Krooninen sairaus

tiivistelmä

sarja uusia antraseenin L-rhamnopyranosides yhdisteet suunniteltiin ja syntetisoitiin ja niiden antiproliferatiivinen toimintaa syöpäsolujen linjat tutkittiin. Huomasimme, että yksi johdannainen S-8 (EM-d-Rha) esti voimakkaasti solujen lisääntymisen paneelin eri ihmisen syövän solulinjojen A549, HepG2, OVCAR-3, HeLa- ja K562 ja SGC-790 solulinjoissa, ja näytetään IC50 arvot alhaisen mikro-molaarisia alueita, jotka ovat kymmenen taittuu tehokkaampia kuin emodin. Lisäksi löysimme EM-d-Rha (3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-

O

-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin) olennaisesti indusoi solujen apoptoosia HepG2 ja OVCAR-3 solujen varhaisen kasvuvaiheen. Lisäksi EM-d-Rha johti laskua mitokondrion transmembraanisen potentiaalin, ja säädelty nimenomaista solujen apoptoosin tekijöitä on pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Tulokset osoittivat EM-d-Rha voi estää kasvun ja leviämisen HepG2-solujen kautta polun apoptoosin, ja mahdolliset molekyylitason mekanismi saattaa johtua aktivaation sisäisten apoptoottisten signaalireitin.

Citation: Xing JY, Song Gp, Deng Jp, Jiang Lz, Xiong P, Yang Bj, et al. (2015) Kasvaintenvastainen Vaikutukset ja mekanismi Novel emodin Rhamnoside Johdannaiset vastaan ​​ihmisen syöpäsoluja

In vitro

. PLoS ONE 10 (12): e0144781. doi: 10,1371 /journal.pone.0144781

Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, SINGAPORE

vastaanotettu: 30 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 22 marraskuu 2015; Julkaistu: 18 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Xing et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Major Program of Science and Technology Program Guangzhou (PX, 11C32100704), Kiina, Reserch Project kiinalaisen lääketieteen Administration Guangdongin maakuntaan (px, 2010276), Kiina ja Natural Science Foundation for Nuoret (GPS pX, B020602), Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

emodiinia (3-metyyli-1, 6, 8-trihydroxyanthraquinone) (kuvio 1), joka on laajalti antrakinoni, on peräisin juuria ja juurakoita

Rheum palmatum L

., ja muita kasvit, kuten

polygonum

,

Rhamnaceae

,

Leguminosae

, ja

Liliaceae

. Emodin on tärkeä osa kiinalaisten yrttien ja rakenteeltaan samanlainen antrasykliini. Se on sama trisyklisiä tasomainen kromofori luuston tiettyjen antitumor antibiootit, kuten daunorubisiini ja mitoksantroni, joka voi interkalatoi DNA syöpäsoluja. Antituumorivaikutuksen emodin on hyvin dokumentoitu. On osoitettu, että emodin joilla on antiproliferatiivista vaikutusta, estää syövän etäpesäkkeitä [1-3], herkistävät syöpäsolujen sädehoidon ja kemoterapia-aineiden [4-6], anti-angiogeeninen [7, 8] ja käännetään monilääkeresistenttiä (MDR) syöpäsolujen [ ,,,0],9]. On todettu, että emodiini on laajakirjoinen inhiboiva aine syöpäsolujen, mukaan lukien leukemia [10, 11], keuhkosyöpä [12-14], ihmisen kielen levyepiteelin syöpä [15, 16], paksusuolen syöpä [17, 18] , sappirakon syöpä [19-21], haimasyöpä [22-24], rintasyöpä [25-27], ihmisen kohdunkaulan syövän [28] ja maksan karsinoomasoluja [29-31]. Syövän vastainen mekanismit emodin olivat mukana monissa biologisissa polkuja [32-34], kuten kaseiinikinaasi Ⅱand ERK1 /2. Kuitenkin emodin on epätyydyttävä kemoterapeuttinen aine syövän johtuen sen puute bioaktiivisuutta, suhteellisen huono hyötyosuus ja myrkyllisyyttä in vivo. Tästä huolimatta emodin, luonnollisena yhdiste, tarjoavat erinomaisen perustan kehittää uusia kemopreventiolle ja kemoterapia-aineiden syöpiä vastaan ​​(kuvio 1). Koska mahdollisia ehdokkaita luonnontuotteista pidettiin yksi tuottavia strategioita nykyisen lääkekehityksen ja kehitys [35].

