Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta viimeaikaisista parannuksista hoitotuloksia uudempien androgeenireseptorin (AR) reitin salpaajat, vastus kastraatiotason kestävä eturauhassyövän (CRPC) pysyy edelleen kliinisen ongelman. Co-kohdistaminen vaihtoehtoinen resistenssinkehittymismallia ovat merkittävää etua hoitoon CRPC ja viivästyttää vastarintaa. Sekä AKT ja MEK signalointireitteihin aktivoituvat kuin eturauhassyöpä kehittyy vastustuskykyä AR-kohdistettuja hoitoja. Tämä pre-kliinisessä tutkimuksessa selvitetään yhteistyössä kohdentamalla väyliä AR-positiivisten eturauhassyöpä malleja. Erilaisilla

in vitro

malleissa eturauhassyövän tautitilojen kuten androgeeniriippuvaisessa (LNCaP), CRPC (V16D ja 22RV1) ja ENZ kestävä eturauhassyövän (MR49C ja MR49F), arvioimme merkitystä kohdistettu sekä AKT ja MEK reittejä. Tuloksemme osoittavat, että AKT esto indusoi apoptoosia ja estää solukasvua PTEN null solulinjoissa riippumatta niiden herkkyyttä hormonihoito; kuitenkin, AKT inhibitio ei ollut vaikutusta PTEN positiivisen 22RV1 solulinjassa. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että MEK: n esto oli enemmän vaikutusta 22RV1 soluihin verrattuna LNCaP, V16D tai ENZ-resistenttien solujen MR49C ja MR49F soluja.

In vitro

, yhdistelmä AKT ja MEK saarto oli näyttöä synergiaa havaittiin joissakin solulinjoissa ja määritykset, mutta tämä ei ollut yhdenmukainen kaikissa tuloksia.

In vivo

, yhdistelmä AKT ja MEK inhibitio johti enemmän johdonmukaisesti kasvaimen kasvun inhibition MR49F ksenograftien ja pidemmän tautikohtaisten eloonjäämistä verrattuna AKT-estäjällä monoterapiana. Kuten meidän

in vitro

tutkimuksessa 22RV1 ksenograftit olivat vastustuskykyisempiä AKT eston, kun he olivat herkempiä MEK esto. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohdentaminen AKT ja MEK yhdistelmä voi olla arvokas strategia eturauhassyövässä kun molemmat reitit aktivoituvat ja tukee edelleen merkitystä kuvaavat hallitseva onkogeeninen väylän kunkin potilaan kasvain, jotta voidaan valita paras mahdollinen hoito.

Citation: Toren P, Kim S, Johnson F, Zoubeidi A (2016) Yhdistetty AKT ja MEK Pathway Blockade prekliinisissä mallit Enzalutamide hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10,1371 /journal.pone.0152861

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 07 lokakuu 2015; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2016; Julkaistu: 05 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Toren ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Rahoitusta saatiin Discovery Grant, eturauhasen syöpä Kanada ja AstraZeneca A. Zoubeidi. PT tukivat Kanadan Urologisessa Association tukisäätiön. AstraZeneca oli mukana neuvotteluissa, jotka koskivat tutkimuksen suunnittelu ja tarkistaminen käsikirjoituksen, mutta tietojen keruun ja analysoinnin sekä päätös julkaista tehtiin kirjoittajat. Toinen rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: AZ, kuvaa vastaanottaa tutkimusrahoituksen AstraZeneca ja Gilead Sciences. PT tuodaan esille vastaanottava tutkimusrahoitusta Innocrin Pharma. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Medical tai kirurgisen kastraation edelleen ensimmäinen rivi systeemisen hoidon etäpesäkkeitä eturauhassyövän (PCA) lähtien sen löytö yli 70 vuotta sitten [1]. Valitettavasti parannuskeino on edelleen heikko seuraava kastraatio ja potilaat väistämättä edetä kehittää kastraatiotason resistenttejä eturauhassyöpä (CRPC). Voimakkaat androgeenireseptorin (AR) reitin inhibiittorit, kuten enzalutamide (ENZ) ja abirateronin ovat nyt yleisesti käytetään potilailla, joilla on CRPC. Vaikka selviytyminen paranee, kestävyys kuitenkin väistämättä kehittyy näille aineille [2]. On odotettavissa, että lisääntyneeseen kliinistä käyttöä näiden voimakkaampi AR reitin inhibiittorit että kohdentamismenetelmiä muunmaalaisten AR ajettu resistenssinkehittymismallia saavat yhä tärkeämpiä [3]. Siksi ymmärrys ja kohdentamalla reittejä sekaantunut vastustuskyky on tärkeä kliininen merkitys.

