokset olivat kukin melko pieniä, ilmeni, että useimmat korotukset olivat tunnisteet monityydyttymättömiä rasvahappoja, ja erityisesti ne, jotka sisältävät 3 tai useampia tyydyttymättömiä hiilivetyjä (valkoiset pylväät), erityisesti eikosapentaeenihappo C20: 5 (harmaat palkit), sekä LE AT rasvan ja öljyn (kuvio 3A ja 3B). Lisäksi kun nämä tiedot yhdistettiin yhteen vaikutti siltä, ​​että siellä voi olla globaali kasvu poly-tyydyttymättömiä rasvahappoja sisältäviä TAG ja kaventumiseen vähemmän tyydyttyneitä rasvoja, kuten di-, mono- tai täysin tyydyttymättömiä rasvoja, LE AT (kuvio 3C). Kuitenkin nisäkkäillä, C20-monityydyttymättömiä rasvahappoja ovat yleensä syntetisoidaan ravinnon hankitaan linolihappo (C18: 2) ja alfa-linenic happoa (C18: 3) toiminnan kautta rasvahapon desaturaasien ja elongaasien, ja proksimaalinen entsyymi tuottaa sekä arakidonihapon C20: 4 ja eikosapentaeenihapon C20: 5, mistä niiden esiasteista C18: 2 ja C18: 3, vastaavasti, on delta-5-desaturaasi. Sitä vastoin mono-tyydyttyneitä rasvahappoja ovat riippuvaisia ​​stearoyl-CoA desaturaasit. Siten on epäselvää, nämä pienet yksittäiset muutokset erityisiä DAG ja tunnisteet ovat biologisesti merkittäviä eli onko (i) ne kuvastavat todellisia muutoksia rasva-aineenvaihdunnan kuten lisääntyminen delta-5-desaturaasien ja /tai pienentää stearoyl-CoA desaturaasiaktiivisuutta, että myöhemmin tai samanaikaisesti johtaa lisääntyneeseen tuotantoon tulehdusta omega-3-pohjainen eikosapentaeenihappo C20: 5, tai vaihtoehtoisesti (ii) ovatko nämä pienet vaikutukset ovat kaikki yksinkertaisesti sisällä ulottuvuuksissa tausta vaihtelu-erityisesti sen pienen suuruus ja yleinen puute tilastollisen merkityksen jälkeen BH korjauksen analyysi. Kuitenkin, kohtuullinen alustava johtopäätös on, että LE AT näyttää olevan hämmästyttävän samankaltaisia ​​lipidomic profiili ei-LE AT (lukuun ottamatta suurempi pitoisuus C20: 5, joka sisältää TAG), ja että LE öljy, joka vapautuu revennyt rasvasolut Muistuttaa öljy, joka on läsnä koskemattomina AT rasvasolut (rasva) läsnäolon, vähintään suhteessa DAG ja TAG sisältöä.