Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet eturauhasen syöpiä retkahduksen takia sukupolven chemoresistance tekee ensilinjan hoitoon lääkkeitä, kuten paklitakseli (PTX) tehoton. Tässä tutkimuksessa tarkoituksena on selvittää rooli miRNA ja Hedgehog (Hh) väylän solunsalpaajaresistentti eturauhassyöpä ja arvioida yhdistelmähoitoa käyttämällä Hh estäjää syklopamiinihoidon (CYA). Tutkimukset suoritettiin PTX kestävä DU145-TXR ja PC3-TXR solulinjojen ja kliinisen eturauhaskudoksiin. Drug herkkyys ja apoptoosin määritykset osoittivat merkittävästi parantunut sytotoksisuus yhdistelmällä PTX ja CYA. Erottaa läsnäolo syövän kantasoluja, kuten puolella populaatiot (SP), Hoechst 33342 virtaussytometrillä menetelmää käytettiin. PTX kestävä DU145 ja PC3-soluja, samoin kuin ihmisen eturauhassyövän kudoksen omaavat erilaisia ​​SP osa. Lähes 75%: n SP-solut ovat G0 /G1 vaiheeseen verrattuna 62% ei-SP-soluissa ja on korkeampi ekspressio kantasolujen merkkiaineita samoin. SP solufraktio nostettiin seuraavalla PTX yksinään hoidon CYA tai CYA plus PTX tehokkaasti vähentäneet numerot viittaa tehokkuuden yhdistelmähoitoa. SP osa solujen annettiin erilaistua ja uudelleenanalysoidaan Hoechst-värjäys ja geenin ilmentymisen analyysi. Lähetä erilaistuminen, SP solut muodostavat 15,8% kaikista elinkelpoisia soluja, jotka laskee 0,6% käsittelemällä CYA. Ilmaisu tasot P-gp ulosvirtaus proteiini myös merkittävästi vähentynyt käsiteltäessä PTX ja CYA yhdistelmä. MicroRNA profilointi DU145-TXR ja PC3-TXR soluissa ja eturauhasen syöpä kudosta potilaista havaittiin vähentynyt ilmentyminen tuumorisuppressorin miRNA kuten miR34a ja miR200c. Hoito PTX ja CYA yhdistelmä palautti ilmaus miR200c ja 34a, vahvistaa niiden asemaa moduloinnissa chemoresistance. Olemme osoittaneet, että täydentämisestä mitoosi stabilointiaine lääkkeiden kuten PTX Hh-estäjän CYA voi kääntää PTX chemoresistance ja poistaa SP jae androgeeniriippumattomaksi, metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa.

Citation: Singh S, Chitkara D, Mehrazin R , Behrman SW, WC RW, Mahato RI (2012) Chemoresistance eturauhassyöpäsoluissa säätelee miRNA ja Hedgehog Pathway. PLoS ONE 7 (6): e40021. doi: 10,1371 /journal.pone.0040021

Editor: Wing-Kin Syn, Institute of Hepatology Lontoo, Iso-Britannia

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 30 toukokuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukena on Idea Award (W81XWH-10-1-0969) Department of Defense Eturauhassyöpä tutkimusohjelma. Taloudellinen tuki Kosten Foundation (www.kostenfoundation.com) on myös kiittävät. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa [1]. Vaikka antiandrogeeninen hoito on tällä hetkellä ensimmäinen rivi hoito potilailla on diagnosoitu eturauhasen syöpiä, useimmat potilaat lopulta kehittää androgeenin itsenäinen prostatasyövistä joka on erittäin metastaattinen ja on huono ennuste [2]. Mikrotubuluksen stabilisaattoreita, kuten PTX ovat tehokkaita hoidettaessa potilaita, joilla on diagnosoitu androgeenista riippumaton eturauhassyöpä [3]. Vaikka kliiniset kokeet ovat osoittaneet alkuperäisen tehoa taksaanien lisäämisessä eloonjäämisen eturauhassyöpäpotilailla [4], on vielä vähän tehokkaita lähestymistapoja hoitoon solunsalpaajaresistentti eturauhasen syöpiä.