PI3K /AKT /mTOR ja RAF /MEK /ERK signalointireitteihin tärkeä rooli solujen selviytymisen, hoito vastus, ja yhteistyötä helpottaakseen PCa eteneminen CRPC [4-8]. Sekä AKT [9, 10] ja ERK [11, 12] signalointipolkujen ovat ajan säädellään CRPC ja niihin liittyy huono tulos [13, 14]. On laaja ylikuuluminen näiden kahden reitin sekä muiden kasvaimia synnyttävän polkuja [15, 16]. Olemme aiemmin osoittaneet, että sekä AKT ja ERK aktivoidaan hoidon jälkeen ENZ PCA soluissa [17]. Kohdistaminen AKT yksin riitä aiheuttamaan ehdollisen kuolleisuutta johtuen palautteen signalointi aktivoitumiseen johtavat AR ja siksi kohdistaminen AKT yksin ei ole hyvä strategia torjumiseksi ENZ vastus [18]. Mielenkiintoista, kaksi esto PI3K /AKT ja MEK /ERK reitit ovat osoittaneet lupausta prekliinisissä malleissa muiden syöpien [19-22]. Tulokset yhdistelmän mTOR-estäjän kanssa MEK estäjän transgeenisissä

NKx3

.

1-PTEN

hiiren eturauhassyöpämallin edelleen tukee perusteluissa yhdistettyä lähestymistapaa, eturauhasen syöpä [14] terapia.

Siksi asetimme tutkia yhdistelmä AKT plus MEK estäjähoidosta ihmisen eturauhassyövän malleja, erityisesti ENZ kestävä eturauhassyövän malleja. Me valitaan paneelin solulinjojen ENZ kestävä LNCaP-solulinjat sekä 22RV1 solulinja. 22RV1 eturauhassyöpäsolulinja hallussaan aktivointia MEK /ERK-reitin [23], kun taas ENZ vastustuskykyisten MR49C ja MR49F havaitaan olevan enemmän riippuvaisia ​​AKT-reitin aktivaation [24]. Osoitamme, että yhdistelmä saartoon AKT ja MEK ei parantaa vasteita verrattuna monoterapiaan joissakin ourin

in vitro

ja

in vivo

eturauhassyövän kokeiluja. Huomattavaa on, että tulokset vaihtelevat huomattavasti eri malli järjestelmien kanssa ilman lisähyötyä joissakin tapauksissa korostetaan tarvetta asianmukaisesti tunnistaa, mitkä potilaat hyötyvät eniten yhdistelmä lähestymistapa.

Materiaalit ja menetelmät

eturauhassyöpäsolulinjoissa

ihmisen eturauhassyöpä LNCaP ja 22RV1 käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa toimitti ystävällisesti Dr. Leland WK Chung [25] (1992 MDACC, Houston Tx). V16D (kastroida kestävä), MR49F ja MR49C soluja (enzalutamide kestävä) saatiin sarjasiirrostuksilla ksenografti läpikulun LNCaP kuten aiemmin on kuvattu [26] (S1 Kuva). Lyhyesti, LNCaP-solut ruiskutettiin hiiriin ja, kun seerumin PSA saavutti 50 ng /ml hiiret kastroitu. Kun seerumin PSA saavutti jälleen 50 ng /ml 5-6 viikkoa myöhemmin kasvaimet kutsuttiin kastraatiotasolle resistenttejä. V16D solut on johdettu LNCaP vierassiirrettä vastustuskykyisiä kastraatio. Kasvaimet leikattiin irti ja solulinjoja androgeeni elatusaineessa. Sillä MR49C ja MR49F solulinjoissa, kun LNCaP ksenografteissa saavuttanut kastraatiotasolle kestävä tilassa, niitä käsiteltiin 10 mg /kg ENZ kanssa myöhemmin PSA väheneminen alhaisen seerumin arvoihin. Kun seerumin PSA palasi castrate resistenttejä tasolle tai korkeammalle, kasvaimia kutsuttiin ENZ kestävä. Nämä kasvaimet vietiin sitten 3 kertaa kastraatiotason käsitellyillä hiirillä ENZ ja solulinjoja. Soluja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa 5% CO2-atmosfäärissä, jossa on 10 uM ENZ lisätään kaikki median MR49C ja MR49F soluja.

Reagenssit

AKT-estäjällä AZD5363 saatiin AstraZeneca (Macclesfield, UK). ENZ ostettiin Shanghai Haoyuan Chemexpress (Shanghai, Kiina), PD0235901 alkaen Selleck Chem (Houston, TX) ja LY294002 ja UO126 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). LY294002 on palautuva PI3K estäjä; AZD5363 on kilpailukykyinen yleiseurooppalainen AKT-estäjällä [27]. PD0325901 on kilpailukykyinen MEK1 /2-estäjä, kun UO126 inhiboi MEK1 /2 ei-kilpailukykyinen, valikoivasti [28]. Kantaliuoksia AZD5363, PD0235091, UO126 ja LY294002 valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma-Aldrich); ENZ valmistettiin H

2O.

soluproliferaatiomääritykset

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 96-kuoppaisille viljelylevyille käyttäen WST-1-reagenssia ja /tai kristallivioletti määritys, kuten on kuvattu aiemmin [26].