Tähän mennessä rakenteellinen muutos emodin pääasiassa mukana muutosta sivuketjun , mukaan lukien metyyli, hydroksyyli ja aryylirengasosassa. Itse asiassa on osoitettu, että käyttöönotto sivuketjujen kuten polymethyleneamine, sokeria tai heterosykli on emodin voi parantaa kasvaimen vastainen vaikutus [36-38]. Lisäksi muut saavutetaan johdannaisten avulla käyttöön aminoryhmien ja glykosidisidoksiin osoitti myös korkeampia syövän vastaista aktiivisuutta [39-41]. Emodin glykosidi johdannainen on eristetty

R

.

nepalensis

,

Rhamnaceae

kasveille [42],

Rhamnus frangula L

. [43] ja

Rumex japonicus Houtt

. [44]. Jotkut luonnollinen emodin glykosidijohdannaisten, kuten

frangulin B

ja

2

,

3-di-O-acetylfrangulin

[45-47], osoittivat merkittävästi korkeampia antituumorivaikutus kuin emodin. Nämä tutkimukset osoittivat, että lisätty sokeria ketjut C3-OH sivuston emodin molekyyli paitsi lisäsi liukoisuutta vaan myös paransi antituumorivaikutuksen [46]. Toistaiseksi kuitenkin tutkimus emodin johdannaisia ​​glykosylaation muutokset on harvoin raportoitu. Viime aikoina olemme syntetisoineet sarjan uusia antraseeni L-rhamnopyranosides johdannaiset emodiinia liittämällä L-rhamnopyranosides tasomaiseen aromaattinen molekyyli (kuvio 2) [48]. Tässä tutkimuksessa olemme seulotaan ja analysoi antituumorivaikutukset kaikkien johdannaisten. Löysimme yksi yhdiste, EM-d-Rha, inhiboivat voimakkaasti kasvua ja syöpäsolujen lisääntymistä, mikä oli lähes kymmenen taittuu vahvempi kuin emodiinia. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen osoittanut antiproliferatiivinen EM-d-Rha on syöpäsolujen, ja tutkia mekanismi toimintaa EM-d-Rha estää kasvun ja leviämisen HepG2-soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

emodin johdannaiset syntetisoitiin

synteesi kohde yhdisteiden S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9 oli sama kuin aiemmin on kuvattu (kuvio 2) [48].

Solulinjat ja kemiallisten reagenssien

Ihmisen keuhkosyöpää A549, Human maksakarsinooma HepG2, ihmisen rintasyövän MCF-7- Human eturauhassyöpä PC-3, ihmisen kohdunkaulan syöpä HeLa, Human krooninen myelooinen leukemia K562, Human mahasyövän SCG-7901, Madin-Darby Canine Munuaiset solu (MDCK), Ihmisen normaali maksan solujen L02 ja Human munasarjasyöpä OVCAR-3 soluja saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kaikki paitsi leukemia K562-soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteuden suhteen kontrolloidussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO2: Dulbeccon Modified Eagle Medium, jota oli täydennetty natriumbikarbonaatilla (2,2%, paino /tilavuus), L-glutamiinia (0,03%, paino /tilavuus), penisilliiniä (100 ug /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), ja naudan sikiön seerumia (FBS, 10%). Leukemia K562-soluja viljeltiin RPMI-1640 täydellistä alustaa, jota oli täydennetty 10% FBS.

Sisplatiini (

TOKYO Chemical Industry Co.

.

LTD

), HCPT (

SHAANXI Sciphar Natural Products Co

.

Oy

), dimetyylisulfoksidissa (DMSO,

MP Biomedicals LLC

), naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone, USA), Dulbeccon Modified Eagle Medium ( DMEM,

Hyclone

,

USA

), RPMI Media 1640 (

Hyclone

,

USA

), penisilliini-streptomysiini Double antibiootti (

SIGMA -ALDRICH

), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT,

SIGMA-ALDRICH

), 0,25% trypsiini-EDTA: a (

Gibco

,

USA

), trypaanisineä Stain (

Sigma-Aldrich

), Hoechst 33342 värjäysliuos (

Pik päivää Biotekniikan instituutti

,

Jiangsu

), Apoptosis-DNA tikkaat Extraction Kit (

Pik päivää Biotekniikan instituutti

,

JiangSu

), anneksiini Apoptosis Detection Kit V-F1IC /7-AAD (

BD Pharmagen Yritys

,

USA

), PI /RNase värjäysliuos (

BD Pharmagen Company

,

USA

), EZNA

TM kokonais-RNA Kit II (

OMEGA

), M-MLV Reverase Transcriptase (

Promega

), dNTP (

Promega

), Oligo (

Promega

), GoTaq®qPCR Master Mix (

Promega

).

