Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

tavoitteena Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää apoptoosin edistävät vaikutukset ja mekanismit Hematoporfyriinin monometyylieetterin (HMME) -sonodynamic terapia (SDT) kohdun limakalvon syövän soluissa

in vitro

.

Methods

endometriumsyöpä solunäytteillä jaettiin neljään ryhmään: 1) hoitamattomaan verrokkiryhmään, 2) HMME ryhmä, 3) puhdasta ultraääni ryhmä, ja 4) HMME yhdistettynä ultraäänellä, eli SDT ryhmä. CCK-8 menetelmää käytettiin arvioimaan estävä vaikutus SDT proliferaatioon kohdun limakalvon syövän soluja. Optisella mikroskoopilla ja kenttä päästöjen transmissioelektronimikroskopia käytettiin kuvaamaan morfologian muutokset syöpäsolujen aiheuttama hoitoja. Apoptosis korko, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) tutkittiin virtaussytometrillä. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin laserkeilauksella konfokaalimikroskopiaa käytettiin tutkimaan vaihtelu solunsisäisen kalsiumionin (Ca

2 +) pitoisuus. Apoptoosiin liittyviä proteiineja, jotka liittyvät sekä ulkoisen ja sisäisen apoptoosin signaloinnit analysoitiin western-blotilla.

Tulokset

SDT voidaan tehokkaasti indusoida apoptoosin kohdun limakalvon syövän soluja. Verrattuna ultraääni, joka tunnetaan tehokkaana anti-kasvain menetelmä, SDT johtaa huomattava parannus tukahduttamisesta solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosin induktion yhdessä oudompi muutostöitä morfologian ja alusrakenteeseen sekä ultraääni herkkiä tai resistenttejä kohdun limakalvon syöpä soluja. Lisätutkimukset paljastaa, että SDT edistää ROS tuotanto, aiheuttaa menetyksiä MMP ja lisää solunsisäistä Ca:

2+ pitoisuus tehokkaammin kuin HMME tai ultraääni yksin. SDT ryhmät osoittavat myös melko korkea ilmentyminen apoptoosin edistäviä proteiineja, mukaan lukien Bax, Fas ja Fas-L, ja huomattavasti alhaisempi ilmentyminen apoptoosin suspendoivia proteiinien, mukaan lukien Bcl-2 ja surviviinin. Samaan aikaan molemmat lohkaista caspse-3 ja kaspaasi-8 dramaattisesti parannettu SDT ryhmissä. Useita reittejä on ehdotettu prosessissa, mukaan lukien luontainen aktivointi liiallinen ROS ja ylikuormitettuja Ca

2+, vaientaminen surviviini geeni, ja ulkoinen tie välittämää kuoleman reseptori.

Johtopäätös

Koska huomattavaa vaikuttavuutta sekä ultraääni herkkiä tai resistenttejä soluja, SDT voi siis olla lupaava terapeuttinen keinona hoitaa kohdun limakalvon syöpiä.

Citation: Sun H, Ge W, Gao X, Wang S, Jiang S, hu Y, et ai. (2015) Apoptosis edistävät vaikutukset matoporfyriini monometyylieetterin-Sonodynamic Therapy (HMME-SDT) on kohdun limakalvon syöpä. PLoS ONE 10 (9): e0137980. doi: 10,1371 /journal.pone.0137980

Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 29 joulukuu 2014; Hyväksytty: 29 heinäkuu 2015; Julkaistu: 14 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee taloudellisesti National Natural Science Foundation of China (Grant nro 30872650); Ohjelma New Century Excellent Talents in University of China (Grant No. NCET-09-0131); MY myöntää taloudellista tukea rekrytointi ohjelma Global Young Asiantuntijat, Kiina.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdun limakalvon syöpä on yksi yhteinen gynekologisia maligniteetteja perinteisesti hoitaa leikkauksen ja täydennettynä kemoterapiaa ja sädehoitoa, joka valitettavasti on melko alhainen herkkyys aikaisin tai etäpesäkkeitä kohdun limakalvon syöpä, yleensä mukana on merkittäviä sivuvaikutuksia [1-2]. Toistaiseksi se on vielä avoin kysymys, kuinka aikaisin endometriumsyöpään voidaan hoitaa säilyttäen hedelmällisyyttä. Eikä ole raportti kirjallisuudessa uruilla säilyttämisestä potilaille välivaiheessa tai pitkälle. On selvää, tehokas lähestymistapa on alhainen myrkyllisyys on ensiarvoisen tärkeää.