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä propidiumjodidilla värjäys suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu [29]. Suhteellinen DNA pitoisuus analysoitiin FACS Canto II virtaussytometrillä käyttäen cyflogic v1.2.1 ohjelmisto (www.cyflogic.com) analysoitavaksi.

kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys

kaspaasi-3-aktiivisuus oli arvioitiin käyttämällä kaspaasi 3 Pitoisuus kit, jossa asetyyli Asp-Glu-Val-Asp 7-amido-4-metyylikumariini (Ac-DEVD-AMC) fluorometrisen alustan (Enzo Scientific). Kolmekymmentä mikrogrammaa kokosolulysaatissa inkuboitiin kaspaasi-3 alustan AC-DEVD-AMC 37,5 ° C: ssa 2,5 tuntia ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden määrä määritettiin fluorometrillä virityksellä asetettu 365nm ja emissio 460 nm. Kertainen muutos eroja ohjaus laskettiin seuraavan vähentämällä lukemien nollakoekuoppien ilman lysaattia.

Western blot-analyysi

Yhteensä proteiinit uutettiin RIPA puskuria kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. 30-50 ug proteiinia lysaatti erotettiin SDS-PAGE: lla ja Western blot suoritettiin käyttäen ensisijaista vasta-aineita PSA, AR (Santa Cruz Biotechnology), vinkuliinin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PARP, p-AKT Ser473 , AKT, p-ERK yhteensä ERK yhteensä S6 ja p-S6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Detection johdetun vasta suoritettiin käyttäen ODYSSEY IR kuvantamisjärjestelmä (Li-COR Biosciences) tai ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

Quantitative käänteistranskriptio (RT) -PCR

RNA ja RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30]. Reaaliaikainen seuranta PCR-monistus cDNA tehtiin käyttämällä seuraavia alukepareja ja koettimia:

AR

(Hs00171172_m1),

PSA

(Hs00426859_g1), ja

GAPDH

(Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) käyttäen TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Kohdegeenin ilmentymisen normalisoitiin

GAPDH

tasot vastaavissa näytteissä sisäisenä kontrollina.

Eläinten hoito

Kuusiviikkoisia uros kastroitu kateenkorvattomia nude-hiirten (Harlan Sprague-Dawley, Inc.) injektoitiin subkutaanisesti 2×10

6 MR49F soluja (suspendoitu 0,1 ml Matrigel, BD Biosciences) on molempiin kylkiin. Yhdeksän hiirtä per varsi satunnaistettiin ajoneuvo (0,1% metyyliselluloosaa), AZD5363 100 mg /kg kahdesti vuorokaudessa, PD0325901 5 mg /kg OD tai yhdistelmän. ENZ 10 mg /kg annettiin ennen siirrostusta ja sitä jatkettiin kunnes oli saavutettu tuumoreiden 200mm

3. Tuumorimäärityksiä mitattiin joka toinen viikko ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa P x L x d x 0,5236. Lääkkeet annettiin suun kautta letkulla 5 päivää päälle, 2 kpl. PSA-pitoisuudet mitattiin viikoittain automatisoidulla entsymaattista immunomääritys (Cobas, Montreal, Quebec, Kanada). Hiiret tapettiin, jos koko kasvain taakka oli 2000 mm

3 tai oli 20% painon menetys. Sillä 22RV1 ksenografteista, 2×10

6 solua ympättiin vasempaan kylkeen nude kastraatiotasolle hiirillä. Kahdeksan hiirtä per varsi satunnaistettiin ajoneuvoon, AZD5363 100mg /kg BID, selumitinib (AZD6244; ARRY-142886) 25 mg /kg BID, ja yhdistelmä. 22RV1 ksenografteja tapettiin kun kasvaimen tilavuus oli 1500 mm

3. Kaikki hiiret seurata säännöllisesti mahdollisen kliinisen tilan valvonnassa eläinlääkärin University of British Columbia. Lopetettaessa kaikki hiiret syvä anestesia isofluraanilla ennen niiden eutanasia CO2. Kasvaimet talteen lopettamisen jaettiin osiin ja jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä tai kiinnitetty formaliiniin. Kaikki eläin menettelyt suoritettiin kanadalaisen neuvoston Eläinten hoito -suosituksia ja hyväksynnällä Animal Care komitean University of British Columbian (protokolla # A12-0210).

immunohistokemia

kudos microarray kaikista MR49F ksenograftikasvaimissa rakennettiin käyttäen manuaalista kudosta microarrayer (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [31]. Kaikki vertailut värjäytymisvoimakkuuksia tehtiin klo 20X suurennus kolmelle näytteelle jonka patologi sokaisi hoitoon tehtävän.