Useimmat kasvaimet ovat heterogeenisiä ja koostuvat irtotavarana ja kasvaimen aloittamista soluja (-lämpökameroissa) sen kanssa muodostaen selvästi alaryhmän moniin syöpiin. -lämpökameroissa Usein kutsutaan syövän kantasoluja (CSCS) ja ovat vastuussa kasvaimen aloittamista, itseuudistumiseen, ja chemoresistance [5], [6]. Monet eturauhasen syöpiä relapsin läsnäolon takia erittäin solunsalpaajaresistentti kasvain aloittaneen /syövän kantasoluja [7], [8]. Chemoresistance että syöpälääkkeet kuten PTX, nämä solut voivat olla peräisin lääkeaineen effluksipumppujen joka voi tehokkaasti poistaa lipofiilisten molekyylien, mukaan lukien hydrofobinen syöpälääkkeiden. Tämä luontainen ominaisuus solunsalpaajaresistentti soluja käytetään tunnistamiseen ja eristämiseen puoli väestöstä (SP), jotka ovat eräänlainen syövän kantasoluja. SP jae, aluksi tunnistaa Goodell, on pieni solujen ala- populaation rikastettua kantasolujen toimintaa ja tiedetään osoittaa leimallisesti alhainen Hoechst 33342 väriaine värjäystä [9]. SP osa-solujen on osoitettu olevan herkkä eri kemoterapeuttisten [10], koska niiden kyky effluxing kemoterapiaa huumeiden (ja lipofiiliset väriaineet, kuten Hoechst 33342), mikä johtuu korkeasta ilmentymisestä ATP-sitoutumisen kasetin perheen, kuten MDR1 (P glykoproteiini) ja ABCG2 [11]. Solunsalpaajaresistentti SP solut selviävät ja ylläpitämään niiden kyky muodostaa klooneja aikana alkualtistusta sytostaattien, jolloin tauti uusiutuu, kun hoito lopetetaan. Nämä osajoukot CSCS siis pidetty toteuttamiskelpoisena kohde parantunut terapeuttinen intervention ja estää chemoresistance ja syövän uusiutumisen.

kehittäminen chemoresistance lisäämällä määrä syövän kantasolujen kaltaisten solujen, mukaan lukien SP jakeet syyksi on muutokset tasolla MikroRNA (miRNA) eri syöpätyyppeihin. Nämä ei-koodaavat RNA-molekyylit voivat toimia onkogeenien sekä kasvaimia estävä [12], [13], [14]. Häiriöstä miRNA on tuumorigeneesiin ja lääkeresistenssin samoin. Viimeaikaiset työn Cochrane et al. on tunnistettu miRNA moduloimiseen osallistuva chemoresistance useissa syövissä [15].

Meidän Esillä olevassa tutkimuksessa olemme arveltu, että chemoresistance PTX metastaattisessa eturauhassyöpäsoluissa voisi johtua muuttuneita miRNA ilmentymisen näissä soluissa, ja että yhdistelmä antimitoottista lääkkeen toisen pienen molekyylin, joka estää CSCS on todennäköisesti tehokas paitsi palataan chemoresistance tukahduttamalla CSCS vaan myös kohdistaa miRNA mukana chemoresistance. Näin ollen, vaikka epäonnistuminen perinteinen kemoterapia vian vuoksi tuhota CSCS /SP jakeet, kombinatorinen lähestymistapa tuottaa todennäköisesti parempia tuloksia, koska CSC-estäjän tappavat pluripotenttien syöpäsoluja ja mahdollistaa antimitoottisella lääkkeen (tässä tapauksessa PTX) hyökätä irtotavarana syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten olemme yhdistäneet PTX syklopamiinilla (CYA), luonnollinen steroidaalinen alkaloidi, joka estää Hedgehog (Hh) reitin johtaa vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosin [16]. Viime vuosina, Hh-signalointireitin on liitetty kehittämisessä ja levitä eturauhassyövän [17], [18]. Todisteet on myös ilmoittanut, että Hh signalointi tukee androgeenireseptorin signalointi ja androgeenista riippumattoman kasvun eturauhasen syöpäsolujen alhaisen androgeenien ympäristössä [19]. Esto Hh-reitin johtaa downregulation liittyvien geenien kantasolujen itseuudistumisen sekä regressio eturauhasen kasvain ilman uusiutumisen [20]. Yhdistelmä dosetakselin CYA ja epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjä gefitinibi aiheuttama suurempi antiproliferatiivinen ja apoptoottinen vaikutus SP solufraktioita eristettiin metastaattinen syöpäsolujen kuin sellaisia ​​lääkkeitä [21]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että lisäämällä EGFR-inhibiittoria lapatinib voi tehostaa PTX apoptoosin on paklitakseli-resistenttejä, androgeeni-riippumaton metastaattinen eturauhassyöpä solujen linja DU145-TXR sekä

in vitro

sekä ksenograftikasvaimissa [22].