houkuttelemisen apoptoosin on edullista syövän hoidossa [3]. On osoitettu, että ultraääni voi aiheuttaa apoptoosin suuri valikoima soluja, kuten myelooinen leukemia-solut, lymfosyytit ja sarkoomasolujen [4-6]. Kuitenkin viivästynyt tappava vaikutus [7] yhdessä tehoton teho ultraääneen kestävä kasvainsolut voivat suurelta osin rajoittaa sen klinikalla sovelluksia. Äskettäin yhdistelmänä ultraääni ja sonosensitizers, sonodynamic hoito (SDT) on tullut kiehtova ei-invasiivisen anti-kasvain menetelmän korkea hyötysuhde ja korkea selektiivisyys kasvainsoluja ja mitään ilmeistä vaikutusta viereisen normaaleissa kudoksissa [8-10]. Joukossa erilaisia ​​kemiallisia aineita sovellettu SDT, hemato- monometyylieetteri (HMME) on erityisen suosittu sonosensitizer koska sen optimaaliset optiset ominaisuudet ja tyydyttävät etuoikeutetut pidättyminen kudoksessa [11]. Vielä tärkeämpää on, HMME on paljon suurempi kertymävakio kasvaimen kuin normaaleissa kudoksissa [10], ja tämä korkea selektiivisyys takaa ultraääni energiaa keskitytään nimenomaan syöpäsoluja.

soveltaminen SDT on gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia on nopeasti kehittymässä. Vaikka aikaisemmassa tutkimuksessa

in vitro

ei osoittavat, että metyleenisininen välittämä SDT voi merkittävästi lisätä reaktiivisia hapen lajeja munasarjasyöpäsoluja ja siten apoptoosin [12], SDT vaikutuksia kohdun limakalvon syöpä pysyy tutkimaton asti.

tässä tutkimuksessa vaikutuksesta HMME-SDT molemmilla ultraääni herkkiä ja resistenttejä kohdun limakalvon syövän solut on tutkittu

in vitro

. Apoptosis edistävät vaikutukset ja mekanismit käsitellään valossa käytettävissä tietoja.

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Cell Culture

Ihmisen kohdun limakalvon adenokarsinooman solulinjoja Ishikawa ja HEC-1-a ostettiin Shanghai Bogoo Biotechnology. Co., Ltd. Soluja viljeltiin RPMI1640 (Hyclone, Thermo), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Hyclone, Thermo) ja inkuboitiin kyllästyskosteus inkubaattoriin (HF240, Heal Force) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kokeet suoritettiin kun solut saavuttivat logaritmisen kasvun vaiheessa.

2,2. Cell eloonjäämisaste

Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa asetettiin 0,25% trypsiiniä ruoansulatusta ja sentrifugoimalla ja valmistettu yhdeksi-solususpensio, jonka pitoisuus on 1 x 10

5 /ml. Sitten solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Oli neljä näytettä ryhmään seuraavasti: 1) käsittelemätön kontrolliryhmä (kontrolli), 2) HMME ryhmä (HMME), 3) puhdasta ultraääni ryhmä (ultraääni), ja 4) ultraääni yhdistettynä HMME ryhmä (SDT). Sillä SDT ryhmä, HMME lisättiin yksi tunti ennen ultraäänen häiriöitä, mikä oli 1,0 W /cm

2 1 MHz 60 s Ishikawa ja 2,0 W /cm

2 1 MHz käsiteltiin 240 s heh- 1-a. Ja lopullinen pitoisuus HMME oli 15 ug /ml Ishikawa ja 50 ug /ml HEC-1-a. Märkä sieni sijoitettiin pohjalle kulttuurin levyn ja ultraääni koetin estää useita heijastuksia ultraääni. Säteilytyksen jälkeen solut hajotettiin ja kerättiin välittömästi, sitten siirrettiin 96-kuoppaisille levyille säätämisen jälkeen pitoisuus, 100 pl kuhunkin kuoppaan. Kaksi tuntia myöhemmin lisättiin 10 ui Cell Counting Kit-8-reagenssia (CCK-8, Dojindo) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Tunnin lisäviljelyaikajak-, absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin käyttäen automaattista entsyymiä merkki instrumentti (Multiskan MK3, Thermo) [13].