Tilastollinen

Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, jossa yksisuuntainen ANOVA käytettiin tunnistamaan merkittäviä eroja useiden hoitojen. Kun ANOVA osoitti merkittäviä eroja (p 0,05), Tukeyn HSD post-hoc testiä käytettiin vertaamaan keinoin. Kasvaimen kasvunopeus laskettiin käyttäen lineaarista regressiota. Kaplan Meier selviytyminen analyysi verrattuna syövän erityinen eloonjäämisen (CSS) ja kokonaiselossaolo, jossa log-rank-testiä käytettiin vertaamaan ryhmille. CSS määriteltiin aika hoidon alusta saakka kasvaimen kokonaistilavuus ylitti 2000mm

3 ja kokonaiselossaoloaika kuin aika hoidon aloituksesta lopetukseen asti. Yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin käyttäen CalcuSyn ohjelmistoa (Biosoft, Cambridge, UK). CI 1 osoittaa synergiaa, CI 1 osoittaa antagonistista vuorovaikutusta.

Tulokset

vaikutus kohdistaminen MEK ja AKT reitit AR signalointireitille

Tutkiakseen merkityksellisyys AKT ja MEK reittejä PCA, suunnattiin kunkin väyliä käyttäen AZD5363 (AKT-estäjällä) ja PD0325901 (MEK estäjä). Olemme arvioineet vaikutuksia yksinään ja yhdistelmänä malleissa eri vaiheissa eturauhasen syöpä, mukaan lukien androgeenien herkät solut (LNCaP), castrate resistenttejä (V16D, 22RV1) ja ENZ-resistenttien solujen (MR49C ja MR49F) (kuvio 1). Esto AKT kanssa AZD5363 arvioitiin sen vaikutus AKT alavirtavaikuttajainhibiittorit p6SK eikä AKT-fosforylaation itse, koska luonteen AZD5363. Periaatteessa AZD5363 indusoi lisääntynyt AKT fosforylaatio, joka ei ole aktiivinen, tapahtuu ilmiö, jossa monet ATP kilpailukykyinen, katalyyttinen estäjiä AKT, ja johtuu proteiinin pidetään hyperfosforyloitunut mutta katalyyttisesti inaktiivinen muoto seurauksena yhdistettä sitova edellä todettiin . AZD5363 havaittiin indusoivan väheneminen S6K fosforylaatio kaikissa solulinjoissa; tämä vaikutus oli huomattavampi PTEN null solut MR49C, MR49F, LNCaP ja V16D soluja verrattuna PTEN positiivisia 22RV1 soluja (kuvio 1). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin käyttämällä muita MEK-estäjä (UO126) ja AKT-estäjällä (LY294006) tai yhdessä Ay (kuvio 1, S2 kuvassa). Vuonna 22RV1 soluissa, PD325901 täysin kumotaan ERK-fosforylaation, kun taas AZD5363 ei ollut vaikutusta AKT alavirtavaikuttajainhibiittorit S6K fosforylaatio, joka oli vain yhdistelmällä AZD5363 ja PD0325901 (kuvio 1). Kuitenkaan mitään ylimääräistä laskua Perk tasojen havaittiin yhdistelmällä verrattuna MEK estäjä ei yksinään. Lisäksi havaitsimme, että AKT esto lisäsi sekä AR ja PSA-proteiinin ja RNA-tasot LNCaP ja sen johdannaiset (kuvio 1). Vaikka AZD5363 lisääntynyt AR ja PSA-tasot kaikissa solulinjoissa, vaikutus PD0325901 on AR ja PSA-tasot yksin tai yhdessä AZD5363 vaihteli solulinjojen (kuvio 1). Toisin kuin LNCaP-pohjainen solulinjoissa, PSA nosti edelleen yhdistelmä AZD5363 ja PD0325901 in 22RV1 soluissa. Erityisesti nämä tulokset peilattu vastaavat tiedot aiemmin testattu onnistunut yhdistelmä AZD5363 ja ENZ joissa muutokset AR ilmaisun myös vaihteli 22RV1 ja LNCaP-pohjainen solulinjoissa (S2 kuvassa) [32]. Yhdessä voimme päätellä, että AKT ja MEK yhteistyössä säädellä AR-reitin.