ymmärtää ilmiö chemoresistance, esillä olevassa tutkimuksessa olemme käyttäneet androgeeniriippumattomaksi (AI) metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa DU145 ja PC3 sekä niiden PTX-resistentti versiot, DU145-TXR ja PC3-TXR, vastaavasti. Olemme osoittaneet, että PTX vastus eturauhassyöpäsolujen voidaan moduloida tasolla miRNA. Me osoittavat lisäksi, että yhdistelmähoito CYA ja PTX voidaan tehokkaasti vähentää solujen elinkykyä, vähentää SP-solufraktio annoksina huomattavasti alhaisempi kuin mitä käytetään CYA yksinään vaikutusta miRNA oletettavasti mukana moduloivan chemoresistance. Tuloksemme osoittavat, että yhdistelmähoito, johon täydentämistä PTX Hh-estäjät voivat kohdistaa tiettyihin miRNA ja syövän kantasoluja, kuten SP solupopulaatioiden annoksilla, jotka ovat tehokkaita yhdistelmänä, mutta ei monoterapiassa. Tämä lähestymistapa voi edustaa parempi lähestymistapa ehkäisyssä etäpesäke ja uusiutumisen tulenkestävät eturauhasen syöpä, koska se on vähemmän todennäköisesti myrkyllinen ja esittelee kanssa paljon vähemmän sivuvaikutuksia potilaalle, varmistamalla parempi noudattaminen ja vähentää mahdollisuuksia toistumisen.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

PTX ja CYA ostettiin LC Labs (Woburn, MA). SYBR Green reaaliaikainen PCR Master Mix ja käänteistranskriptio reagenssit hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA). Vuohen anti-kani P-gp: n vasta-aineella ja johdetun vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Kaikki muut kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja käytettiin sellaisenaan, ellei toisin mainita.

Solulinjat

Ihmisen metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa DU145 ja PC3 ja niiden PTX kestävät versiot DU145-TXR ja PC3-TXR olivat ystävällinen lahja prof Evan T. Keller (University of Michigan). Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin RPMI elatusaineissa täydennetty 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco), kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu [22] .

Human eturauhasessa

Human eturauhasessa (syöpä- ja hyvänlaatuisia) saatiin Veterans Affairs (VA) Hospital, Memphis, TN kanssa noudattamalla vakiintuneita menettelyjä ja noudattaen tietoisen suostumuksen säädetty poikkeus Institutional Review Board (IRB) at UTHSC ja VA sairaalassa. Eturauhasen kudosta otettiin käyttäen 18 gaugen ydin neula biopsiapyssyyn ja osa tästä kudos huuhdellaan ja joko flash-jäädytettiin nestetypessä ja sen jälkeen säilytettiin -80 ° C: ssa tai laitetaan kylmään seerumittomassa RPMI-elatusaineeseen, joka sisälsi antibioottien valmistamiseksi yhden solususpensiot. Kudokset luokiteltiin pahanlaatuisia tai hyvänlaatuinen perusteella tekemän diagnoosin patologi.

Drug herkkyys ja apoptoosin määrityksissä DU145-TXRCells

laajuuden määrittämiseksi solujen apoptoosin seuraavista lääkehoitojen, DU145- TXR solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (7,5 x 10

5 solua /kuoppa). 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja tuoretta väliainetta, joka sisälsi vaihtelevia pitoisuuksia PTX, CYA tai niiden yhdistelmät lisättiin. Sitten solut värjättiin anneksiini-V: n ja propidiumjodidilla (PI) käyttäen Vybrant Apoptosis Assay Kit kohti valmistajan protokollaa (Molecular Probes). Lyhyesti, solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja pelletoitiin sentrifugoimalla 800 rpm: ssä 5 min. Pelletit suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 1X anneksiini sidospuskuria ja 5 ui fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -Annexin-V. Propidiumjodidia (100 ug /ml) lisättiin kuhunkin 100 ul: aan solususpensiota. Värjätyt solut analysoitiin välittömästi virtaussytometrialla.