2.3. Valmistelu karakterisointi Solumorfologia ja Alusrakenne

morfologia ja kiinnittyneet solujen kasvua havaittiin 6h jälkeen neljä eri hoitoja käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus CKX4). Solut hajotettiin 0,25% trypsiiniä 90s, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, sentrifugoitiin 2000 r /min 5 min. Supernatantin poistamisen jälkeen solut kiinnitettiin välillä 2,5% glutaraldehydiä ja 1% osmic happoa, kuivattu etanolilla ja asetonilla, upotetaan Epon812 epoksihartsiin, ja leikataan III ohut viipaleet. Sitten näytteet double-värjätty uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla ja sitten tunnettu käyttäen kentän päästöjen siirto (TEM, JEM-2010 JEOL).

2.4. Apoptoosin analysointi

6h käsittelyjen jälkeen solut neljästä edellä mainitut ryhmät kerättiin ja laskettiin sitten säilötyt estämään valon 15 min jälkeen lisättiin 10 ui fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla anneksiiniV (20 ug /ml) 1 x 10

6 solua. Sen jälkeen, 5 ui propidiumjodidia (PI) (50 ug /ml) lisättiin. Sen jälkeen reaktio 5 min, 400 ui sitomispuskuria oli sekoitettu. Näytteet testattiin virtaussytometrillä (BD FACSCanto) välittömästi.

2.5. Reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) B

jälkeen ultraäänisäteilytyksen, soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan. 2’7′-dikloori-diasetaatti (DCFH-DA, Beyotime) ja Rhodamine123 (Sigma), jonka lopullinen pitoisuus 10 umol /l ja 200 nmol /l, lisättiin kuhunkin näytteeseen, että ROS: n ja MMP-testi. Molemmissa tapauksissa, soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 välttäen valoa 30 minuuttia. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin sitten virtaussytometrillä viritysaallonpituudella ja emissio aallonpituudella 480 nm ja 520 nm ROS testi, ja 490 nm: n ja 530 nm: n MMP testissä, vastaavasti.

2,6. Määritys solunsisäisen kalsiumin (Ca) Ion pitoisuus

Kohdun limakalvon syövän solujen valvontaa ja SDT ryhmä pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuriliuoksella, kuormitetaan Fluo-3 /AM (Bio-Rad), jossa lopullinen konsentraatio on 10 umol /l 37 ° C: ssa 45 minuutin ajan, ja sitten siirretään erityisen pieni ura. Fluoresenssi-intensiteetti testattiin laser skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Meridian, Insight-PlusIQ) klo argonlaserviritys 488 nm. Vapaa Ca

2+ pitoisuus soluissa kalibroitiin yhtälöllä: [

Ca

2+] =

K

d

[ ,,,0],(

F

–

F

min) /(

F

max –

F

)], jossa

K

d

on 400 nanomoolia,

F

on mitattu suhteellinen fluoresenssin arvo,

F

max

on maksimi fluoresenssin arvo lisäyksen jälkeen 10 mikromol /l 4-Br-A23187 korkea Ca neste (10 mmol /LK

2CaEGTA, 10 mmol /L K-mopit ja 100 mmol /l KCI, Bio-Rad Company),

F

min

on pienin fluoresenssin arvo lisäyksen jälkeen 10 mmol /L 4-Br-A23187 Ca-vapaa liuos [14]. Tämä on suhteellinen yksinkertainen ja edullinen menetelmä yleensä vaatinut solunsisäisen Ca

2 + keskittyminen.