(A) vaikutus AKT ja MEK estoa loppupään signalointireitteihin. Androgeeniriippuvaisessa PCa LNCaP, CRPC (V16D ja 22RV) ja ENZ resistenttejä solulinjoja MR49C, MR49F solulinjoja käsiteltiin AZD5363 1 uM, PD0325901 20 uM yksinään tai yhdessä 48 tuntia. Yhteensä proteiinit uutettiin ja western blotit suoritettiin käyttämällä AR, PSA ja PI3K /AKT-reitin signalointi proteiineja kuten. Edustavia blots päällekkäisiä kokeita näkyvät. (B-C) vaikutus AKT ja MEK estoa AR kautta. MR49C, MR49F ja 22RV solulinjoja käsiteltiin AZD5363 1 uM, PD0325901 20 uM yksinään tai yhdessä 48 tuntia. RNA uutettiin eri solulinjojen ja kvantitatiivinen reaaliaikainen suoritettiin käyttäen Taqman-koettimia AR (B) ja AR kohdegeenin PSA (C). Edustavia tulokset biologisen kaksoiskappaleet teknistä triplikaatit näkyvät.

vaikutus yhdistelmän MEK ja AKT eristämisen apoptoosia ja proliferaatiota

määrittämiseksi biologinen aktiivisuus kohdistamista AKT ja MEK signalointi reitit-solujen apoptoosin, käsittelimme meidän paneeli solulinjojen kanssa AZD5363, PD0325901 tai yhdistelmä. Tuloksemme osoittivat, että yhdistelmä kohdistaminen AKT ja MEK indusoi apoptoosin mikä näkyy lisääntynyt sub G0 /G1 solusyklin väestöstä. Tämä vaikutus oli suurempi kuin AZD5363 monoterapiana CRPC soluissa V16D (17% vs. 10%, P = 0,009) ja ENZ kestävä MR49C (29% vs. 12%, p = 0,005) ja MR49F (12% vs. 3%, p = 0,006 ) solut. Yksikään hoitojen näytteillä merkittäviä muutoksia osa G1 /G0 jae 22RV1 soluissa (kuvio 2). Sen sijaan, androgeeni-herkkien LNCaP-solut, yhdistelmähoito terapia ei näytä vielä induktio sub G1 /G0 verrattuna AZD5363 monoterapiaan (17% vs. 16%, p = 0,76). S-vaiheen ja G2 /M jakeet näytti laskevan vastaavan määrän MR49C, MR49F ja V16D solujen AZD5363 tai yhdistelmällä, jossa on merkittäviä eroja sekä hoitoja ohjaus (P 0,001). Lisäksi AZD5363 ja PD325901 yhdistelmä indusoi lohkaista PARP LNCaP-pohjainen solulinjoissa verrattuna PTEN positiivisten solujen 22RV1 soluja (kuvio 2). Vaikka ei tilastollisesti erilainen, samanlainen suuntaus havaittiin kaspaasi 3 -aktiivisuusmäärityksiä (kuvio 2).

(AE) propidiumjodidianalyysi virtaussytometria solusyklin analyysi ilmoitetun solun kesken näkyy kasvanut apoptoottisten solu- syklin osa (SubG1 /G0) (vasemmanpuoleiset paneelit). Keinot rinnakkaisessa kokeessa on piirretty +/- SEM. Edustavia tulokset kaikista solukierron populaatiot näkyvät oikeassa paneelit. (F) Indikoitu soluja käsiteltiin AZD5363 1 uM, PD0325901 20 uM, tai yhdistelmä 48 tuntia. Proteiinit uutettiin, ja Western blot suoritettiin käyttäen PARP-vasta-ainetta, vinkuliinin käytettiin latauskontrollina. Edustaja blots kahden tai useamman kokeen on esitetty. (G) kaspaasi-3: n aktiivisuuden in MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP ja V16D solulinjoja käsiteltiin AZD5363 ja /tai PD0325901 24 tuntia. Mean kertainen muutos +/- SEM yhdistettyjen arvojen ainakin kahdesta biologisen kaksoiskappaleet esitetään.

tutkimme seuraavaksi, jos vaikutus havaittiin solujen apoptoosin voidaan kääntää solujen elinkykyä. Tuloksemme osoittavat, että kohdistaminen AKT: ä käyttäen AZD5363 vaikuttaa solujen elävyys kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 3), kun kohdistaminen MEK joko PD0325901 (kuvio 3) tai UO126 (S3 kuvassa) oli suurempi aktiivisuus 22RV1 soluissa verrattuna muihin solulinjoja edelleen vahvistaa tietomme solusyklin väestöön ja PARP pilkkominen. Vaikka me havaittu kehitys laski elinkelpoisuuden ja synergia yhdistelmä verrattuna monoterapiassa LNCaP-soluissa ja V16D soluja, vuonna MR49C ja MR49F solujen yhdistelmää ei näy synergistisiä (kuvio 3). Tämä vahvistettiin käyttämällä yhdistelmää MEK estäjän U0126 kanssa AKT-estäjällä LY294006 in MR49C, MR49F soluja (S3 kuvassa). Synergy havaittiin 22RV1 solujen yhdistelmällä indeksi 1 (kuvio 3, S3 kuvassa).