Solulisääntyminen ja solunelinkykyisyysmääritys

elinkelpoisuus syöpäsolujen arvioitiin MTT: llä. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä 1 x 10

4 /kuoppa täydellistä elatusainetta, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia lopulliseen tilavuuteen 0,2 ml. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vähintään 24 tuntia, jotta optimaalinen kiinnitys. Kun solut saavuttivat 60% konfluenssin, ne käsiteltiin sisplatiinin kanssa, HCPT ja emodin rhamnopyranosides johdannaisten eri konsentraatioissa, ja inkuboitiin kosteuskontrolloidussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Medium vaihdettiin 24 tunnin välein. Cell kontrolliryhmässä ja tyhjä ryhmä perustettiin samalla tavalla, jossa kukin ryhmä on kuusi rinnakkaista kuoppiin. Solujen eloonjäänti arvioitiin suoraan lisäämällä 22 ui 5 mg /ml MTT 0,2 ml väliainetta. Kolmen tunnin kuluttua, formatsaanipitoisuus sakka liuotettiin 200 ui isopropanolia per kuoppa, ja täysin sekoitetaan huoneenlämmössä. Sen jälkeen optinen tiheys kussakin kuopassa havaittiin aallonpituudella 570 nm aallonpituudella iMark mikrolevylukijalla (

Bio-rad

,

USA

). Tämä koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

morfologinen analyysi

morfologinen havainnointi, HepG2-soluissa logaritmisessa kasvuvaiheessa ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 1 x 10

4 /kuoppa 0,2 ml: lla täydellistä alustaa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia. Solujen annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin EM-d-Rha ja HCPT tietyssä pitoisuudessa. Kullakin ryhmällä on kuusi rinnakkaista kuoppiin. Soluja inkuboitiin kostutetussa 5% CO 2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Medium vaihdettiin 24 tunnin välein. Sen jälkeen 48 h, kasvu valtiot ja morfologiset muutokset HepG2-soluissa havaittiin käännettyä mikroskooppia (

Nikon

,

Japani

).

Fluoresenssimikroskopia määritys

HepG

2-soluja ympättiin kahtena kappaleena 3 x 10

5 /kuoppa tiheys 6-kuoppaiselle levylle ja niiden annetaan kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Jälkeenpäin soluja käsiteltiin 10 uM HCPT, 25 uM emodiinia ja erityisiä pitoisuus EM-d-Rha (0,1 uM, 0,5 uM, 2.5μM), vastaavasti. Cell kontrolliryhmää asetetaan samalla tavalla. Sitten soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Medium vaihdettiin edellä kuvatulla tavalla. Lopulta kaikki väliaine heitettiin pois ja solut hajotettiin 2 ml 0,25% trypsiini-EDTA-liuosta 37 ° C: ssa 5 min. Sen jälkeen kun solut kerättiin, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja sen jälkeen sentrifugoimalla nopeudella 300 x g 5 minuutin ajan. Lopuksi solut suspendoitiin uudelleen 100 ui kylmää PBS: ia, kun supernatantti heitettiin pois. Soluja viljeltiin pimeässä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, kun on lisätty 100 ui 1 mg /ml Hoechst 33342 värjäysliuosta. Solut kerättiin jälleen edellä kuvatulla tavalla hävittää värjäävä liuos. Pese korjattu solut kahdesti PBS: llä ennen kuin puhtaan lasin dioja. Morfologiset muutokset solujen tumat havaittiin ja valokuvattiin fluoresenssin mikroskoopilla (

Olympus

,

Japani

) 350 nm: n eksitaatioaallonpituudella. Koe toistettiin kolme kertaa.

DNA tikkaat määrityksessä

DNA tikkaat muodostuminen on tärkeä kriteeri sen määrittämiseksi, soluja apoptoosin. Vahvista apoptoosin induktion vaikutus, analyysi DNA pirstoutumista tehtiin. HepG2-soluja logaritmisessa kasvuvaiheessa ympättiin 10 cm halkaisijan soluviljelylevyille tiheydellä 5 x 10

5-soluja 12 ml: aan täydennettyä elatusainetta, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Jälkeenpäin soluja käsiteltiin EM-d-Rha ja sisplatiinia tietyssä pitoisuudessa. Soluja viljeltiin ja kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. Lopuksi, DNA kaikista näytteistä uutettiin käyttämällä apoptoosin DNA tikkaat detektioreagenssipakkaus seuraten valmistajan ohjeita. DNA-fragmentoituminen määritettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi 0,5 mg /ml etidiumbromidia (EtBr) 5V /cm 2.5hours ja valokuvattiin UV. Koko DNA: n fragmentoituminen verrattiin markkeri (molekyylipaino standardi).

Virtaussytometrianalyysi

Virtaussytometria-analyysi määritettiin käyttämällä anneksiini V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (

BD Parmagen

,

U

.