2.7. Expression of Apoptotic-liittyvät proteiinit

Apoptosis-sukuiset proteiinit analysoitiin 24 tuntia kunkin hoidon jälkeen Western blot. Lyhyesti, solut kerättiin eri käsittelyjen jälkeen. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille, jotka oli ensin blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja inkuboidaan sitten spesifisten vasta-aineiden, kuten osoitetaan kuvissa 4 ° C: ssa yön yli. Piparjuuri peroksidaasiin konjugoitua toisio lisättiin jälkeenpäin. Proteiinien ekspression visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssi- (ECL) järjestelmä (Thermo Scientific Pierce).

2,8. Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäisesti eri soluissa. SPSS versio 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois) käytettiin analyysiin. Tiedot esitetään keskiarvona ± neliö poikkeama (SD). Päivämäärä analysoitiin paritonta t-testiä. P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1. Vaikutus SDT on eloonjäämisaste Kohdun limakalvon Syöpäsolut

Jotta voitaisiin arvioida vaikutusta SDT solujen elinkelpoisuus, joka on CKK-8 määritys sovellettiin Ishikawa ja HEC-1-a-soluissa, kun erilaisia ​​hoitoja kuten kuvassa 1. selviytyminen hidastuu yhdellä hoitoon joko HMME tai ultraääni sekä Ishikawa ja HEC-1-a-solut (kuvio 1). Mielenkiintoista, solujen elinkelpoisuuden Ishikawa solujen laskenut 33.99 ± 4,06% 1 MHz ultraääni (1,0 W /cm

2) 60 s; vaikka mitään selvää kasvun estäminen havaitaan HEC-1-a soluja samoissa olosuhteissa (katso S1A Kuva). Lisäksi on havaittu, että solujen elinkelpoisuus HEC-1-a-solut säilytetään vähintään 81,39 ± 4,83% käsittelemällä jopa vahvempi ultraäänen (2,0 W /cm

2) pitkäksi ajaksi 60 s 240 s (S1B kuvio). Tämä suoraan osoittaa herkkyyttä Ishikawa ja kestävyys HEC-1-a, kun ultraääni hoito. Tärkeää on, kuten kuviossa 1, vaikka ultraääni estää solujen elinkelpoisuuden kohdun limakalvon syövän solujen eri pidentää, synergiaa ultraäänen kanssa HMME voi johdonmukaisesti ja merkittävästi herättää pitkälti parannettu tappaminen vaikuttavuutta eli 165% ja 115% niin, että ultraääni yksin HEC-1-a ja Ishikawa-soluja, vastaavasti.

CCK-8-määritystä käytettiin arvioimaan elinvoimaisten solujen hallinnassa, HMME, ultraääni ja SDT ryhmien Ishikawa (a) ja HEC-1-a (b ) solut. HMME tai ultraääni näyttää ilmeinen estävä vaikutus solujen eloonjäämistä. SDT estää solujen elinkelpoisuus tehokkaammin kuin kumpikaan yksittäinen hoito. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3), ** P 0,01.

3.2. Vaikutus SDT morfologiasta ja Alusrakenne on kohdun limakalvon syövän solut

katsottuna kuvien kuvassa 2, torjunta- ja HMME ryhmät, useimmat solut kasvatetaan toisissaan kiinni ja tasaisesti osaksi ”paving-stone” rakenne, osoittaa selkeä ääriviivat, hyvä läpinäkyvyys ja elinvoimaa; kun taas solut ultraäänen ja SDT ryhmä ovat huonosti avoimia, ei tiukasti kiinni tai jopa keskeyttää, ja morfologia osa soluista tulee pyöreä.

morfologia ja tarttuu kasvua Ishikawa (a) ja HEC-1-a (b) soluja, havaittiin 6h jälkeen neljä eri hoitoja käyttämällä käänteisen optisella mikroskoopilla (Olympus CKX4). Ohjaus ryhmät osoittavat toisissaan kiinni kasvaneet solut selkeät ääriviivat ja hyvä läpinäkyvyys; ultraääni ja SDT ryhmänäyttely huonosti läpinäkyvä soluja, jotka eivät ole tiukasti kiinni tai jopa keskeyttää. Suurennus Kaikkien kuvien on 40 kertaa, asteikko bar = 100 pm.