DU145-TXR soluja käytettiin myös määrittämään solujen kasvun estäminen kyky PTX ja CYA. -Soluja (5 x 10

3 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille ja inkuboitiin 24 tuntia, jotta solujen kiinnittymistä. Media korvattiin sitten tuoreella väliaineella, joka sisälsi PTX (0,5 /1 uM) tai CYA (10/25 uM) tai yhdistelmänä (PTX 0,5 uM ja CYA 10 pM) ja inkuboitiin edelleen 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa /5% CO

2. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin sitten MTT-määrityksellä. Tätä varten väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä ja 200 ui tuoretta väliainetta, joka sisälsi 3- (4,5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (0,5 mg /ml ) lisättiin, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa /5% CO

2: ssa 4 tuntia. 4 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja muodostettiin formatsaanikiteet kiteet liuotettiin 200 ul: aan DMSO: ta, ja absorbanssi mitattiin 560 nm: ssä. Solujen elinkelpoisuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa:

DMSO käytettiin liuottamaan PTX ja CYA ja DMSO kontrollia sisällytettiin kaikkiin kokeisiin.

Side Populaatioanalyysit ja solujen lajittelu FACS

Side väestö analyysi DU14-TXR ja PC3-TXR solulinjoissa tehtiin käyttämällä Hoechst 33342 virtaussytometrialla menetelmällä. Lyhyesti, kiinnittyneet solut trypsinoitiin ja pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). -Soluja (1 x 10

6 solua /ml) suspendoitiin sitten RPMI-elatusaineessa, jota oli täydennetty 2% FBS: ää ja 1 mM HEPES-puskuria kanssa tai ilman lääkeliuoksiin (Verapamil, PTX tai PTX + CYA). Hoechst 33342 (5 ui; 1 mg /ml), väriaine lisättiin sitten seurasi inkubointi 90 min ajan 37 ° C: ssa. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin useita kertoja PBS: llä poistamaan sitoutumaton väriaine ja suspensoitiin lopulta jääkylmään PBS: ään, joka sisälsi 2% FBS: ää. SP osa kliinisistä näytteistä analysoitiin, kuten yllä on kuvattu lisävaiheita. Lyhyesti, juuri resektoitiin eturauhasen kudosta huuhdottiin, mekaanisesti jauhettu ja pilkottiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 100 U /ml kollagenaasi IV (Worthington Biologicals) seerumivapaassa RPMI. Kudos usein pipetoitiin kanssa 5 ml: n serologiset pipetillä ja lopussa inkubaation digestio vietiin läpi 18.5- gaugen neula, sentrifugoitiin nopeasti ja supernatantti seulottiin 100 um: n solusiivilän, jolloin saatiin yksisolususpensio. Laimennettu yksisolususpensioita vietiin sitten kerran läpi 40 um meshin suodattimen, niiden elinkelpoisuutta arvioitiin trypaanisini-värjäyksellä ja pidettiin jäissä, kunnes analysoitiin.

Soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin A) 0,3% DMSO: ta, B) 0,5pM PTX C) 10 uM CYA, D) 25 uM CYA, E) 0,5pM PTX +10 uM CYA 48 tuntia ja F) DU145-TXR solujen jälkeen eri lääkehoitoon. Sen jälkeen solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI ennen apoptoottista analyysi virtaussytometrialla. A-E ovat palstojen kolmesta yksittäisestä kokeesta. Tietojen paneelissa F on kvantitointiin% solukuoleman ja edustaa keskiarvo ± SD (n = 3). *

p

0,05 vs. kontrolli. MTT-määritys (Fig. 1 G), soluja kasvatettiin 96-kuoppaisella levyllä käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden lääkeaineiden 48 tuntia. Tämän jälkeen MTT-reagenssia PBS: ssä lisättiin ja inkubointia suoritettiin vielä 4 tunnin ajan. Saatu formatsaanituote liuotettiin DMSO: hon ja värin voimakkuus määritettiin käyttäen levylukijaa. Tilastollisesti merkittävä ero (*

p

arvo 0,05) havaittiin, kun yhdistelmä 0,5pM PTX ja 10 uM CYA käytettiin. Solujen elinkelpoisuus = a

testi /A

controlX100. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). PTX, Paklitakseli; CYA, Syklopamiini.

Cell Cycle analyysi

Virtaussytometria käytettiin määrittämään solujen prosenttiosuus eri kasvun sykliä. -Soluja (5 x 10

5), joka saadaan sen jälkeen, kun lajittelu pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin etanolilla (70%) 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen käsitellään RNaasi (1 mg /ml) ja värjättiin PI (10 ug /ml ). Solujen prosenttiosuus eri solusyklivaiheista määritettiin sitten.