(AE) MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP ja V16D solulinjoja käsiteltiin AZD5363 ja /tai PD0325901 kuin osoitti 48 tuntia ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä WST-1-määritystä. Yhdistettiin tulokset biologisen kolmena rinnakkaisena teknisiä triplikaatit näkyvät. Yhdistelmä indeksit on esitetty upotettavat, joiden arvot 1 osoittaa synergiaa.

kohdistaminen AKT ja MEK reittejä yhdistelmänä estää kasvaimen kasvua ja parantunut syövän erityinen selviytymisen

Koska toiminta yhdistelmähoitoa osoittivat erot liittyvät PTEN ilmaisun, tutkimme

in vivo

miten kohdistamista AKT ja MEKin vaikuttaa kasvaimen kasvua kahdessa mahdollisessa kliinisissä (PTEN positiiviset ja negatiiviset kasvaimia). Käytimme ENZ kestävä MR49F solujen ja CRPC 22RV1 solujen arvioida

in vivo

yhdistelmän tehoon kohdentamisen AKT ja MEK polkuja.

MR49F -ksenografteja herkkä AZD5363, jolloin arviointi Lisäetuna kanssa MEK saarto haastavaa. Monoterapiahoidossa kanssa PD0325901 osoittivat kasvaimen kasvun esto ja osoittivat ei-merkitsevä suuntaus alentaa seerumin PSA verrattuna ajoneuvoon (kuva 4). Yhdistelmä hoidon AZD5363 ja PD0325901 että MR49F ksenografteissa ei aiheuttanut suurempaa pienenemistä kasvaimen tilavuuden verrattuna AZD5363 monoterapiaan, mutta yhdistelmä ei ole merkittävästi parantunut syövän erityinen eloonjäämisen (CSS) (P 0,001) verrattuna ajoneuvo- ja PD0325901- hoito varret (kuvio 4). Mediaani CSS oli 17 päivää ja vehikkelillä käsitellyillä hiirillä, 25 päivää ja PD0325901-käsitellyillä hiirillä, ja ei saavutettu joko AZD5363 yksinään tai yhdessä PD0325901. Ei hiiret yhdistelmähoitoa saaneilla lopetettiin johtuen kasvaimen kokoa 35 päivän jälkeen hoidon. Seerumin PSA väheni merkittävästi sekä AZD5363 ja yhdistelmä hoitoryhmien verrattuna vehikkeliin (kuvio 4).

Kun perustaminen kasvaimia (200mm3) päässä ihon alle ENZ resistenttien MR49F solujen kastroitu hiirissä paineessa 10 mg /kg vuorokaudessa ja ENZ, hiiriä hoidettiin 100 mg /kg, AZD5363 100 mg /kg kahdesti vuorokaudessa, PD0325901 5 mg /kg QD tai AZD5363 100 mg /kg kahdesti vuorokaudessa + PD0325901 5 mg /kg kerran vuorokaudessa. (A) edustaja data MR49F kasvaimen keskimääräisen tilavuuden 4 viikon näytetään. (B) Keskimääräinen MR49F kasvaimen kasvunopeus kussakin testiryhmässä +/- SEM laskettiin käyttäen lineaarista regressioestimointi kasvaimen kasvunopeus kullekin hiirelle. (C) Mean MR49F viikoittain PSA piirretty kertainen muutos perustasosta kussakin testiryhmässä +/- SEM. (D) vesiputous juoni Yksittäisten PSA mittausten jälkeen 3 viikon kohtelu kaikille MR49F vierassiirrännäiset tutkimuksessa. (E-F) Kaplan-Meier syöpää erityisiä elossaolo ja kokonaiselossaoloaika käyrät hoitoon käsivarret MR49F ksenograftien. (G) keskimääräinen 22RV1 -ksenografti tilavuus hoidon jälkeen ajoneuvo, AZD5363 100mg /kg BID, selumetinib 25mg /kg QD tai AZD5363 100 mg /kg kahdesti vuorokaudessa + selumetinib 25mg /kg QD. Mean kertainen muutos kasvaimen koon on piirretty +/- SEM. (H) vesiputous käyrä 22RV1 ksenograftin kasvainten 6 viikon kuluttua hoidon aloittamisesta.

vieressä arvioitiin yhdistelmä AKT ja MEK-reitin estäminen käyttäen 22RV1 ksenografteina kastroitu hiirillä. AZD5363 käytettiin taas AKT- estäjällä kun Selumetinib valittiin MEK estäjä, joka voi olla kliinisesti merkitsevää, koska se on tällä hetkellä kliinisessä arvioinnissa ja äskettäin hyväksytty melanooman hoitoon. Toisin kuin MR49F mallin, 22RV1 kasvaimet olivat suhteellisen epäherkkiä AZD5363, mutta ei osoittavat kasvaimen kasvun estämistä sekä Selumetinib ja yhdistelmä Selumetinib plus AZD5363. Kun kaikki 22RV1 kasvaimia kasvaa suhteellisen voimakkaasti hoidosta huolimatta, ei havaittu merkittäviä eroja hoitoryhmien välinen, vaikka suurin kasvaimen kasvun esto nähtiin yhdistelmähoidon (kuvio 4).