Lisätietoja voidaan tutkia alkaen TEM kuvia kuvassa 3. On havaittu, että solujen valvontaa ja HMME ryhmä hallussaan ehjä solu- ja ydinvoiman kalvot, selkeä organelle rakenteet ja täydellinen mitokondrioiden rakenteita ilman selvää muuttamista. Osalta Ultraääni ryhmään, solun tumassa kromatiini on tietenkin kelatut hyytynyttä ja syrjäytyneiden; mitokondriot turpoavat, epämuodostuneita ja vakuolaarisen ja lysosomissa on lisääntynyt, jotka ovat kaikki merkkejä kohti solujen apoptoosin. Sillä SDT ryhmä, tyypillinen ilmiöitä apoptoosin voidaan jo havaita soluista, jossa ytimet ovat alle ilmeisiä pyknosis osaksi heterogeeninen lohkon rakenne, joka osoittaa pieni apoptoottisia kappaleita, laajentuneen perinuclear aukkoja ja tumahuokonen, laajennettu Golgin laitteeseen ja solulimakalvostoon alle degranulaatio sekä epäselvä tai katosi mitokondrioiden kristat. Jotkut solut jopa näyttää kertyneen glykogeenin rae niiden solulimassa alentuneeseen solun tilavuus.

Alusrakenne neljän ryhmän solut leimasi siirto (TEM, JEM-2010, JEOL). (A) kontrolli ja (b) HMME ryhmä, joka osoittaa ehjä solukalvon ja tumakalvoa, selkeä organelle rakenne ja täydellinen mitokondriarakenne ilman selvää muuttamista; (C) ultraääni ryhmä, joka osoittaa taipumusta solujen apoptoosin, mukaan lukien kietoutunut tai hyytynyttä ja syrjäytyneiden solun tumassa chromatin, epämuodostuneita ja vakuolaarisen mitokondrioita ja lisääntynyt lysosomi; (D) SDT ryhmä, joissa ilmenee tyypillisiä ilmiöitä apoptoosin, jossa ytimet ovat alle ilmeisiä pyknosis osaksi heterogeeninen lohko rakenne, jossa pieni apoptoottisia kappaleita, laajentuneen perinuclear kuilu ja tumahuokonen, laajennettu Golgin laitteeseen ja solulimakalvostoon alle degranulaatio sekä epäselvä tai katosi mitokondrioiden kristat. Mittakaavapalkki kaikissa kuvat on 2 pm.

3.3. Vaikutus SDT on ROS sukupolvi ja MMP Reduction

Kuten kuviossa 4, apoptoottisen määrä SDT, ultraääni, HMME ja kontrolliryhmässä on 96.66 ± 0,45%, 91,21 ± 3,44%, 4,75 ± 1,10% ja 0,42 ± 0,35%, vastaavasti, Ishikawa soluissa ja 67.54 ± 12.65%, 18.88 ± 3,73%, 43.50 ± 5,02% ja 3,09 ± 1,37%, vastaavasti, HEC-1-a-soluissa. Indusoidun apoptoosin korreloi käänteisesti solujen elävyys määritettiin CCK-8-määritys on neljä erilaista ryhmää (S1 kuvio ja kuvio 4), mikä viittaa siihen, että apoptoosi on yksi merkittävä mekanismeja, jotka liittävät alhainen solujen elinkyky hoitoja. Apoptoosi hinnat SDT ryhmissä merkittävästi lisääntynyt verrattuna joko HMME tai ultraääni hoito yksinään sekä Ishikawa soluissa (p 0,05, kuvio 4B) ja HEC-1-a-solut (p 0,01, kuvio 4D). Kuitenkin SDT pääasiassa edistää varhaista apoptoosin Ishikawa soluissa (kuvio 4A), kun taas myöhemmin apoptoosin HEC-1-tapaus (kuvio 4C).

apoptoosin tasot ovat paljon suurempia SDT ryhmissä kuin kontrolli, HMME tai ultraääni ryhmät Ishikawa (a ja b) ja HEC-1-a (c ja d) soluja. Edustavia FACS-profiilit näytettiin a ja c. Histogrammit hetkellä keskimääräinen ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (b ja d, * P 0,05; ** P 0,01.)