A) DU145-solut, B) DU145-TXR soluja, C) DU145-TXR soluja käsiteltiin verapamiilia (10 uM, 90 min), D) DU145 -TXR solut käsiteltiin PTX (1 uM, 12 h), E) DU145-TXR soluja käsiteltiin CYA (20 uM, 12 h), F) DU145-TXR soluja käsiteltiin CYA ja PTX (20 uM ja 0,5 uM, tässä järjestyksessä , 12 h). Verapamiili käytettiin portin SP osa kaikkien paneelien ja esitetään prosentteina koko elävien solujen populaation. Numeeriset arvot ilmoitetaan ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *

p

0,05 kontrolliryhmään DU145 soluja (A). PTX, Paklitakseli; CYA, Syklopamiini.

A) PC3-TXR soluja, B) Soluja käsiteltiin verapamiilia (10 uM, 90 min), C) PC3-TXR soluja käsiteltiin CYA (20 uM, 12 h) tai D) CYA ja PTX (20 uM ja 0,5 uM, tässä järjestyksessä, 12 h). SP fraktio, joka poistettiin käsittelemällä verapamiilin, on porteilla (P8) kaikissa paneelien ja esitetään prosentteina koko elävien solujen populaation. Numeeriset arvot ilmoitetaan ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *

p

0,05 kontrolliryhmään DU 145 soluja (A). PTX, Paklitakseli; CYA, Syklopamiini.

Kun virtaus lajittelu, puhdas SP solut levytettiin ja annettiin erilaistua 2-viikkoa. Edustavia mikrovalokuvia SP (A) ja NSP soluja (B) on esitetty enemmän SP solujen jolla sidekudosta, pitkänomainen fenotyyppi verrattuna NSP. Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin vahvistamaan suurempi ekspressio kantasolujen merkkiaineita MMA: iden 4 ja Nanog ja syövän kantasolujen merkkiaineita CD133 ja ALDH1 (C). Samanlaista menetelmää käytettiin osoittamaan suurempi ekspressio pluripotenttisuuden ja ulosvirtaus merkki ABCG2 ja pienempi ilmentyminen MCM7 transkriptien alkuperäisen SP-soluissa (SP), verrattuna sekapopulaatioissa jälkeiseen erilaistumiseen (DIFF) missä vähentynyt ABCG2 ja lisääntynyt MCM7 tasot havaittiin (D) . Yhdet soluja käsiteltiin myös 25 uM CYA 48 tuntia. Sen jälkeen solut trypsinoitiin ja uudelleen värjättiin Hoechst väriaineella ja analysoitiin virtaussytometrialla. Post-erilaistuminen, peräisin olevat solut virtaus lajiteltu SP-soluissa oli suurempi prosenttiosuus SP Solufraktioiden kuin aikaisemmin saadun ei-lajiteltu DU145-TXR soluissa. CYA hoito vähensi merkitsevästi (

p

0,001 vs. kontrolli) prosenttiosuus SP fraktion soluista 15,8 (± 2,1)% (paneeli E) 0,6 ± (0,09)% (paneeli F). Edustavia pistekuvioita kolmesta yksittäisestä kokeita tarjotaan. Data edustaa keskiarvoa ± SD (n = 3).

In vitro erilaistuminen tutkimuksessa

Kyky SP solujen erilaistumisen määritettiin viljelemällä puhdasta solufraktioiden on 6 kuoppalevyllä 14 vuorokautta lajittelua. SP-fraktion soluja DU145-TXR ja PC-TXR (1 x 10

5 /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kasvaa RPMI elatusaineissa oli täydennetty 10% FBS: ää. Jälkeen 14 päivää, Hoechst-värjäys ja SP-analyysi tehtiin käsiteltyä tai käsittelemätöntä solupopulaatiot, kuten edellä on kuvattu. Geenien ilmentyminen analyysi suoritettiin myös SP ja ei-SP-soluissa sekä ennen-erilaistumista.

hoidon jälkeen, on monien lääkkeiden kuvattu, kokonaisproteiinin uutettiin ja erotettiin SDS-PAGE ennen koettimena P -gp vasta-aine. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Yhdistelmä 0,5pM PTX ja 10gM CYA oli tehokkaampi vähen- tämisessä P-gp ilmentymistä lääkeresistenttiä syöpäsolujen kuin monoterapiaan joko CYA tai PTX 10 ja 0,5 uM. P-gp downregulation 25 uM CYA oli lähes samanlainen kuin saadaan yhdistelmähoito. (B) ilmentäminen Hh-reitin ja kantasolujen merkki geenejä DU145-TXR soluissa. Kokonais-RNA uutettiin soluista ja käänteistranskriptio cDNA: ksi. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green kemian ja Ct-arvoja Näin saadut käytettiin laskettaessa kertainen muutos. Lääkkeille vastustuskykyiset DU145-TXR soluilla on suurempi ekspressio kaikkien kolmen geenin testattu. PTX herkkä DU145-soluja käytettiin kontrollina ja geenin ilmentymistä arvot DU145-TXR solujen normalisoitiin suhteessa kontrolliarvoihin. *

p

0,05 vs. kontrolli.