analyysi yksittäisten hiirten kasvainten tilavuudet MR49F malli viittaa siihen, että yhdistetyn estäminen voi hyödyttää alijoukko hiiriä (kuvio 5). Vuonna AZD5363 monoterapiana käsivarteen, kun taas useimmat kasvaimet vastasivat hyvin, valitse tapauksissa kasvaimen kasvun estäminen oli minimaalinen. Kuitenkin yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä, vieraita havaintoja ei havaittu (kuvio 5). Erityisesti immunohistokemia värjäytyminen MR49F kasvaimia osoitti lisäansiot värjäytyminen hiirillä, jotka osoittivat resistenssiä AZD5363 (kuva 5). Mitään merkittävää Perk värjäytymistä nähtiin hiirissä, jotka vastasivat hoitoon (kuvio 5) eikä ollut eroja PS6 värjäystä tai Ki67 värjäytymistä havaitaan välillä yhdistelmähoito ja AZD5363 monoterapiana varsi (Kuva 5).

(A) yksittäiset kasvaimen kasvukäyrät kaikkien hiirten tutkimuksessa ryhmitelty hoito. (B) immunohistokemia Perk osoittaa havaittavia määriä 3 hiirten varhainen vastustuskykyä AZD5363 hoitoon (ylhäällä); 3 muut hiiret hoidettiin AZD5363 on esitetty vertailun (alhaalla). (C) Värjäys microarray yksilöitä osoittaa, että positiivinen Perk värjäytyminen oli vain ilmeinen näissä hiirissä. (D) osuus PS6 on väheni AZD5363 ja suuremmassa määrin yhdistelmähoitoa AZD5363 + PD0325901. (E) Ki67 värjäys markkerina leviämisen. Kudos mikrosiru konstruoitiin käyttäen kasvainnäytteestä kussakin ryhmässä (7-9 ryhmää kohti). Keskiarvot värjäytymisen intensiteetti luokiteltava pidennetyn patologi esitetään +/- SEM.

Keskustelu

Huolimatta menestyksestä kastraatio ja uudemmat voimakkaita AR-reitin estäjiä, kuten enzalutamide, hoito vastus esiintyy kaikissa tapauksissa. Pysyvät AR signalointi on yleensä kliinisesti todettu nousevalla PSA. Pysyvyys AR-signalointi voidaan ajaa useita resistenssin lukien AR silmukoitumisvarianttia sisäinen kasvaimen tuotantoa androgeenien ja aktivaation vaihtoehtoisen reittejä, jotka tukevat AR signalointi, kuten AKT ja MEK reittejä [33]. Yhdistelmähoitoa PCA pätee mahdollisuudet lisätä potilaiden eloonjäämisen estämällä näiden resistenssinkehittymismallia.

Early kliinistä kokemusta PCa potilailla viittaavat siihen, että kohdistaminen AKT yksin ei ole tehokas strategia. Kliinisissä tutkimuksissa, joissa AKT-estäjällä monoterapian CRPC ovat osoittaneet vähäistä menestystä tämän lähestymistavan [34, 35]. Ennen

in vitro

Niiden mukaan PI3K /AKT esto voi johtaa ajan sääntelyn Raf /MEK /ERK-reitin [36], ja meidän tulokset MR49F ksenograftimallia ehdottaa myös tämä voi tapahtua joissakin tapauksissa . Hyvin tunnustettu ylikuulumisen välillä reittejä tarjoaa perusteet yhdistyvät sekä näiden estäjien [19-22, 37-39]. Kliininen kokemus dual kohdentaminen MEK ja AKT reittejä on vähän; alustavista tuloksista pitkälle edennyt syöpä viittaa siihen, että dual kohdentaminen molempien reittien paranee onkologisesta tehokkuus on suuremman toksisuuden kustannuksella [40].

Tutkimuksemme korostetaan eroja, jotka voivat esiintyä AR positiivisen PCa malleja ja erityisesti merkitystä PTEN tilan, kun kohdistaminen AKT ja MEK polkuja. Mielenkiintoista, kohdistaminen AKT-reitin lisääntynyt PSA transkription eloonjääneiden solujen ja tämän vaikutuksen, totesi aiemmin muiden [41], voi olla tärkeää pohtia suunnittelussa tulevien kliinisten tutkimusten Näiden kohdennettujen aineilla koska PSA on yleisesti käytetty markkerina etenemistä. Vuonna LNCaP-johdettu ENZ kestävä malleja, MEK esto lisäsi vaatimaton hyöty verrattuna AKT esto; kiinnostavasti synergian näytti olevan suurempi

in vivo

kuin

in vitro

. Vuonna 22RV1 soluissa, MEK esto yksin ollut merkittävä vaikutus soluproliferaatioon ja signalointi, mutta yhdistelmä MEK ja AKT esto osoitettiin minimaalinen lisähyötyä

in vitro

. Näin ollen, vaikka parannuksia syövän vastaista aktiivisuutta havaittiin joidenkin mittareiden kanssa yhdistelmän kunkin mallin, jokainen malli ilmestyi suhteessa riippuvaisiksi AKT ja MEK, vastaavasti, mikä rajoittaa hyöty yhdistelmähoitoa.