Solunsisäinen ROS ovat tärkeitä välittäjiä apoptoosin [15]. Ymmärtää onko SDT aiheuttamaa apoptoosia johtuu ROS tuotanto, ROS tasoilla tehtiin näkyväksi DCF-A, koetin, joka fluoresoi hapettunut. On havaittu, että yksi neljä erilaista ryhmää, SDT voi parhaiten lisätä huomattavasti ROS tasoilla sekä Ishikawa ja HEC-1-a-soluja (p 0,01, kuvio 5). Verrattuna ultraääni, ROS sukupolvi määrä SDT ryhmien kasvoi jopa 1,48-kertaiseksi Ishikawa soluissa (p 0,01) ja 4,7-kertaisesti HEC-1-a-solut (p 0,01), tässä järjestyksessä.

ROS tasot vahvistetaan huomattavasti SDT ryhmissä verrattuna kontrolliin, HMME, ja ultraääni ryhmien Ishikawa (a ja b) ja HEC-1-a (c ja d) soluja. Edustavia FACS-profiilit näytettiin a ja c. Histogrammit hetkellä keskimääräinen ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (b ja d, ** P 0,01.)

Tehostettu ROS voi aiheuttaa muutoksia MMP, mikä edelleen edistää apoptoosin etenemisen [16]. Mitokondrion kalvon potentiaali oli siten mitattiin soluista käsitelty rodamiini. Kuten kuvassa 6, lievää laskua MMP havaitaan HMME ja ultraääni ryhmiä sekä Ishikawa ja HEC-1-a-soluissa. Tärkeää on, menetys MMP tulee paljon selvempää SDT ryhmässä verrattuna mono-hoitoryhmässä molemmissa solulinjoissa mukana. (P 0,01) B

Ishikawa (a ja b) ja HEC-1-a (c ja d) tehtiin neljä eri käsittelyistä: ohjaus, HMME, ultraääni ja SDT. Menetys MMP oli selvempää SDT ryhmässä kuin muissa ryhmissä. Edustavia FACS-profiilit näytettiin a ja c. Histogrammit hetkellä keskimääräinen ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (b ja d, ** P 0,01.)

3.4. Vaikutus SDT on Solunsisäiset Ca-ionipitoisuus

Kuten kuviossa 7 ja taulukossa 1, Ca-ionipitoisuus Ishikawa kohdun limakalvon solujen valvontaa, HMME, ultraääni ja SDT ryhmä on 92,533 nmol, 204,539 nmol, 2991,485 nmol ja 3455.750 nmol vastaavasti. Ilmeisesti solunsisäinen Ca

2+ pitoisuus ultraäänikäsittelyllä voidaan nostaa 32,3 kertaa verrattuna, että kontrolliryhmässä, ja SDT voi aiheuttaa lisäkorotukset keskittymää noin 37,3 kertaa.

Fluoresenssi intensiteetti Ishikawa kohdun limakalvon syövän solut 1 h kuluttua hoitojen testattiin laser skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Meridian, Insight-PlusIQ) klo argonlaserviritys 488 nm. (A) valvonta ja (b) SDT ryhmä, joka osoittaa solunsisäisen kalsiumionikonsentraation SDT on huomattavasti korkeampi kuin vertailuryhmällä.

3.5. Vaikutus SDT on Expression of Apoptotic-liittyvät proteiinit

Jotta ymmärtää molekyylitason mekanismeja SDT: n indusoiman apoptoosin, aktivointi kaspaasi-3 ja kaspaasi-8 havaittiin ensimmäisen western blottauksella erilaisten käsittelyjen jälkeen. Kuten on esitetty kuviossa 8, sekä pilkottiin kaspaasi-3 ja kaspaasi-8 vahvistetaan huomattavasti SDT ryhmissä, mikä viittaa siihen, sekä casapses aktivoidaan, kun hoitoa. Lisäksi, anti-apoptoottisen proteiinin surviviiniperäisten ja Bcl-2 on vähentynyt ja pro-apoptoottinen Bax on kasvanut SDT. Lisäksi kuoleman reseptori opastemerkintä, kuten Fas- ja Fas-L, myös parantaa SDT (kuvio 8). Nämä tiedot yhdessä ehdottaneet, että sekä sisäiseen ja ulkoiseen reittejä ovat olleet mukana SDT: n indusoiman apoptoosin.