S

.

). HepG

2-soluja ympättiin tiheydellä 3 x 10

5 /kuoppa 6-kuoppalevyille, ja niiden annetaan kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Jälkeenpäin soluja käsiteltiin erityisten pitoisuus EM-d-Rha, ja viljeltiin ja kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. Solujen kumpaakin näytettä suspendoitiin 300 ui kylmää sitovaa puskuria ennen lisäämistä 2.5μL anneksiini V-APC konjugaatin ja 5 ui 7-AAD ratkaisu. Sitten soluja inkuboitiin 15 minuutin ajan jäillä pimeässä. Solususpensio laimennettiin lopulliseen tilavuuteen 250 ui jääkylmää, 1 x anneksiini V Binding Buffer. Määritys suoritettiin virtaussytometrialla (

BD FACSCalibur

,

USA

). Sirontakaavioissa luotiin käyttäen Cell Quest pro ohjelmisto (

BD Biosciences

,

San Jose

,

CA

). Koe toistettiin kolme kertaa.

Analyysi mitokondrion kalvon potentiaalia

HepG

2-solut ympättiin 10 cm halkaisijan soluviljelylevyille tiheydellä 5 x 10

5-solut, ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Jälkeenpäin soluja käsiteltiin 5.0μM EM-d-Rha 0, 24, 48 tunnin ja 72 vastaavasti. Soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa mukana 5% CO

2 37 ° C: ssa 72 tunnin ajan. Medium vaihdettiin 24 tunnin välein. Kerätyt solut kunkin näytteen suspensoitiin 500 pl PBS ennen lisäämällä 5 ui Rhodamine123. Sitten näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa pimeässä 15 minuutin ajan. Solut uudelleen talteen sentrifugoimalla 300 x g 5 minuutin ajan ja supernatantti heitettiin pois. Solupelletit pestiin kahdesti 4 ° C: ssa PBS: ää. Lopuksi solut kaikki näytteet suspensoitiin uudelleen 500 pl PBS. Ennen kuin määrityksen, säätämällä viritysaallonpituus ja emission aallonpituus 480 nm, 520 nm vastaavasti ΔΨm muutoksia HepG2 mitokondrioiden mitattiin virtaussytometrillä (

BD FACSCalibur

,

BD Biosciences

,

Yhdysvaltain

). Koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

Solusyklianalyysiä (PI-värjäys) B

HepG2-soluissa logaritmisessa kasvuvaiheessa ympättiin 10 cm soluviljelylevyille tiheydellä 5 x 10

5 soluja ja inkuboidaan yön yli ja annettiin kiinnittyä. Kun se on alttiina EM-d-Rha tiettyihin pitoisuuksilla 48 tunnin ajan, solut kerättiin ja pestiin kylmällä PBS: llä kahdesti. Sitten kerätyt solut kiinnitettiin 1 ml PBS: ää ja 3 ml kylmää 100% etanolia 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen solut jälleen talteen sentrifugoimalla nopeudella 300 x g 10 minuuttia. Solut pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 450 ui PBS: ää, ja sitten käsiteltiin 50 pl ribonukleaasi (RNaasi, 10 mg /ml) 37 ° C: ssa 15 minuuttia. 500 ui propidiumjodidia (PI, 50 ug /ml) lisättiin näytteisiin. Sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä, solusyklin jakautumisen mitattiin käyttämällä BD FACSCalibur-virtaussytometrillä (

BD Biosciences

,

USA

), ja 10,000cells laskettiin kullekin näytteelle. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin analysoitiin virtaussytometrialla Jo (

BD Biosciences

,

USA

). Koe toistettiin kolme kertaa.

Gene analyysi RT-qPCR

HepG

2-soluja inokuloitiin 6-kuoppaisilla viljelylevyillä tiheydellä 3 x 10

5 solua /kuoppa, ja annettiin kiinnittyä 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin keskittymistä EM-d-Rha ja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa mukana 5% CO

2 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan. Medium vaihdettiin 24 tunnin välein. Jälkeenpäin mRNA uutettiin jokaisesta ryhmästä käyttämällä E.Z.N.A.