Yhdistetty kohdistaminen MEK ja AKT polku on tutkittu useissa muissa syövissä prekliinisissä malleissa, joissa tulokset tukevat yhdistelmän käyttö [19-22, 37-39]. In prekliinisen eturauhassyöpä

in vivo

tutkimuksessa PD0325901 arvioitiin yhdessä mTOR-estäjä rapamysiini [14]. Vaikka emme noudata mitään merkittävää laskua Ki67 yhdistelmällä, tämä saattaa liittyä kerätä kaikkia kasvaimia lopussa tutkimuksen, jossa vaiheessa ksenograftikasvaimissa olivat hoito-resistenttejä. Äskettäin Park et al, osoitti yhdistelmä selumitinib ja yleiseurooppalaisen PI3K estäjä GSK2126458 parantaa kasvaimen kasvun estämistä verrattuna joko monoterapiana AR-negatiivisten DU145 ja PC3 ksenografteissa [42]. Kaiken kaikkiaan niiden tuloksia AR-negatiiviset mallit ovat verrattavissa tuloksemme. Yhdessä tietomme viittaavat siihen, että teho kohdistaminen AKT ja MEK on riippumaton tautitilan eturauhassyövän, ja että tehokkuus korreloi aktivoitumisen näistä reiteistä on kasvain.

tutkimus on rajoitettu useiden puolia eturauhassyövän malleja. LNCaP-solut näyttävät olevan erittäin riippuvainen AKT kautta. Kuitenkin, kuten AR positiivinen, PSA tuottavista solulinjoista aktivoidun PI3K /AKT-reitin, ne eivät muistuta yhteistä CpRC fenotyyppi havainnut [43]. Lisäksi meidän ENZ kestävä mallit osoittavat useita fenotyyppejä yhdenmukainen kliinisten ENZ-resistenttejä, kuten jatkuva AR tumalokalisaatio, AR F876L mutaatio, ja säätelyä steroiodogenic entsyymejä [26, 32, 44]. 22RV1 solut satama androgen silmukoitumisvarianttia, joka ennustaa huonompi vaste AR-reitin inhibiittorit [45]. Läsnäolo enzalutamide-agonistinen F876L mutaatio ja läsnäolo hallitseva AR silmukointivariantit rajoittuu kykymme testata tehokkuuden yhdistetyn AKT ja MEK esto yhdessä AR eston edennyt eturauhassyöpä malleja. Edelleen, kun taas meidän in vitro tutkimuksia ei ole tehty androgeenien puutteellinen media, on epäselvää, onko tämä johtaisi merkittävästi erilaisia ​​tuloksia erityisesti CRPC kasvaimet voivat tuottaa omia androgeenien kautta

de novo

synteesi reittejä [46] . Siten tuloksemme kastraatiotason olosuhteissa

in vivo

eivät olisi olennaisesti erilainen.

Yhteenvetona tuloksemme ENZ kestävä CRPC solumalleja viittaavat siihen, että yhdistelmä käsittely AKT ja MEK esto voi olla järkevä yhdistelmä osajoukko kestävä eturauhassyövän tapauksista tarvitsevat lisätutkimuksia. Tuloksemme osoittavat myös, että on tärkeää kohdistaminen estäjien kasvaimen reittejä, joiden tiedetään aktivoidaan; hyvin valikoiduilla potilailla monoterapia saattaa olla yhtä tehokas kuin yhdistelmähoito. Kaiken kaikkiaan tämä korostaa tarvetta järkevä, biomarker perustuva valinta Potilaiden kohdennettuja terapeuttisina arvioidaan kliinisissä kokeissa.

tukeminen Information

S1 Kuva. MR49C solut ovat vastustuskykyisiä ENZ.

5×10

4cells ympättiin 12-kuoppalevyille ja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 uM). 72 tunnin altistuksen, viljelyalusta vaihdetaan tuoreeseen elatusaineeseen yksinään (Palauta) tai ENZ (jatka). 48 tuntia myöhemmin, solujen elinkykyisyys analysoitiin kristalliviolettiliuokseen määrityksessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0152861.s001

(TIF)

S2 Kuva. Vaikutus yhdistelmän AKT plus MEK inhibitio vaihtoehtoisen estäjien solun signalointi.

(A) MR49C ja MR49F solulinjoja käsiteltiin LY294006 20 uM, UO126 10 uM, tai yhdistelmä 48 tuntia.