Ishikawa (a) ja HEC-1-a (b) alistettiin neljää erilaista hoitoa: ohjaus, HMME, ultraääni ja SDT. Apoptoosiin liittyviä markkereita havaittiin Western-blottauksella, jossa spesifisiä vasta-aineita, kuten on ilmoitettu. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Keskustelu

Vaikka ultraääni on pidetty tehokas hoito syöpien, epätyydyttävä tappaminen vaikutukset ovat ehdottaneet HEC-1-a-soluissa tässä tutkimuksessa ja myös aikaisemman työn [7]. Tärkeää on, SDT toimii paitsi tehokkaasti ultrasounds herkkien Ishikawa soluja, ja myös ultraäänitutkimuksia kestävä HEC-1-a-soluissa, mikä osoittaa, että SDT voi olla sovelluksia laajempia syöpäsoluja. Synergistinen pro-apoptoosia vaikutus yhdistämällä HMME ja ultraääni kohdun limakalvon syöpiä voi johtua kahdesta tekijästä eli korkea hyötysuhde HMME kuin sonosensitizer ja tappava vaikutus ultraäänen.

SDT tavallisesti on kaksi tappaminen tilat kasvainsoluihin eli kuolion ja apoptoosin [17]. Hallitseva apoptoottinen kaltainen muutos solun morfologian ja alusrakenne esitetty käänteismikroskooppi ja TEM kuvia huomauttaa, että apoptoosin on merkittävä kuoleman tavalla endometriumsyöpätapausta solujen tässä tapauksessa. Perustuu koetuloksiin, mahdolliset mekanismit SDT apoptoosiin kohdun limakalvon syövän solut ehdotetaan seuraavaa:

(1) menetys MMP ROS sukupolvi ja Bcl-2-perheen vuorottelu voi olla yksi SDT aiheuttaman apoptoosin polkuja.

Se paljastuu, että ROS soluissa käsitellään SDT on eniten liiallinen kaikkien näytteiden. Normaaleissa olosuhteissa, solut voivat itse poistaa jatkuvasti pieniä molekyylejä syntyvää aerobisen hengityksen, kuten singlettihappea [18,19]. Kuitenkin epätasapainoinen tila, solunsisäinen ROS voidaan kerätä, vahinkoja mitokondrion kalvon ja vähentää kalvon potentiaalia [20-22]. Tämä on sopusoinnussa Koetulokset, jossa merkittävin ROS sukupolvi nopeuden ja MMP vähennysmäärään havaittiin samanaikaisesti SDT ryhmissä. Lisäksi mitokondrion kalvon potentiaali altistetaan myös Bcl-2-perheen jäsenten sääntelyä. Tässä tutkimuksessa, Bcl-2-perheen jäsenen Bax on lisääntynyt ja Bcl-2 on vähentynyt SDT ryhmissä. Lisääntynyt Bax voi siten muodostaa Bax /Bax homodimeerejä tai antagonisoi Bcl-2: n antiapoptoosi vaikutus läpi muodostaen Bax /Bcl-2-heterodimeerejä at ulkokalvon mitokondrioiden [23]. Tällaiset muutokset voidaan sitten lisätä läpäisevyyttä siten, että apoptoosia edistävät tekijät, kuten sytokromi c, on vapauttaa mitokondrioita sytosoliin, missä ne laukaisevat kaspaasi kaskadeja ja lopulta johtaa apoptoosin kohdun limakalvon syövän soluja. Tämän vuoksi päättelemme, että liiallinen ROS ja muutokset Bcl-2-perheen jäsenten SDT voi aktivoida luontaisen apoptoosireitin vaikuttamalla mitokondrioiden kalvopotentiaaleissa.