TM Yhteensä RNA Kit II mukaan valmistajan ohjeiden. Uutettu mRNA liuotettiin 20 ul DDH

2O (

Qiagen

), joka sisältää dietyylipyrokarbonaattia (DEPC). Pitoisuus mRNA kvantifioitiin kanssa NanoDrop ND-100-laite (Thermo Fisher Scientific). cDNA syntetisoitiin käyttäen 3 ug uutettua mRNA kustakin näytteestä PCR -järjestelmää (

BIO-RAD

,

USA

). CDNA-synteesi Reaktio valmistettiin valmistajan ohjeiden sekoittamalla 3 ug mRNA, 4.0μL 5 x MMLV-puskuria, 3 ui oligodT18, 0,5 pl 10 mM dNTP-liuosta, 0.8μL RNaasi-inhibiittori, 3.7μL MMLV Rtase, ja 6.0μL DEPC DDH

2O PCR putkiin. Reaktio ehto 5min 70 ° C: ssa, 60 min 42 ° C: ssa ja 10 min 4 ° C: ssa. Tuotteet käytettiin myöhemmin RT-qPCR analyysi. MRNA: n ilmentyminen mitattiin RT-qPCR käyttäen CFX96

TM C1000 Real-Time PCR System (

BIO-RAD

,

USA

) kantavassa alukkeet suunniteltiin käyttäen IDT .dna ohjelmisto (http //www.idtdna.com). Erityiset alukkeet olivat: Cyto C: 5′-AGATGGTGAGCACAAGGTAAG-3 ’(eteenpäin), 5′-CTCACTGTCCCACAAAGATACA -3′ (taaksepäin); Kaspaasi 3: 5’- CCTACAGCCCATTTC TCCATAC-3 ’(eteenpäin), 5′-GCCTCACCACCTTTAGAACAT- ”(reverse); β-aktiini: 5’-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3 ’(eteenpäin), 5′-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3’ (taaksepäin). Tuote koot Cyto C, kaspaasi 3 ja β-aktiini olivat 91bp, 125bp ja 107bp, vastaavasti. PCR-reaktio suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 20 ui käyttäen optista 96-kuoppaisen alustan. Reaktioseos koostui 10 pl SYBR I vihreä Mix /GoTaq®qPCR

Master Mix (

Promega

), 0.3μL kutakin aluketta (10 uM), ja 1,0 ui cDNA-templaattia. PCR-syklien ehto oli yksi sykli 5 min 95 ° C: ssa, 39 sykliä, ja joista jokainen koostui 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 15 sekuntia 62 ° C: ssa ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa, ja lopullinen pidennys 60 ° C: ssa 5 sekuntia. Terminen sula parametri tutkittiin arvioida tasalaatuisuuden PCR. Kukin näyte analysoitiin nelinkertaisena ja keskimääräinen käytettiin lisäanalyysiä. MRNA ekspressiotasot kutakin näytettä kvantifioitiin mittaamalla kynnyksen syklin (CT) arvoista geenejä. Suhteelliset arvot kohdegeenin ilmentymisen laskettiin CT-arvot kohdegeenien ja viite-geenin (β-aktiini) soveltamalla Livak ja Schmittgen menetelmällä. Se on, se on yhtä suuri kuin 2

-Δ ACt, ACt vastaa keskiarvo Ct varten kohdegeenin miinus keskiarvon Ct varten β-aktiini-geenin, ja ΔΔCT yhtä suuri ACt käsitellyn ryhmän miinus ACt kontrolliryhmässä.

Western blot-analyysi

HepG

2-solut ympättiin, viljeltiin ja kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. Sen jälkeen koe suoritettiin jäällä. Korjatut Solupelletti pestiin kylmällä PBS: lla ennen kuin ne suspendoitiin uudelleen 300 ui sytosoliin lyysipuskuria kautta pyörteen. Sitten solut kaikki näytteet hajotettiin sonikoimalla menetelmällä jäällä käyttäen ultraääni disruptor (100 W 30s x 4 kertaa). Kokonaisproteiinia kutakin näytettä mitattiin Bradfordin menetelmällä käyttäen proteiini määrän reagensseja Bio-Rad. Kaikki näytteet lisättiin 2 x latauspuskuria ennen analysointia 12% geeleissä SDS-PAGE. Sitten proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille elektro-blottauksella. Membraanit blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) tai 5% maitoa liuokseen huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanin (

Univ-bio

,

Kiina

) 4 ° C: ssa yön yli. Kalvot pestiin sitten kolme kertaa 1 x TBST: llä, joka kerta kestää 5 min. Membraanit inkuboitiin sitten sekundaarisen vasta-3 tunnin ajan 4 ° C: ssa, mitä seurasi pesu 1 x TBST: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu. Lopuksi immunologiseen reaktiiviset vyöhykkeet havaittiin ja dokumentoitu käytetään vahvistettua kemiluminesenssireagenssia Western blotting järjestelmä (

Thermo-tieteellinen

,

USA) B on Versa Doc kuvantamisjärjestelmä.