Western blot-analyysi

hoidon jälkeen, DU145 TXR solut hajotettiin käyttäen RIPA-puskurilla ja kokonaisproteiinin konsentraatio määritettiin käyttäen Bio-Rad RC DC-proteiinin määritys kit (Hercules, CA). SDS-PAGE suoritettiin sitten ratkaista proteiineja, jotka siirrettiin sitten Immobilon polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo käyttäen iBlot kuiva blotting-järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esto tehtiin käyttämällä 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 x PBST (PBS, joka sisältää 0,05% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kalvoja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 16 h 4 ° C: ssa. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus ja kohde- proteiini havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL) havaitseminen kit (GE Healthcare Life Sciences, PA).

Kokonais-RNA mukaan lukien miRNA eristettiin DU145-TXR ja DU145-soluja (A ) tai PC3 ja PC3-TXR soluja (B) käyttäen miRNEasy RNA eristyspakkausta. SYBR Green pohjainen reittiin keskittynyt miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) käytettiin miRNA profiloinnin tutkimuksiin. Levyt ajettiin Roche Light Cycler 480® väline ja ilmentyminen yksittäisten miRNA analysoitiin käyttämällä saatua C

p-arvot ja ΔΔCt menetelmällä. Taulukko insertin (C) vahvistaa validointi miRNA profilointi tietojen miScript pohjamaali määrityksessä. Validointi miRNA profilointitiedot tehtiin SYBR Green pohjainen reaaliaikainen RT-PCR-määrityksen valittujen miRNA. Koska normalisoija, SNORD6 käytettiin taloudenhoito miRNA. (D) teho yhdistelmähoidon palauttamisesta miR 200 c ja 34a määritettiin käsittelemällä DU145-TXR solujen PTX (0,5 uM) ja CYA (10 uM) yhdistelmä 48 tuntia, minkä jälkeen uutettiin kokonais-RNA, joka on muunnettu cDNA: n ja käytettiin templaattina miScript aluke määritys ilmentymisen miRNA 200c ja 34a. Hoitamaton DU145-TXR-soluja käytettiin kontrollina laskemiseksi kertamuutos jälkeen SYBR Green reaaliaikainen RT-PCR-määritystä. Data edustaa keskiarvoa ± SD (n = 3). *

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli.

Reaaliaikainen RT-PCR

Yhteensä RNA uutettiin valikoidun ja lajittelemattoman syöpäsolujen käyttäen RNeasy RNA eristäminen (Qiagen, MD), jonka jälkeen laadun määrittämiseksi, jonka Nanodrop 2000 väline. Sen jälkeen käänteistranskriptio cDNA: ksi malliin, kuten on kuvattu aiemmin [23]. cDNA (100 ng) monistettiin sitten reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä SYBR Green väriaine Universal Master Mix vaalealla Cycler 480 instrumentti (Roche, Indianapolis, IN) käyttäen alukkeita kiinnostavat geenit neljäkymmentä sykliä suhteellinen määrä mRNA verrattuna S19 (siivous geeni) taso laskettiin Ylityspaikka (Cp) arvot ja skaalata vertailuryhmään nähden näytteitä asetettu arvoon 1. tulokset geeniekspression Koenäytteet piirrettynä verrattuna kontrolliryhmään.

Useat geenien syöpään liittyvissä biologisissa prosesseissa ja tunnetut tavoitteet ilmentyvät eri miRNA tutkimuksessamme muutellaan PTX resistenttien DU145 TXR soluja. Seuraavat RNA ja SYBR Green perustuu reaaliaikainen RT-PCR: llä käyttäen spesifisiä geenin alukkeita, Cp-arvot laskettiin ja resistenttejä DU145-soluja käytettiin normalisoimaan ilmentyminen yksittäisten geenien. Data edustaa keskiarvoa ± SD (n = 3).