(2) Overloaded Ca ioneja soluissa voi olla toinen merkittävä luontainen tekijä solun apoptoosin SDT.

ylikuormitus Ca ioneja liittyy useita apoptoosin prosesseihin, erityisesti alkupään sääntelyä niistä. Ca-ioneja on yleensä tallennettu endoplasmakalvostossa. Endoplasmakalvosto stressi johtuu liiallisesta ROS [14] voidaan lisätä Ca

2 + tallennuskapasiteetti solujen sekä vapauttaa nopeuden Ca

2 + soluihin. Kuten käy ilmi esillä konfokaalimikroskoopin tuloksia, Ca

2+ ylikuormitus soluissa on melko ankara SDT ryhmä. Koska julkaisun sytokromin c on positiivinen palaute Ca

2+ pitoisuus [24-26], Ca

2+ ylikuorma SDT voi olla toinen stimulantti suurten sytokromin c vapautumiseen, joka sitten aktivoi kaspaasi-3 ja aiheuttavat solujen apoptoosin kuten edellä mainittiin.

(3) SDT voi tehokkaasti vaientaa elossa geeni.

Äskettäin on osoitettu, että surviviiniproteiiniperheestä ilmaisun kurssi kohtukarsinooma kudos on (100%) korkeampi kuin pidempään endometriumhyperplasia (73%) [27], mikä tarkoittaa, että surviviini voi osallistua tiiviisti pahanlaatuisiksi kohdun limakalvon. Vielä tärkeämpää on, aikaisempi työ on todennut, että selviytyminen proteiini surviviiniperäistä voi voimakkaasti estää apoptoosin stimuloida erilaiset tekijät [28]. Hiljentäminen surviviini voi siis rikkoa suojaa ja suosivat apoptoosin syöpäsoluissa. Tässä työssä, SDT: n on osoitettu olevan tehokas tapa estää tämän geenin, joka johtaa erittäin heikentynyt surviviinin ilmentymiseen ja tehokkaampi kaspaasi-8 ja kaspaasi-3 verrattuna kolmen muiden ryhmien.

(4) ulkoinen tie voi avustaa luontainen tekijät apoptoosin SDT.

läsnäolo Fas /Fas-L on merkki kuolemasta reseptorivälitteisen ulkoista apoptoosireitin joissa kaspaasin 8 säädökset tärkeänä aloittamista kaspaasi ja kaspaasi-3 on toimeenpaneva kaspaasi. Tuloksemme osoittavat, että kuoleman reseptori proteiinien Fas /Fas-l merkittävästi lisääntynyt SDT ryhmiä ja sekä kaspaasi-8 ja kaspaasi-3 aktivoidaan saman kohtelun, joka ilmaisee suoraan aktivointi ulkoisen apoptoottisten reittien vastauksena SDT.

Yhteenvetona, SDT voi merkittävästi inhiboimaan kohdun limakalvon syövän solujen, paljon tehokkaampaa kuin HMME tai ultraääni yksin sekä ultraääni herkkiä tai resistenttejä soluja. Indusoiman apoptoosin HMME-SDT liittyy useita eri reittejä pitkin, mukaan lukien luontainen apoptoottinen reitti aktivoituu ROS: n syntyminen, MMP vähentäminen ja Ca

2+ ylikuormitus, tehokas hiljaisuus surviviinin geenin yhdessä Fas /Fas-L-välitteisen ulkoista apoptoosin kautta. Ottaen huomioon merkittävä vaikuttavuutta sekä ultraääni herkkiä tai resistenttejä soluja, HMME-SDT voi siis ovat avanneet uuden kuntoutuksen tie potilaille, jotka eivät voi elää leikkauksesta, sädehoitoa tai kemoterapiaa, ja jotka tarvitsevat säilyttämiseen elinten ja jopa lisääntymistoimintojen.

tukeminen Information

S1 Kuva. Ultraääni herkkyys kohdun limakalvon syövän solujen analysoitiin CKK-8 määrityksissä.

(A) Ishikawa ja HEC-1-a-soluja käsiteltiin ultraäänellä (1 MHz), on intensiteetti 1,0 W /cm

2 60 s ja saatetaan sitten CKK-8-määrityksessä. Ishikawa on herkempi ultraääni kohtelun kuin HEC-1-a. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3), ** P 0,01. (B) Ultraääni resistenttejä HEC-1-a-soluja käsiteltiin ultraäänellä lisääntynyt intensiteetti 2,0 W /cm

2 0 s, 60 s, 120 s ja 240 s, vastaavasti. Hieman ja ajasta riippuvainen solujen elinkelpoisuus inhibition on havaittu hoitoja. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0137980.s001

(TIF)