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SEM SPSS tilastollinen ohjelmisto Windows Version 17.0 käytettiin yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukey HSD testi monimuuttujille tarvittaessa. Erot mittaussuureet kahden ryhmän välillä verrattiin Studentin t-testiä. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. GraphPad Prism 5 ohjelmisto (

GraphPad Software

,

Inc

,

San Diego

,

CA

,

USA

) käytettiin analyysi. RT-qPCR ja virtaussytometria kokeiden tiedot olivat edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Tulokset

solunelinkykyisyysmääritys

Olemme testanneet vaikutuksia eri konsentraatioiden emodiinia (S-1) ja sen johdannaiset (S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9) elinkyvyt testatun ihmisen syöpäsoluja linjat (kuvio 2 ja taulukko 1). Niin puoli-inhiboiva konsentraatio (IC

50) arvot laskettiin näistä tiedoista. Tulokset osoittivat, että eri johdannaiset estävät kasvua erilaisten solulinjojen kanssa vaihtelevalla (taulukko 1).

Mukaan tehon arviointiin standardit antitumor lääkkeen in vitro testeissä, IC

50-arvot syntetisoidun yhdisteen tai kasviuute on oltava pienempi kuin 10 ug /ml, ja tehoa on on annos-riippuvaisella tavalla, välin maksimi estävä vaikutus on suurempi kuin 80%. Jos testattava yhdiste täyttävät kaikki kuvatut kriteerit, katsottiin olevan anti-leviämisen ja kasvun estämiseen vaikutuksia syöpäsolujen in vitro.

Kuten taulukosta 1, joukossa kaikki syntetisoidut yhdisteet, S-8 ja S-9 johdannaiset osoittivat vahvempaa estovaikutusta testattujen syöpäsoluihin kuin vanhemman emodin. Oikeastaan, S-8 teko parempi kuin S-9. Kun verrataan IC

50 emodin, IC

50-arvot S-8 A549, HepG2, OVCAR-3 ja HeLa-solut vähenivät 7,52, 19,68, 42,3 ja 10,56 kertaiseksi. Eli toisin sanoen, S-8 parantaa syövän vastaista aktiivisuutta noin kymmenen kertaluokkaa. Erityisesti HepG2 ja OVCAR-3 solujen havaittiin olevan altis S-8 johdannainen.

Rakenne-aktiivisuus-analyysi emodin rhamnopyranosides johdannaisten

solunelinkykyisyysmääritys osoittaneet, että rhamnopyranosides johdannaiset toiminut paremmin kuin vanhempi emodin. Mutta on epäselvää, miten muuttuneessa kemiallisia rakenteita osaltaan parannettu aktiivisuus. Joten me alustavasti analysoitu syövän vastaisen rakenteen ja tehokkuuden suhteen (kuvio 2 ja taulukko 1). In vitro tiedot, voitiin havaita, että käyttöönotto ramnoosia voi auttaa parantamaan syövän vastaista aktiivisuutta (kuvio 2). Kuitenkin parannettu aktiivisuus liittyy käyttöön tapa ramnoosia ja substituoidun kanta ramnoosia hydroksyyli asetyyliryhmiä. Jos vain yksi ramnoosia otettiin emodiini, liukoisuus johdannaisen parani, mutta syövänvastainen aktiivisuus oli huono (S-3). Lisäksi, kun hydroksyyli ramnoosia oli disubstituoitu kahdella asetyyliryhmiä. Syövän vastaista aktiivisuutta syntyvän johdannaisen 3, 4-hydroksyyli ramnoosia disubstituoitu viereisen asetyyli, on parempi kuin 2, 3-hydroksyyli- tai 2, 4-hydroksyyli disubstituoitu johdannainen, joka on, entinen on vahva antiprolifertion vaikutus (S-5). Kun emodin rhamnopyranosides johdannainen oli sen sokeriketjuissa pitkittyy, syövän vastaista aktiivisuutta in vitro merkittävästi parannettu (S-8). Vastaavasti, kun hydroksyyliryhmät C-1 ja C-8 asemaan emodin ovat metyloitu, sen syövän vastaista aktiivisuutta oli myös parantunut (S-9).

inhiboiva vaikutus EM-d-Rha useita syöpäsolujen linjat

vahvista estävää vaikutusta ja antiproliferatiivista aktiivisuutta EM-d-Rha syöpäsolujen in vitro, ja ymmärtää annos-vastesuhde, me edelleen suoritti kokeita eri pitoisuuksia EM-d-Rha vastaan useita syöpäsoluja. IC

50-arvot laskettiin näistä tiedoista.