MicroRNA (miRNA) profiloinnin ja tietojen validointi

Yhteensä-RNA, joka sisältää pieniä koodaamattomalla miRNA eristettiin hoitamatta ja huumeiden -käsitellyssä DU145-TXR ja DU145 soluja tai PC3 ja PC3-TXR soluihin käyttäen miRNEasy RNA: n eristys (Qiagen MD) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Samoja reagensseja käytettiin eristämään kokonais-RNA: ta ihmisen eturauhasen kudosta. Lyhyesti, flash jäädytetty kudos suspendoitiin uuttopuskuriin ja alistettiin huolellinen hajoamisen käyttäen kädessä pidettävää sähköinen homogenisaattorissa 30s alhaisella-to-middle nopeusasetuksen. Homogenaattia sentrifugoitiin 3 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti käytetään erottamaan kokonais-RNA. Post-eristäminen RNA laatu määritettiin käyttäen Nanodrop 2000 väline.

(A) Ihmisen eturauhassyöpä kudosta muutettiin yksisolususpensioi- kuten ’Menetelmät’. Solut värjättiin Hoechst väriaineella ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu. Lähes 1% koko elinkelpoisten solupopulaatio aidatulla kuin SP jae. (B) Kokonais-RNA eristettiin toinen joukko ihmisen eturauhasen kudosten (syöpä ja hyvänlaatuinen) käyttäen miRNEasy RNA eristyspakkausta. SYBR Green pohjainen reittiin keskittynyt miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) käytettiin miRNA profiloinnin tutkimuksiin. Levyt ajettiin Roche Light Cycler 480® väline ja ilmentyminen yksittäisten miRNA analysoitiin käyttämällä saatua C

t-arvot ja ΔΔCt menetelmällä. Kansi muutokset kasvainkudoksessa normalisoitiin suhteessa eturauhasen hyvänlaatuisen kudosta. (C) Taulukko insertti vahvistaa validointi miRNA profilointi tietojen miScript pohjamaali määrityksessä. Validointi miRNA profilointitiedot tehtiin RT-PCR-arvio on valittu miRNAs200c, 34a ja 29b. SNORD6 käytettiin taloudenhoito miRNA datan normalisointi.

miRNA profilointi tutkimuksissa SYBR green perustuvat reittiin keskittynyt miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) käytettiin. Syöpä polku array (luettelonumero 102ZF) mahdollistaa samanaikaisen havaitsemisen 84miRNAs aikaisemmin tunnistettu ihmisen syövissä, sekä asianmukaiset siivous määritykset ja RNA laadunvalvontaa. Määritys suoritettiin valmistajan protokollan. Kolmesataa nanogrammaa (ng) kokonais- RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen miScript II RT Kitiä. Laimennettu cDNA sekoitettiin yleispohjamaaliksi ja SYBR Green väriainetta ja lisättiin kuoppiin 96-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät lyofilisoidun aluketta. Levyt ajettiin Roche Light Cycler 480®instrument ja ilmentyminen yksittäisten miRNA analysoitiin käyttämällä saatua C

t: n arvot. Taitteen muutos Kunkin miRNA laskettiin liittämällä C

p arvot valmistajan web-pohjainen ohjelmisto. DU145 soluja tai PC3-solut, samoin kuin eturauhasen hyvänlaatuisen näytteitä pidettiin ”valvonta”, jotta voidaan laskea taitteen muutosta DU145-TXR ja PC3-TXR soluissa ja syöpä- eturauhasessa, vastaavasti. Endogeeninen valvonta, RT negatiiviset ja positiiviset kontrollit, ja genominen DNA-kontaminaation valvonta testattiin myös kunkin matriisin.

Merkittävät keskinäisistä välillä chemoresistance, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ja etäpesäkkeiden, joka haitallisesti vaikuttaa hoitotuloksia. Chemoresistance, keskeinen piirre CSCS ja solujen käynnissä EMT, säätelee dysregulaatio miRNA. Meidän ehdotettu yhdistelmähoito PTX ja CYA samanaikaisesti tavoitteet CSCS ja irtotavarana syöpäsoluja, kääntää EMT ja palauttaa ilmaus miRNA muuteta sukupolven chemoresistance ja on toteuttamiskelpoinen strategia hoitoon lääkeresistenttiä eturauhassyöpä.

validointi miRNA profilointitiedot tehtiin reaaliaikainen PCR arvio valittujen miRNA. Kunkin valitun miRNA, joka on miScript PCR-aluke hankittiin Qiagen. Tämä määritys on kohdistettu vain kypsiä miRNA, eikä niiden esiasteita. Koska normalisoija, SNORD6 käytettiin taloudenhoito miRNA. Lyhyesti, laimennettu cDNA käytetään miRNA profilointia käytettiin mallina läsnäollessa SYBR Green väriaine, yleispohjamaaliksi ja miScript pohjamaali. Levyä ajettiin edellä kuvatulla tavalla ja taita muutokset miRNA ilmaisun laskettiin C

t arvosta normalisoija valvontaa. Samanlaista lähestymistapaa käytettiin mittaamaan ilmaus miR200c ja miR 34a DU 145-TXR soluja käsiteltiin 0,5 uM PTX + 10 uM CYA. Käsittelyn jälkeen eristettiin kokonais-RNA, käänteiskopioitiin cDNA: ksi ja käytetään mittaamaan miRNA ilmentymisen, kuten edellä on kuvattu.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot sekä teksti ilmaistiin keskiarvona ± SD . Tulokset analysoitiin ja yksittäisen ryhmän avulla verrattiin Studentin pariton

t

-testi.

p

-arvo on vähintään 0,05 katsottiin merkitseväksi ja on merkitty tähdellä (*).

Tulokset

yhdistelmä CYA ja PTX vähentää solujen elinkelpoisuutta ja lisää apoptoosia huumeiden vastustuskykyisten syöpäsolujen

kyky yhdistelmänä kemoterapian kasvun estämiseksi PTX resistenttejä eturauhassyövän solulinjaa arvioitiin solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin määritystä. Havaittiin, että yhdistelmä PTX ja CYA merkittävästi (

p

arvo 0,05) pienenee solujen elinkykyä 40% verrattuna joko PTX tai CYA yksinään (Fig. 1, kentät A-F). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin anneksiini V solukuoleman määritys, jossa yhdistelmähoito johtaa huomattavasti suurempi solukuolemaa verrattuna yhden aineen kemoterapiaan (Fig. 1, G). Useista PTX ja CYA johti lähes 70% soluista kuolee, prosentuaalinen solukuolemaa havaittiin PTX tai CYA monoterapiana oli 15% ja 25% vastaavasti. Kuitenkin hoito 25pM CYA oli merkitsevästi tehokkaampi kuin valvontaa ja aiheutti lähes 40% solukuolema.

Side Population jakeet olemassa PTX kestävä eturauhassyövän solut ja ovat ainutlaatuisia geenien ilmentymisen

Kuviot 2 ja 3 esittävät SP analyysi eturauhassyöpäsolulinjoissa DU145-TXR ja PC3-TXR, vastaavasti sekä hoidon vaikutusta PTX ja CYA. Ohjaus DU145 solut ovat pieniä määriä SP (0,2%, Fig. 2A), kun taas PTX resistentti solulinja DU145-TXR on ~3.2% SP-soluissa (kuvio. 2B), kuten Hoechst-värjäys (

p

0,05 kaikissa näytteissä). PC3-TXR soluja, SP jae heikkeni merkittävästi hoidon jälkeen CYA (Fig. 3C) tai CYA ja PTX yhdistelmä (Fig. 3d). Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi osoittaa korkeampi ilmentyminen pluripotenttisuus merkkiaineiden Oct4 ja Nanog ja syöpä kantasolujen merkkiaineita CD133 ja ALDH1 SP jakeet verrattuna ei-SP (NSP) jakeet sekä DU145-TXR ja PC3-TXR soluissa. Post-eriyttäminen kohtaloa SP solujen tutkittiin reaaliaikainen RT-PCR ja Hoechst värjäyksen jälkeen eristämisen ja uudelleen viljely. Nämä solut erilaistuneet sekoitus väestö käsittää SP ja NSP jakeet, jotka erosivat toisistaan ​​fenotyypin (Fig. 4, paneelit A ja B, vastaavasti). Expression analyysin jälkeisen erilaistumisen sekoitettu-populaatiot osoittaa alentunut selostukset ABC-kuljettaja ja syövän stemness merkki ABCG2 ja korkeampi ilmentyminen solujen lisääntymisen merkki minikro- huolto 7 (MCM7) verrattuna eriytymättömiä SP-jakeet (Fig. 4D). Jatkokäsittely jälkeisen eriyttäminen SP populaatioiden kanssa 25 uM CYA 48 h johti SP jae merkittävästi vähentynyt 15,8% (paneeli E) 0,6% (paneeli F,

p

0,05). Taulukossa 1 on esitetty solusyklin analyysi virtauksen järjestetty SP ja NSP-soluja. Havaittiin, että 62% NSP soluista olivat G0-G1 ja 30% S-vaiheessa toisin kuin 71,5% ja 21% SP-soluissa, vastaavasti (

p

0,05).

Gene ja Protein Expression in DU 145-TXR Cells

Expression of P-glykoproteiinin (P-gp) arvioitiin Western-blottauksella. Kuva.