Kuten on esitetty taulukossa 2 ja taulukossa 3, voimme nähdä, että EM-d-Rha on erittäin merkittävä anti-proliferatiivisia vaikutuksia vastaan ​​eri syövän solulinjoista pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Kuitenkin sen puoli-estävä pitoisuus arvojen normaalin kudoksen solut ovat korkeammat kuin syöpäsoluihin. On mahdollista, että kasvua estäviä vaikutuksia EM-d-Rha soluihin ovat selektiivisiä jossain määrin.

Annos-vaste-käyrä EM-d-Rha vastaan ​​HepG2

EM-d-Rha kohdistuu merkittävä antiproliferatiivinen vaikutus HepG2-soluissa, tulokset johtivat meidät edelleen tutkia ja vertailla annos-vaste-käyrät EM-d-Rha kanssa, emodiinia, sisplatiinia ja HCPT. Kuten kuviossa 3, kasvua inhiboiva vaikutus EM-d-Rha HepG2-soluissa osoitti annoksesta riippuvalla tavalla. Kun yhä log pitoisuuden EM-d-Rha, inhibitioprosentti HepG2 soluista huomattavasti (kuvio 3). Lisäksi aktiivisuus EM-d-Rha oli vahvempi verrattuna, että emodin vastaan ​​HepG2-soluissa. On kuitenkin huonompi verrattuna, että sisplatiinin ja HCPT vastaan ​​HepG2-soluissa.

neljä käyrät edustavat annos-vaste-käyrä HCPT, EM-d-Rha, sisplatiini, ja emodiinia vastaan ​​HepG2 solujen vasemmalta oikea puolestaan. Virhepalkit edustavat keskiarvo ± keskihajonta (kolme toistoa). Vaaka-akseli esittää log konsentraatio EM-d-Rha, pystyakselilla inhibitioprosentti.

EM-d-Rha morfologiasta HepG2-soluissa

nähdä suoraan kasvua estävää vaikutusta EM-d-Rha HepG2-soluissa, havaitsimme morfologiset muutokset HepG2-soluissa jälkeen käsitelty (kuvio 4). Morfologiset muutokset solut voivat heijastaa kasvun ja kuoleman tila. Tämän seurauksena käsittelemättömien HepG2-soluissa kontrolliryhmän oli korkea yhtymäkohdassa yksikerrossoluissa eläneetkään logaritmisessa kasvuvaiheessa, joka oli ilmeinen morfologiset ominaisuudet rotuhygienia solujen, kuten solujen välistä liitokset, kirkas kalvo, koko sytoplasmaan ja hyvä taitekerroin suorituskyvyn ( kuvio 4A). Sen sijaan, EM-d-Rha-käsitellyistä soluista osoitti selvästi morfologiset muutokset apoptoosin kuten väheneminen solujen määrän ja menettää solu-solu-kontaktien annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4D-4H). Kun käsitelty 12.5μM EM-d-Rha, morfologiset muutokset HepG2 soluista osoittivat samanlaisia ​​piirteitä kuin 2.5μM HPLC-käsitelty (kuvio 4C).

bright-kentän mikroskopia kuvat inkubaation jälkeen HCPT 48 tuntia at 0,5 uM; 2.5μM ja EM-d-Rha 48 tunnin ajan vaihtelevina pitoisuuksina: 0μM (kontrolli); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM; 12.5μM; 62.5μM (alkuperäinen suurennos 100 x).

tutkia tarkemmin, ovatko elinkelpoisuuden väheneminen HepG2 käsitelty solu EM-d-Rha johtuu apoptoosin, toteutimme morfologiset havainto kanssa fluoresenssimikroskopiaan joka on parannettu herkkyys ja kontrastia. HepG2 solut värjättiin DNA fluoresoivalla Hoechst 33342, joka on suuri herkkyys ja alhainen sytotoksisuus. Se voi tunkeutua syöpäsoluja kalvo, ja sitovat DNA: ta ja päästävät voimakkaan indigo fluoresenssi. Hoechst sitoo DNA uran alueita, jotka sisältävät antelias AT emässekvenssin. Se on hyvä vesiliukoisia ja vakautta. Siksi fluoresenssimikroskopiaa yhdistyy suurin herkkyys molekyylikaavan spesifisyys ja poikkeuksellisen kuvan kontrastia. Sen tarkistamiseksi, onko testi onnistuu tai ei, asetamme HCPT yhdistettä positiivisena kontrollina.

Kuten kuvassa 5, HepG2 solut osoittivat tyypillisen apoptoottinen ydin- morfologia altistumisen jälkeen 2.5μM HCPT 48 tuntia, ja esitteli solusta soluun kontakti menetys, ydin- kutistuminen, kalvo blobbing, DNA tiivistyminen ja pirstoutuminen (kuvio 5C). Vastaavasti, kun HepG2-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla EM-d-Rha 48 tuntia, ne osoittivat selvästi ominaisuudet ydin- kutistuminen ja DNA: n kondensaatio ja esitettiin annos-riippuvainen suurentuneita vaurioita (kuvio 5D-5F) .Jotkut HepG2-soluja irrottaa yksikerroksisen listataan viljelyalustan, mutta apoptoottinen ydin- ulkonäkö ei havaittu käsittelemätön kontrolli, HepG2 solut kontrolliryhmän ilmestyi yhtenäinen sininen fluoresenssi (kuvio 5A). HepG2-solut käsiteltiin 25 uM emodin näytetään myös apoptoottisten morfologisia muutoksia (kuvio 5B).

ytimet morfologiset muutokset HepG2 solujen havaittiin fluoresenssimikroskopian jälkeen inkuboitiin 25.0μM emodin, 2.5μM HCPT 48 tuntia ja EM -d-Rha 48 tunnin ajan vaihtelevina pitoisuuksina: 0μM (kontrolli); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM (alkuperäinen suurennos 400 x). Kondensoi- ja hajanainen loisteputki ytimet (valkoiset nuolet) apoptoottisten solujen näkyvät käsitellyissä soluissa, mutta ei kontrolli-soluissa.

Effects of EM-d-Rha DNA pirstoutumisen HepG2-soluissa

jotta voitaisiin edelleen tutkia, EM-d-Rha johti DNA pirstoutuminen HepG2-soluissa, mikä on tärkeä ominaisuus solujen apoptoosin. Ydinvoiman DNA havaittiin agaroosigeelielektroforeesilla menetelmällä. Olemme myös havainneet, että EM-d-Rha voi aiheuttaa sen apoptoottisen induktion vaikutuksia, kun HepG2-soluja käsiteltiin EM-d-Rha, uutettu DNA HepG2-solut näyttivät tyypillinen tikkaat tai pirstoutuminen muoto (kuvio 6), oli samanlainen kuin mitä DNA HepG2-soluja käsiteltiin sisplatiini esitetty, oli kuitenkin erilainen DNA-muodon käsittelemättömän HepG2-soluissa (kuvio 6). Tuloksena ehdotti, että EM-d-Rha aiheutti kaksijuosteisen DNA: n murtumista HepG2-soluissa ja indusoi apoptoosin HepG2-soluissa.

Kaista M: DNA Ladder; Kaista 6: valvonta; Lanes1, ja 2: Solut, jotka käsitelty 3.0μM ja 6.0μM sisplatiini; Kaistat 3, 4 ja 5: Solut, jotka käsitelty 2.5μM, 5.0μM ja 10.0μM EM-d-Rha, vastaavasti.

apoptoosin vaikutuksia EM-d-Rha HepG2 ja OVCAR-3 solut

osoitti lisäksi, että EM-d-Rha voi estää kasvun ja leviämisen HepG2-soluissa ja OVCAR-3-soluihin mekanismi apoptoosin, myös soveltaa virtaussytometria-analyysi, jossa kaksinkertainen värjäys menetelmä anneksiini V-APC: n ja 7-AAD (7-amino-aktinomysiini D). Apoptoosin induktio aktiivisuus S-8 havaittiin bind välillä anneksiini V: n ja fosfatidyyliseriinin (PS), joka pääasiassa levittää sytoplasmisen puolella elävien solujen, kuitenkin, varhaisen vaiheen aikana solujen apoptoosin, PS muuttaa solulimatoimin- puolelta soluseinän puolella, joten tämä voi tuottaa tiettyjä sitoa välillä anneksiini V ja PS. 7-AAD on nukleiinihappo tahra, joka voi läpäistä solukalvot klo myöhäisessä solun apoptoosin ja kuolleita soluja ja edelleen väriaine ydin punainen. Joten yhdistetty käyttö anneksiini V-APC ja 7-AAD voi erottaa myöhään apoptoottisten solujen varhaisesta apoptoottisia soluja. HepG2-soluissa ja OVCAR-3-soluissa tehtiin apoptoosin altistumisen jälkeen EM-d-Rha at 2.5μM, 5 uM ja 10 uM 48 tuntia (Kuva 7 ja Kuva 8). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen on esitetty taulukossa 4 ja taulukossa 5.

HepG2-soluja inkuboitiin 72 tunnin EM-d-Rha 0, 2.5μM, 5 uM, 10 uM, vastaavasti. Ja solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini V: n ja 7-AAD. V: edustaja pistekuvioita anneksiini V-FITC /7-AAD värjäystä. a: kontrolli, 72h; b: 2.5μM EM-d-Rha, 72; c: 5 uM EM-d-Rha, 72; d: 10 uM EM-d-Rha, 72h. 3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin